Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/57953
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Internal Medicine and Cardiology, Charité University Medicine, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

Abstract

במאמר זה, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד פרפור cardiomyocytes (ACMs) ממודל עכברוש של תסמונת מטבולית (גרורות)-הקשורים אי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר (HFpEF). השכיחות של HFpEF הקשורות המטס עולה ולאחר פרפור cardiomyopathies הקשורים שיפוץ פרוזדורים פרפור פרוזדורים הן רלוונטיות קלינית גבוהה כמו שיפוץ פרוזדורים כמנבא עצמאית של התמותה. מחקרים עם cardiomyocytes תא בודד מבודדים משמשים לעתים קרובות לאמת ולהשלים ויוו ממצאים. Rarefication כלי הדם ואת רקמת ביניים פיברוזיס להוות גורם מגביל באופן פוטנציאלי לבידוד בתא יחיד מוצלחת של ACMs של מודלים חייתיים של מחלה זו.

פתרנו בעיה זו על-ידי הפעלת מכשיר המסוגל באופן ידני וויסות הלחץ intraluminal של חללים הלב במהלך ההליך בידוד, האריך את התשואה של ACMs מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע. התאים הנרכש ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים שונים, כגון תרבית תאים הדמיה תפקודית סידן (קרי, עירור-התכווצות-מצמד).

אנו מספקים החוקר עם פרוטוקול צעד אחר צעד, רשימה של פתרונות ממוטבים, הוראות יסודיות כדי להכין את כל הציוד הדרוש, מדריך מקיף לפתרון בעיות. בעוד היישום הראשוני של ההליך עשוי להיות קשה למדי, הסתגלות מוצלחת יאפשר לקורא לבצע את המדינה-of-the-art ACM ומשום במודל של עכברים של המטס הקשורות HFpEF עבור קשת רחבה של ניסויים.

Introduction

המטס מתאר מקבץ של גורמי סיכון סוכרת סוג 2, מחלות לב וכלי דם, כולל של לחץ דם עורקי מוגברת, dyslipidemia (העלה טריגליצרידים והנמכתי כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה), גדל צום גלוקוז, השמנה מרכזית1. השכיחות של גרורות ברחבי העולם מוערך 25 – 30% ובעלייה מתמדת2. HFpEF היא תסמונת קלינית heterogenous קשורה לעיתים קרובות עם גרורות. שיפוץ לב במהלך HFpEF, בשלבים הקודמים שלה (כלומר, מחלות לב לחץ דם גבוה) מלווה גם שיפוץ של אטריה3. הפונקציה כויץ מופחתת ושינויים מבניים של אטריום שמאל קושרו עם תמותה מוגברת, פרפור פרוזדורים, אי ספיקת לב התפרצות חדשה4. שיפוץ פרוזדורים מאופיין על ידי שינויים יון ערוץ פונקציה, Ca2 + הומאוסטזיס, מבנה פרוזדורים, פיברובלסט ההפעלה, וכן רקמות פיברוזיס5. עזבו שיפוץ פרוזדורים HFpEF הקשורות מטס, שבבסיס שלה מנגנונים פתולוגיים עדיין הם הבינו, דורשים חקירה מעמיקה עוד יותר. מודלים בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך, להוביל ופיתוחים בתחום של פרפור cardiomyopathies6,7,8,9.

מחקרים עם cardiomyocytes תא בודד מבודדים משמשים לעתים קרובות לאמת ולהשלים ויוו ממצאים. בידוד, התרבות תאים עוקבים פוטנציאליים, לאפשר החקירה של איתות המסלולים זרמי ערוץ יוניים, עירור-התכווצות-מצמד. בתנאים הפיזיולוגיות, cardiomyocytes לא להתרבות. המיזוג בין רצפי רגולטוריות גנים ברמת השעתוק גורם atrial natriuretic, וירוס קופיים 40 גדול T אנטיגן של העכברים הטרנסגניים הוביל ליצירתו של ACMs immortalized הראשונה, בשם AT-110. המשך ההתפתחות של תאים ב- 1 הולידה HL-1 תאים, אשר לא יכולים רק להיות באופן סדרתי passaged אבל גם חוזה באופן ספונטני11. הם, לעומת זאת, מראים הבדלים מבניים ופונקציונליים לעומת תאים מבודדים טרי, כמו ultrastructure פחות מאורגנים, מופע גבוהה של פיתוח myofibrils11, ו- מופעל hyperpolarization פנימה הנוכחי12. בידודו של חדרית cardiomyocytes (VCM) אצל חולדות ועכברים ממגוון רחב של דגמים הוא וותיקה13,14,15,16,17,18 , 19. בדרך כלל, הלב נכרת הוא רכוב על מנגנון Langendorff ו retrogradely perfused עם Ca2 +-חינם מאגר המכיל אנזימי עיכול, כגון collagenases, פרוטאזות. סידן ואז מופיעה שוב בצורה stepwise לכל התנאים הפיזיולוגיים. עם זאת, למרות הפרוטוקולים המוקדש בידודו של ACMs זמין20,21, בשל פיברוזיס מוגברת והבדלים הקשורות ללחץ, התועלת שלהם מחלת דגמים עם שיפוץ פרוזדורים מוגבל.

