Summary
यहाँ, हम का वर्णन एक अनुकूलित, Langendorff-आधारित प्रक्रिया एकल सेल अलिंद cardiomyocytes के एक चूहे के मॉडल से चयापचय सिंड्रोम के साथ संबंधित दिल की विफलता संरक्षित बेदखली अंश के साथ. हृदय गुहाओं के intraluminal दबाव के एक मैनुअल विनियमन कार्यात्मक बरकरार myocytes उत्तेजना-संकुचन-युग्मन अध्ययन के लिए उपयुक्त उपज के लिए लागू किया जाता है ।
Abstract
इस अनुच्छेद में, हम एक अनुकूलित, Langendorff-आधारित प्रक्रिया के अलगाव के लिए एकल सेल अलिंद cardiomyocytes (ACMs) चयापचय सिंड्रोम (मेट्स) के एक चूहे के मॉडल से-संरक्षित इंजेक्शन अंश (HFpEF) के साथ संबंधित दिल की विफलता का वर्णन । मेट्स से संबंधित HFpEF की व्यापकता बढ़ रही है, और अलिंद remodeling और अलिंद अलिंद के साथ जुड़े अलिंद cardiomyopathies चिकित्सकीय बेहद प्रासंगिक है के रूप में अलिंद remodeling मृत्यु दर का एक स्वतंत्र कारक है । पृथक एकल सेल cardiomyocytes के साथ अध्ययन अक्सर पुष्ट और vivo निष्कर्षों में पूरक करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । संचार पोत rarefication और मध्य ऊतक फाइब्रोसिस इस रोग के पशु मॉडलों से ACMs के सफल एकल सेल अलगाव के लिए एक संभावित सीमित कारक मुद्रा ।
हम एक डिवाइस मैंयुअल रूप से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान हृदय गुहाओं के intraluminal दबाव को विनियमित करने में सक्षम है, काफी आकृति विज्ञान की उपज में वृद्धि और कार्यात्मक बरकरार ACMs को रोजगार के द्वारा इस मुद्दे को संबोधित किया है । प्राप्त कोशिकाओं को विभिन्न प्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कोशिका संस्कृति और कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग (यानी, उत्तेजना-संकुचन-युग्मन).
हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल, अनुकूलित समाधान की एक सूची, आवश्यक उपकरण तैयार करने के लिए पूरी तरह से निर्देश, और एक व्यापक समस्या निवारण गाइड के साथ शोधकर्ता प्रदान करते हैं । हालांकि प्रक्रिया के प्रारंभिक कार्यांवयन के बजाय मुश्किल हो सकता है, एक सफल अनुकूलन पाठक राज्य के-the-कला ACM अलगाव मेट्स के एक चूहे के मॉडल में प्रदर्शन करने की अनुमति होगी प्रयोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए HFpEF संबंधित ।
Introduction
मेट्स मधुमेह प्रकार के लिए जोखिम कारकों में से एक क्लस्टर का वर्णन-2 और हृदय रोग और एक वृद्धि हुई धमनी रक्तचाप भी शामिल है, डिसलिपिडेमिया (ट्राइग्लिसराइड्स उठाया और उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन कोलेस्ट्रॉल कम), उपवास बढ़ा ग्लूकोज, और मध्य मोटापा1. मेट्स के विश्वव्यापी प्रसार के लिए 25-30% और लगातार2बढ़ती अनुमानित है । HFpEF एक heterogenous नैदानिक सिंड्रोम अक्सर मेट्स के साथ जुड़ा हुआ है । HFpEF और उसके पूर्ववर्ती चरणों (यानी, ग्रस्त हृदय रोग) के दौरान कार्डियक remodeling भी atria3के एक remodeling के साथ है । कम सिकुड़ा समारोह और वाम atrium के संरचनात्मक परिवर्तन वृद्धि हुई मृत्यु दर, अलिंद अलिंद, और नई शुरुआत दिल असफलता4के साथ जुड़े रहे हैं । अलिंद remodeling आयन चैनल समारोह में परिवर्तन की विशेषता है, Ca2 + homeostasis, अलिंद संरचना, fibroblast सक्रियण, और ऊतक फाइब्रोसिस5. मेट्स-संबंधित HFpEF और उसके अंतर्निहित रोग तंत्र में अलिंद remodeling वाम अभी भी खराब समझ रहे है और एक और गहराई से जांच की आवश्यकता होती है । पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान उपकरण साबित हो गया है और अलिंद cardiomyopathies6,7,8,9के क्षेत्र में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व ।
पृथक एकल सेल cardiomyocytes के साथ अध्ययन अक्सर पुष्ट और vivo निष्कर्षों में पूरक करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । एक अलगाव, और संभावित बाद सेल संस्कृति, संकेत रास्ते की जांच के लिए अनुमति, ईओण चैनल धाराओं, और उत्तेजना-संकुचन-युग्मन । शारीरिक शर्तों के तहत, cardiomyocytes मत पैदा करना । एक अलिंद natriuretic कारक के transcriptional विनियामक अनुक्रम और ट्रांसजेनिक चूहों में एक simian वायरस ४० बड़े टी प्रतिजन के बीच फ्यूजन पहली अमर ACMs के निर्माण के लिए नेतृत्व किया, पर-110नाम. एटी-१ कोशिकाओं के आगे विकास ने एचएल-१ की कोशिकाओं को जन्म दिया, जो केवल प्रश्नपत्र ही नहीं हो सकता लेकिन यह भी अनुबंध अनायास11. वे करते हैं, तथापि, इस तरह के एक कम संगठित ultrastructure, myofibrils11के विकास की एक उच्च घटना के रूप में ताजा अलग कोशिकाओं की तुलना में संरचनात्मक और कार्यात्मक मतभेदों को दिखाने के लिए, और एक hyperpolarization आवक वर्तमान12सक्रिय । एक किस्म के मॉडलों से चूहों और चूहों में वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (VCM) का अलगाव अच्छी तरह से स्थापित है13,14,15,16,17,18 , 19. आम तौर पर, आबकारी दिल एक Langendorff तंत्र के लिए मुहिम शुरू की है और एक Ca2 +मुक्त बफर जैसे collagenases और teases के रूप में पाचन एंजाइमों, युक्त के साथ प्रतिगामी perfused । कैल्शियम तो शारीरिक स्थितियों के लिए एक stepwise तरीके से फिर से शुरू है । हालांकि, भले ही ACMs के अलगाव के लिए समर्पित प्रोटोकॉल उपलब्ध है20,21, वृद्धि की फाइब्रोसिस और दबाव से संबंधित मतभेदों के कारण, अलिंद remodeling के साथ रोग मॉडल में उनकी उपयोगिता सीमित है ।
