Summary
ここでは、保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから単一セル心房心筋細胞を分離するため、蛍光ベースの最適化手順をについて説明します。心腔の内圧の手動調節、機能そのまま心筋興奮収縮連関研究に適した屈する実装されます。
Abstract
この記事で述べるメタボリック シンドローム (メッツ) のモデルラットから単一セル心房心筋細胞 (Acm) を分離するため、蛍光ベースの最適化手順-保存された駆出分画 (HFpEF) で心不全の関連。メッツ関連 HFpEF の有病率が上昇していると心房リモデリングと心房細動に関連する心房の心筋症は、心房を改造死亡率の独立した予測因子である関連性の高い臨床的に。隔離された単一細胞心筋細胞を用いた研究が確証し、生体内で調査結果を補完するためによく使用されます。循環容器 rarefication と間質性組織線維化は、この病気の動物モデルからの ACMs の成功単一セル隔離の可能性のある制限要因をもたらします。
我々 は形態および機能そのまま ACMs の収量が大幅に増加手動で分離している最中、心臓腔内圧を調整する装置を採用することによりこの問題を解決しました。取得した細胞はさまざまな細胞培養、機能カルシウム イメージング (すなわち、興奮収縮連関) など、別の実験で使用できます。
順を追ってプロトコル最適化されたソリューションは、包括的なトラブルシューティング ガイドと必要な機器を準備する徹底した指示のリストと研究者を提供します。プロシージャの最初の実装は難しいかもしれないの成功の適応はメッツ関連 HFpEF 実験の広いスペクトルのためのモデルラットの新式の ACM 隔離を実行するリーダーになります。
Introduction
メッツ タイプ 2 糖尿病と心血管疾患のリスク要因のクラスターをについて説明し、増加動脈血圧高脂血症 (トリグリセリドの発生し、高密度リポタンパク質コレステロールを下げる)、増加断食グルコースおよび中心性肥満1。メッツの世界的な有病率は 25-30% になり、絶えず上昇2と推定されます。HFpEF はメッツにしばしば関連付けられている異種臨床症候群です。HFpEF と (すなわち、高血圧性心臓病) その前の段階の間に心筋のリモデリング心房3の改造伴われるも。減らされた収縮機能および左心房の構造的変化は、死亡率の増加、心房細動新規発症の心不全4と関連しています。心房リモデリングはイオン チャネル機能、Ca2 +恒常性、心房の構造、線維芽細胞の活性化と組織の線維化5の変化によって特徴付けられます。左心房改造メッツ関連 HFpEF とその基礎となる病理学的メカニズムはまだよくわかっていないし、さらに詳細な調査が必要です。動物モデルは、貴重なツールになるし、心房の心筋症6,7,8,9の分野で多くの進歩をもたらすと証明しました。
隔離された単一細胞心筋細胞を用いた研究が確証し、生体内で調査結果を補完するためによく使用されます。分離、および潜在的なそれに続く細胞培養、シグナル伝達経路, イオン チャネル電流と興奮収縮連関の調査を可能にします。生理学的な条件の下で心筋細胞は増殖しません。心房性 na 利尿因子の転写制御配列と、シミアン ウイルス 40 large T 抗原遺伝子導入マウスの融合は、AT 110の名前最初の不死化 ACMs の作成をもたらした。AT 1 細胞のそれ以上の開発は HL 1 セルのみ連続継代できませんがまた11を自発的に契約をもたらした。ただし、に比べてあまり組織的微細構造、筋原繊維の11、および過分極側に内側現在12開発の頻度が高いなどの新鮮単離細胞構造および機能に違いを示す彼らは。ラットおよびマウスの様々 なモデルからの心室心筋細胞 (VCM) の分離が確立13,14,15,16,17,18,19します。 一般的に、摘出心臓は蛍光装置に取り付け、Ca2 +による逆行性に灌流-コラーゲンやプロテアーゼなどの消化酵素を含む空きバッファー。カルシウムは生理学的条件を段階的に再導入し。しかし、ACMs の分離に専用プロトコルが利用可能な20,21, 線維の増加と圧力差による心房リモデリングと疾患モデルの有用性は限られています。
この記事で心房改造 (すなわち、特にメッツ関連 HFpEF の ZFS1 ラット モデル)22動物から心房の単一細胞心筋細胞の隔離のためのプロトコルを実装しています。既存の隔離のプロトコル最適化、制御、形態および機能そのまま心筋細胞のより高い収穫につながる心の空洞の内圧を修正する簡単な特注デバイスによって補完されます。次のプロトコルは、研究者のステップ バイ ステップ ガイド、カスタムメイド機器ソリューションのリスト、包括的なトラブルシューティング ガイドの詳細な説明を提供します。
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Protocol