במאמר זה, יישמנו פרוטוקול עבור בידודו של פרפור cardiomyocytes תא בודד מחיות המציגים פרפור שיפוץ (קרי, במיוחד עבור דגם עכברוש ZFS1 עבור HFpEF הקשורות מטס)22. קיימים פרוטוקולים בידוד ממוטב, כהשלמה מכשיר פשוט, בהזמנה אישית לשליטה ולשינוי הלחץ intraluminal של חללים הלב, שמוביל תשואות גבוהות של cardiomyocytes מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע. להלן כללי התנהגות מספק החוקר עם מדריך צעד אחר צעד, תיאור מפורט של הציוד בהזמנה אישית, רשימה של פתרונות, כמו גם מדריך לפתרון בעיות מקיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שאושרו על-ידי ועדת האתיקה המקומית (מס ערך מוסף T0060/15 ו- T0003-15) וביצע מסכים עם הקווים המנחים על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (המכון הלאומי לבריאות, ארה ב).

הערה: תרשים זרימה מפושטת של התהליך מוצג באיור1.

1. סידור מראש

  1. להכין את המאגרים על פי טבלה 1.
פתרון PB CB DB SB S1 S2 S3 NT
ריאגנט (מ מ)
NaCl 135 135 135 135 135 135 135 135
אשלגן כלורי 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4
2פו ח'4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
נה2HPO4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
MgSO4 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
MgCl 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10
טאורין 30 30 30 30 30 30 30
גלוקוז 10 10 10 10 10 10 10
BDM 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 1 0.01 0.125 0.25 0.5 1
BSA 150 70 70 70
אנזים מטוהרים תערובת (Thermolysin בינוני) יחידות Wünsch 0.195/mL...
יש להתאים ל- pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4
pH להתאמה 37 ° C 4 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C
pH באמצעות NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH

טבלה 1: רשימת מאגרי. חמאת בוטנים: זלוף מאגר, אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 ° C (300 מ"ל לכל חיה). CB: תעלות מאגר, אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 ° C (200 מ"ל לכל חיה). מסדי נתונים: עיכול מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (40 מ"ל לכל חיה). SB: עצירת מאגר, אשר יש לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). S1: שלב 1 מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). S2: שלב 2 מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). S3: שלב 3 מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). NT: Tyrode נורמלי, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (50 מ"ל לכל חיה).

  1. הכינו את המנגנון Langendorff (איור 2 א).
    1. לרוקן את המערכת עם 100 מ של 70% אתנול, ואחריו ריקונים 2 100 מ ל מזוקקים מים. למלא את המערכת עם 200 מ ל מאגר זלוף (PB).
    2. הגדר את קצב הזרימה של משאבת סחרור 3 mL/min.
    3. לכייל את הטמפרטורה של PB עוזבת את המנגנון Langendorff ל 39 מעלות צלזיוס.
      1. מקם את הצינורית בהזמנה אישית [16 גרם, 25 מ מ אורך, חדות קצה הסיר (איור 3 א)] על המנגנון Langendorff ולהתחיל את הזרימה. להפעיל את המודול חימום ולהתאים את הערך של מודול חימום כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה של PB בקצה הצינורית. עם סיום כיול טמפרטורה, להעביר את הצינורית בהזמנה אישית המזרק משמש את תעלות (איור 2B).
    4. הכן את התקן בקרת לחץ (איור 3C) ליד מערכת Langendorff. לטעון את המחט פרפר על גבי חצובה המלחציים והכן 3 קשרים חסימה.
      הערה: פעילות אנזים Collagenase משתנה עם הטמפרטורה. ניטור טמפרטורה של אטריום שמאל, כמו גם התאמה דינמי הימנו, נדרש בהמשך ההליך.
  2. להגדיר את ציוד הכריתה איברים של תעלות על פי איור 2B. ממלאים את הספל, מזרק, צלחת פטרי עם מאגר תעלות קר כקרח (CB) והכן את הקשרים תעלות.
  3. Heparinize העכברוש עם 500 I.U. של הפארין לכל 100 גרם של משקל הגוף של החולדה כדלקמן.
    1. לשים 2 מ ל 100% איזופלוריין תא אינדוקציה הרדמה מתאים עבור מכרסמים. העברת בת שבוע 21 ZFS-1 החולדה שמנים מן הכלוב אל התא אינדוקציה. אפשר החולדה להזין הרדמה עמוקה, המצוין על-ידי ההאטה של הנשימה מחצית תדירותו הראשונית.
    2. הסר את החולדה התא אינדוקציה. מזריקים I.U. 500 של הפארין לכל 100 גרם של משקל הגוף של החולדה לתוך הצפק באמצעות מזרק הפארין.
    3. להחזיר את החולדה לכלוב שלה ולאפשר לו כדי להתעורר.
      הערה: אין צורך לשמור על עקרות במהלך שלב 1.4. לחכות 20 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. בדיקות דם לא שלם יכולות לגרום קרישת דם, המוביל מיקרו-infarctions, אשר יכולים להשפיע באופן משמעותי את האיכות ואת התשואה של cardiomyocytes מבודד.