इस अनुच्छेद में, हम अलिंद एकल के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल लागू किया है-सेल cardiomyocytes जानवरों से है कि दिखाने के अलिंद remodeling (यानी, विशेष रूप से मेट्स के लिए ZFS1 चूहा मॉडल के लिए HFpEF से संबंधित)22। मौजूदा अलगाव प्रोटोकॉल को अनुकूलित और हृदय गुहाओं के intraluminal दबाव को नियंत्रित करने और संशोधित करने के लिए एक सरल, कस्टम-मेड डिवाइस द्वारा पूरित किया गया, आकृति विज्ञान की उच्च पैदावार और कार्यात्मक बरकरार cardiomyocytes के लिए अग्रणी । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक कदम दर कदम गाइड के साथ शोधकर्ता प्रदान करता है, कस्टम-निर्मित उपकरण, समाधान की एक सूची, साथ ही एक व्यापक समस्या निवारण गाइड का एक विस्तृत विवरण.
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Protocol
सभी प्रयोगों स्थानीय नैतिकता समिति (TVA T0060/15 और T0003-15) द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के साथ समझौते में प्रदर्शन (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, संयुक्त राज्य अमेरिका).
नोट: प्रक्रिया का एक सरलीकृत फ़्लोचार्ट आरेख 1में दिखाया गया है ।
1. प्रबंध
- तालिका 1 के अनुसार बफ़र्स तैयार करें ।
| समाधान | पंजाब | सीबी | Db | Sb | S1 | S2 | S3 | Nt | |
| एजेंट (मिमी) | |||||||||
| Nacl | १३५ | १३५ | १३५ | १३५ | १३५ | १३५ | १३५ | १३५ | |
| KCl | ४.७ | ४.७ | ४.७ | ४.७ | ४.७ | ४.७ | ४.७ | 4 | |
| KH2पो4 | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ||
| ना2HPO4 | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ०.६ | ||
| MgSO4 | १.२ | १.२ | १.२ | १.२ | १.२ | १.२ | १.२ | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurine | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| ग्लूकोज | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| Bdm | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl२ | 1 | ०.०१ | ०.१२५ | ०.२५ | ०.५ | 1 | |||
| Bsa | १५० | ७० | ७० | ७० | |||||
| शुद्ध एंजाइम ब्लेंड (मीडियम Thermolysin) | ०.१९५ Wünsch यूनिट्स एमएल/ | ||||||||
| पीएच समायोजित करने के लिए | ७.४ | ७.४ | ७.४ | ७.४ | ७.४ | ७.४ | ७.४ | ७.४ | |
| पर समायोजित पीएच | ३७ ° c | 4 ° c | ३७ ° c | ३७ ° c | ३७ ° c | ३७ ° c | ३७ ° c | ३७ ° c | |
| पीएच के साथ समायोजित | Naoh | Naoh | Naoh | Naoh | Naoh | Naoh | Naoh | Naoh |
तालिका 1: बफ़र्स की सूची । पंजाब: छिड़काव बफर, जो 4 डिग्री सेल्सियस (पशु प्रति ३०० मिलीलीटर) में 3 दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है । सीबी: cannulation बफर, जो 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (पशु प्रति २०० मिलीलीटर) में संग्रहित किया जा सकता है । DB: पाचन बफर, जो दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए है (प्रति पशु ४० मिलीलीटर) । SB: रोक बफर, जो दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए है (पशु प्रति 2 मिलीलीटर). s: 1 चरण बफर, जो दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए है (पशु प्रति 2 मिलीलीटर). S2: चरण 2 बफर, जो दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए है (पशु प्रति 2 मिलीलीटर) । S3: चरण 3 बफर, जो दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए है (प्रति पशु 2 मिलीलीटर). NT: सामांय Tyrode, जो दिन के भीतर इस्तेमाल किया जाना है (प्रति पशु ५० मिलीलीटर) ।
-
Langendorff उपकरण (चित्रा 2a) तैयार करें ।
- ७०% इथेनॉल के १०० मिलीलीटर के साथ प्रणाली फ्लश, १०० मिलीलीटर आसुत जल के 2 flushes द्वारा पीछा किया । छिड़काव बफर (पंजाब) के २०० मिलीलीटर के साथ प्रणाली भरें ।
- सिकुड़नेवाला पम्प की प्रवाह दर को 3 मिलीलीटर/
- ३९ डिग्री सेल्सियस के लिए Langendorff तंत्र छोड़ने पंजाब के तापमान जांचना ।
- Langendorff उपकरण के शीर्ष पर कस्टम-निर्मित प्रवेशनी [16 ग्राम, 25 मिमी लंबी, तीव्र टिप हटा दिया गया (चित्रा 3)] प्लेस और प्रवाह शुरू करते हैं । हीटिंग मॉड्यूल को चालू करें और प्रवेशनी की नोक पर पंजाब के वांछित तापमान तक पहुंचने के लिए हीटिंग मॉड्यूल के मूल्य को समायोजित करें । एक बार तापमान अंशांकन पूरा हो गया है, cannulation (चित्रा बी) के लिए इस्तेमाल किया सिरिंज के लिए कस्टम निर्मित प्रवेशनी चाल.