すべての実験は (TVA T0060/15 と T0003 15) ローカル倫理委員会で承認され、ケアと実験動物の使用 (国立衛生研究所、米国) のためのガイドラインと一致して実行します。
注: プロシージャの簡易フローチャートは、図 1に示すです。
1. 雛形
- 表 1 に従ってバッファーを準備します。
| ソリューション | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| 試薬 (mM) | |||||||||
| 塩化ナトリウム | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| Na2HPO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| タウリン | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| グルコース | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0.01 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| 精製酵素ブレンド (中サーモライシン) | 0.195 Wünsch 単位/mL | ||||||||
| pH を調整するには | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH 調整 | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH の調整 | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム | 水酸化ナトリウム |
表 1: バッファーのリスト。PB: 灌流バッファーは、4 ° C (1 頭につき 300 mL) で 3 日間保存することができます。CB: カニュレーション バッファーは、4 ° C (動物あたり 200 mL) で 3 日間保存することができます。日 (動物あたり 40 mL) 内で使用している DB: 消化バッファー。SB: は、バッファーを停止する日 (動物あたり 2 mL) で使用されるあります。日 (1 頭につき 2 mL) 内で使用するには、S1: ステップ 1 バッファー。日 (1 頭につき 2 mL) 内で使用するには、S2: ステップ 2 のバッファー。S3: ステップ 3 バッファー: 日 (動物あたり 2 mL) 内で使用しています。NT: 通常 Tyrode、日 (動物あたり 50 mL) 内で使用しています。
-
蛍光装置 (図 2 a) を準備します。
- 70% のエタノールの 100 ml の蒸留水の 2 フラッシュ続いて 100 ml システムをフラッシュします。200 mL の灌流バッファー (PB) とシステムを入力します。
- 蠕動ポンプの流量を 3 mL/分に設定します。
- 39 ° C に蛍光装置を残して PB の温度を調整します。
- 蛍光装置上に [16 G 25 mm 長く、鋭い先端を削除 (図 3 a)] カスタムメイド カニューレを置き、流れを開始します。加熱モジュールをオンにし、カニューレの先端に PB の目的の温度に達するまで加熱モジュールの値を調整します。温度校正が完了すると、特注のカニューレを穿刺 (図 2 b) 用注射器に移動します。
- 蛍光システムの横にある圧力制御装置 (図 3) を準備します。三脚クランプに蝶針をマウントし、3 ブロック ノットを準備します。
注: コラゲナーゼ酵素の活性は、温度によって異なります。その動的な調整と同様、左心房の温度監視は、後の手順で必要です。
- 器官切除および図 2 bによると穿刺のための機器を設定します。ビーカー、注射器と冷たいカニュレーション バッファー (CB) でシャーレを埋めるし、穿刺ノットを準備します。
-
ラットの体重 100 g 当たりヘパリンの 500 i. u. にラットをとおり heparinize します。
- 齧歯動物に適した麻酔誘導区域の 100% イソフルランの 2 mL を置きます。誘導部屋にケージから 21 週齢 ZFS 1 肥満ラットを転送します。ラット初期周波数の半分に呼吸の減速によって示される深い麻酔を入力するを許可します。
- 誘導室からラットを削除します。ヘパリンの注射器を使用して腹膜にラットの体重 100 g 当たりヘパリンの 500 i. u. を挿入します。
- そのケージにラットを返し、目を覚ますことを可能にします。
注: 手順 1.4 の中に無菌性を維持する必要はありません。次のステップに進む前に 20 分を待ちます。不完全な抗凝固療法は、血液凝固、品質および分離心筋細胞の収量に大きく影響する微小梗塞につながる可能性があります。