2. לב הכנה

  1. לשים 2 מ ל 100% איזופלוריין תא אינדוקציה הרדמה מתאים עבור מכרסמים. העברת בת שבוע 21 ZFS-1 החולדה שמנים מן הכלוב אל התא אינדוקציה. אפשר החולדה להזין הרדמה עמוקה, המצוין על-ידי ההאטה של הנשימה מחצית תדירותו הראשונית.
  2. להרדימו ע י עריפת ראשו באמצעות גיליוטינה מתאים עבור מכרסמים. שמלמדות את הגפיים של העכברוש על משטח פוליסטירן מוקצף. הרם, מסירים את העור המכסה את הסרעפת עם מספריים כירורגיים. פתח את הצפק מתחת הצלעות משני הצדדים ולחשוף את הסרעפת.
  3. פתח הסרעפת על-ידי ביצוע חתך לאורך הקשת הקדמי באמצעות מספריים משובחים. לחתוך הצלעות משני הצדדים לאורך לינאה mediaclavicularis עד העצם בריחי, באמצעות מספריים כירורגיים, כדי לחשוף את. החיץ הקרומי בתוך באתרו.
  4. הסר את הריאות בקצות דיסטלי הילה במספריים בסדר. לגזור התימוס לחשוף את קשת אבי העורקים.
  5. לצבוט את הבסיס של הלב באמצעות מלקחיים ומשוך בעדינות לכיוון הזנב של החיה. קיצור דרך אבי העורקים תוך שמירה על משיכה על הלב, השארת קטע ארוך 5 מ מ של אבי העורקים מצורף אל הלב. העבר במהירות את הלב לתוך 50 מ ל מגלן קרח במיכל 50 מ ל (איור 2B).
    הערה: במהלך השלבים 2.5-3.3, הלב הוא ביעילות בתנאים איסכמי. הימנע העולה על סך של 3 דקות על שלבים אלה כדי לא לגרום נזק cardiomyocytes.

3. תעלות

  1. חכו כ 10 s עבור הלב להירגע ולתפוס התכווצויות. להעביר את הלב לתוך צלחת פטרי המכילות 50 מ של רענן, CB קר כקרח. הסר בזהירות את רקמת שומן סביב העורקים באמצעות מלקחיים ומספריים.
  2. הכנס את הצינורית בהזמנה אישית (אותו הדבר כמו בשימוש שלב 1.2.3), אשר מצורף המזרק 10 מ"ל מלא עם CB קר כקרח, 3 מ מ לתוך העורקים. שמלמדות העורקים על גבי הצינורית על ידי קשירת אחד הקשרים תעלות שני (איור 3B) בשקע מקורב אל קצהו של הצינורית.
    הערה: יש להיזהר לא לגרום נזק את שסתום אבי העורקים על ידי חדירה עם הצינורית.
  3. בעדינות לרוקן את העורקים עם 5 מיליליטר CB כקרח באמצעות המזרק מחובר את הצינורית עד אין יותר דם מוצגת ב- העורקים הכליליים. בעדינות לעסות את אטריום שמאל באמצעות מלקחיים, להזריק את 5 מיליליטר CB, התרת דם עודף להסיר החלל לתוך הפטרי הנותרים.
  4. את הכוס השנייה תעלות (תפר: USP 3/0, משי) בשקע דיסטלי אל קצהו של הצינורית. טעינת את הצינורית עם הלב המצורפת של המזרק. לטעון את הצינורית עם לב המצורפת Langendorff באמצעות מתאם מתאים.
    הערה: פרוטוקול זה מעסיקה לחץ גבוה בחלל חדרית במהלך זלוף-המנגנון Langendorff. הקשר תעלות נוסף נדרש כדי לשמור על הלחץ הזה על ידי הימנעות כל זליגת מאגר anterograde דרך אבי העורקים.