- दबाव नियंत्रण डिवाइस (चित्रा 3सी) Langendorff प्रणाली के बगल में तैयार करें । तिपाई दबाना पर तितली सुई माउंट और 3 अवरुद्ध समुद्री मील तैयार करते हैं ।
नोट: Collagenase एंजाइम गतिविधि तापमान के साथ बदलता रहता है । बाईं atrium के तापमान की निगरानी, साथ ही साथ एक गतिशील समायोजन, प्रक्रिया में बाद में आवश्यक है ।
- अंग उत्पाद शुल्क और चित्रा बीके अनुसार cannulation के लिए उपकरण सेट करें । एक आइस-कोल्ड cannulation बफर (CB) के साथ यूरिन, सिरिंज, और पेट्री डिश को भरें और cannulation नॉट तैयार करें ।
-
चूहे के शरीर के वजन के १०० ग्राम प्रति हेपरिन के ५०० I.U. के साथ चूहा Heparinize इस प्रकार है ।
- एक संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर कुतर के लिए उपयुक्त में १००% isoflurane के 2 मिलीलीटर रखो । 21 सप् ताह पुराने ZFS-1 मोटे चूहे को पिंजरे से बाहर कर इंडक्शन चैंबर में ट्रांसफर कर देना । चूहे गहरी संज्ञाहरण में प्रवेश करने की अनुमति दें, अपनी प्रारंभिक आवृत्ति के आधे से सांस लेने की एक मंदी द्वारा संकेत दिया ।
- इंडक्शन चैंबर से चूहे निकाले । एक हेपरिन सिरिंज का उपयोग कर हेपरिन में चूहे के शरीर के वजन के १०० ग्राम प्रति ५०० I.U. सुई ।
- अपने पिंजरे में चूहे लौटें और इसे जगाने के लिए अनुमति देते हैं ।
नोट: यह कदम १.४ के दौरान बाँझ बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं है. अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें । एक अधूरा एंटिकोगुलेशन रक्त के थक्के पैदा कर सकता है, सूक्ष्म infarctions के लिए अग्रणी, जो काफी हद तक अलग cardiomyocytes की गुणवत्ता और उपज को प्रभावित कर सकते हैं ।
2. दिल की तैयारी
- एक संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर कुतर के लिए उपयुक्त में १००% isoflurane के 2 मिलीलीटर रखो । 21 सप् ताह पुराने ZFS-1 मोटे चूहे को पिंजरे से बाहर कर इंडक्शन चैंबर में ट्रांसफर कर देना । चूहे गहरी संज्ञाहरण में प्रवेश करने की अनुमति दें, अपनी प्रारंभिक आवृत्ति के आधे से सांस लेने की एक मंदी द्वारा संकेत दिया ।
- Euthanize पशु को कुतर के लिए उपयुक्त गिलोटिन का प्रयोग करके decapitation । एक polystyrene फोम सतह पर चूहे के अंग निर्धारण । लिफ्ट और शल्य कैंची के साथ असिरूप प्रक्रिया को कवर त्वचा को हटा दें । दोनों पक्षों पर रिब पिंजरों के नीचे एक आँख खोलने और डायाफ्राम बेनकाब ।
- ठीक कैंची का उपयोग पूर्वकाल चाप के साथ एक चीरा बनाने के द्वारा डायाफ्राम खोलें । clavicular हड्डी के लिए लीनिया mediaclavicularis के साथ दोनों पक्षों पर पसलियों के माध्यम से कटौती, शल्य कैंची का उपयोग, सीटू मेंमध्यावकाश को बेनकाब करने के लिए.
