Summary
Vi rapporterer metoder til karakterisering af MLKL-medieret plasmamembran brud i necroptosis herunder konventionelle og konfokal mikroskopi, live-celle billedbehandling, scanning elektronmikroskopi og NMR-baseret lipid bindende.
Abstract
Necroptosis er en programmeret celle død pathway udløst ved aktivering af receptor interaktion protein kinase 3 (RIPK3), som phosphorylates og aktiverer blandet lineage kinase-lignende domæne pseudokinase, MLKL, at briste eller permeabilize plasmamembran . Necroptosis er en inflammatorisk pathway forbundet med flere patologier herunder autoimmunitet, smitsomme og hjerte-kar-sygdomme, slagtilfælde, neurodegeneration og kræft. Her beskriver vi protokoller, der kan bruges til at karakterisere MLKL som bøddel af plasma membran brud i necroptosis. Vi visualisere processen med necroptosis i celler ved hjælp af live-celle imaging med konventionelle og konfokal Fluorescens mikroskopi og faste celler ved hjælp af elektronmikroskopi, som sammen afslørede en omfordeling af MLKL fra cytosol til plasma membran før induktion af store huller i plasma membranen. Vi præsenterer i vitro Kernemagnetisk resonans (NMR) analyse ved hjælp af lipider for at identificere formodede modulatorer af MLKL-medieret necroptosis. Baseret på denne metode, identificeret vi kvantitative lipid-bindende præferencer og phosphatidylphosphatid-inositol fosfater (kerner) som kritiske bindemidler af MLKL, der er nødvendige for plasma membran målretning og permeabilization i necroptosis.
Introduction
At identificere genetiske komponenter af necroptosis har fremmet brugen af dyremodeller for at afprøve implikationen af necroptosis i fysiologi og sygdom1,2,3,4,5. Knockout af RIPK3 eller MLKL i mus havde minimal implicit i udvikling og voksen homøostase tyder på, at necroptosis ikke er afgørende for liv3,6. Derudover indeholder visse arter ikke enten RIPK3 eller MLKL gener, støtte ikke-væsentlige rolle necroptosis i dyr7,8. På den anden side har udfordrende knockout dyremodeller med forskellige patologier induceret i laboratoriet afsløret en vigtig rolle for necroptosis i inflammation, medfødt immunitet og viral infektion9,10, 11 , 12.
Necroptosis kan aktiveres på flere måder ved signalering gennem forskellige medfødt immunitet sensorer, alle som fører til aktivering af RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 igen phosphorylates og aktiverer MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Mest studerede, og måske den mest komplekse måde, fører til aktivering af RIPK3 indebærer død receptor ligatur, som tveger baseret på downstream sammensætningen af de signaling komplekser til enten inducerer apoptose eller necroptosis1. Necroptosis ensues når signalering gennem RIPK1 er begunstiget og resulterer i engagement RIPK319,20. Dette resultat er let begunstiget ved farmakologisk hæmning eller genetiske sletning af caspase 8, en formodede endogene hæmmer af necroptosis, der holder necroptosis i skak. RIPK1 binder til og aktiverer RIPK3. En anden måde at aktivere necroptosis er gennem Toll-lignende receptorer TLR3/TLR4 signalering, der inddrager og aktiverer RIPK3 gennem TIR-domæne-holdige adapter-inducerende interferon-β (TRIF)21. Endnu er en anden måde at dø af necroptosis ved aktivering af DNA-sensor DAI, der direkte inddrager og aktiverer RIPK322.
MLKL er en cytosole protein består af en N-terminale helix bundt (NB) domæne og en C-terminal pseudokinase domæne (psKD) forbundet med en regulerende tandbøjle region3. I normale celler, er MLKL fundet i cytosol, hvor det menes at være i en inaktiv kompleks med RIPK314. Aktivering af necroptosis udløser RIPK3 fosforylering af MLKL i aktivisering sløjfen psKD og potentielt flere steder i den NB og tandbøjle3,15,23. Fosforylering inducerer en konformationel ændring i MLKL, der resulterer i dissociation fra RIPK314. Dårligt forstået konformationelle ændringer frigive bandage fra psKD24. Tandbøjle, som indeholder 2 helices, medierer oligomerisering af MLKL til en formodede trimer gennem C-terminale helix25. Den N-terminale helix af skinnen hæmmer NB-domæne, som er afgørende for membran permeabilization24,26. I isolation er NB domæne tilstrækkelig til at fremkalde plasma membran permeabilization og necroptosis16,24,27. Pro-necroptotic aktivitet af NB var rekonstitueres i mus embryonale fibroblaster mangelfuld i MLKL (mlkl- / - MEFs). NB er et lipid bindende domæne, der fortrinsvis engagerer phospholipid phosphatidylinositol 4,5 ud (PIP2). Vi foreslår en trinvis mekanisme for aktivering af MLKL, hvori tandbøjle oligomerisering letter rekrutteringen af MLKL til plasma-membran via svage vekselvirkninger mellem NB med PIP2 polar hoved gruppe24. På membranen gennemgår NB regulerede eksponering af en ekstra høj-affinitet bindingssted for PIP2, som er maskeret af skinnen i inaktiv MLKL. Samlet set destabilisere NB flere interaktioner med PIP2 plasmamembran fører til sit ruptur, selv om den molekylære mekanisme af disse begivenheder ikke har blevet belyst.