4. לחץ מניפולציה ועיכול

  1. התחל את משאבת סחרור של המנגנון Langendorff ליזום את זלוף של רקמת הלב עם חמאת בוטנים. לקשור קשר בוהן כפול (תפר: USP 3/0, משי) הבסיס של הלב, למעט אבי העורקים. חזור על שלב זה עד האינפלציה של האטריום ימינה ושמאלה, כמו גם הסינוס הכלילי, הוא הבחין.
  2. לנקב האטריום עם מחט פרפר של התקן בקרת לחץ (איור 3D) ולאפשר האטריום להוצאת אוויר. לתפעל את הלחץ intraluminal של האטריום על-ידי התאמת גובה של הצינור פרפר. תמשיך האטריום בניפוח מעט במהלך המשך ההליך; לפקח ולכוונן בהתאם.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במהירות, כמו האינפלציה ממושך של אטריום שמאל תגרום מוות cardiomyocyte.
  3. למדוד את הטמפרטורה המשוערת של אטריום שמאל על-ידי הצבת בדיקה טמפרטורה בין מימדי החדר השמאלי. להתאים את הטמפרטורה של Langendorff חימום מודול בהתאם, מיקוד משוער בטמפרטורה של 37 ° C של אטריום שמאל.
  4. Perfuse את הלב עם PB עבור סכום כולל של 3 דקות.
  5. לעבור את זלוף מאגר עיכול (DB) למשך כ- 14 – 18 דקות.
    הערה: העיכול הושלם, כאשר המבנה פרפור השמאלי כיווץ הרקמה רוכשת את מרקם חלבי.
  6. לצבוט האטריום באמצעות מלקחיים, לחוקק משיכה קלה. הסר את אטריום שמאל באמצעות מספריים בסדר ולהעביר האטריום לתוך סירה במשקל גדול המכיל 2 מ ל לעצור את המאגר (SB), מלא השוקע הרקמה.
  7. השלך רקמת הלב הנותרים לבצע את ההנחיות של המעבדה שבו מתבצע ההליך.

5. התא עיבוד והתאמה מחדש סידן

  1. מינצ הרקמה פרפור לחתיכות קטנות של בערך 2 מ"מ x 2 מ"מ באמצעות מספריים משובחים.
  2. לפזר את הרקמה על ידי יניקה עדינה וגושים הוצאה של הרקמה באמצעות פיפטה של העברה. המשך הליך זה כ 5 דקות עד יכול להיות שנצפו דיסוציאציה מאקרוסקופית של הרקמה.
    הערה: להימנע בכל בועות אוויר במהלך שלב זה, כמו חשיפת התאים לאוויר יגרום למוות cardiomyocyte.
  3. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. לאפשר את חתיכות רקמה להסתפק העברה ס' 30 את תגובת שיקוע לתוך עוד צינור חרוטי 15 מ"ל. לאפשר את התאים להתיישב למשך 15 דקות.
  4. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 2 מ של מאגר שלב 1 (ראה טבלה 1). לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
    הערה: תגובת שיקוע שהושלכו כוללת גם fibroblasts ותאי אנדותל. עיין בפרוטוקולים אחרים אם זה רצוי להשתמש תאים אלה עבור ניסויים14,23. בגדר תכיל בעיקר פרפור cardiomyocytes, אשר יכול להיות מאושרות על ידי מיקרוסקופ אור. מאפייני cardiomyocytes פרפור מיקרוסקופיים נידונות בשלב 6.1.
  5. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 2 מ של מאגר בשלב 2. לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
  6. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 2 מ של מאגר שלב 3. לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
  7. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 250 µL של נורמלי Tyrode (NT) המכיל 1 מ Ca2 +.
  8. העברת µL 50 של Tyrode רגיל המכיל cardiomyocytes פרפור על גבי צלחת זכוכית-התחתון, אשר היה מצופה laminin 25% (להתייבש מראש). לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
  9. למלא צלחת זכוכית-התחתון µL 500 של NT המכיל 1 מ מ CaCl2.

