Summary
Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.
Abstract
Necroptosis ist ein programmierter Zelle Tod Weg, ausgelöst durch die Aktivierung des Rezeptors Interaktion Proteinkinase 3 (RIPK3), die phosphorylates und aktiviert die gemischte Abstammung Kinase-ähnliche Domäne Pseudokinase, MLKL, Bruch oder permeabilize der Plasmamembran . Necroptosis ist eine entzündliche Weg mehrere Pathologien einschließlich Autoimmunität, infektiöse und Herz-Kreislauferkrankungen, Schlaganfall, Neurodegeneration und Krebs zugeordnet. Hier beschreiben wir Protokolle, die verwendet werden, um MLKL als der Henker der Plasmamembran Bruch in Necroptosis zu charakterisieren. Wir visualisieren den Prozess der Necroptosis in Zellen mittels live Cell Imaging mit konventionellen und konfokale Fluoreszenzmikroskopie und in festen Zellen mittels Elektronenmikroskopie, die zusammen die Umverteilung von MLKL aus dem Zytosol in das Plasma enthüllt Membran vor Induktion von großen Löchern in der Plasmamembran. Wir präsentieren in Vitro Kernspinresonanz (NMR) Analyse mit Lipiden, um vermeintliche Modulatoren des MLKL-vermittelten Necroptosis zu identifizieren. Basierend auf dieser Methode, identifizierten wir quantitative Lipid-verbindliche Präferenzen und Phosphatidyl-Inositol Phosphate (PIPs) als kritische Bindemittel der MLKL, die für die Plasmamembran targeting und Permeabilisierung in Necroptosis erforderlich sind.
Introduction
Identifizierung von genetischen Komponenten des Necroptosis hat die Verwendung von Tiermodellen, die Implikation des Necroptosis in Physiologie und Krankheit1,2,3,4,5testen erleichtert. Ko von RIPK3 oder MLKL bei Mäusen hatten minimal Implikation in Entwicklung und Erwachsenen Homöostase, was darauf hindeutet, dass diese Necroptosis nicht für wichtig Leben3,6. Darüber hinaus enthalten bestimmte Arten entweder RIPK3 oder MLKL Gene, Unterstützung der unwesentliche Rolle der Necroptosis in Tiere7,8. Auf der anderen Seite hat anspruchsvolle ko Tiermodellen mit verschiedenen Pathologien im Labor induziert eine wichtige Rolle bei Entzündungen, angeborene Immunität und Virusinfektion9,10, Necroptosis ergeben 11 , 12.
Necroptosis kann auf verschiedene Weise durch Signalisierung durch verschiedene angeborene Immunität Sensoren aktiviert werden alle die sich bei der Aktivierung von RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 wiederum phosphorylates und aktiviert MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Die meisten studierte, und vielleicht der komplexeste Weg, führt zu einer Aktivierung des RIPK3 beinhaltet Tod Rezeptor Ligatur, die gabelt basierend auf die nachgelagerten Zusammensetzung der Signalisierung komplexe entweder induzieren Apoptose oder Necroptosis1. Necroptosis entsteht, wenn durch RIPK1 Signalisierung begünstigt wird und zu Engagement von RIPK319,20 führt. Dieses Ergebnis ist leicht begünstigt auf pharmakologische Hemmung oder genetische Löschung von Caspase 8, eine vermeintliche endogener Inhibitor des Necroptosis, die Necroptosis in Schach hält. RIPK1 bindet an und aktiviert RIPK3. Eine weitere Möglichkeit, Necroptosis zu aktivieren ist durch Toll-Like-Rezeptoren TLR3/TLR4 Signaltechnik, die eingreift und aktiviert RIPK3 durch TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE)21. Noch ist eine andere Art zu sterben durch Necroptosis durch Aktivierung der DNA-Sensor DAI, der direkt eingreift und aktiviert RIPK322.
MLKL ist ein cytosolischen Protein, bestehend aus einer N-terminalen Helix-Bundle (NB)-Domäne und einer C-terminalen Pseudokinase Domäne (PsKD) durch eine regulatorische Klammer Region3verbunden. In normalen Zellen ist MLKL in das Zytosol gefunden wo es angenommen wird, in einem inaktiven Komplex mit RIPK314. Aktivierung des Necroptosis löst RIPK3 Phosphorylierung des MLKL in der Aktivierung der PsKD und möglicherweise weitere Standorte in der NB und Klammer3,15,23. Phosphorylierung bewirkt eine Konformationsänderung in MLKL, der Dissoziation von RIPK314führt. Schlecht verstandene Konformationsänderungen lassen Sie die Klammer aus dem PsKD24. Die Klammer, die 2 Helices enthält, vermittelt Oligomerisierung von MLKL in einem vermeintlichen Trimer durch die C-terminale Helix25. Die N-terminale Helix der Orthese hemmt die NB-Domäne, die für Membran Permeabilisierung24,26unerlässlich. Isoliert reicht die NB Domäne Permeabilisierung der Plasmamembran und Necroptosis16,24,27induzieren. Die Pro-Necroptotic-Aktivität der NB wurde in Maus einen Mangel an MLKL (Mlkl- / - MEFs) embryonalen Fibroblasten rekonstituiert. NB ist ein Lipid-bindende Domäne, die bevorzugt die Phospholipid-Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2) eingreift. Wir haben einen schrittweisen Mechanismus der Aktivierung des MLKL, wobei Klammer Oligomerisierung erleichtert die Einstellung des MLKL in der Plasmamembran über schwachen Wechselwirkungen der NB mit dem PIP2 polare Kopfgruppe24vorgeschlagen. An der Membran erfährt die NB geregelten Exposition eine zusätzliche High-Affinity-Bindungsstelle für PIP2, die durch die Orthese in inaktiven MLKL maskiert wird. Insgesamt destabilisieren mehrere Interaktionen der NB mit PIP2 der Plasmamembran zu seinen Bruch, obwohl der molekulare Mechanismus dieser Ereignisse sind nicht geklärt.