2. 心の準備
- 齧歯動物に適した麻酔誘導区域の 100% イソフルランの 2 mL を置きます。誘導部屋にケージから 21 週齢 ZFS 1 肥満ラットを転送します。ラット初期周波数の半分に呼吸の減速によって示される深い麻酔を入力するを許可します。
- 斬罪に齧歯動物に適したギロチンを使用して動物を安楽死させます。発泡スチロールの表面にラットの手足をじっと見つめます。手術用はさみで剣状突起を覆っている皮膚を持ち上げて外します。両側の肋骨のケージの下の腹膜を開き横隔膜を公開します。
- 良いはさみを使用して前方の弧に沿って切開することで横隔膜を開きます。鎖骨骨に手術用ハサミを使用して縦隔原を公開するリネア mediaclavicularisに沿って両側にリブをカットします。
- 高級ハサミ、ヒラの遠位端に肺を削除します。大動脈弓を公開する胸腺をカットします。
- 鉗子を使用して心の底をつまみ、動物の尻尾の方をそっと引き下げます。心臓の中心に接続されている大動脈の 5 mm 長いセグメントを残してプルを維持しながら、大動脈を横切ってください。(図 2 b) 50 ml ビーカーに 50 mL の冷たい CB に心をすばやく転送します。
注: 手順 2.5-3.3 中心は効果的に阻血状態です。心筋細胞に損傷を与えることの順序で手順 3 分の合計を超えない。
3. 穿刺
- 冷却し、収縮をつかむ心の待機約 10 秒。50 mL の新鮮なを含むペトリ皿に心を移すように冷たい CB。鉗子、はさみを用いた大動脈周囲脂肪組織を慎重に取り外します。
- 冷たい CB、大動脈に 3 mm でいっぱい 10 mL の注射器に接続されている (同じステップ 1.2.3 で使用)、カスタムメイド カニューレを挿入します。カニューレの先端に近位インデント 2 穿刺ノット (図 3 b) の 1 つを結ぶことによって大動脈にカニューレをこだわる。
注: カニューレと浸透によって大動脈弁を傷つけないように気をつけてください。 - 優しくないより多くの血液が冠動脈に表示されるまでに、カニューレに接続されている注射器を使用して冷たい CB の 5 mL の大動脈をフラッシュします。優しく鉗子を用いた左房をマッサージし、ペトリ皿に空洞から削除する余分な血を可能にする CB の残り 5 mL を注入します。
- カニュレーション結び目を 2 番目 (縫合: USP 3/0、絹) カニューレの先端の遠位インデント。注射器から接続されている心でカニューレをアンマウントします。適切なアダプターを使用して蛍光に添付の心でカニューレをマウントします。
注: このプロトコルは蛍光装置で血流中に心室キャビティの上昇圧力を採用しています。追加カニュレーション結び目は大動脈を介して前向性バッファー漏れを回避することによってこの圧力を維持するために必要です。
4. 圧力操作と消化
- PB と心筋の灌流を開始する蛍光器具の蠕動性ポンプを起動します。ダブルオーバーハンド ノットのネクタイ (縫合: USP 3/0、絹) 心の根元、大動脈を除きます。冠状静脈洞を気づいただけでなく、右と左の心房のインフレまでこの手順を繰り返します。
- アトリウムを圧力制御装置 (図 3 D) の蝶針で穿刺し、収縮させるアトリウムを許可します。バタフライ ホースの標高を調整することにより心房の内圧を操作します。プロシージャの残りの部分で若干水増しアトリウムを維持します。監視し、それに応じて調整します。
注: この手順長引くインフレ左心房の心筋細胞死ときたらすぐに実行する必要があります。 - 左心房と左心室の間の温度プローブの位置によって左心房のおおよその温度を測定します。蛍光モジュールをそれに応じて加熱、左心房の 37 ° C のおおよその温度をターゲットの温度を調整します。
- Pb 3 分の合計のための心臓を灌流します。
- 約 14-18 分の消化バッファー (DB) に灌流を切り替えます。
注: 左心房の構造の崩壊、組織取得ミルキー テクスチャと、消化が完了です。 - 鉗子を用いたアトリウムをピンチし、わずかなプルを制定します。良いはさみを使用して左心房を取り外し、2 mL のバッファー (SB)、組織を完全に水没を停止を含む大規模な計量ボートにアトリウム。
- 残存心筋組織で、手順を実行する研究所のガイドラインに従い処分します。
5. 細胞処理とカルシウム再適応
- 約 2 mm x 2 mm の良いはさみを使用して小さな断片に心房組織をミンチします。
- 穏やかな吸引によって組織を分散して、ティッシュの取り出しチャンク転送ピペットを使用しています。組織の巨視的解離が見られるまで、約 5 分に対して、この手順を続行します。
注: いずれかを避ける空気に細胞を公開すると、このステップの中に空気の泡が心筋細胞死になります。 - 15 mL の円錐管にセルを転送します。30 s. 転送の他の 15 mL コニカル チューブに上清を解決する組織塊を許可します。15 分のために解決するために細胞を許可します。
- 削除し、上澄みを廃棄します。2 mL のステップ 1 バッファーを追加 (表 1参照)。10 分のために解決する心筋細胞を許可します。
注: 破棄された清は、線維芽細胞と血管内皮細胞にも含まれます。実験14,23にこれらの細胞を使用する必要がある場合は、他のプロトコルを参照してください。ペレット主心房心筋細胞光学顕微鏡によって確認することができますが含まれます。心房の心筋細胞の顕微鏡の特徴は、6.1 の手順で説明します。 - 削除し、上澄みを廃棄します。2 mL のステップ 2 のバッファーを追加します。10 分のために解決する心筋細胞を許可します。
- 削除し、上澄みを廃棄します。2 mL のステップ 3 バッファーを追加します。10 分のために解決する心筋細胞を許可します。
- 削除し、上澄みを廃棄します。250 μ L 通常 Tyrode 権 (NT) 1 mM Ca2 +を含むを追加します。
- されている 25% ラミニンとコーティング (あらかじめ乾燥させて) ガラス底皿に心房の心筋細胞を含む通常 Tyrode の 50 μ L を転送します。10 分のために解決する心筋細胞を許可します。
- 500 μ L の 1 mM CaCl2を含む NT でガラス底皿を埋めます。
6 興奮収縮連関の機能評価
- 細胞の形態や 20 倍の倍率 (図 4 aおよび4 b) を使用して光学顕微鏡下での生存率を評価します。ランダムに約 100 セルを選択し、セルの隔離プロシージャの実行可能性を評価するために実行可能または実行不可能としてそれらを分類します。
注: 実行可能なセルは、対称筋節構造、膜胞の不在とロッドの形状が特徴です。 -
ロードセル Ca2 +と-を完了する 20 分以内敏感な蛍光染料ステップ 5.9。
- 10 μ M を追加 (ステップ 5.9) からガラス底皿から nt 削除上清を 500 μ L を Fluo4 午前。ガラス底皿に Fluo4 AM を含む NT を追加します。室温で 20 分間混合物を孵化させなさい。削除し、上澄みを廃棄します。NT の 500 μ L を使用して x サンプル 2 を洗います。
-
Ca2 +を可視化する-次のように共焦点顕微鏡を用いた励起。
- 共焦点顕微鏡ガラス底皿を転送し、Ca2 +を可視化-共焦点顕微鏡を用いた励起 (レーザー励起 488 で 5.8% の強度 nm, 515 排出 nm) 40 倍の倍率を使用して。
- Nt の適切な superfusion デバイスを使用して 37 ° C に加熱セルを灌流します。また、細胞を顕微鏡に取り付けられた熱インキュベーターを使用して温めてください。
- 1 Hz の周波数で電流 24 a. 待つ 1 分の細胞は Ca2 +ハンドリングの定常状態に到達するために、市販の顕微鏡に取り付けられた刺激電極を有する電界で心筋細胞を刺激します。
- 細胞を肉眼的契約核とのランダムに選択されたエッジの間途中横断軸に平行スキャン ラインを配置します。繰り返しスキャンによりライン スキャン画像を取得します。
- 自由に利用できるイメージング ソフトウェアを使用すると、セル全体にわたって電気刺激 (F0) の直前に信号強度を推定します。1 刺激サイクル (F) のコース全体のセルにまたがって信号強度をプロットします。除算 (0F) (F) をそれぞれ Ca2 +非定常を取得します。
図 1: 分離のプロシージャの簡易フローチャート。筋紡錘の酵素消化が完了するまで、手順は時間高感度です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 分離前に機器の準備。(A) このパネルは自作蛍光装置を示しています: (1) pb; ジャケット反応容器(2) CB; ジャケット反応容器(3) の三方活栓;(4) 注射器;(蠕動ポンプ 5)(6) 加熱浸漬。(ジャケット バブル トラップ 7)(8) とカニューレと心。(B) このパネルが最適化されたワークフローのため挿管および器官の切除のためのセットアップを示しています: (1) 冷たい CB; 50 mL で 100 mL のビーカー(2) 冷たい CB; と 10 mL の注射器(3) 冷たい CB; とシャーレ(4) 光源;(5)、カニュレーションと特注のカニューレの結び目 (図 3 aと3 bを参照)。(6) うまく、鉗子。(7) 組織鉗子。(8) の微細鉗子角度 45 °;(9) 腹部外科はさみ;(10) 微細外科はさみ;(30 G の針; x 4 11)(12) と 15 G 針。