6. הערכה תפקודית של עירור-התכווצות-מצמד

  1. להעריך את התא מורפולוגיה ואת הכדאיות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות הגדלה X 20 (איור 4A , 4B). באופן אקראי בחרו כ 100 תאים, לסווג אותם קיימא או נבאדה כדי לאמוד את הכדאיות של ההליך בידוד תאים.
    הערה: התאים קיימא מאופיינים במבנה סימטרי סרקומר היעדר קרום מגדלים פורחים, צורת מוט.
  2. לטעון את התאים עם Ca2 +-רגיש הפלורסנט בתוך 20 דקות של השלמת שלב 5.9.
    1. להוסיף 10 מיקרומטר Fluo4-בבוקר עד 500 µL של NT. להסיר תגובת שיקוע מתוך קערה מזכוכית-התחתון (מתוך שלב 5.9). הוסף את NT המכיל Fluo4-אם למנה זכוכית-התחתון. דגירה את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את הדגימה 2 x באמצעות µL 500 של NT.
  3. דמיינו Ca2 +-עירור עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדלקמן.
    1. להעביר את הצלחת התחתונה זכוכית מיקרוסקופ קונפוקלי והמחש Ca2 +-עירור עם מיקרוסקופ קונפוקלי (לייזר בעוצמה 5.8%, עירור-488 ננומטר, פליטה-515 ננומטר) באמצעות 40 X הגדלה.
    2. Perfuse התאים עם NT מחומם ל 37 ° C באמצעות מכשיר superfusion המתאים. לחלופין, לחמם את התאים באמצעות חממה של חום רכוב מיקרוסקופ
    3. לעורר את cardiomyocytes בתוך שדה חשמלי עם אלקטרודות ממריץ זמינים מסחרית, רכוב מיקרוסקופ תדירות של 1 הרץ, זרם חשמלי של 24 א להמתין 1 דקות כדי לאפשר את התאים כדי להגיע למצב יציב של Ca2 + טיפול.
    4. מקם את הסריקה קו מקביל לציר חציה, במחצית הדרך בין הגרעין לבין קצה שנבחרו באקראי, בעין בלתי מזוינת קבלנות תא. לרכוש קו לסרוק תמונות על-ידי סריקת חוזרות.
    5. השתמש בתוכנת הדמיה זמינה בחופשיות כדי לאמוד את עוצמת האות מיד לפני גירוי חשמלי (F0) על-פני התא כולו. להתוות את עוצמת האות על פני התא כולו במהלך גירוי 1 מחזור (נ). לחלק (נ) (F0) כדי לקבל את הערכים המתאימים Ca2 + ארעית.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה מפושטת של ההליך בידוד. הנוהל הוא מאוד רגיש זמן עד השלמת עיכול אנזימטי השריר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הכנת ציוד לפני הבידוד. (א) חלונית זו מציגה את מנגנון Langendorff מתוצרת עצמית: (1) כלי התגובה במקטורן עם חמאת בוטנים; (2) כלי התגובה במקטורן עם CB; (3 צימוד 3-way); (4 מזרק); (5 משאבת סחרור); (6 טבילה חימום); (7) מלכודת בועות במקטורן; ו- (8) הצינורית ואת הלב. (B) לוח זה מראה את השטויות הכריתה תעלות ו עוגב זרימת עבודה מיטביים: (1) גביע 100 מ עם 50 מ של CB הקר; (2) מזרק 10 מ"ל עם CB הקר; (3) צלחת פטרי עם CB הקר; (4) מקור אור; (5) בצינורית בהזמנה אישית עם תעלות מקמי (ראה גם להבין 3A ו- 3B); (6) מלקחיים בסדר, עקומים; (7) מלקחיים רקמות; מלקחיים בסדר (8), בזווית 45 מעלות; (9) מספריים כירורגיים בטן; (10) מספריים כירורגיים בסדר; (11) 4 x 30 G מחטים; (12) מחט 15 גרם. (C) בלוח זה מציגה בניינ מיקרוסקופ ציוד ההדמיה קונאפוקלית: אלקטרודות אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי (1); (2) עט superfusion; (3) צלחת זכוכית-התחתון עם ACMs; אלקטרודות שקוע ממריץ חשמלי פלטינה (4). (די) לוח זה מראה את השטויות מיקרוסקופ קונפוקלי ההדמיה: (1) מיקרוסקופ קונפוקלי; (2) עט superfusion; (3) מאגר מאגר superfusion; (4 וסת זרימה superfusion); (5) superfusion חימום מודול; (6 עמדות מחשב); ו- (7) אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ציוד בהזמנה אישית. (א) לוח זה מראה 15 מניפולציה בצינורית G עם מנעול סכינים סטריליים. החצים מצביעים על שתי הכניסות עבור הקשרים תעלות. (B) אלו הן התרגילים תעלות שני קשר בוהן כפול מניחים אחד על השני להידוק מהיר. החצים מצביעים ואיפה שבו סדר הקשר צריך לתגבר. (ג) לוח זה מראה המכשיר בקרת לחץ מורכבים. מחט פרפר 21 G, מחובר לבית מלחציים חצובה. . הצינור נשמרת באותו גובה כמו המחט. הבורג העליון נפתח. ניתן לשנות את גובה הצינור פרפר כפי שצוין על ידי החצים כדי לשנות את הלחץ intraluminal של אטריום שמאל. (D) שמאלה אטריום נוקב עם המכשיר בקרת לחץ תמונה זו מראה אטריום שמאל באופן אידיאלי המנופח. האליפסה מסמן את המיקום של קשר בוהן. (E) שמאלה אטריום נוקב עם המכשיר בקרת לחץ תמונה זו מראה אטריום שמאל יתר המנופח, אשר יניבו תשואה נמוכה יותר של קיימא ACMs. האליפסה מסמן את המיקום של קשר בוהן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רוב בגיל 21 שבועות, 60 – 90% של קיימא ACMs (מוערך כפי שמתואר בשלב 6.1), לאחר הסתגלות מחדש סידן (שלב 5.4 – 5.7), יכול להיות מבודד עכברים שמנים ZSF-1. בשיטה זו (איור 4A). בחולדות, ACMs מאופיינים שונה, יותר פנוטיפ heterogenous לעומת24,VCMs25. איור 4B מראה של ACM בודדים עם ממברנות שהשתמרו ומבנה סרקומר, שני אינדיקטורים חזקים של תא נפרד מבחינה פונקציונלית.