- ठीक कैंची के साथ hila के बाहर के सिरों पर फेफड़ों निकालें । महाधमनी आर्क को बेनकाब करने के लिए थाइमस को काट लें ।
- संदंश का उपयोग कर दिल के आधार चुटकी और धीरे जानवर की पूंछ की ओर नीचे खींच । दिल पर एक पुल बनाए रखते हुए महाधमनी भर में कटौती, दिल से जुड़ी महाधमनी के एक 5 मिमी लंबे खंड छोड़ने. जल्दी से ५० मिलीलीटर चोंच (चित्रा बी) में ५० मिलीलीटर बर्फ ठंड सीबी में दिल हस्तांतरण ।
नोट: कदम के दौरान 2.5 – 3.3, दिल कोरोनरी स्थितियों में प्रभावी ढंग से है. cardiomyocytes को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए इन चरणों के लिए 3 मिनट की कुल से अधिक से बचें ।
3. Cannulation
- दिल के लिए लगभग 10 एस रुको शांत और संकुचन जब्त । एक पेट्री डिश में दिल ताजा, बर्फ की ५० मिलीलीटर युक्त स्थानांतरण-शीत सीबी । ध्यान से फैटी संदंश और कैंची का उपयोग कर महाधमनी आसपास के ऊतकों को हटा दें ।
- संमिलित कस्टम-बनाया प्रवेशनी (चरण 1.2.3 में उपयोग के रूप में एक ही) है, जो 10 मिलीलीटर बर्फ से भरा सिरिंज, ठंड सीबी, महाधमनी में 3 मिमी से जुड़ा हुआ है । प्रवेशनी की नोक के लिए समीपस्थ इंडेंट में दो cannulation समुद्री मील (चित्रा बी) में से एक को बांधने के द्वारा प्रवेशनी पर महाधमनी निर्धारण ।
नोट: प्रवेशनी के साथ एक पैठ द्वारा महाधमनी वाल्व को नुकसान नहीं सावधान रहना । - धीरे बर्फ के 5 मिलीलीटर के साथ महाधमनी फ्लश-ठंड सीबी प्रवेशनी से जुड़ी सिरिंज का उपयोग कर जब तक कोई और अधिक रक्त कोरोनरी धमनियों में दिखाई दे रहा है । धीरे संदंश का उपयोग कर छोड़ दिया atrium मालिश और सीबी के शेष 5 मिलीलीटर सुई, किसी भी अतिरिक्त रक्त के लिए अनुमति पेट्री पकवान में गुहा से हटा दिया जाएगा ।
- दूसरी cannulation गाँठ टाई (टांका: खासियत 3/0, रेशम) प्रवेशनी की नोक से बाहर इंडेंटेशन में । सिरिंज से संलग्न दिल के साथ प्रवेशनी अनमाउंट. एक उपयुक्त अनुकूलक का उपयोग कर Langendorff को संलग्न दिल के साथ प्रवेशनी माउंट ।
नोट: इस प्रोटोकॉल Langendorff तंत्र में छिड़काव के दौरान वेंट्रिकुलर गुहा में ऊंचा दबाव को रोजगार । अतिरिक्त cannulation गाँठ महाधमनी के माध्यम से किसी भी anterograde बफर रिसाव से बचने के इस दबाव को बनाए रखने के लिए आवश्यक है.
4. दबाव हेरफेर और पाचन
- Langendorff तंत्र के सिकुड़नेवाला पंप शुरू करने के लिए पंजाब के साथ कार्डियक ऊतक के छिड़काव शुरू । टाई एक डबल हाथ गांठ (टांका: खासियत 3/0, रेशम) दिल के आधार के आसपास, महाधमनी को छोड़कर । इस कदम को दोहराने जब तक सही और बाएं atrium की मुद्रास्फीति, साथ ही कोरोनरी साइनस, ध्यान दिया है ।
- दबाव नियंत्रण डिवाइस (चित्रा 3 डी) की तितली सुई के साथ atrium पंचर और atrium खंडन करने के लिए अनुमति देते हैं । हेर तितली नली की ऊंचाई को एडजस्ट करके atrium के intraluminal प्रेशर को बढ़ाते हैं । atrium थोड़ा प्रक्रिया के बाकी भर में फुलाया रखें; मॉनिटर और तदनुसार समायोजित करें ।
नोट: इस कदम को तेजी से प्रदर्शन की जरूरत है, के रूप में छोड़ दिया atrium की लंबी मुद्रास्फीति cardiomyocyte मौत में परिणाम होगा । - बाएँ atrium और बाएँ निलय के बीच एक तापमान जांच स्थिति से बाएँ atrium के अनुमानित तापमान को मापने. तदनुसार Langendorff हीटिंग मॉड्यूल के तापमान को समायोजित करें, बाईं atrium के ३७ ° c के एक अनुमानित तापमान लक्ष्यीकरण ।
- Perfuse 3 मिनट की कुल के लिए पंजाब के साथ दिल ।
- छिड़काव एक पाचन बफर (DB) के लिए लगभग 14-18 मिनट के लिए स्विच करें ।
ध्यान दें: पाचन जब वाम अलिंद संरचना गिर जाता है और ऊतक एक दूधिया बनावट प्राप्त पूरा हो गया है । - संदंश का उपयोग कर atrium चुटकी और एक मामूली खींचतान अधिनियमित । बाएं atrium ठीक कैंची का उपयोग कर निकालें और एक बड़े वजन के 2 मिलीलीटर रोकने बफर (SB), पूरी तरह से ऊतक के विलय से युक्त नाव में atrium हस्तांतरण ।
- शेष हृदय ऊतक के निपटान प्रयोगशाला के दिशा निर्देशों के बाद जहां प्रक्रिया की जाती है ।
5. सेल प्रोसेसिंग और कैल्शियम पुनः अनुकूलन
- मोटे तौर पर 2 मिमी x 2 ठीक कैंची का उपयोग कर मिमी के छोटे टुकड़ों में अलिंद ऊतक कीमा ।