(C) このパネル共焦点イメージングのための顕微鏡マウント機器が表示されます: (1) 電気刺激電極;(2) superfusion ペン;(3) ガラス底皿 ACMs;(4) の白金の電気刺激は浸漬電極。(D) このパネル共焦点イメージングのための顕微鏡のセットアップを示しています: (1) 共焦点顕微鏡;(2) superfusion ペン;(3) superfusion バッファー貯蔵所;(4) superfusion 流量調整弁;(モジュールの暖房 5) スパーフュー ジョン法(6) のコンピュータワーク ステーション。(7) と電気刺激。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: カスタムメイド機器。(A) このパネル表示操作 15 G カニューレ、ルアーロックで。矢印は、カニュレーション ノットの 2 つのインデントを示します。(B) 2 つダブル オーバーハンド ノット急激な引き締めのために互いの上に配置、カニュレーション ノットです。矢印を示す順序結び目を強化する必要がある場所とそうで。(C) このパネルでは、組み立てられた圧力制御装置を示しています。21 G 蝶針は、三脚のクランプにフックされます。ホースは、針と同じ高さで保持されます。スクリュー トップは開かれます。左房内圧を変更するために矢印で示されているように、蝶ホースの標高を変更ことができます。(D) 左心房圧制御装置で穴を開けます。この写真は、理想的な水増し左心房を示しています。楕円は、オーバーハンド ノットの位置をマークします。(E) 左心房圧制御装置で穴を開けます。この図は、実行可能な ACMs の低収量になります以上に膨張した左心房を示しています。楕円は、オーバーハンド ノットの位置をマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Representative Results
生後 21 週、実行可能な ACMs (6.1 のステップに従って推定)、カルシウム再適応 (ステップ 5.4-5.7) 後の 60-90% は、このメソッド (図 4 a) によって ZSF 1 肥満ラットから分離できます。ラット、ACMs VCMs24,25と比較してより多くの異種表現型と異なる特徴です。図 4 bは、保存状態の膜および筋節構造、機能的に不可欠な細胞の両方の強い指標で個々 の ACM を示しています。
取得した ACMs をさまざまな方法で処理できます。図 5に代表されるようセル ロードされるかもしれない蛍光染料の形態や機能を研究するために使用します。例えば、ディ 8 ANEPPS 心房ラット細胞 (図 5 a) で筒状のシステムを記述する使用されました。別の一連の実験では、心房の改造のゾル性細胞質のミトコンドリア (図 5 b) を検出するミトコンドリア染色まで赤い蛍光染料 (例えばmitotracker 赤 FM) を採用します。図 5に示すように、このプロトコルで分離した ACMs 生細胞 Ca2 +イメージングに適しています、フィールド刺激そのまま興奮収縮 1 Hz のカップリングを示します。すべての画像は、さらにさまざまな研究員6,7 (図 5) に使用可能なアルゴリズムを使用して分析に使用できます。
図 4: 実行可能な単一セルの時のそれぞれの収量(A) このパネル表示 ACMs の 1 mM Ca への再適応後分離の収量2 + NT。 このパネル (B) で分離、単一セル心房の心筋細胞が表示されます。筋節の構造、細胞膜と核がはっきりと見えるです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ラット ACMs 蛍光染料での染色します。(A) 細胞膜および尿細管ネットワーク蛍光色素 Di8ANNEPS の染色、このパネルが表示されます。(B) このパネルを示してこのパネル、蛍光色素 mitotracker-赤-ツキガイ (C) ミトコンドリアの染色の Ca2 +横断線スキャン-単一細胞を蛍光色素 Fluo4 AM を励起。矢印は、電気刺激、実施で 1 Hz (D) このパネルは、パネルCから派生した longitudenal Ca2 +トランジェントを示していますを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、我々 はまずメッツ関連 HFpEF 示す心房改造22をマークのモデルラットから単一セル ACMs の隔離のためのプロトコルを説明します。手順は、過剰な脂肪組織はますます困難な大動脈カニュレーションと同様、手術の準備をすることができます一意に挑戦です。トラブルシューティング ガイドは、表 2アドレス分離のプロシージャの最も一般的な問題です。
| 問題 | 考えられる原因 | ソリューション |
| バタフライ ホースを通して流れのないです。 | 大動脈カニュレーション ノットとの不適切な閉鎖 | 締める前に脂肪組織を削除します。 |
| それぞれのインデント 3 カニュレーション結び目を追加します。 | ||
| 高められた力のための手で結び目を引っ張ってください。 | ||
| ブロック針 | 内腔に位置を再調整します。 | |
| 注射器でゆっくり引いてブロックを解除します。 | ||
| 右心房の冠状静脈洞に誇張されていない/ | 心底の不適切な閉鎖 | さらにノットのブロック フロー |
| 右心房の準備中に壊れています。 | クリップ/ノットで漏れを閉じる | |
| 消化不良/アトリウムが軟化しません。 | 間違った温度で還元酵素活性 | 37 ° C に温度を調整します。 |
| 非アクティブ/分解酵素 | 置換 | |
| 旧/過度に線維化アトリウム | 消化時間が長く (+50 の手順で %) | |
| 破損した大動脈弁 | 穿刺時に浅い溶 | |
| 悪い細胞収率 | 過剰消化アトリウム | 消化時間を短縮 (+25 の手順で %) |
| バタフライ ホースを下げることによって管腔内の圧力を減らす | ||
| アトリウムの下で消化 | (25% のステップ) で消化時間を増やす | |
| バタフライ ホースを上げることによって管腔内の圧力を高める | ||
| 細胞分散も積極的 | もっと優しく |
表 2: トラブルシューティング ガイド。このテーブルには、分離のプロシージャおよび彼らのそれぞれのソリューションの一般的な問題が表示されます。
最近の研究では、我々 が示す ZFS 1 肥満モデルラット心房サイズの増加22広範な心房改造.左の atrial サイズの増加は拡張不全26の重要な予後マーカーとして認識されているし、組織に対する微小血管 rarefication を引き起こします。これは分離のプロシージャ、特に困難なこのモデルで単一細胞分離をレンダリング中に大動脈の逆行性血流を通して消化バッファーの減少分布に します。ZDF ラットの心房リモデリング心房の線維化、増加の線維症の特徴などが示されている-代謝糖尿病と、ZFS1 の 1 つの親株のモデルラット ラット27。コラーゲンの沈殿物は、細胞外マトリックスから心筋細胞を解放し、したがって、さらに細胞分離手順28の調整を必要とする消化酵素の有効性を損ないます。
心房リモデリングのこのモデルで改善された分離結果を容易に圧装置、機構は、左心房の冠血流のローカライズされた減衰に関連可能性が最も高いです。冠血流量の 1 つの主要なコンポーネントは、冠灌流圧、冠動脈圧とそれぞれ空洞29の末期圧の勾配として定義されています。説明中には、心底の閉塞は冠動脈圧と中心部全体で腔圧の世界的な増加に します。左心房の後の穿刺は、左心房内の内圧のローカルの選択ドロップを促進します。したがって、だけでなく大きな冠灌流圧勾配を確立すると、混雑した左心室から左心房に流用消化ソリューションによって血流量も増加します。
さらに、消化酵素の選択 ACM 分離の重大である: I および II コラーゲン30のような少ないの目標とされ、純粋な酵素に優れていることが示されているコラゲナーゼの酵素ブレンドを精製しました。この酵素心筋細胞の形態学的および機能的そのままより高い利回りののみを許可しないが、また単一細胞の彼らの分離31後固まってを最小限に抑えます。追加高当期とコラーゲンの精製酵素ブレンドまたは媒体サーモライシン コンテンツがラット心筋細胞分離の最もよく使用されます。心房筋細胞の最良の結果が得られた VCMs がより高い濃度で最もよく隔離される中、0.195 の濃度と Wünsch ユニット/mL のこれを使用してプロトコル32。
メッツ関連 HFpEF の有病率が上昇している2と心房心筋症心房リモデリングにつながると心房細動が臨床的に関連性の高い、この分野の研究は極めて重要な関心。HFpEF の多くの新しい動物モデルが浮上して33,34と心房改造房調律障害の発生率の増加に伴い、病気の認刻極印の特徴。説明方法ラット非常に高い収率でさらなる研究に心房リモデリング モデルから実行可能な単一心筋細胞を分離する研究者および機械的・電気的機能を保持します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は DZHK (ドイツ語マッシィ心血管研究センター)、によって支えられた (Else Kröner フレゼニウス財団、f. H.) EKFS、BMBF (ドイツ語教育省および研究) と臨床科学者プログラム資金 BIH シャリテによってシャリテ - Universitätsmedizin ベルリン、ベルリン衛生研究所 (f. H.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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