ניתן לעבד את ACMs שנרכש במגוון דרכים. כפי שהודגם באיור5, התאים עלולה להיות עמוסה צבעי פלורסנט המשמשות ללימוד מורפולוגיה ו/או פונקציה. למשל, di-8-ANEPPS שימשה ניסחו את המערכת צינורי תא עכברוש פרפור (איור 5A). בקבוצה אחרת של ניסויים, צבע אדום-זריחה רחוק מכתים המיטוכונדריה (למשל, mitotracker-אדום-FM) הוא מועסק כדי לזהות cytosolic המיטוכונדריה (איור 5B) ב שיפוץ פרוזדורים. כפי שמוצג באיור 5C, ACMs מבודדת עם פרוטוקול זה, גם הם מתאימים Ca2 + הדמיה לחיות תאים ולהראות שלם עירור-התכווצות צימוד עם 1 הרץ שדה-גירוי. כל התמונות יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף באמצעות מגוון של האלגוריתמים הזמינים ביותר חוקר6,7 (איור 5D).

Figure 4
איור 4: התשואה בהתאמה של קיימא, תא בודד אני (א) לוח זה מראה התשואה של בידוד לאחר הסתגלות מחדש של ACMs עד 1 מ מ Ca2 + ב- NT. (B) לוח זה מראה cardiomyocyte פרפור מבודדת, תא בודד. סרקומר מבנה קרום התא, גרעין הם נראים בבירור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: צביעה של עכברוש ACMs עם צבעי פלורסנט. (א) לוח זה מציג את ההכתמה של קרום התא וכן רשת צינורי עם תיוג הפלורסנט Di8ANNEPS. (B) לוח זה מראה צביעה של המיטוכונדריה עם הפלורסנט mitotracker-האדום-FM. (ג) לוח זה מראה את הסריקה קו חציה של Ca2 +-עירור עם הפלורסנט Fluo4-אם מעל לתא בודד. החצים מצביעים על גירוי חשמלי, שנערך ב 1 הרץ. (D) לוח זה מראה longitudenal Ca2 + שנחשולי נגזר לוח C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו קודם תיאר עבור בידודו של תא בודד ACMs ממודל עכברוש של המטס הקשורות HFpEF המציגה מסומן שיפוץ פרוזדורים22פרוטוקול. הנוהל הוא ייחודי מאתגר כמו רקמות שומן עודף יכול לגרום ההכנה כירורגי, כמו גם את תעלות של אבי העורקים, יותר ויותר קשה. המדריך לפתרון בעיות מסופקים כתובות בטבלה 2 הבעיות הנפוצות ביותר של ההליך בידוד.