Her viser vi specifikke metoder anvendt til at karakterisere MLKL funktion som bøddel necroptosis24. Især fokuserer vi på de mest minimal domæne MLKL, NB og tandbøjle (NBB), som er reguleret af bandage hæmning og kan aktiveres gennem tvungen dimerization til at fremkalde plasma membran brud og necroptosis. Vi beskriver vores inducerbar ekspressionssystem kombineret med tvungen narkotika-induceret FKBP-medieret dimerization til live-celle billedbehandling og elektronmikroskopi af celler gennemgår necroptosis. Derudover viser vi vores in vitro- NMR-analyse af samspillet mellem NBB med phosphatidylinositols (kerner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kloning og Cell Line Generation
- PCR forstærke regionen NBB svarende til aminosyrerester 1-140 (NBB140), fra menneskelig MLKL cDNA for i ramme standard begrænsning enzym-baserede kloning med oligomerisering domæne 2 x FK506 bindende protein (2xFKBP eller 2xFV) og Venus fluorescerende protein i doxycyclin (Dox) - inducerbar retroviral vektor pRetroX-TRE3G at opnå NBB140- 2xFV-Venus (tabel 1, tal 1A-B).
- Udødeliggøre primære mlkl- /- eller ripk3- / - mlkl- / - mus embryonale fibroblaster (MEFs) fremstillet af de respektive mus i den grønne laboratorium ved forbigående Transfektion med SV40-store antigen at udtrykke plasmid. Vælg udødeliggjort celler i ~ 1-2 uger, og vedligeholde i DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og streptomycin, 1 mM natrium pyruvat og uvæsentlige aminosyrer ved 37 ° C og 5% CO2 i standard væv kultur væksthuse.
- Transduce SV40-udødeliggjort mlkl- / - MEFs med omvendt tetracyklin kontrolleret transaktivatoren (rtTA)-indeholdende retrovirus udtrykt fra et plasmid som indeholder blasticidin resistens gen (vores ændrede plasmid) og behandler for 1 uge med 5 μg/mL blasticidin til at vælge for celler, der stabilt udtrykker rtTA28.
- Transduce rtTA-udtrykker MEFs med den Dox-inducerbar retroviral vektor indeholdende de kimære MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) og vælg med 4 μg/mL puromycin for én uge, 2 dage efter transduktion.
2. live-celle mikroskopi billeddannelse af MLKL-medieret Necroptosis
- Plade mlkl- / - MEFs udtrykker NBB140-2xFV-Venus med en tæthed på 50.000 celler pr. brønd (1 mL/hul) i 24 godt plader, og der inkuberes natten over (figur 2A). Bruge live-celle farvning for automatiseret celle tælle (Se Tabel af materialer).
- Behandling af celler til 12 h med Dox (0,5 μg/mL) til at fremkalde udtryk for NBB140-2xFV-Venus.
- Fremkalde necroptosis med 25 nM FKBP dimerizer (Dim) ud over 25 nM membran-vandtætte grøn fluorescerende farvestof (Se Tabel af materialer) i standard DMEM (Se 1.2). Celler gennemgår necroptosis ophobes farvestoffet som deres plasma membran integritet er kompromitteret af NBB140-medieret brud. Udføre assays i tre eksemplarer eller fire eksemplarer.
- For at overvåge necroptosis ved hjælp af single - eller dual-farve Billeddannende systemer (Se Tabel af materialer), skal du placere fartøjerne i respektive Trykbilledenheden har til huse i et pattedyr vævskultur inkubator.
- Åbn softwaren (Se Tabel af materialer), og vælg fanen tidsplan kommende scanner under listen opgaver.
NOTE: denne protokol er for billeddannelse ved hjælp af single-farve systemer, men en lignende software er tilgængelig for dual-farve systemer. - Vælg "Bakken, fartøj, Scan typer", og "Skan mønster" i fanen "Fysiske Layout" og "Hurtigt fluorescens" under fanen egenskaber.
- Tilføj "Skan tiden" ved at klikke på vinduet "Tidslinjen" og det samlede antal af tidspunkter og hyppigheden af erhvervelse (typisk 1 erhvervelse hver 0,5 h 1 h 6 h til 12 h, eller al mulig 5 min til fast-kinetik necroptosis) og start billede erhvervelse ved at vælge "App ly"(rød knap).
- Kvantificere necroptosis ved hjælp af billede analyse software (Se Tabel af materialer) ved at vælge rudens"opgaver", "Objekt optælling nye analyse med faste segmentering tærskel over baggrundsniveauet", som kan bestemmes ved at holde den musemarkøren over baggrunden regioner i flere billeder anvendt i analysen.
- Undersøge fluorescerende objekter ved at vælge visning ved hjælp af aktuelle billede og finjustere tærskelværdierne efter behov.
- Integrere grønne fluorescens tæller ved at åbne fanen "Lancere nye analyse", vælge "Tidsinterval", Vælg wells analyseres, Indtast "Analyse jobnavn", og tryk på "OK".
- Adgang analyseret data fra fanen "Analyse job" ved at dobbeltklikke på den respektive jobnavn og eksport fra vinduet graf/Export for yderligere analyse i eksterne graftegning software (Se Tabel af materialer).
- Kvantificere data som grønne fluorescens positive (+ ve) tæller/mm2 eller normalisere tæller ved sammenløbet og udtrykke data som grønne fluorescens + ve tæller/sammenløb.
- Eventuelt på den eksperimentelle slutpunkt, pletten celler med 100 nM af membran-permeant grøn fluorescerende farvestof (Se Tabel af materialer). Normalisere data til % necroptotic celler som forholdet mellem grøn fluorescens/grøn fluorescens på slutpunktet.
3. live-celle Konfokal mikroskopi billeddannelse af Plasma membran rekruttering og Permeabilization af MLKL
- Plade mlkl- / - MEFs udtrykker NBB140-2xFV-Venus med en tæthed på 20.000 celler pr. brønd (0,5 mL/hul) i en glas bund 4-godt mikroskopi kammer forbehandlet med 50 µg/mL fibronektin i PBS ved 37 ° C i 30 min og der inkuberes i ~ 12 h ( Figur 2B).
- Behandling af celler med Dox (0,5 μg/mL) for ~ 12 h til at fremkalde udtryk for NBB140-2xFV-Venus.
- Fremkalde necroptosis ved at inkubere med friske medium (1 mL/hul) indeholdende 25 nM Dim for at fremkalde NBB140-2xFV-Venus aktivering og omplantning til plasmamembran.
- Sted i salen på en roterende disk laser scanning Konfokal mikroskop bygget på en inverteret stå udstyret med miljøkontrol og en 63 1,4 NA mål og begynde imaging erhvervelse ved hjælp af software valg (Se Tabel af materialer).
- Initialisere softwaren, skal du vælge "Fokus" ikon og YFP filter konfiguration (excitation bølgelængde 515 nm).
- Find synsfelt og brændplanet, og engagere fokus vedligeholdelsessystem ved hjælp af fanen "Konkret fokus".
- Til at begynde erhvervelse, Vælg fanen "Capture" efterfulgt af tildeling af filter konfiguration, passende EMCCD kamera eksponering tid og intensivering gevinst og time-lapse erhvervelse parametre, herunder interval og længden af erhvervelse.
- Overvåge cellulære omfordeling af de fluorescerende NBB140-2xFV-Venus protein under necroptosis ved at erhverve billeder hver 10 s ved en EMCCD kamera ved hjælp af en 515 nm laser (film 1).
Bemærk: Photobleaching er en bekymring med fluorescerende proteiner billeddannelse. Venus er en af de mere resistente fluorescerende proteiner til photobleaching29. Hvis der anvendes fluorescerende proteiner, der er mere modtagelige for photobleaching billede hver 30 s eller længere tillade genopretning af signalet mellem imaging tidspunkter. - At overvåge plasmamembran sammenslutning af NBB140-2xFV-Venus under necroptosis, billede hver 10 s prøven udarbejdet i 3.3 af total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi ved hjælp af et mikroskop udstyret med en automatiseret JOHANNAS skyderen og en 100 x 1,4 Nielsen objektivt og en EMCCD kamera (Movie 2). Følg trin 3,5-3,7, men justere JOHANNAS vinklen under fanen JOHANNAS fokus efter prøven og bunden glas tykkelse af mikroskopi kammer.
Bemærk: Plasma membran markører som LCK-C-RFP kan bruges som kontrolelementer til plasma membran lokalisering i JOHANNAS analyse. - Udføre billedbehandling for at forbedre kvaliteten af foldning med den negative normaliserede anden afledede af en Gaussisk funktion (Marr algoritme).
4. elektronmikroskopi
- Plade mlkl- / - MEFs udtrykker NBB140-2xFV-Venus med en tæthed på 5 millioner celler i en plasma-belagt 150 mm celle kultur parabol og Inkuber i 12 h (figur 3).
- Behandling af celler med doxycyclin (0,5 μg/mL) til at fremkalde udtryk for NB1-140-2xFV-Venus i 12 timer.
- Fremkalde NBB140-2xFV-Venus aktivering og omplantning til plasma membran med 25 nM af homodimerizer i 5 min. Denne gang er etableret fra kinetik af necroptosis observeret i live-celle billedbehandling.
- Fjern mediet og lave celler ved hjælp af 10 mL 2,5% glutaraldehyd, 2% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M natrium cacodylate buffer pH 7,4 (cacodylate buffer) pre varmes ved 37 ° C.
- Indsamle prøven ved at skrabe og spin prøver i 10 min på 500 x g. Supernatanten.
- Postfix prøve for 1,5 h i reduceret 2% osmium dinitrogentetraoxid med 1,5% kaliumferrocyanid i 0,1 M natrium cacodylate buffer. Osmium dinitrogentetraoxid er en farvning agent udbredt i TEM for at give kontrast. Vi brugte TEM som foreløbig analyse forud for SEM af cellen undergår necroptosis.
- Skyl prøve 5 gange i ultrarent vand i 5 min på 500 x g, efterfulgt af skylninger i buffer (Se 4.6), vand, og ethanol på en automatisk processor. Supernatanten.
- SEM, bejdse de tidligere faste prøver med 1% uranyl acetat og bly aspartat heavy-metal pletten31.
- Dehydrere prøver gennem en gradueret serie af alkohol og propylen oxid løsninger.
- Integrere prøven i hårde resin32 at opnå en harpiks blok.
- Skær tyk sektioner 0,5 μm til at bestemme det korrekte område af analyse.
- Coat prøver med en ultra-tynd film af elektrisk ledende metal (Iridium).
- Billede og analysere prøver (figur 3). Til kvantificering, en lav forstørrelse billede af harpiks blok overflade med udsatte celler er scannet på 5 keV ved hjælp af en elektron mikroskop.
- Visualisere celler på tværs af individuelle billeder taget af SEM eller tænkelig programmel kan udnyttes til at tilslutte flere felter-of-view i ét sammenhængende billede30. Omtrent 100 celler kan bruges til at evaluere brøkdel af celler gennemgår necroptosis på denne måde ved at generere en høj opløsning montage i valg-software (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Scoring nekrotisk morfologi af SEM sammenligner normal celle funktioner med progression af pre nekrotisk eller nekrotisk fænotyper. Disse funktioner omfatter plasma membran ændringer herunder microvilli forsvinden, udfladning, bristninger i celler spænder fra 10 nm til 1 µm i størrelse, eller tab af organelle struktur på tværs af mindst 30-40% af området cytosole celle.
5. lipid Binding af MLKL ved Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi
- Forberede 15N-mærket NBB1-156 af standard protein proteinekspression og -oprensning som tidligere beskrevet24.
- Opløse 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol ammoniumsalt (18:0 PI) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) ammoniumsalt (18:1 PI) i 500 µL af iskolde CHCl3 hver endelige koncentrationer af 1 mg/mL.
- Der sonikeres 1 mg/mL 18:0 og 18:1 PI i vandbad sonikering i 1 minut ved stuetemperatur eller op til 5 min i en is-vand-blanding.
-
Alikvot 1 mg/mL 18:0 og 18:1 PI i ren hætteglas for individuelle NMR titrering serie (figur 4). Overførsel lipider i organiske opløsningsmidler ved hjælp af glas lufttæt sprøjter.
- Alikvot 132 µL af 1 mg/mL 18:1 PI (molar masse = 880.137 g/mol) i CHCl3 for en endelige resuspension volumen af 1.200 µL på 125 µM koncentration.
Bemærk: For 5 mm NMR rør, forberede seriel fortynding mængder > 1.000 µL og endelige NMR sample mængder > 500 µL. For 3 mm NMR rør, forberede seriel fortynding mængder af > 300 µL og endelige NMR sample mængder > 150 µL.
- Alikvot 132 µL af 1 mg/mL 18:1 PI (molar masse = 880.137 g/mol) i CHCl3 for en endelige resuspension volumen af 1.200 µL på 125 µM koncentration.
- Alikvot 1 mg/mL svin hjerne L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat ammoniumsalt i 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (hjernen PI (4,5) P2) i ren hætteglas.
- Placer hætteglas under en gasformige strøm af argon (Ar) eller nitrogen (N2) med moderat flow til at fordampe organisk opløsningsmiddel uden sprøjt mod hætteglas glasvægge. Fem til 30 min er typisk tilstrækkeligt for mængder af 10-200 µL organisk opløsningsmiddel.
- Arrangere glas vial(s) på bunden af en Büchner eller sugekolbe ved hjælp af store pincet, forsegle med en gummiprop og vedhæfte plastslanger tilsluttet et vakuum linje. Evakuere kolben under milde vakuum overnight hen til ophæve resterende organics.
- Overlay lipid film delprøver med inaktiv gas, forsegle med en lufttæt låg, og opbevares ved-20 ° C til brug inden for en måned eller-80 ° C for langsigtede oplagring.
- Forberede NMR prøve buffere uden vaskemiddel (-Det) indeholdende 20 mM NaxHyPO4 pH 6,8, 10% D2O og med vaskemiddel (+ Det) indeholdende 20 mM NaxHyPO4 pH 6,8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (Bettinas).
- Tilføj + Det buffer til hætteglasset med lipid film at opnå ønskede koncentration og Læg instrumenterne i ultralydsbad i vandbad i op til 30 min, skiftevis ultralydbehandling i 10 min efterfulgt af visuel inspektion.
Bemærk: Ultralydbehandling kan varme prøve. Lad den køle til stuetemperatur i 15 min. før endelige protein prøve rekonstitution. - Foretage seriel fortynding af lipid-vaskemiddel micelles i + Det buffer ved hjælp af sonikering af 1:1 blandinger for den ønskede koncentration serie. Start på 125 µM lipid koncentration, vil tre gentagelser give 62,5 µM, 31.3 µM og 15,6 µM lipid i 0,34 mM Bettinas.
- Forberede kontrol og reference NMR prøver af protein og tilsætningsstoffer i - Det og + Det buffere, henholdsvis. Tilføje protein og tilsætningsstoffer til hver fortynding af lipid i + Det buffer.
Bemærk: For 15N NBB156, protein føjes til en endelig koncentration på 40 µM og suppleret med 2 mM deutereret dithiothreitol at holde Cys restprodukter reduceres. - Overføre det passende antal prøver til 5 mm og 3 mm NMR rør (se note i trin 5.4).
- Indlæse prøver i NMR instrument eller arrangere i en automation platform såsom SampleCase loader manuelt.
- Erhverve sammensatte NMR spektre bruger standard puls programmer for 1H proton spektre som kvalitetskontrol efterfulgt af 2D 1H -15N korrelation spectra enten som tværgående afslapning optimeret spektroskopi (TROSY) eller heteronuclear flere quantum sammenhæng (SOFAST-HMQC)33.
Bemærk: Brugen af 3 mm NMR rør kræver 64 scanninger for 1 H -15N TROSY (~ 3 h) eller 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Skan numre er halveret til 5 mm NMR rør. - Forarbejdede 2D NMR spektre kan føjes til en CARA repository34 for analyse eller andre software valg til brugeren.
-
Analysere software ved udfyldelse af 2D NMR resonanser for tre godt spredte og løst toppe for hver af protein. Optage peak amplituder for hver af seks toppe for hver buffer betingelse indeholdende NBB156 (figur 5A).
- Bruge CARA til at forberede en parti-integration liste (Klik på Hovedmenu overskrift "spektrum | Setup Batch List"...) af alle spektre indsamlet og analysere ved hjælp af en enkelt peak opgavefil (Klik på Hovedmenu overskrift "toppe | Importere Peaklist".. .og vælge en bruger-defineret .peaks fil med 6 samlede toppe, 3 for hvert protein stat, defineret inden for).
- Finjustere indstillingerne ("Integrator | Tune Top Model"...) af X-bredde 0,06 ppm og Y-bredde 0,30 ppm (Klik på Hovedmenu overskrift "Integrator | Tune Top Model"...) før du optager det endelige output i to menuvalg (1. Klik på Hovedmenu overskrift "Integrator | Integrere Batch List") (2. Klik på Hovedmenu overskrift "toppe | Eksportere Integration tabel") (figur 5B).
Bemærk: Rygraden akrylamid resonanser for restkoncentrationer M21, V53 og L105 er blevet tildelt til NBB156 lukket tandbøjle stat. Open-brace stat blev tildelt rygraden akrylamid resonanser af restkoncentrationer G130 og A141 og epsilon proton sidekæde resonans af W133 ved hjælp af 3D NMR eksperimenter24.
- Normalisere prøver for direkte sammenligning fra forskellige magneter eller prøve betingelser af i gennemsnit tre open-brace amplituder af referenceprøver og beregning af en normalisering faktor vedrørende de to referencer. Beregne de skalerede amplituder for NBB156 resonanser ved hjælp af normalisering faktor og indstilling negative amplituder til nul (tabel 2).
Eksempler: 1) sammenligning prøver fra forskellige magneter: Magnet A, NBB156+ Bettinas og Magnet B, NBB156+ Bettinas. 2) vaskemiddel sammenligning: 0,34 Bettinas og 1,7 mM Bettinas. - Beregn for hver resonans den skalerede brøkdel af lukket - eller open-brace ved at dividere med en række mindstekrav til maksimale amplitude af alle spektre indsamlet indeholdende relevante referencer af gratis NBB156 og fuldt open-brace NBB156 i rengøringsmiddel.
- Afbilde de normaliserede NMR amplituder som funktion af lipid og sammenligne brøkdel af open-brace NBB156 i forskellige betingelser (figur. 5 C).
Bemærk: Alternativt analyse af brøkdel af lukket tandbøjle kropsbygning mod lipid koncentration kan udføres for at sammenligne lipid binding til NBB156. Vi foretrækker den tidligere analyse, fordi det er hurtigere og bedre rapporter på brøkdel fuldt-engageret af lipider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisere reguleret necroptosis udførelse i levende celler har været muligt via inducerbar udtryk for en minimal afkortet MLKL konstruktion, NBB140-2xFV-Venus. Denne konstruktion bevarer evnen til at fremkalde plasma membran permeabilization og aktiveres via Dim-induceret oligomerisering af FKBP kassette (2xFV). Vi observerer og kvantificere necroptosis af live-celle mikroskopi imaging, overvågning kinetically (hvert 5 min) optagelsen af en celle uigennemtrængelige grønne fluorescens DNA bindende farvestof (fig. 6A). Denne inducerbar system er meget robust og komplet necroptosis af mlkl- / - MEFs kan iagttages inden for ~ 1 h ved Dim-medieret oligomerisering af Dox-forinkubereret celler, der udtrykker NBB140-2xFV-Venus (figur 1A ). Vi henviser til disse betingelser som fast-kinetik necroptosis. Udtryk for Venus alene ± Dim eller NBB140-2xFV-Venus i mangel af Dim ikke fremkalde necroptosis (fig. 6A). Vi udfører normalt mindst 3 Repliker imaging eksperimenter i tre eksemplarer eller fire eksemplarer i 24-, 96- eller 384-godt plader.
Hurtig-kinetik necroptosis induceret af tvungen dimerization af NBB140-2xFV-Venus (fig. 6A) understøtter MLKL rolle som den formodede bøddel af plasma membran brud. At visualisere en omfordeling af NBB140-2xFV-Venus til plasma membranen under necroptosis, live-celle Konfokal mikroskopi anvendes til at overvåge Venus fluorescens. Under hurtig-kinetik necroptosis, indenfor 2-3 min inkubation med Dim, efterfulgt Venus belægning af celle periferien er observeret, af gradvis celle afrunding (film 1). NBB140-2xFV-Venus ophobning på plasmamembran er visualiseret ved JOHANNAS Konfokal mikroskopi, der fokuserer på cellevolumen på cytosol-plasma membran-barometer grænseflade. Plasma membran-associerede Venus puncta er synlige inden for 1-2 min af inkubationen med Dim (Movie 2). Således håndhæves oligomerisering af NBB140-2xFV-Venus inducerer sin hurtige omfordeling til plasma membran.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) er et kraftfuldt værktøj til at afsløre de morfologiske forandringer i celler inde i necroptosis. Under hurtig necroptosis induceret af oligomerisering af NBB140-2xFV-Venus, cellerne ændre morfologi fra normale aflange figurer (time 0 min) til afrundet og svulmede (5 min) til delvist bristet (10 min) og omfattende demonteret hvor cytosol har forsvundet (20 min) (fig. 6B). SEM supplerer de tidligere bemærkninger fra live-celle mikroskopi korrelerede MLKL lokalisering til plasma membran med membran brud. Samlede mikroskopi-teknikker præsenteres heri tilbyde supplerende midler til at overvåge, evaluere og kvantificere necroptosis på cellulært niveau og indblande NBB140-2xFV-Venus i udførelsen af plasma membran brud.
For at bestemme, hvis MLKL direkte kan kontakte plasmamembran udfører vi i vitro lipid bindende eksperimenter overvåges af NMR spektroskopi ved hjælp af rekombinant NBB156. Serielle fortyndinger af lipid-vaskemiddel micelles, ved hjælp af en konstant koncentration af vaskemiddel (køretøj for lipid præsentation) og variable lipid koncentrationer, er testet for binding til 15N-mærket NBB156 af 2D NMR spektroskopi, som skærme bindende-inducerede ændringer i protein. NBB156 undergår gennemgribende strukturelle ændringer på lipid bindende for at fortrænge hæmmende bandage-regionen (aminosyrer 132-156) fra den lukkede og spiralformet (lukket tandbøjle) til åben og uløseligt uordnede kropsbygning (åbne tandbøjle) (figur 7 A). To-dimensionelle NMR spektroskopi giver per rester oplysninger for blandinger af begge konformere (Figurer 7B-7 C). Vi har tidligere tildelt rygraden amider af begge konformere24. Vi kan nemt overvåge procenter af lukkede og åbne konformere i en given prøve, som beskrevet i tal 5A-C. Ved hjælp af denne bindende assay, udforske vi NBB156 bindende til PIPs i Bettinas vaskemiddel, som er inert til NBB156 bindende (figur 5B). I denne analyse er PIP2 den bedste NBB156 ligand, som inducerer fuld åbning af hæmmende skinnen på 125 µM (figur 5C). Derimod er mættet (18:0) PI og umættede (18:1) PI fattige NBB156 ligander inducerende delvis tandbøjle åbning på de samme betingelser (figur 5C). Vores NMR-baseret lipid bindende assay indeholder dokumentation for samspillet mellem MLKL NBB156 med fosfolipider og antyder en direkte forbindelse mellem MLKL og plasma membran.
Figur 1: Stabile cellelinie husly en modificeret Tet-On 3 G inducerbar system. (A) stabil cellelinjer blev genereret af retroviral transduktion af/mlkl- / - MEFs med pTREX-rtTA-blast efterfulgt af pRetroX-TRE3G-NBB140-2xFV-Venus-puro. Hver transduktion blev efterfulgt af antibiotika valg for op til 1 uge før man går videre til efterfølgende analyser. (B) skematisk gengivelse af inducerbar MLKL udtryk system. Dette system er baseret på 2 stof-inducerbar lovgivningsmæssige skridt: i) MLKL Gen-ekspression, protein produktion (+ Dox) og ii) aktivering af oligomerisering (+ Dim). Når protein produktion er induceret i forvejen + Dox, hurtig-kinetik necroptosis kan udløses, + Dim. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Live-celle billeddannelse af fast-kinetik necroptosis afslører hurtige membran relocalization af MLKL. (A) Fast-kinetik necroptosis induceret som i figur 1B kan overvåges i et billedbehandlingssystem. Necroptosis er scoret af optagelsen af den celle-vandtætte grøn fluorescerende farvestof. (B) skematisk gengivelse af live-celle billeddannelse af fast-kinetik necroptosis med epifluorescensmikroskop og total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Skematisk fremstilling af scanning elektronmikroskopi (SEM) forberedelse af prøver og analysen. Celler fra fast-kinetik necroptosis induceret som beskrevet i figur 1 er fast på pladen på forskellige tidspunkter efter tilsætning af Dim. Cellerne er derefter klar til SEM analyse ved at skrabe og samle, heavy metal farvning, harpiks indlejring og iridium belægning som beskrevet i afsnit 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Prøve forberedelse og dataindsamling for NMR titreringer af 15N NBB156 og lipid-vaskemiddel micelles. Denne analyse og analyse udføres typisk i 3-4 dage: i løbet af dagen 1, lipid delprøver udleveres og tørret natten over. I løbet af dag 2, er lipid film rehydreret i assay buffer ± vaskemidler, sonicated, og seriefremstillede fortyndet (dobbelt) ved at blande lige store mængder af rehydreret lipid løsning med lipid-fri stødpudeopløsning. Hver fortynding er sonicated for at sikre homogen blanding og distribution af lipider i vaske-og rengøringsmidler micelles før efterfølgende fortyndinger. Protein prøver er blandet i serie lipid-vaskemiddel micelle fortyndinger, indlæses i passende NMR rør, placeret i en SampleCase loader (eller indlæst manuelt), og automatisk NMR dataindsamling er startet. Under efterfølgende dage, er NMR dataindsamlingen afsluttet og efterfulgt af 2D NMR-analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Lipid-bindende præferencer i NBB156 målt ved hjælp af 2D NMR. (A) overlejret 1H -15N TROSY spektre for 15N-NBB156 i (rød) eller ej (blå) på 125 µM PI (4,5) P2 i 0,34 mM Bettinas visualiseret i CARA. (B) endimensional skiver af resonanser bruges til amplitude målinger og normalisering. Den rå spektrum (grøn) er belagt med grænsen for amplitude og integration af programmet CARA. (C) normaliseret amplituder af NBB156 i nærværelse af phosphoinositide-Bettinas micelles plottes i lipid koncentration. PIP2 inducerer fuld åbning af skinnen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Fast-kinetik necroptosis induceret af oligomerisering af NBB140-2xFV-Venus i/mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis kvantificering af høj overførselshastighed fluorescens billeddannelse af optagelsen af celle-vandtætte, DNA-bindende grøn fluorescerende farvestof. Robust necroptosis induktion er kun observeret ved Dim-induceret oligomerisering af NBB140-2xFV-Venus, men ikke i mangel af Dim. Venus-kun kontrol forsøg udføres også. Alle betingelser, der er gjort i tre eksemplarer og er afbildet som gennemsnit og SD fra én repræsentant replikere. (B) Fast-kinetik necroptosis induceret i overværelse af Dim visualiseret med scanning Elektron Mikroskopi. Den tid kurset afslører morfologiske ændringer underliggende necroptosis herunder celle afrunding og hævelse (5 min), briste af plasma membran (10 min), og komplet ekstravasation af cytosol (20 min). Hver prøve havde samme antal celler ved tid 0 min. Fra venstre mod højre indeholder zoomet i området 26, 32, 23 og 36 celler med kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Bindende af NBB156 at phosphoinositides overvåges af NMR spektroskopi. (A) 1H -15N TROSY spektrum af 15N-NBB156. De kemiske skift af resonanser anvendes til normalisering af lukkede tandbøjle spektrum eller kvantificering af det åbne land er fremhævet med firkanter eller cirkler, henholdsvis. Højre, skematisk af NMR signaturer opdaget i fravær eller tilstedeværelse af lipid-vaskemiddel micelles. NBB156 binder ikke Bettinas vaskemiddel micelles i mangel af phosphoinositides. (B) overlejret 1H -15N TROSY spektre af 15N-NBB156 i nærværelse af de respektive lipid-vaskemiddel micelles. (C) enkelt 1H -15N TROSY spektre af 15N-NBB156 i nærværelse af de respektive lipid-vaskemiddel micelles fra panelet B. Ved at afsløre de åbne og lukkede konformationer utvetydigt i blandinger af de to konformationer kan vi kvantificere procentsatserne for de to opbygninger i en given prøve. PIP2 er den foretrukne lipid ligand i NBB156 en direkte forbindelse mellem MLKL og plasma membran fosfolipider. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| PCR buffer (10 x) | 5.0 ΜL |
| DNA skabelon (100 ng/µL) | 1,0 ΜL |
| cDNAs for MLKL, 2 x FKBP, Venus) | |
| dNTP'er (25 mM hver NTP) | 0,5 ΜL |
| PCR-primere frem (F) (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| PCR-primere frem (FR (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP Rasmussen | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Venus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus Rasmussen | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA-Polymerase (2,5 U/µL) | 1,0 ΜL |
| Destilleret deioniseret vand (ddH2O) | 39.9 ΜL |
| Samlede reaktion volumen | 50,0 ΜL |
| PCR cykling parametre | |
| 1 cyklus | 94-98 ° C; 45 s |
| 25 – 30 cykler | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1-2 min | |
| 1 cyklus | 72 ° C; 10 min |
Tabel 1: PCR reaktion af NB 140 -2xFV-Venus for begrænsning enzym-baserede kloning i pRetroX-TRE3G.
Tabel 2: rå data til NMR spektre præsenteret i figur 5 illustrerer den normaliserede transformation af data indsamlet fra en anden NMR magnet til den beregnede gennemsnitlige åben tandbøjle tilstand. Venligst klik her for at se en større version af denne tabel.
Movie 1: hurtig-kinetik necroptosis induceret af oligomerisering af NBB 140 -2xFV-Venus i mlkl- / - MEFs. Live Konfokal mikroskopi viser hurtig omplantning af NBB140-2xFV-Venus fra cytosol til plasmamembran efter tvungen oligomerisering af domænet FKBP. Cellerne blev behandlet som beskrevet i figur 1. Gul: NBB140-2xFV-Venus. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2: JOHANNAS mikroskopi af fast-kinetik necroptosis. JOHANNAS mikroskopi viser hurtigt (~ 2 min) relocalization og sammenlægning af MLKL på plasmamembran ved tilsætning af Dim mlkl- / - MEFs udtrykker NBB140-2xFV-Venus. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi leverer protokoller for teknikker, vi kombineret impliceret MLKL som den formodede bøddel plasmamembran brud24. Ud over at decifrere de regulerende netværk, der regulerer MLKL-medieret necroptosis, kan disse teknikker bruges selvstændigt at karakterisere andre egnede biologiske systemer. Praktisk talt, er disse teknikker medium til lav overførselshastighed registreringsværktøjer.
Vi har rutinemæssigt anvendes live-celle billeddannelse af NBB140-2xFV-Venus-mægle necroptosis, og der induceres ved andre MLKL konstruktioner, til mekanisk dissekere regulering af MLKL i necroptosis gennem mutagenese og ved hjælp af lille molekyle kemiske sonder. Navnlig, vi og andre grupper har vist, at mennesker og mus konstruktioner af MLKL, der indeholder den minimale region i NBB kan mægle necroptosis i mennesker og mus cellelinjer. En rapporteret advarsel vedrørende MLKL-medieret necroptosis er arter, der kendetegner RIPK3 og MLKL interaktion, som forhindrer krydsreaktivitet mellem arterne observeret på upstream stimulation af kombination af TNF, smac mimetics og caspase hæmning 25,35,36. Derfor, mennesker og mus RIPK3 og MLKL proteiner ikke krydsreagere under disse betingelser25,35,36. For at omgå de begrænsninger, der indbyrdes arter, indfører vi mutationer, der aktivere menneskelige MLKL eller bruge oligomerisering kassetter som vist her for NBB140-2xFV-Venus24. Menneskelige NBB140 er en konstruktion, der fastholder den hæmmende region og derfor forbliver inaktiv i forbindelse med NBB140-2xFV-Venus. Dimerization af 2xFV menes at aktivere NBB140 ved at frigive skinnen. Derimod inducerer menneskelige NBB182 necroptosis selv i mangel af oligomerisering, fordi denne konstruktion er købedygtig spontant oligomerize24. Derudover peger mutanter (R30A, R30E, E136A og E136R) aktivering NB regionen i forbindelse med fuld længde menneskelige MLKL overvinde behovet for aktivering af RIPK3 fosforylering24. Desuden vi rekonstitueres dimerizable menneskelige RIPK3 (Cerulean-2xFV-RIPK3) og Dox-inducerbar fuld længde menneskelige MLKL-Venus, som er kompatible og håndfast fremkalde necroptosis i/ripk3- / - mlkl- / - MEFs24 . Andre for nylig afslørede yderligere mutationer eller menneske-mus domæne byttet MLKL konstruktioner, der kan overvinde arter specificitet barrierer25.
Vi optimere typisk necroptosis assay betingelser ved at udføre flere range finding eksperimenter i 96-brønd plader. Vi derefter følge op med optimeret eksperimenter i 24-godt plader, som giver tilstrækkelig celler for multiplexing med supplerende fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) og western blotting analyser udføres senere på samme prøverne umiddelbart efter imaging den endelige tidspunkt. I øjeblikket, er live-celle imaging baseret på påvisning af grønne og røde fluorescens, begrænser de mærkning muligheder for mange applikationer. Et fælles alternativ til grøn fluorescerende farvestoffer er celle-vandtætte DNA-bindende fluorescerende farvestof propidium Iodid (PI). Dobbelt farve imaging instrumenter giver mulighed for at anvende disse farvestoffer med supplerende grønne eller røde fluorescerende proteiner til at forbedre indhold af necroptosis imaging nytte og oplysninger.
MLKL evne til at translocate til plasmamembran efter dens aktivering, gør levende mikroskopi teknik valg at studere biologi af dette protein og for at følge i realtid den morfologiske ændringer underliggende necroptosis. JOHANNAS mikroskopi løser utvetydigt MLKL protein aggregater på plasma membran, især når henrettet i overværelse af markører, der co Lokaliser til plasmamembran. Vi brugte LCK-C-RFP som markør for plasma membran Co lokalisering24. Evnen til at tag proteiner af interesse med forskellige fluorophores, giver også mulighed for at studere samtidigt aktiviteten af flere proteiner involveret i den samme proces. Den næste generation af super-resolution mikroskopi delvist overvinder diffraktion grænse problem i standard Konfokal mikroskopi og har potentiale til at afsløre yderligere funktioner i MLKL-medieret necroptosis.
Et af kendetegnene ved necroptosis er plasma membran permeabilization. Selvom flere teknikker kan indirekte kvantificere eller angive membran bristninger, kan kun EM visualisere afbrydelser i plasma membran integriteten induceret af MLKL. Mens TEM har den højeste potens af opløsning, har SEM evnen til at kortlægge større modellen områder. Denne funktion, kombineret med udvikling af nye og kraftfulde software i stand til at administrere større mængde data, har forbedret nytten af SEM i celle morfologi karakterisering. Desuden, SEM er også købedygtig skanne træk prøve sektioner giver mulighed for 3D rekonstruktion når koblet til andre systemer, såsom fokuseret Ion stråle. Nogle af ulemperne ved EM analyse omfatter udgifter til instrumentering og vedligeholdelse, nødvendighed af højt specialiseret personale og betydelig tid investeringer i prøve behandling og analyse.
Dot skamplet assays har været brugt oprindeligt at gøre direkte forbindelser mellem MLKL og plasma membran fosfolipider16,27. Vores NMR-baseret lipid bindende assay er endeligt belastende MLKL i specifikke phospholipid bindende, fremhæve PIP2 som MLKL ligand valg. Vores resultater viser en skadelig effekt af acyl kæde mætning på NBB156 binding til phosphatidylinositol. Alligevel, hvordan MLKL binding til PIP2og potentielt andre fosfolipider, resulterer i plasma membran brud er fortsat ukendt. Ved hjælp af denne protokol kan nogen andre phospholipid blive testet for binding til MLKL. Vores assay fungerer som et fantastisk værktøj til at teste nye modeller af MLKL-mægle necroptosis, som det kan bruges med mutanter af MLKL og forskellige ligander til at lokalisere de specifikke bidrag til lipid bindende. Derudover kan det bruges til andre membran forbundet systemer til at afhøre deres lipid bindende profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