- एक कोमल चूषण द्वारा ऊतक फैलाने और एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर ऊतक के हिस्से की बेदखली । ऊतक के एक macroscopic पृथक्करण मनाया जा सकता है जब तक लगभग 5 मिनट के लिए इस प्रक्रिया को जारी रखें ।
नोट: इस कदम के दौरान किसी भी हवाई बुलबुले से बचें, के रूप में हवा के लिए कोशिकाओं को उजागर cardiomyocyte मौत में परिणाम होगा । - कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब स्थानांतरण । ऊतक हिस्सा 30 एस के लिए बसने के लिए अनुमति दें एक और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में supernatant हस्तांतरण । कक्षों को 15 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
- supernatant को निकालें और छोड़ें । चरण 1 बफ़र के 2 मिलीलीटर जोड़ें ( तालिका 1देखें) । cardiomyocytes 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें ।
नोट: छोड़े गए supernatant में fibroblasts और endothelial कक्ष भी शामिल हैं । अगर यह प्रयोग14,23के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करना वांछित है कृपया अंय प्रोटोकॉल को देखें । गोली ज्यादातर अलिंद cardiomyocytes, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जा सकती है शामिल होंगे । अलिंद cardiomyocytes की सूक्ष्म विशेषताओं चरण ६.१ में चर्चा कर रहे हैं । - supernatant को निकालें और छोड़ें । 2 मिलीलीटर चरण 2 बफ़र जोड़ें । cardiomyocytes 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें ।
- supernatant को निकालें और छोड़ें । चरण 3 बफ़र के 2 मिलीलीटर जोड़ें । cardiomyocytes 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें ।
- supernatant को निकालें और छोड़ें । 1 मिमी Ca2 +युक्त सामान्य Tyrode (NT) के २५० µ एल जोड़ें.
- स्थानांतरण ५० µ सामांय Tyrode के एल एक गिलास नीचे पकवान, जो 25% laminin के साथ लेपित किया गया है पर अलिंद cardiomyocytes युक्त (और पहले से शुष्क करने की अनुमति दी) । cardiomyocytes 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें ।
- 1 मिमी CaCl2युक्त NT के ५०० µ एल के साथ एक गिलास नीचे पकवान भरें ।
6. उत्तेजना के कार्यात्मक मूल्यांकन-संकुचन-युग्मन
- एक 20X आवर्धन (चित्रा 4a और 4B) का उपयोग कर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें । बेतरतीब ढंग से लगभग १०० कोशिकाओं का चयन करें और उंहें वर्गीकृत के रूप में या तो व्यवहार्य या व्यवहार्य के क्रम में सेल अलगाव की प्रक्रिया की व्यवहार्यता का अनुमान है ।
नोट: व्यवहार्य कोशिकाओं सममित sarcomere संरचना, झिल्ली blebs के अभाव, और एक रॉड आकार की विशेषता है । -
५.९ कदम पूरा करने के 20 मिनट के भीतर सीए2 +-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोशिकाओं लोड ।
- जोड़ 10 µ m Fluo4-एएम के ५०० µ l को NT. supernatant को शीशे के नीचे डिश (स्टेप से ५.९) से हटा दें । NT युक्त Fluo4-हूं गिलास नीचे पकवान में जोड़ें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन । supernatant को निकालें और छोड़ें । धो नमूना 2x NT के ५०० µ एल का उपयोग कर ।
-
इस प्रकार के रूप में एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ Ca2 +-उत्तेजना कल्पना ।
- एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए ग्लास नीचे पकवान हस्तांतरण और एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ सीए2 +-उत्तेजना कल्पना (५.८% पर लेजर तीव्रता, ४८८ एनएम पर उत्तेजना, ५१५ एनएम उत्सर्जन) एक 40X आवर्धन का उपयोग कर ।
- Perfuse ३७ एक उपयुक्त superfusion डिवाइस का उपयोग कर ° c NT के साथ कोशिकाओं को गरम करें । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को गर्म एक खुर्दबीन-हीट मशीन मुहिम का उपयोग कर रखो ।
- एक बिजली के क्षेत्र में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, माइक्रोस्कोप-घुड़सवार उत्तेजित करता है 1 हर्ट्ज की एक आवृत्ति और 24 ए के एक बिजली के वर्तमान के साथ cardiomyocytes को उत्तेजित 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए कोशिकाओं के एक स्थिर-राज्य तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के लिए सीए2 + हैंडलिंग ।
- आड़ा अक्ष के समानांतर स्कैन लाइन प्लेस, नाभिक और एक बेतरतीब ढंग से चयनित, macroscopically करार सेल के किनारे के बीच आधा रास्ता । दोहराए जाने वाली स्कैनिंग द्वारा लाइन स्कैन छवियां प्राप्त करें ।
- पूरी सेल में एक बिजली की उत्तेजना (एफ0) से पहले तुरंत सिग्नल तीव्रता का अनुमान लगाने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । 1 उत्तेजना चक्र (एफ) के पाठ्यक्रम पर पूरे सेल भर में संकेत तीव्रता प्लाट । (f) (f0) द्वारा विभाजित संबंधित Ca2 + क्षणिक प्राप्त करने के लिए ।
चित्र 1: आइसोलेशन प्रक्रिया का सरलीकृत फ़्लोचार्ट । प्रक्रिया अत्यधिक समय के प्रति संवेदनशील है जब तक myocytes के एंजाइमी पाचन पूरा हो गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: अलगाव से पहले उपकरणों की तैयारी । (क) यह पैनल एक स्व-निर्मित Langendorff उपकरण से पता चलता है: (1) पंजाब के साथ एक जैकेट रिएक्शन पोत; (2) सीबी के साथ एक जैकेट रिएक्शन पोत; (3) a 3-way टोंटी; (4) एक सिरिंज; (५) एक सिकुड़नेवाला पंप; (6) एक ताप विसर्जन; (7) एक जैकेट बुलबुला जाल; और (8) प्रवेशनी और दिल । (ख) यह पैनल एक अनुकूलित कार्य प्रवाह के लिए cannulation और अंग उत्पाद शुल्क के लिए सेट-अप दिखाता है: (1) ५० मिलीलीटर बर्फ के साथ एक १०० मिलीलीटर चोंच-शीत सीबी; (2) बर्फ के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज-शीत सीबी; (3) बर्फ के साथ एक पेट्री डिश-शीत सीबी; (4) एक प्रकाश स्रोत; (5) कस्टम-एक cannulation गाँठ के साथ प्रवेशनी बनाया (यह भी चित्र 3 ए और 4 बीदेखें); (६) ठीक, घुमावदार संदंश; (7) टिशू संदंश; (8) महीन संदंश, angled ४५ °; (9) उदर शल्य कैंची; (10) ठीक सर्जिकल कैंची; (11) 4 x 30 ग्राम सुई; और (12) एक 15 ग्राम सुई । (ग) इस पैनल के लिए माइक्रोस्कोप-घुड़सवार उपकरण से पता चलता है फोकल इमेजिंग के लिए: (1) बिजली उत्तेजक इलेक्ट्रोड; (2) अ superfusion पेन; (3) ACMs के साथ एक गिलास नीचे पकवान; और (4) डूबे प्लेटिनम इलेक्ट्रिक उत्तेजित इलेक्ट्रोड । (घ) इस पैनल के फोकल इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेट अप से पता चलता है: (1) फोकल माइक्रोस्कोप; (2) अ superfusion पेन; (३) एक superfusion बफर जलाशय; (4) एक superfusion प्रवाह नियामक; (5) एक superfusion हीटिंग मॉड्यूल; (6) एक कंप्यूटर कार्य केंद्र; और (7) एक बिजली के उत्तेजक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: कस्टम-निर्मित उपकरण । (क) यह पैनल एक Luer लॉक के साथ हेर १५ जी प्रवेशनी को दिखाता है. तीर cannulation समुद्री मील के लिए दो इंडेंट का संकेत है । (ख) ये cannulation गाँठें हैं, तेजी से कसने के लिए एक-दूसरे के ऊपर रखे दो दोहरे हाथ गाँठें. तीरों से संकेत मिलता है कि कहाँ और किस क्रम में गाँठ को कसने की आवश्यकता है. (ग) इस पैनल के इकट्ठे दबाव नियंत्रण उपकरण से पता चलता है । एक 21 जी तितली सुई एक तिपाई दबाना में झुका हुआ है । नली को सुई की तरह ही ऊँचाई पर रखा जाता है. पेंच टॉप खोल दिया है । तितली नली की ऊंचाई के रूप में तीर से संकेत दिया क्रम में छोड़ atrium के intraluminal दबाव बदलने के लिए बदला जा सकता है । (घ) वाम atrium दबाव नियंत्रण उपकरण के साथ पंचर है । यह तस्वीर एक आदर्श फुलाया छोड़ atrium से पता चलता है । दीर्घवृत्त के स्थान पर हाथ की गाँठ के निशान हैं. (ङ) बायां atrium दबाव नियंत्रण उपकरण के साथ पंचर हो जाता है । इस तस्वीर से पता चलता है एक से अधिक फुलाया वाम atrium, जो व्यवहार्य ACMs की एक कम उपज में परिणाम होगा । दीर्घवृत्त के स्थान पर हाथ की गाँठ के निशान हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Representative Results
उंर के 21 सप्ताह, 60-व्यवहार्य ACMs के 90% से कम (६.१ कदम में वर्णित के रूप में अनुमान), के बाद कैल्शियम पुनः अनुकूलन (5.4 कदम-5.7), ZSF से अलग किया जा सकता है-1 इस विधि से मोटापे से ग्रस्त चूहों (चित्रा 4a) । चूहों में, ACMs VCMs24,25की तुलना में एक अलग और अधिक heterogenous phenotype की विशेषता है । चित्रा 4B संरक्षित झिल्ली और sarcomere संरचना, दोनों एक कार्यात्मक अभिंन कोशिका के मजबूत संकेतक के साथ एक व्यक्तिगत ACM से पता चलता है ।
अधिग्रहित ACMs को कई तरह से प्रोसेस किया जा सकता है । चित्र 5में उदाहरण के रूप में, कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रंगों की आकृति विज्ञान और/या समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल के साथ लोड किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, di-8-ANEPPS एक अलिंद चूहा सेल में ट्यूबलर प्रणाली चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (आंकड़ा 5 ए). प्रयोगों के एक और सेट में, mitochondria-अब तक लाल-प्रतिदीप्ति डाई (जैसे, mitotracker-red-FM) का पता लगाने के लिए कार्यरत है cytosolic mitochondria (चित्रा 5B) अलिंद remodeling में । चित्रा 5Cमें दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल के साथ अलग ACMs भी रहते हैं-सेल सीए2 + इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं और एक 1 हर्ट्ज क्षेत्र उत्तेजना के साथ बरकरार उत्तेजना-संकुचन युग्मन दिखाते हैं. सभी छवियों शोधकर्ता6,7 (चित्रा 5d) के लिए उपलब्ध एल्गोरिदम की एक किस्म का उपयोग कर आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्रा 4: व्यवहार्य, एकल सेल के संबंधित उपज हूं । (क) यह पैनल ACMs के पुनः अनुकूलन के बाद एक अलगाव की उपज से पता चलता है 1 मिमी Ca2 + NT में । (ख) यह पैनल एक पृथक, एकल-कोशिका अलिंद cardiomyocyte को दिखाता है. sarcomere संरचना, कोशिका झिल्ली, और नाभिक स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: फ्लोरोसेंट रंगों के साथ चूहे ACMs के दाग । (क) इस पैनल फ्लोरोसेंट डाई Di8ANNEPS के साथ एक कोशिका झिल्ली और ट्यूबलर नेटवर्क के दाग से पता चलता है । (ख) इस पैनल फ्लोरोसेंट डाई mitotracker-लाल एफएम के साथ mitochondria के दाग से पता चलता है । (ग) इस पैनल के आड़ा लाइन स्कैन से पता चलता है एक Ca2 +-उत्तेजना के साथ फ्लोरोसेंट डाई Fluo4-हूं एक ही कक्ष पर । तीर 1 हर्ट्ज पर आयोजित विद्युत उत्तेजना, संकेत मिलता है. (घ) इस पैनल longitudenal Ca2 + पैनल सीसे व्युत्पंन यात्रियों से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां, हम पहले एकल सेल ACMs के अलगाव के लिए एक मेट्स के एक चूहे मॉडल से संबंधित HFpEF कि पता चलता है के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णित अलिंद remodeling22। प्रक्रिया अत्यधिक फैटी ऊतक शल्य तैयारी कर सकते हैं के रूप में विशिष्ट रूप से चुनौतीपूर्ण है, साथ ही महाधमनी के cannulation, तेजी से मुश्किल. समस्या निवारण मार्गदर्शिका तालिका 2 में प्रदान की गई आइसोलेशन प्रक्रिया की सबसे सामान्य समस्याओं को हल करता है ।
| समस्या | संभावित कारण | समाधान |
| तितली नली के माध्यम से कोई प्रवाह | cannulation समुद्री मील के साथ महाधमनी के अनुचित बंद | कस से पहले फैटी ऊतक निकालें |
| संबंधित इंडेंट के साथ 3 cannulation गाँठ जोड़ें | ||
| बढ़े बल के लिए हाथ से खींचो गाँठ | ||
| अवरुद्ध सुई | लुमेन में स्थिति को फिर से समायोजित | |
| सिरिंज के साथ कोमल खींचो द्वारा अनवरोधित | ||
| Right atrium/कोरोनरी साइनस फुलाया नहीं | हृदय के आधार को अनुचित ढंग से बंद करना | अतिरिक्त समुद्री मील के साथ ब्लॉक प्रवाह |
| तैयारी के दौरान सही atrium क्षतिग्रस्त | क्लिप के साथ बंद रिसाव/ | |
| गरीब पाचन/atrium नरम नहीं करता है | गलत तापमान के माध्यम से कम एंजाइम गतिविधि | ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान समायोजित |
| निष्क्रिय/ | बदलें | |
| Old/ओवरआल fibrotic atrium | पाचन समय बढ़ाएं (के चरणों में + ५०%) | |
| क्षतिग्रस्त महाधमनी वाल्व | cannulation के दौरान उथले पैठ | |
| खराब सेल यील्ड | Atrium-पच | कम पाचन समय (के चरणों में + 25%) |
| तितली की नली कम करके intraluminal प्रेशर को कम करें | ||
| Atrium-पच | पाचन समय में वृद्धि (25% के चरणों में) | |
| तितली नली की स्थापना से intraluminal दबाव बढ़ाएं | ||
| सेल का फैलाव भी आक्रामक | अधिक कोमल हो |
तालिका 2: मार्गदर्शिका समस्या निवारण । यह तालिका आइसोलेशन प्रक्रिया और उनके संबंधित समाधानों की सामान्य समस्याएँ प्रदर्शित करती है.
हाल के एक अध्ययन में, हमें पता चला है कि ZFS-1 मोटापे से ग्रस्त चूहे मॉडल एक वृद्धि हुई अलिंद आकार के साथ व्यापक अलिंद remodeling प्रदर्शित करता है22। बाएं अलिंद आकार में वृद्धि डायस्टोलिक रोग के लिए एक महत्वपूर्ण शकुन मार्कर के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है26 और microvascular ऊतक के सापेक्ष जहाजों की एक rarefication का कारण बनता है । यह अलगाव प्रक्रिया के दौरान महाधमनी के प्रतिगामी छिड़काव के माध्यम से पाचन बफर के एक कम वितरण की ओर जाता है, विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण इस मॉडल में एकल सेल अलगाव प्रतिपादन । अलिंद remodeling, अलिंद फाइब्रोसिस, और वृद्धि की फाइब्रोसिस की अंय बानगी सुविधाओं ZDF चूहों के लिए दिखाया गया है-चयापचय मधुमेह और एक ZFS1 चूहों27के जनक तनाव के लिए एक चूहा मॉडल । कोलेजन जमा पाचन एंजाइमों की प्रभावकारिता ख़राब करने के लिए extracellular मैट्रिक्स से cardiomyocytes मुक्त और, इसलिए, आगे समायोजन की आवश्यकता सेल आइसोलेशन प्रक्रिया28.
तंत्र जिसके द्वारा दबाव युक्ति अलिंद remodeling के इस मॉडल में सुधार अलगाव परिणाम की सुविधा सबसे अधिक संभावना बाईं atrium के कोरोनरी रक्त प्रवाह के एक स्थानीयकृत क्षीणन करने के लिए संबंधित है । कोरोनरी रक्त प्रवाह का एक प्रमुख घटक कोरोनरी छिड़काव दबाव है, जो कोरोनरी धमनी के दबाव के बीच ढाल के रूप में परिभाषित किया गया है और संबंधित गुहा के अंत डायस्टोलिक दबाव29. वर्णित प्रक्रिया के दौरान, हृदय के आधार की एक रुकावट हृदय में कोरोनरी धमनी के दबाव और intraluminal दबाव में एक वैश्विक वृद्धि की ओर जाता है । बाईं atrium के बाद पंचर अलिंद गुहा में intraluminal दबाव के एक स्थानीय, चयनात्मक ड्रॉप की सुविधा । इस प्रकार, न केवल एक बड़ी कोरोनरी छिड़काव दबाव ढाल की स्थापना की है, लेकिन छिड़काव मात्रा भी भीड़भाड़ वाम निलय से छोड़ दिया atrium को हटाने पाचन समाधान से बढ़ जाती है ।
इसके अलावा, पाचन एंजाइमों के विकल्प ACM अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है: collagenase मैं और द्वितीय के शुद्ध एंजाइम मिश्रणों को दिखाया गया है कम करने के लिए बेहतर लक्षित और कम30collagenases तरह शुद्ध एंजाइमों । इस एंजाइम केवल आकृति विज्ञान की एक उच्च उपज और कार्यात्मक बरकरार cardiomyocytes के लिए अनुमति नहीं है, लेकिन यह भी अपने अलगाव31के बाद एकल कोशिकाओं के किसी भी झुरमुट को कम करता है । एक अतिरिक्त उच्च dispase या मध्यम thermolysin सामग्री के साथ collagenases के शुद्ध एंजाइम मिश्रणों सबसे अधिक चूहे cardiomyocyte अलगाव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । जबकि VCMs सबसे अच्छा उच्च सांद्रता पर पृथक कर रहे हैं, अलिंद myocytes का सबसे अच्छा परिणाम ०.१९५ Wünsch इकाइयों की एकाग्रता के साथ प्राप्त किया गया/
के रूप में मेट्स की व्यापकता से संबंधित HFpEF2 बढ़ती है और अलिंद cardiomyopathies अलिंद remodeling और अलिंद अलिंद के लिए अग्रणी नैदानिक अत्यधिक प्रासंगिक हैं, इस क्षेत्र में अनुसंधान के निर्णायक ब्याज की है । HFpEF के लिए कई नए पशु मॉडल३३,३४ और अलिंद लय विकारों की एक वृद्धि की घटनाओं के साथ लाइन में remodeling उभर रहे है बीमारी की पहचान विशेषताएं हैं । वर्णित विधि शोधकर्ताओं ने एक असाधारण उच्च उपज और संरक्षित यांत्रिक और बिजली के समारोह के साथ एक और अध्ययन के लिए अलिंद के साथ चूहे मॉडल से व्यवहार्य एकल cardiomyocytes को अलग करने के लिए अनुमति देता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अनुसंधान DZHK (हृदय अनुसंधान के लिए जर्मन केंद्र, D.B.), EKFS (और Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), और BMBF (जर्मन शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से BIH-Charité नैदानिक वैज्ञानिक कार्यक्रम के रूप में वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था Charité-Universitätsmedizin बर्लिन और बर्लिन स्वास्थ्य संस्थान (F.H.) द्वारा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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