הבעיה סיבה אפשרית פתרון
אין זרימה דרך צינור פרפר הסגר לקוי של אבי העורקים עם קשרים תעלות הסרת רקמות שומן לפני הידוק
להוסיף 3 תעלות קשר עם כניסה בהתאמה
משוך את הקשר עם היד על כוח מוגבר
מחט חסומים להסתגל עמדה לתוך לומן
חסימה על ידי משיכה עדינה עם מזרק
אטריום ימין / הסינוס הכלילי לא מנופח הסגר לקוי בבסיס הלב לחסום זרימה עם קשרים נוספים
אטריום ימין ניזוק במהלך ההכנה זליגת קרוב עם סרטונים/קשרים
עיכול / אטריום לא רך פעילות אנזים מופחתת דרך הטמפרטורה הלא נכון להתאים את הטמפרטורה עד 37 ° C
האנזים לא פעיל/מושפל החלף
זקנה/יתר שהותירה אטריום להגדיל את זמן עיכול (בשלבים של +50%)
שסתום אבי העורקים פגום חדירה רדודים במהלך תעלות
תפוקת תא המסכן אטריום יתר מתעכל לצמצם את זמן עיכול (בשלבים של +25%)
להפחית את הלחץ intraluminal על-ידי הורדת את הצינור פרפר
אטריום תחת-מעוכלים להגדיל את זמן עיכול (בשלבים של 25%)
להגביר את הלחץ intraluminal באמצעות העלאת הצינור פרפר
תא נפיצה יותר מדי אגרסיבי להיות קצת יותר עדינים

בטבלה 2: פתרון בעיות מדריך. טבלה זו מציגה בעיות נפוצות של ההליך בידוד ופתרונות המתאימים שלהם.

במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו הראו כי המודל עכברים שמנים ZFS-1 מוצגים שיפוץ פרוזדורים נרחב עם גודל פרפור מוגברת22. עלייה שמאל בגודל פרפור הוכר סמן prognostic חשוב עבור בעיות בתפקוד הדיאסטולי26 וגורמת rarefication של כלי microvascular ביחס הרקמה. זה מוביל בהתפלגות ירידה של המאגר העיכול דרך זלוף רטרוגרדית של אבי העורקים במהלך ההליך בידוד, עיבוד הבידוד תא בודד במודל זה מאתגר במיוחד. תכונות אחרות-סימן ההיכר של שיפוץ פרוזדורים, פרפור סיסטיק פיברוזיס מוגברת הוכחו על ZDF חולדות – מודל עכברוש סוכרת מטבולית, הורה אחד מזן ZFS1 חולדות27. פיקדונות קולגן לפגום את היעילות של אנזימי העיכול כדי לשחרר את cardiomyocytes מ מטריצה חוץ-תאית, לכן, דורשים יותר התאמות של הליך בידוד תא28.

המנגנון שבאמצעותו המכשיר לחץ ומקילה על התוצאות בידוד משופר במודל זה של שיפוץ פרוזדורים היא ככל הנראה הקשורות הנחתה המותאמות לשפות אחרות של זרימת הדם בעורק הכלילי של אטריום שמאל. אחד מהמרכיבים החשובים של זרימת הדם בעורק הוא לחץ זלוף כלילית, אשר מוגדר מעבר הצבע בין הלחץ עורקים לחץ דיאסטולי של חלל בהתאמה29. במהלך ההליך המתואר, סתימה של הבסיס הלב מוביל לעלייה הכללית העורק הלחץ ובלחץ intraluminal בכל רחבי הלב. הניקוב עוקבות של אטריום שמאל מקלה על טיפת מקומי, סלקטיבי intraluminal לחץ בחלל פרפור השמאלי. לפיכך, לא רק הדרגתי לחץ גדול זלוף כלילית היא הוקמה, אבל האחסון זלוף הוא גדל גם על-ידי הפתרון עיכול מוסחת מן החדר השמאלי גדוש אטריום שמאל.

בנוסף, הבחירה של אנזימי עיכול הוא קריטי עבור הבידוד ACM: טיהור תערובות אנזימים של collagenase I ו- II הוכחו להיות מעולה כדי פחות אנזימים יישוב וטהור פחות כמו collagenases30. אנזים זה אינו מאפשר רק עבור תשואה גבוהה יותר של cardiomyocytes מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע, אלא אף ממזערת את כל הצליעה של תאים בודדים לאחר הבידוד שלהם31. אנזים מטוהרים תערובות של collagenases עם dispase גבוהה נוספים או תוכן thermolysin בינוני הנפוץ ביותר עבור ומשום cardiomyocyte חולדה. בעוד VCMs הם הכי מבודד בריכוזים גבוהים, התוצאות הטובות ביותר של פרפור נייטרלים נרכשו עם ריכוז של 0.195 יחידות Wünsch/שימוש זה mL פרוטוקול32.