Hier zeigen wir spezifische Methoden verwendet, um die Funktion des MLKL als Vollstrecker des Necroptosis24charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die minimalsten Domain MLKL, NB und Klammer (NBB) die Klammer Hemmung unterliegt und durch erzwungene Dimerisierung induzieren Plasmamembran Bruch und Necroptosis aktiviert werden können. Wir beschreiben unsere induzierbaren Expressionssystems kombiniert mit erzwungenen drogeninduzierte FKBP-vermittelte Dimerisierung für live Cell Imaging und Elektronenmikroskopie der Zellen Necroptosis. Darüber hinaus zeigen wir unsere in-vitro- NMR-Analyse der Interaktionen der BNB mit Phosphatidylinositols (PIPs).
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Protocol
1. Klonen und Zell-Linie-Generation
- PCR verstärken die BNB-Region entspricht Aminosäurereste 1-140 (BNB140), von menschlichen MLKL cDNA für Rahmen standard Restriktionsenzym-basierte Klonen mit Oligomerisierung Domäne 2 x FK506-bindendes Protein (2xFKBP oder 2xFV) und Venus Leuchtstofflampen Protein in Doxycyclin (Dox) - induzierbaren retroviral Vektor pRetroX-TRE3G, BNB140zu erhalten - 2xFV-Venus (Tabelle 1, Figuren 1A-B).
- Primäre Mlkl- /- oder ripk3- / - Mlkl- / - Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) erhalten aus den jeweiligen Mäusen, die in das grüne Labor durch Transiente Transfektion mit SV40-große Antigen zu verewigen mit dem Ausdruck Plasmid. Wählen Sie Zellen aus verewigt in ~ 1 – 2 Wochen, und pflegen in DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentlichen Aminosäuren bei 37 ° C und 5 % CO2 im standard Gewebe ergänzt Kultur-Inkubatoren.
- Transduzieren SV40 verewigt Mlkl- / - MEFs mit umgekehrter Tetracyclin kontrollierte transaktivator (RtTA)-enthält Retrovirus von ein Plasmid enthält die Blasticidin-Resistenz-Gen (unsere modifizierte Plasmid) ausgedrückt und Leckerbissen für 1 Woche mit 5 μg/mL Blasticidin für stabil auszudrücken RtTA28Zellen auswählen.
- Transduzieren RtTA exprimierenden MEFs mit Dox-induzierbaren retroviralen Vektors mit der Chimäre MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-Puro) und wählen Sie mit 4 μg/mL Puromycin für 1 Woche, 2 Tage nach Transduktion.
2. live-Cell-Mikroskopie-Bildgebung des MLKL-vermittelten Necroptosis
- Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 50.000 Zellen pro Bohrloch (1 mL/na) in 24 auch Platten, und über Nacht inkubieren (Abb. 2A). Verwenden Sie Leben-Zelle Färbung für automatisierte Zellzählung (siehe Tabelle der Materialien).
- Zellen für 12 h mit Dox zu behandeln (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von BNB140-2xFV-Venus.
- Induzieren Necroptosis mit 25 nM FKBP Dimerizer (Dim) zusätzlich 25 nM Membran undurchlässig grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien) in standard DMEM (siehe 1.2). Zellen Necroptosis akkumulieren den Farbstoff wie ihre Plasmamembran Integrität von BNB140kompromittiert-vermittelte riss. Führen Sie Tests in dreifacher Ausfertigung oder vervierfacht.
- Zur Überwachung der Necroptosis mit einfarbigen oder Dual bildgebende Systeme (siehe Tabelle der Materialien), legen Sie die Schiffe in die jeweiligen Belichtungseinheit, untergebracht in einem Säugetier Gewebekultur-Inkubator.
- Öffnen Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die Registerkarte Zeitplan kommenden scannt unter der Aufgabenliste.
Hinweis: dieses Protokoll ist für die Bildgebung mit einfarbigen Systemen, aber eine ähnliche Software ist für zwei-Farben-Systeme verfügbar. - Wählen Sie das "Fach, Schiff, Scantypen", und "Scan-Pattern" in der Registerkarte "Physische Layout" und "Schnell Fluoreszenz" in der Registerkarte "Eigenschaften".
- Fügen Sie die "Scan Zeit" durch Klicken auf das Fenster "Zeitachse" und die Gesamtzahl von Zeitpunkten und Frequenz des Erwerbs (in der Regel 1 Übernahme jeweils 0,5 h bis 1 h 6 h bis 12 h lang alle 5 min für schnelle Kinetik Necroptosis) und wählen Sie "App zunächst Bildaufnahme Ly"(roter Knopf).
- Necroptosis mit der Bildanalyse-Software zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien) durch Auswahl aus den "Aufgabenbereich", "Counting neue Analyse von Objekten mit festen Segmentierung Schwellenwert über der Hintergrund-Ebene", die ermittelt werden, indem Sie den Cursor der Mauszeiger über Hintergrund Regionen in mehreren Bildern in der Analyse verwendet.
- Prüfen Sie fluoreszierende Objekte durch Auswahl mit aktuellen Bild Vorschau und verfeinern Sie die Schwellenwerte nach Bedarf.
- Integrieren Sie grüne Fluoreszenz zählt durch Öffnen der Registerkarte "Neue Analyse starten" zu, wählen Sie den "Zeitbereich", die Brunnen analysiert werden, geben den Auftragsnamen"Analyse", und drücken "OK".
- Zugang analysiert Daten aus der Registerkarte "Analyse Aufträge" durch einen Doppelklick auf den Namen des jeweiligen Auftrags und aus dem Diagramm/Export-Fenster für die weitere Analyse in externen Grafik-Software exportieren (siehe Tabelle der Materialien).
- Quantitate Daten als grüne Fluoreszenz positiv (+ Ve) zählt/mm2 oder normalisieren die Grafen von Confluence und drücken die Daten als grüne Fluoreszenz + Ve zählt/Zusammenfluss.
- Optional am experimentellen Endpunkt Beflecken Zellen mit 100 nM die Membran-permeationsfähigen grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien). Daten auf % Necroptotic Zellen als das Verhältnis der grünen Fluoreszenz/grüne Fluoreszenz am Endpunkt zu normalisieren.
3. live-Zelle konfokalen Mikroskopie Bildgebung der Plasmamembran Rekrutierung und Permeabilisierung von MLKL
- Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 20.000 Zellen pro Bohrloch (0,5 mL/na) in einem Glas unten 4-Well Mikroskopie Kammer vorbehandelt mit 50 µg/mL Fibronektin in PBS bei 37 ° C für 30 min und ~ 12 h ( inkubieren Abbildung 2B).
- Behandlung der Zellen mit Dox (0,5 μg/mL) für ~ 12 h induzieren die Expression von BNB140-2xFV-Venus.
- Induzieren Necroptosis durch Inkubation mit frischem Medium (1 mL/na) mit 25 nM Dim induzieren BNB140-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran.
- Legen Sie die Kammer auf eine drehenden Scheibe Laserscanning confocal Mikroskop gebaut auf einem umgekehrten Stand ausgestattet mit Umweltkontrolle und ein 63 1,4 NA Ziel und imaging-Erwerb mit Software der Wahl beginnen (siehe Tabelle der Materialien).
- Initialisieren der Software, wählen Sie "Focus" Symbol und YFP Filterkonfiguration (Erregung Wellenlänge 515 nm).
- Suchen Sie das Sichtfeld und die Brennebene und engagieren Sie das Wartung-System mithilfe der Registerkarte "Definitive Fokus" zu.
- Um Übernahme zu beginnen, die Registerkarte "Capture" gefolgt von Zuordnung der Filterkonfiguration, geeignete EMCCD Kamera Belichtung Zeit und Intensivierung Verstärkung und Zeitraffer Aufnahmeparameter einschließlich Intervall und Länge des Erwerbs.
- Zelluläre Umverteilung der fluoreszierenden BNB140zu überwachen-2xFV-Venus-Protein während der Necroptosis durch den Erwerb von Bilder alle 10 s mit einer EMCCD Kamera mit einem 515 nm Laser (Film 1).
Hinweis: Immunofluoreszenz geht mit fluoreszierenden Proteins Bildgebung. Venus ist eines der widerstandsfähiger fluoreszierende Proteine Immunofluoreszenz29. Fluoreszierende Proteine, anfälliger für Immunofluoreszenz sind, verwendet, Bild alle 30 s oder länger, um die Wiederherstellung des Signals zwischen bildgebenden Zeitpunkten ermöglichen. - Plasmamembran Verband der BNB140überwachen-2xFV-Venus während Necroptosis, Bild alle 10 s die Probe vorbereitet in 3.3 durch Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einer automatisierten TIRF-Slider und eine 100 x 1,4 NA Ziel und einer EMCCD Kamera (Film 2). Führen Sie die Schritte 3,5 – 3,7, aber passen Sie den Winkel der TIRF innerhalb der TIRF Fokus Registerkarte nach Probe und unten Glasstärke der Mikroskopie Kammer.
Hinweis: Plasmamembran Markierungen wie LCK-C-RFP können als Steuerelemente für die Plasmamembran Lokalisierung in TIRF Analyse verwendet werden. - Durchführen Sie Bildverarbeitung zur Verbesserung der Qualität durch Faltung mit der negativen normalisierte zweite Ableitung einer Gaußschen Funktion (Marr Algorithmus).
(4) Elektronenmikroskopie
- Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 5 Millionen Zellen in einem Plasma beschichtet 150 mm Zelle Kulturschale und inkubieren Sie für 12 h (Abbildung 3).
- Behandlung der Zellen mit Doxycyclin (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von NB1-140-2xFV-Venus für 12 h.
- Induzieren BNB140-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran mit 25 nM Homodimerizer für 5 Minuten. Diesmal wird aus der Kinetik der Necroptosis beobachtet in live Cell Imaging gegründet.
- Entfernen Sie das Medium und beheben Zellen mit 10 mL 2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer pH 7,4 (Cacodylate Puffer) bei 37 ° c vorgewärmt zu
- Sammeln der Probenmaterials durch Schaben und Spinnen die Proben 10 min bei 500 X g. Verwerfen Sie den überstand.
- Postfix die Probe für 1,5 h in reduzierten 2 % Osmium ausgefällt mit 1,5 % Kaliumferrocyanid in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer. Osmium ausgefällt ist eine Färbung Agent in TEM Kontrast am meisten benutzt. Wir benutzten TEM als vorläufige Analyse vor SEM der Zelle Necroptosis unterziehen.
- Spülen Sie die Probe 5 Mal in Reinstwasser für 5 min bei 500 X g, gefolgt von Spülungen im Puffer (siehe 4.6), Wasser und Ethanol auf eine automatische Prozessor. Verwerfen Sie den überstand.
- Für die SEM Fleck vorher festen Proben mit 1 % Uranyl Acetat und Blei Aspartat-Schwermetall Fleck31.
- Die Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol und Propylen oxid Lösungen zu entwässern.
- Einbetten der Probenmaterials in harten Harz32 , einen Harz-Block zu erhalten.
- Schneiden Sie dicke Schichten von 0,5 μm zu bestimmen, den richtigen Bereich der Analyse.
- Bestreichen Sie die Proben mit einem hauchdünnen Film von elektrisch leitfähigen Metall (Iridium).
- Image und analysieren die Proben (Abbildung 3). Für die Quantifizierung, ein Low-Vergrößerung Bild der Block Harzoberfläche mit exponierten Zellen wird gescannt, bei 5 keV mit einem Elektronenmikroskop.
- Zellen in einzelne Bilder von SEM zu visualisieren oder imaging-Software genutzt werden kann, um mehrere Felder-of-View in einem zusammenhängenden Bild30beitreten. Etwa 100 Zellen verwendet werden, um den Bruch der Zellen in der Necroptosis auf diese Weise durch die Erzeugung einer hochauflösenden Montage im Software der Wahl zu bewerten (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Scoring nekrotische Morphologie von SEM normale Zelle Funktionen mit dem Fortschreiten der Pre-nekrotische oder nekrotischen Phänotypen vergleicht. Zu diesen Features gehören Plasmamembran Änderungen einschließlich Mikrovilli verschwinden, Abflachung, Brüche in den Zellen von 10 nm bis 1 µm Größe oder Verlust der Organelle Struktur über mindestens 30 – 40 % der cytosolischen Zellbereich.
(5) Lipid-Bindung des MLKL durch Kernresonanzspektroskopie (NMR)
- 15N beschriftet BNB1-156 von standard Protein-Expression und Reinigung wie oben beschrieben24vorzubereiten.
- Auflösen von 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol Ammoniumsalz (18:0 PI) und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) Ammoniumsalz (18:1 PI) in 500 µL des eiskalten Kchl3 jeweils für Endkonzentrationen von 1 mg/mL.
- 1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI im Wasserbad Beschallung für 1 min bei Raumtemperatur beschallen oder bis zu 5 min in ein Eis-Wasser-Gemisch.
-
Aliquoten 1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI in sauberes glasvials für individuelle NMR Titration Serie (Abbildung 4). Transfer-Lipide in organischen Lösungsmitteln mit luftdichten Glas Spritzen.
- Aliquoten 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (molare Masse = 880.137 g/Mol) in Kchl3 für eine endgültige Wiederfreisetzung Volumen von 1.200 µL bei 125 µM Konzentration.
Hinweis: Für 5 mm NMR Röhrchen, bereiten Sie serielle Verdünnung Mengen von > 1.000 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 500 µL. Vorbereitung 3 mm NMR Röhrchen, serielle Verdünnung Datenmengen > 300 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 150 µL.
- Aliquoten 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (molare Masse = 880.137 g/Mol) in Kchl3 für eine endgültige Wiederfreisetzung Volumen von 1.200 µL bei 125 µM Konzentration.
- Aliquoten 1 mg/mL porcinen Gehirn L-α-Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Ammoniumsalz in 20:9:1 Kchl3/MeOH/H2O (Gehirn PI (4,5) P2) in saubere Glasflaschen.
- Stellen Sie Fläschchen unter einem gasförmigen Strom von Argon (Ar) oder Stickstoff (N2) mit mäßiger Strömung organisches Lösungsmittel verdunsten ohne zu spritzen gegen die Glaswände Fläschchen. 5 bis 30 min ist in der Regel ausreichend für Volumina von 10 bis 200 µL organischen Lösungsmittel.
- Ordnen Sie Glas Ampulle(n) auf Grund einer Büchner oder große Pinzette Isolierflasche mit Gummistopfen verschließen und befestigen Sie Kunststoffschlauch mit einer Vakuumleitung verbunden. Evakuieren Sie Kolben unter milden Vakuum über Nacht, verbleibende organische Stoffe zu entfernen.
- Lipid-Film-Aliquote mit Inertgas überlagert, mit einem luftdichten Deckel verschließen und bei-20 ° C für den Einsatz innerhalb eines Monats oder-80 ° C für die längerfristige Lagerung lagern.
- Bereiten Sie NMR Probe Puffer ohne Waschmittel (-Det) mit 20 mM NaXHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O und Waschmittel (+ Det) mit 20 mM NaXHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O, 0,34 mM n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM).
- Hinzufügen + Det Puffer Glasfläschchen mit Lipid-Film auf gewünschte Konzentration zu erreichen und im Wasserbad für bis zu 30 min, abwechselnd Beschallung für 10 min beschallen gefolgt durch Sichtkontrolle.
Hinweis: Beschallung kann Probe warm. Raumtemperatur für 15 min vor der endgültigen Protein Probe Rekonstitution abkühlen lassen. - Führen Sie serielle Verdünnung der Lipid-Reinigungsmittel-Mizellen in + Det Puffer mit Beschallung von 1:1 Mischungen für die gewünschte Konzentration-Serie. Ab 125 µM Lipidkonzentration, werden drei Wiederholungen 62,5 µM, 31,3 µM und 15,6 µM Lipid in 0,34 mM DDM ergeben.
- Bereiten Sie Kontrolle und NMR-Proben von Protein und Zusatzstoffe in - Det zu verweisen und + Det Puffer, beziehungsweise. Protein und Additive zu jeder Verdünnung der Lipid in + Det Puffer hinzufügen.
Hinweis: Für 15N BNB156, Protein ist hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 40 µM und ergänzt mit 2 mM deuterierter Dithiothreitol, Cys Rückstände reduziert zu halten. - Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Proben auf 5 mm oder 3 mm NMR Röhrchen (siehe Hinweis im Schritt 5.4).
- Manuell laden Sie Proben in NMR-Gerät oder in ein Automatisierungs-Plattform wie der SampleCase Loader vereinbaren.
- Zusammengesetzte NMR-Spektren mit standard Puls-Programme für 1H Proton Spektren als Qualitätskontrolle gefolgt von 2D 1H -15N Korrelation Spektren entweder als transversale Entspannung optimiert Spektroskopie (TROSY) zu erwerben oder Heteronuclear mehrere Quantum Kohärenz (SOFAST-HMQC)33.
Hinweis: Verwendung von 3 mm NMR Röhrchen erfordert 64 Scans für 1 H -15N TROSY (~ 3 h) oder 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan-Nummern sind für 5 mm NMR Röhrchen halbiert. - Verarbeitete 2D NMR-Spektren können eine CARA Repository34 zur Analyse oder anderer Software der Wahl für den Benutzer hinzugefügt werden.
-
Analysieren Sie Software, indem Sie kommentieren 2D NMR-Resonanzen für drei gut dispergierte und gelöst Spitzen für jedes Protein-Staat. Notieren Sie die Peak-Amplituden für jede der sechs Gipfel für jeden Puffer Zustand mit BNB156 (Abb. 5A).
- CARA verwenden, um eine Batch-Integration-Liste erstellen (Klicken Sie auf Main Menu Rubrik "Spektrum | Setup-Batch-Liste"...) Alle Spektren gesammelt und zu analysieren, mit einer einzigen Spitze Aufgabendatei (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Importieren Sie Peaklist"... ...und wählen Sie eine benutzerdefinierte .peaks-Datei mit 6 total Gipfeln, 3 für jedes Protein Staates innerhalb definiert).
- Feinabstimmung der Einstellungen vornehmen ("Integrator | Tune Peak Modell"...) der X-Breite 0,06 ppm und Y-Breite 0,30 ppm (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Tune Peak Modell"...) vor der Aufnahme der endgültigen Ausgabe in zwei Menüauswahl (1.) Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Integrieren Sie Batch-Liste") (2. Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Integration-Tabelle exportieren") (Abb. 5B).
Hinweis: Die Rückgrat Amid Resonanzen für Rückstände M21, V53 und L105 wurden für den BNB156 geschlossen-Brace Staat zugewiesen. Der Open-Brace-Staat war Rückgrat Amid Resonanzen von Rückständen G130 und A141 und Epsilon Proton Sidechain-Resonanz der W133 mit 3D NMR-Experimente-24zugeordnet.
- Normalisieren Sie Proben für den direkten Vergleich von verschiedenen Magneten oder Probe Bedingungen durch Mittelung der drei Open-Brace Amplituden der Referenzproben und berechnen einen Normalisierungsfaktor im Zusammenhang mit den beiden Referenzen. Berechnen Sie die skalierten Amplituden für BNB156 Resonanzen mit den Normalisierungsfaktor und Einstellung negative Amplituden auf NULL (Tabelle 2).
Beispiele: (1) Vergleich von Proben aus verschiedenen Magneten: Magnet A, BNB156DDM und Magnet B, BNB156+ DDM. (2) Waschmittel Vergleich: 0,34 mM DDM und 1,7 mM DDM. - Berechnen Sie für jede Resonanz, dass die skalierte Bruchteil des geschlossen - oder Open-Klammer durch Division mit der Palette von Mindest-und maximale Amplitude der alle Spektren enthalten entsprechende Hinweise frei BNB156 und vollständig offen-Brace BNB156 in gesammelt Waschmittel.
- Die normalisierte NMR-Amplituden als Funktion der Lipidkonzentration des Grundstückes und vergleichen den Bruchteil der öffnen-Brace BNB156 unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung. 5 C).
Hinweis: Alternativ kann Analyse des Bruchs der geschlossen-Brace Konformation gegen Lipidkonzentration durchgeführt werden um Lipid Bindung an BNB156zu vergleichen. Wir bevorzugen die frühere Analyse, weil es schneller und bessere Berichte auf den Bruch-durch Lipide engagiert.
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Representative Results
Visualisierung von regulierten Necroptosis Ausführung in lebenden Zellen wurde möglich durch induzierbaren Ausdruck eines minimalen abgeschnittene MLKL Konstrukts, BNB140-2xFV-Venus. Dieses Konstrukt behält die Fähigkeit, Plasmamembran Permeabilisierung induzieren und durch Dim-induzierte Oligomerisierung FKBP-Kassette (2xFV) aktiviert ist. Wir beobachten und Quantifizierung der Necroptosis durch live-Cell-Mikroskopie imaging, Überwachung kinetisch (alle 5 min) die Aufnahme einer Zelle undurchlässigen grünen Fluoreszenz DNA-Bindung Färbung(Abbildung 6). Dieses induzierbaren Systems ist sehr robust und komplette Necroptosis der Mlkl- / - MEFs beobachtet werden, innerhalb von ~ 1 h nach Dim-vermittelten Oligomerisierung von Dox preincubated Zellen, die BNB140express-2xFV-Venus (Abbildung 1A ). Wir bezeichnen diese Bedingungen als Fast-Kinetik Necroptosis. Ausdruck der Venus allein ± Dim oder BNB140-2xFV-Venus bei fehlender Dim nicht dazu veranlassen, die Necroptosis(Abbildung 6). In der Regel führen wir mindestens 3 replizieren bildgebende Experimenten in dreifacher Ausfertigung oder vervierfacht in 24, 96 oder 384-Well Platten.
Die schnell-Kinetik Necroptosis induziert durch erzwungene Dimerisierung von BNB140-2xFV-Venus(Abbildung 6)unterstützt die Rolle des MLKL als die vermeintliche Henker der Plasmamembran Bruch. Die Umverteilung der BNB140visualisieren-2xFV-Venus an der Plasmamembran während Necroptosis, Leben-Zelle konfokalen Mikroskopie wird verwendet, um Venus Fluoreszenz zu überwachen. Während der Fast-Kinetik Necroptosis, innerhalb von 2 – 3 min Inkubation mit Dim Venus, die Beschichtung der Zelle Peripherie beobachtet wird, gefolgt von schrittweise Zelle Rundung (Film 1). BNB140-2xFV-Venus-Ansammlung an der Plasmamembran wird visualisiert, indem TIRF konfokalen Mikroskopie, dessen Schwerpunkt das Zellvolumen an der Zellflüssigkeit-Plasma-Membran-Glas-Schnittstelle. Plasmamembran-assoziierten Venus Puncta sind innerhalb von 1 – 2 min Inkubation mit Dim (Movie 2) sichtbar. So durchgesetzt Oligomerisierung von BNB140-2xFV-Venus induziert die rasche Umverteilung zur Plasmamembran.
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, die morphologischen Veränderungen in den Zellen, die sich in Necroptosis zu offenbaren. Unter schnell Necroptosis induziert durch Oligomerisierung von BNB140-2xFV-Venus, Zellen ändern Morphologie von normalen länglichen Formen (Zeitpunkt 0 min), gerundet und schwoll (5 min), teilweise gebrochen (10 min) und weitgehend demontiert, wo die Zellflüssigkeit hat verschwunden (20 min) (Abbildung 6B). SEM ergänzt die bisherigen Beobachtungen von Leben-Zelle Mikroskopie korrelieren MLKL Lokalisierung in der Plasmamembran mit Membran-Bruch. Insgesamt die hierin vorgestellten mikroskopiertechniken bieten ergänzende Mittel zu überwachen, bewerten und Necroptosis auf zellulärer Ebene zu quantifizieren und implizieren BNB140-2xFV-Venus bei der Ausführung der Plasmamembran Bruch.
Um festzustellen, ob MLKL der Plasmamembran direkt kontaktieren kann führen wir durch in-vitro- Lipid verbindliche Experimente durch NMR-Spektroskopie mit rekombinanten BNB156überwacht. Verdünnungsreihen von Lipid-Reinigungsmittel Micellen, mit einer Konstanten Konzentration des Reinigungsmittels (Fahrzeug für Lipid-Präsentation) und Variable Lipid-Konzentrationen sind für die Bindung an 15N beschriftet BNB156 von 2D NMR-Spektroskopie, getestet, Monitore Bindung-induzierte Veränderungen des Proteins. BNB156 erfährt weitreichender Strukturveränderungen auf Lipid binden an die hemmenden Klammer-Region (Aminosäuren 132-156) aus dem abgeschlossenen und spiralförmige verdrängen (Klammer geschlossen), der offen und intrinsisch ungeordneten Konformation (öffnen Klammer) (Abbildung 7 A). Zweidimensionale NMR-Spektroskopie bietet pro Rückstand Informationen auf Mischungen von beiden Umformer (Zahlen 7 b-7 C). Das Rückgrat Amide von beiden Umformer24vorher Zuge- Wir können die Prozentsätze der geschlossenen und offenen Umformer in einer gegebenen Probe leicht überwachen, wie in Abbildungen 5A-Cbeschrieben. Mit dieser Bindung-Assay, erkunden wir BNB156 Bindung Pips im DDM Waschmittel, die inert gegenüber BNB156 (Abb. 5B) verbindlich ist. In diesem Test ist PIP2 der besten BNB156 Liganden, der vollständige Öffnung der hemmenden Orthese bei 125 µM (Abbildung 5C) induziert. Im Gegensatz dazu sind gesättigte (18:0) PI und ungesättigten (18:1) PI schlechte BNB156 Liganden induzierende teilweise Klammer öffnen unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 5C). Unsere NMR-basierte Lipid-Bindung-Assay bietet zusätzlichen Nachweise für die Interaktion von MLKL NBB156 mit Phospholipiden und schlägt eine direkte Verbindung zwischen MLKL und der Plasmamembran.
Abbildung 1: Stabile Zelllinie beherbergen ein modifiziertes Tet-auf 3 G induzierbaren System. (A) stabilen Zelllinien wurden durch retrovirale Transduktion von/Mlkl/ - MEFs erzeugt, mit der pTREX RtTA Blast gefolgt von der pRetroX-TRE3G-NBB-140-2xFV-Venus-Puro. Jeder Transduktion folgte antibiotische Auswahl für bis zu 1 Woche vor dem Umzug auf nachfolgende Analysen. (B) schematische Darstellung der induzierbaren MLKL Expressionssystem. Dieses System basiert auf 2 Droge-induzierbaren rechtliche Schritte: (i) MLKL gen-Expression und Protein-Produktion (+ Dox) und (Ii) Aktivierung von Oligomerisierung (+ Dim). Protein-Produktion im Voraus + Dox induziert wird, schnell-Kinetik Necroptosis ausgelöst werden, + Dimmen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Live Cell Imaging von schnell-Kinetik Necroptosis zeigt schnelle Membran Relokalisierung der MLKL. (A) schnell-Kinetik Necroptosis induziert, wie in Abbildung 1 b in ein bildgebendes System überwacht werden kann. Necroptosis wird durch die Aufnahme von der Zelle-undurchlässigen grünen Fluoreszenzfarbstoff bewertet. (B) schematische Darstellung live Cell Imaging von schnell-Kinetik Necroptosis mit Epifluoreszenz und insgesamt interne Reflexion (TIRF) Mikroskopie Fluoreszenzanalyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Schematische Darstellung des Scannens Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Probenvorbereitung und Analyse. Zellen von schnell-Kinetik Necroptosis induziert, wie in Abbildung 1 beschrieben werden auf die Platte zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von Dim fixiert. Die Zellen werden dann auf SEM Analyse durch Schaben und Bündelung, Heavy-Metal zu beflecken, Harz einbetten und Iridium Beschichtung wie in Abschnitt 4 beschrieben vorbereitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Probieren Sie Vorbereitung und Datenerfassung durch NMR Titrationen von 15N BNB156 und Lipid-Reinigungsmittel Micellen. Dieser Assay und Analyse erfolgt in der Regel in 3 – 4 Tage: Tag 1, Lipid Aliquote verzichtet und über Nacht getrocknet. Tag 2 sind die Lipid-Filme in Assay-Puffer ± Wasch-, beschallt, und seriell verdünnt (zweifach) rehydriert, durch gleiche Volumina der eingeweichtes Lipid-Lösung mit Lipid-freie Pufferlösung mischen. Jeder Verdünnung ist beschallt, um homogene Durchmischung und Verteilung von Lipiden in Waschmittel Micellen vor nachfolgenden Verdünnungen zu gewährleisten. Proteinproben gemischt in die serielle Lipid-Reinigungsmittel Micelle Verdünnungen, geladen in den entsprechenden NMR-Röhrchen, in einen SampleCase Loader (oder manuell), und automatische NMR-Daten-Erfassung wird gestartet. Während der folgenden Tage ist NMR Datenerhebung abgeschlossen und gefolgt von 2D NMR-Analyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Lipid-verbindliche Präferenzen der BNB156 gemessen mittels 2D NMR. (A) 1H -15N TROSY Spektren für 15N-BNB156 in der Gegenwart (rot) oder fehlen (blau) von 125 µM PI (4,5) P2 in 0,34 mM DDM visualisiert in CARA überlagert. (B) eindimensionale Scheiben Resonanzen zur Amplitude Messungen und Normalisierung. Das rohe Spektrum (grün) wird mit der Grenze für Amplitude und Integration durch das Programm CARA überlagert. (C) normalisierte Amplituden der BNB156 in Anwesenheit von Phosphoinositide-DDM Micellen aufgetragen gegen Lipidkonzentration. PIP-2 induziert die vollständige Öffnung der Orthese. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Schnell-Kinetik Necroptosis induziert durch Oligomerisierung von BNB140-2xFV-Venus in/Mlkl- / - MEFs. (A) Necroptosis Quantifizierung von Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Bildgebung der Aufnahme von Zelle-undurchlässig, DNA-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff. Robuste Necroptosis Induktion wird nur bei Dim-induzierte Oligomerisierung von BNB140beobachtet-2xFV-Venus, aber nicht in Abwesenheit von Dim. Nur-Venus-Control-Experimente werden auch durchgeführt. Alle Bedingungen sind in dreifacher Ausfertigung erledigt und sind als Durchschnitt geplottet und SD aus einem Vertreter zu replizieren. (B) schnell-Kinetik Necroptosis induziert in Anwesenheit von Dim mit Rasterelektronenmikroskopie visualisiert. Die Zeit, die Kurs zeigt morphologische Veränderungen zugrunde liegenden Necroptosis einschließlich Zelle Rundung und Schwellungen (5 min), Bruch der Plasmamembran (10 min) und komplette Extravasation der Zellflüssigkeit (20 min). Jede Probe hatte ähnliche Anzahl von Zellen auf 0 min Zeit. Die vergrößerte Bereich enthält von links nach rechts 26, 32, 23 und 36 Zellen mit Kernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Bindung von BNB156 , überwacht durch NMR-Spektroskopie Phosphoinositides. (A) 1H -15N TROSY Spektrum von 15N-BNB-156. Die chemischen Verschiebungen von Resonanzen zur Normalisierung des Spektrums geschlossene Klammer oder Quantifizierung der geöffneten Zustand verwendet werden bzw. mit Quadrate oder Kreise, hervorgehoben. Richtig, schematische Darstellung der NMR-Signaturen in das Fehlen oder Vorhandensein von Lipid-Reinigungsmittel Micellen erkannt. BNB156 bindet nicht DDM Waschmittel Micellen bei fehlender Phosphoinositides. (B) 1H -15N TROSY Spektren von 15N-BNB156 im Beisein der jeweiligen Lipid-Reinigungsmittel-Mizellen überlagert. (C) Single 1H -15N TROSY Spektren von 15N-BNB156 im Beisein der jeweiligen Lipid-Reinigungsmittel Micellen aus Gruppe B. Durch das Erkennen von offenen und geschlossenen Konformationen eindeutig in Mischungen von zwei Konformationen können wir die Prozentsätze der zwei Umformer in einer gegebenen Probe quantifizieren. PIP-2 ist der bevorzugte Lipid-Liganden von BNB156 bietet eine direkte Verbindung zwischen MLKL und Plasmamembran Phospholipide. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| PCR-Puffer (10 X) | 5,0 ΜL |
| DNA-Vorlage (100 ng/µL) | 1,0 ΜL |
| cDNAs für MLKL, 2 X FKBP, Venus) | |
| dNTPs (25 mM jedes NTP) | 0,5 ΜL |
| PCR-Primer weiterleiten (F) (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| PCR-Primer weiterleiten (FR (100 ng/µL) | 1.3 ΜL |
| BNB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| BNB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| Venus F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| Venus R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA-Polymerase (2,5 U/µL) | 1,0 ΜL |
| Destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O) | 39,9 ΜL |
| Gesamte Reaktionsvolumen | 50,0 ΜL |
| PCR-Radsport-Parameter | |
| 1 Zyklus | 94-98 ° C; 45 s |
| 25 – 30 Zyklen | 94-98 ° C; 45 s |
| 58 ° C; 45 s | |
| 72 ° C; 1 – 2 min. | |
| 1 Zyklus | 72 ° C; 10 min |
Tabelle 1: PCR-Reaktion der NB 140 -2xFV-Venus für Restriktionsenzym auf Klonen in pRetroX-TRE3G.
Tabelle 2: Rohdaten für NMR-Spektren dargestellt in Abbildung 5 veranschaulicht die normalisierten Transformation von Daten gesammelt von einem zweiten NMR-Magneten in den berechneten durchschnittlichen öffnende geschweifte Klammer Zustand. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Tabelle zu sehen.
Movie 1: schnell-Kinetik Necroptosis induziert durch Oligomerisierung von BNB 140 -2xFV-Venus in Mlkl- / - MEFs. Leben der konfokalen Mikroskopie zeigt die schnelle Translokation von BNB140-2xFV-Venus aus dem Zytosol der Plasmamembran nach erzwungenen Oligomerisierung FKBP-Domäne. Die Zellen wurden behandelt, wie in Abbildung 1 beschrieben. Gelb: BNB140-2xFV-Venus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Movie 2: TIRF-Mikroskopie des schnell-Kinetik Necroptosis. TIRF-Mikroskopie zeigt schnell (~ 2 min) Relokalisierung und Aggregation von MLKL auf der Plasmamembran auf Zusatz von Dim, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Wir bieten Protokolle für Techniken, die wir zusammen als die vermeintliche Henker der Plasmamembran Bruch24MLKL verwickelt. Neben der Entschlüsselung der regulatorischen Netzwerk, das MLKL-vermittelten Necroptosis regelt, können diese Techniken unabhängig verwendet werden, andere geeignete biologische Systeme zu charakterisieren. Praktisch gesehen, sind diese Techniken Medium zu niedrigen Durchsatz Discovery-Tools.
Wir haben routinemäßig verwendet live Cell Imaging von BNB140-2xFV-Venus-vermitteln Necroptosis und induziert durch andere MLKL Konstrukte, die Regulierung des MLKL in Necroptosis durch Mutagenese und mithilfe kleinen Moleküle chemische mechanistisch zu zergliedern Sonden. Insbesondere wir und andere Gruppen haben gezeigt, dass Menschen und Maus Konstrukte der MLKL, die minimale Umgebung: BNB enthalten können Necroptosis in Mensch und Maus-Zell-Linien vermitteln. Man berichtete Vorbehalt für MLKL-vermittelten Necroptosis Arten Spezifität der RIPK3 und MLKL Interaktion, die Kreuzreaktivität zwischen den Arten beobachtet nach vorgelagerten Stimulation durch Kombination von TNF, Smac-Mimetika und Caspase Hemmung verhindert 25,35,36. Entsprechend, Mensch und Maus RIPK3 und MLKL Proteine nicht unter diesen Bedingungen25,35,36Kreuzreaktion. Um die Inter-Spezies-Einschränkungen zu umgehen, stellen wir Mutationen, die menschliche MLKL zu aktivieren oder verwenden Oligomerisierung Kassetten wie hier gezeigt für BNB140-2xFV-Venus24. Menschlichen BNB140 ist ein Konstrukt, das die hemmende Region unterhält und daher bleibt inaktiv im Zusammenhang mit der NBB140-2xFV-Venus. Dimerisierung von 2xFV wird gedacht, um BNB140 aktivieren durch die Klammer zu lösen. Im Gegensatz dazu induziert menschlichen BNB182 Necroptosis auch in Abwesenheit der Oligomerisierung, weil dieses Konstrukt in der Lage ist, spontan24oligomerize. Darüber hinaus zeigen Sie Mutanten (R30A, R30E, E136A und E136R) Aktivierung der NB-Region im Rahmen des Full-Length menschlichen MLKL die Notwendigkeit der Aktivierung von RIPK3 Phosphorylierung24zu überwinden. Darüber hinaus wir rekonstituiert dimerizable menschlichen RIPK3 (himmelblau-2xFV-RIPK3) und Dox-induzierbaren Full-Length menschlichen MLKL-Venus, die kompatibel sind und robust induzieren Necroptosis in/ripk3- / - Mlkl- / - MEFs24 . Andere vor kurzem ergeben weitere Mutationen oder Mensch-Maus-Domäne vertauscht MLKL Konstrukte, die Spezies Spezifität Barrieren25überwinden können.
Wir optimieren in der Regel die Necroptosis-Assay-Bedingungen durch mehrere Bereich-Feststellung experimentieren in 96-Well Platten. Wir folgen dann mit optimierten Experimente in 24-Well-Platten, die genügend Zellen für multiplexing mit den ergänzenden fluoreszierende aktivierte Zellsortierung (FACS) und westlichen befleckenden Analysen später auf die gleichen Proben zur Verfügung stellen unmittelbar nach der endgültige Zeitpunkt imaging. Live Cell Imaging basiert derzeit auf Erkennung der grüne und rote Fluoreszenz, Begrenzung der Kennzeichnung Möglichkeiten für viele Anwendungen. Eine gemeinsame Alternative zum grün fluoreszierende Farbstoffe ist die Zelle-undurchlässig DNA-Bindung Fluoreszenzfarbstoff Propidium Jodid (PI). Dual Color imaging Instrumente bieten die Möglichkeit der Verwendung dieser Farbstoffe mit komplementären grün oder rot fluoreszierende Proteine, um die Dienstprogramm und Informationsgehalt der Necroptosis Bildgebung zu verbessern.
Die Fähigkeit des MLKL, um die Plasmamembran nach seiner Aktivierung translozieren live Mikroskopie macht die Technik der Wahl, die Biologie dieses Proteins zu studieren und um in Echtzeit verfolgen die morphologischen Veränderungen zugrunde liegenden Necroptosis. TIRF-Mikroskopie löst eindeutig MLKL Protein-Aggregate auf der Plasmamembran, vor allem, wenn in Gegenwart von Markierungen ausgeführt, die an der Plasmamembran Co zu lokalisieren. Wir benutzten LCK-C-RFP als ein Marker für die Plasmamembran Co Lokalisierung24. Die Fähigkeit, Tag Proteine des Interesses mit verschiedenen Fluorophore, erlaubt auch gleichzeitig die Aktivität der verschiedenen Proteinen, die in demselben Prozess zu studieren. Die nächste Generation der Super-Auflösung Mikroskopie teilweise überwindet die Beugung Begrenzung Problem im standard konfokalen Mikroskopie und hat das Potenzial, die zusätzlichen Features des MLKL-vermittelten Necroptosis zu offenbaren.
Eines der Markenzeichen des Necroptosis ist Permeabilisierung der Plasmamembran. Auch wenn verschiedene Techniken können indirekt zu quantifizieren oder Membran Brüche zeigen, kann nur EM Diskontinuitäten in der Plasmamembran Integrität induziert durch MLKL visualisieren. Während TEM die höchste Auflösung ausübt, hat SEM die Fähigkeit, größere Bereiche der Probe zuordnen. Diese Funktion, kombiniert mit der Entwicklung von neuen und leistungsfähigen Software in der Lage, größere Datenmengen zu verwalten ist das Dienstprogramm von SEM in der Zelle Morphologie Charakterisierung erhöht. SEM ist übrigens auch in Folge Probe Abschnitte so dass 3D-Rekonstruktion Verbindung zu anderen Systemen, wie konzentriert Ionenstrahl scannen. Einige der Nachteile des EM-Analyse beinhalten die Kosten für die Instrumentierung und Wartung, Notwendigkeit der hoch spezialisierten Personal und erheblichen Zeitaufwand Probenbearbeitung und Analyse.
Dot-Blot Assays wurden ursprünglich zur direkten Verbindungen zwischen MLKL und Plasmamembran Phospholipide16,27zu machen. Unsere NMR-basierte Lipid-Bindung-Assay impliziert endgültig MLKL in spezifische Phospholipid-Bindung, Hervorhebung PIP2 als MLKL Liganden der Wahl. Unsere Ergebnisse zeigen einen gesundheitsschädlichen Effekt der Acyl-Kette Sättigung auf BNB156 Bindung an Phosphatidylinositol. Dennoch ergibt sich wie MLKL Bindung an PIP2und mögliche andere Phospholipide, Plasmamembran Bruch bleibt unbekannt. Mit diesem Protokoll kann andere Phospholipid für die Bindung an MLKL geprüft werden. Unsere Assay dient als ein großartiges Werkzeug zum testen neue Modelle von Necroptosis MLKL zu vermitteln, wie es mit Mutanten von MLKL und verschiedenen Liganden verwendet werden kann, um die spezifischen Beiträge zur Lipid-Bindung zu lokalisieren. Darüber hinaus kann es für andere verbundene Membransysteme um ihre Blutfettwerte Bindung zu verhören verwendet werden.
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Disclosures
Keine.
Acknowledgments
Keine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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