גם השכיחות של HFpEF הקשורות המטס עולה2 ו- cardiomyopathies פרפור המובילים כדי שיפוץ פרוזדורים, פרפור פרוזדורים נמצאים רלוונטיות קלינית גבוהה, מחקרים בתחום זה הוא עניין מרכזי. דגמים רבים של בעלי חיים חדשים עבור HFpEF מתגלים33,34 , שיפוץ עולה בקנה אחד עם שכיחות מוגברת של הפרעות קצב פרפור פרוזדורים תכונות סימן ההיכר של המחלה. השיטה המתוארת מאפשר לחוקרים לבודד קיימא cardiomyocytes יחיד מן החולדה דגמים עם שיפוץ פרוזדורים מחקר נוסף עם תשואה גבוהה במיוחד ונשמר פונקציה מכניים וחשמליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי DZHK (גרמנית מרכז למחקר קרדיו, די. בי), EKFS (Stiftung אחרת-Kröner-Fresenius, F.H.), ועל -ידי את BMBF (משרד החינוך הגרמני, מחקר), כמו גם BIH-צ'אריטה במימון תוכנית מדען קליני מאת צ'אריטה - Universitätsmedizin ברלין, ברלין מכון הבריאות (F.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZSF-1 Obese rat Charles River Laboratories, Inc. 21 weeks old
Fine Iris Scissors Fine Science Tools GmbH 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools GmbH 14001-18
Micro Dressing Forceps (curved, serrated) Aesculap, Inc. BD312R
Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) Aesculap, Inc. BD537R
Tying Forceps (angled) Aesculap, Inc. MA624R
Rodent and Small Animal Guillotine Kent Scientific Corp. DCAP
Low Cost Induction Chamber 3.0 L Kent Scientific Corp. SOMNO-0730 
Butterfly Winged Infusion Set 21 G Hospira, Inc. 181106101
Abbocath 16 G Hospira, Inc. 0G7149702
Microlance Hypodermic Needle Becton Dickinson GmbH 301300 modify needle to make cannula
Braun Original Perfusor Syringe 50 ml B. Braun Melsungen AG 8728810F
Braun Inject Solo Syringe 10 ml B. Braun Melsungen AG 2057926
Beaker 50ml Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) 21 106 17
Duroplan petri dish (100 x 20 mm) Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) 21 755 48
Seraflex Suture USP 3/0 SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG IC208000
VWR disposable Square Weighin Boats 100ml VWR, Inc. 10803-148
Styrofoam surface
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Inc. 71380
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Inc. P4504
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich, Inc. P5379
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich, Inc. S0876
Magensium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich, Inc. 230391
Magensium chloride Sigma-Aldrich, Inc. M8266
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375
Taurine Sigma-Aldrich, Inc. T0625
Glucose Sigma-Aldrich, Inc. G7528
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich, Inc. B0753
Calcium chloride solution (1 M) Sigma-Aldrich, Inc. 21115
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, Inc. A9647
Liberase Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) LIBTM-RO
Heparin Rotexmedica GmbH 3862357
Forene (Isoflurane) Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG 10182054
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich, Inc. L2020
WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm WillCo Wells B.V. HBST-3522
Fluo4 AM Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) F14201 5µM for 20min at RT
Di-8-ANNEPS Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) D3167 10µM for 45 min at 37° C 
Mitotracker RED FM Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) M22425 20nM for 30 min at 37° C
Jacketed reaction vessel 500 ml Gebr. Rettberg GmbH 107024414
Jacketed reaction vessel 1000 ml Gebr. Rettberg GmbH 107025414
Jacketed bubble trap Gebr. Rettberg GmbH 134720001
ED heating immersion circulator Julabo GmbH 9116000
Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) ISM 831
Voltcraft Thermometer 302 K/J Conrad Electronic SE 030300546
Tubing
LSM 700 microscope Carl Zeiss, Inc.
ZEN 2.3 imaging software Carl Zeiss, Inc. 410135-1011-240 
Single channel heater controller TC-324B Warner Instruments, LLC 64-2400
8 channel perfusion system Warner Instruments, LLC 64-0185
8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters Warner Instruments, LLC 64-0105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  2. International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
  3. Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
  4. Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
  5. Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
  6. Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
  7. Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
  8. Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
  9. Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
  10. Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
  11. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  12. Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  15. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
  16. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
  17. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
  18. Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
  19. Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
  20. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
  21. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
  22. Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
  23. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
  24. Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
  25. Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
  26. Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
  27. Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
  28. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  29. Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
  30. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  31. Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
  32. Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
  33. Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
  34. Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).

Tags

רפואה גיליון 137 Atrial שיפוץ HFpEF תסמונת מטבולית בידוד myocyte פרפור תפקוד לקוי של פרפור במודל חולדה
בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., … More

Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., Heinzel, F. R., Hohendanner, F. Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction. J. Vis. Exp. (137), e57953, doi:10.3791/57953 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter