Summary
走査型電子顕微鏡および NMR による脂質結合ネクロトーシス従来および共焦点の生細胞顕微鏡イメージングなどの MLKL を介した膜破断の法を述べる。
Abstract
ネクロトーシスはし、混合系統キナーゼのようなドメインの pseudokinase、MLKL の破裂や permeabilize 血しょう膜を活性化するタンパク質キナーゼ 3 (RIPK3) を相互作用する受容体の活性化によって引き起こされるプログラムされた細胞死経路.ネクロトーシスは自己免疫、感染症や心血管系疾患や脳卒中、神経変性、がんを含む複数の疾患に関連付けられている炎症経路です。ここでは、ネクロトーシス膜破裂の死刑執行人として MLKL を特徴付けるために使用できるプロトコルについて述べる。我々 はネクロトーシス従来および共焦点蛍光顕微鏡を用いた生細胞イメージングを用いた細胞およびプラズマへの細胞質から MLKL の再分配を一緒に明らかに電子顕微鏡を用いた固定細胞プロセスを視覚化します。血しょう膜の大きな穴の誘導の前に膜。MLKL を介したネクロトーシスの推定される変調器を識別するために脂質を用いた核磁気共鳴 (NMR) 分析体外を提案します。本法に基づき、特定定量的脂質結合の好みホスファチジルコリン イノシトールリン酸 (PIPs) 膜ターゲットとネクロトーシスに透過に必要な MLKL の重要なバインダーとしてします。
Introduction
ネクロトーシスの遺伝的要素を識別する生理・疾患1,2,3,4,の5ネクロトーシスの含意をテストするための動物モデルの使用を促進しています。RIPK3 または MLKL のノックアウト マウスは、そのネクロトーシスは人生3,6の必須ではないことを示唆開発および大人の恒常性で最小限の含意を持っていた。さらに、特定の種は動物7,8ネクロトーシスの非本質的な役割をサポート、RIPK3 または MLKL のいずれかの遺伝子を含まない。その一方で、研究室に誘導される様々 な病態とノックアウト動物モデルに挑戦、炎症、免疫、ウイルス感染9,10,ネクロトーシスの重要な役割が明らかに11,12。
ネクロトーシスは異なる免疫センサー信号によっていくつかの方法で実行されるすべての RIPK31,13,14の活性化に繋がる。アクティブな RIPK3 化順番 MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 をアクティブにし、、11,12,13,14,15,16,17,18。ほとんどが勉強した、おそらく最も複雑な方法は、RIPK3 の活性化につながる死受容体血管を結紮を分割するか apoptosis かネクロトーシス1を誘導するシグナル伝達複合体の下流の組成に基づくです。ネクロトーシスはすさまじいが好まれている RIPK1 を介したシグナル伝達機構と RIPK319,20の関与の結果です。この結果は、カスパーゼ 8、ベイでネクロトーシスを保持ネクロトーシスの推定される内因性阻害剤の薬理学的抑制遺伝的削除に簡単に優先されます。RIPK1 に結合し、RIPK3 がアクティブになります。ネクロトーシスをアクティブにする別の方法は、従事し、TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF)21を介して RIPK3 をアクティブにする Toll 様受容体 TLR3/TLR4 シグナル伝達を介してです。まだネクロトーシスで死ぬことの別の方法は、直接従事し、RIPK322をアクティブに DNA センサー台の活性化です。
MLKL N 末端ヘリックス バンドル (NB) ドメインと規制ブレース地域3によってリンクされている C 末端 pseudokinase ドメイン (psKD) から成る細胞内蛋白質であります。正常細胞の MLKL はどこ RIPK314と非アクティブな複合体であると考えられる細胞質にあります。ネクロトーシスの活性化は、psKD、および NB とブレースの3,15,23で可能性のある追加のサイトの活発化のループの MLKL の RIPK3 のリン酸化をトリガーします。リン酸化は、RIPK314から解離による MLKL の構造変化を誘導します。不十分な理解の構造変化は、psKD24からブレースを解放します。2 本のヘリックスが含まれ、ブレースは、C ターミナル螺旋形25推定三量体に MLKL の重合を仲介します。ブレースの N 末端ヘリックスは、膜透過24,26のために不可欠である NB ドメインを阻害します。分離、NB ドメインは細胞膜透過とネクロトーシス16,24,27を誘導するために十分です。NB の pro necroptotic 活性は、マウス胚性線維芽細胞 (mlkl-/- MEFs) MLKL 欠損で再構成されました。NB は優先的に従事するリン脂質ホスファチジルイノシトール 4, 5 二リン酸 (PIP2) 脂質結合ドメインです。ブレース重合が PIP2極性基24NB の弱い相互作用を介して細胞膜と MLKL の採用を促進する前記 MLKL の活性化の段階的な機構を提案する.膜では、NB は、PIP2のため非アクティブな MLKL 内のブレースによってマスクされます追加の高親和性結合サイトの規制の露出を経る。全体的にみて、PIP2と NB の複数の相互作用は、これらのイベントの分子メカニズムが解明されていないが膜の破断につながる不安定します。
ここで我々 はネクロトーシス24の死刑執行人として MLKL の機能を特徴付けるために使用する特定のメソッドを示しています。特に、我々 は MLKL, NB, ブレース (NBB) ブレース阻害によって規制されており膜破裂とネクロトーシスを誘発する強制二量体化してアクティブになることができますの最も最小限のドメインに焦点を当てます。強制薬物誘発性 FKBP を介した二量体化住セルイメージ投射とネクロトーシスになる細胞の電子顕微鏡観察のために結合した発現システムについて述べる。さらに、NBB フォスファチジルイノシトール (PIPs) との相互作用の in vitro NMR 分析を示す.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. クローン作成および細胞ラインの生成
- PCR 増幅 NBB 領域のアミノ酸残基 1-140 (NBB140) は、人間 MLKL cDNA からのフレーム標準的な制限の酵素に基づくクローニング重合ドメイン 2 x FK506 結合蛋白質 (2xFKBP または 2xFV) と金星蛍光に対応します。タンパク質にドキシサイクリン (Dox) - 誘導型レトロウイルスベクター NBB140を取得する pRetroX-TRE3G - 2xFV-金星 (表 1、図 1 a B)。
- 主mlkl-/-またはripk3-/- mlkl-/-マウス胚性線維芽細胞 (MEFs) 抗原 SV40 大きいトランスフェクションによって緑の実験室で利用できるそれぞれのマウスから得られた不滅のものプラスミドを表現します。不死化細胞の [〜 1-2 週間、DMEM 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 ミリメートル L グルタミン、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウムと 37 ° C、5% CO2標準的な組織で非必須アミノ酸と、維持する、文化のインキュベーター。
- SV40 不死化mlkl-/- MEFs 逆テトラサイクリン制御トランス (情報を頼むこと) を変換-レトロ ウイルス ブラストサイジン抵抗性遺伝子 (私たちの変更されたプラスミド) を含んでいるプラスミッドから表現を含むおよび 1 のための御馳走情報を頼むこと28を安定に発現する細胞を選択する 5 μ g/mL ブラストサイジンで週間。
- キメラの MLKL を含む Dox 誘導 retroviral ベクトルの情報を頼むこと表現する MEFs を変換 (pRetroX NBB140-2xFV-金星-プーロ) 導入後 1 週 2 日の 4 μ g/mL ピューロマイシンを選択し、。
2 MLKL を介したネクロトーシスの生きている細胞の顕微鏡観察
- Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs プレート-2xFV-(まあ 1 mL/) 24 あたり 50,000 セルの密度で金星もプレートと一晩インキュベート (図 2A)。生細胞染色自動細胞計数 (材料の表を参照) を使用します。
- Dox で 12 時間のセルを扱う (0.5 μ g/mL) NBB140の発現を誘導するために-2xFV-金星。
- 25 nM 膜不浸透性緑色蛍光に加えてネクロトーシスと 25 nM FKBP dimerizer (Dim) を誘発する標準 DMEM で (材料の表を参照) を染める (1.2 を参照してください)。NBB140によって彼らの膜の整合性が損なわれると、ネクロトーシスになる細胞蓄積染料-破断を介する。3 通または 4 連でアッセイを実行します。
- ネクロトーシス シングルまたはデュアル カラー イメージング システム (材料の表を参照) を使用して、監視するには、哺乳類の組織培養のインキュベーターでありそれぞれのイメージング ユニットに船を配置します。
- ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください) し今後スキャンをスケジュール [タスク リスト] タブを選択します。
メモ:このプロトコルは、単一のカラー システムを用いたイメージングが、同様のソフトウェアがデュアル カラー システムで利用できます。 - [プロパティ] タブで「物理的なレイアウト」タブで「高速蛍光」「トレー、容器、スキャンの種類」、および「スキャン パターン」を選択します。
- 「スキャン時間」をクリックしてして「タイムライン」ウィンドウおよび [合計数時間ポイントと獲得 (通常 1 取得毎 0.5 h 6 h、12 h にまたは高速動力学ネクロトーシス 5 分毎の 1 h) 周波数のを追加し、"アプリを選択することにより画像の取得を開始ly"(赤いボタン)。
- ネクロトーシス イメージ解析ソフトウェアを用いた定量化 (材料の表を参照してください)「オブジェクト カウント新しい解析固定セグメンテーション背景レベルしきい値と」,「作業ウィンドウ」から選択することでホバリングを決定できる、バック グラウンド地域分析で使用されるいくつかのイメージの上にマウス カーソル。
- 現在のイメージを使用してプレビューを選択することにより蛍光物体を確認し、必要に応じて、しきい値レベルを修正します。
- 「起動新しい分析」タブを開いて、蛍光グリーン カウントを統合、「時間の範囲」を選択、井戸分析する"分析ジョブ名"を入力し、押して"OK"を選択します。
- アクセスはそれぞれジョブ名をダブルクリックすると、外部のグラフ作成ソフトウェアで詳細な分析グラフ/エクスポート] ウィンドウからエクスポート「分析ジョブ」タブからのデータを分析 (材料の表を参照してください).
- 緑蛍光陽性 (+ ve) としてデータ数/mm2を量的または合流によってカウントを正常化し、蛍光グリーン + ve のカウント ・合流としてデータを表現します。
- 必要に応じて、エンドポイントでは、実験的、100 細胞を染色 nM 膜側の透過物の緑色蛍光の染料 (材料の表を参照してください)。エンドポイントでグリーン蛍光/グリーン蛍光比として %necroptotic のセルにデータを正規化します。
3. 生きているセルの共焦点顕微鏡イメージング膜採用の MLKL によって透過
- Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs プレート-2xFV-ガラス (0.5 mL/ウェル) ウェルあたり 20,000 セルの密度で金星 4 よく顕微鏡室 30 分の 37 ° C で PBS で 50 μ g/mL のフィブロネクチンで前処理を下にし 〜 12 h (インキュベート図 2B)。
- Dox とセルを扱う (0.5 μ g/mL) NBB140の発現を誘導する 〜 12 時間-2xFV-金星。
- 25 を含む新鮮な培地 (1 mL/ウェル) と孵化によってネクロトーシスを誘発する nM NBB140を誘導するために薄暗い-2xFV-金星の活性化と細胞膜への転流。
- ディスクの回転レーザー環境制御と、63 装備倒立スタンド上に構築された共焦点顕微鏡でチャンバーを配置 1.4 NA 目的と好みのソフトウェアを使用して取得をイメージングを開始 (材料の表を参照してください)。
- ソフトウェアを初期化、YFP フィルター構成 (励起波長 515 nm) の「フォーカス」アイコンを選択します。
- 視野と焦点面を見つけるし、「明確なフォーカス」タブを用いた集中メンテナンスに従事します。
- 取得を開始するには、フィルターの構成、適切な EMCCD カメラの露出時間と発達のゲイン、および間隔や取得の長さを含めてタイムラプス集録パラメーターの代入に続く「キャプチャ」タブを選択します。
- 蛍光 NBB140の細胞の再分配を監視-2xFV-金星蛋白質を修めればネクロトーシス画像すべて 10 515 nm レーザー (映画 1) を用いた EMCCD カメラで s。
注: 退色は蛍光タンパク質のイメージングと懸念です。金星はフォトブリーチング29より耐性の蛍光タンパク質のひとつです。退色しやすい蛍光タンパク質を使用する場合の画像すべて 30 秒以上イメージングの時間ポイントの間の信号の回復を許可します。 - 膜協会 NBB140を監視する-2xFV-ネクロトーシス、中に金星画像すべて 10 のサンプル作製 3.3 の全内部反射蛍光 (TIRF) を自動の全反射スライダーを搭載した顕微鏡を用いた顕微鏡と100 x 1.4 NA 目的、EMCCD カメラ (ムービー 2)。3.5 – 3.7 の手順に従いますが、顕微鏡室のサンプルと下部のガラスの厚さによると全反射フォーカス タブ内で全反射角度を調整します。
注: LCK C RFP のような膜マーカーは、全反射解析における細胞膜局在のコントロールとして使用する場合があります。 - ガウス関数 (マー アルゴリズム) の負正規化された二次導関数との畳み込みによって品質を向上する画像処理を実行します。
4. 電子顕微鏡観察
- Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs プレート-2xFV-プラズマ コーティングの 150 mm で 500 万セルの密度でヴィーナス培養皿の細胞し、インキュベートする 12 h (図 3)。
- ドキシサイクリンで細胞を治療 (0.5 μ g/mL) NB1 140の発現を誘導するために-2xFV-12 h 金星。
- NBB140を誘発する-2xFV-金星の活性化と 25 と細胞膜への転流 5 分 homodimerizer の nM。今回は、ネクロトーシス住セルイメージ投射で観測された速度から確立されます。
- メディアを取り出し、10 mL の 2.5% グルタールアルデヒド、2% パラホルムアルデヒド 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファー ph 7.4 (cacodylate バッファー) 37 ° C に加温を使用してセルを修正
- キサゲ加工によりサンプルを収集し、500 x gで 10 分間のサンプルをスピンします。上清を捨てます。
- 1.5% フェロシアン化カリウム 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファーと四酸化オスミウム還元 2% で 1.5 h のサンプルを後置します。四酸化オスミウムは、コントラストを提供するために広く TEM で染め色剤です。SEM のネクロトーシスを受ける細胞の前に予備的な分析として TEM を使用しました。
- 500 x のg、後にバッファーに洗口液で 5 分間超純水で 5 回サンプルをリンス (4.6 を参照)、水およびエタノール自動プロセッサによる。上清を捨てます。
- SEM のための 1% ウラニル酢酸と鉛アスパラギン酸 - 重金属染色31以前固定試料を染色します。
- アルコールとプロピレンの酸化物ソリューションの傾斜シリーズを通してサンプルを脱水します。
- 硬質レジン32レジン ブロックを取得するサンプルを埋め込みます。
- 分析の正しい領域を決定する 0.5 μ m の厚さのセクションをカットします。
- サンプルは導電性金属 (イリジウム) の超薄膜をコートします。
- イメージし、サンプル (図 3) を分析します。5 で定量化, 露出した細胞と樹脂ブロック表面の低倍率の画像がスキャンされた keV の電子顕微鏡を用いたします。
- SEM で撮影した各画像間で細胞を可視化するまたは 1 つの連続したイメージ30に複数フィールドのビューに参加する利用できるイメージング ソフトウェア。100 セル可能性があります使用して、好みのソフトウェアで高解像度のモンタージュを生成することによってこの方法でネクロトーシスになる細胞の割合を評価する約 (材料の表を参照してください)。
注: SEM による壊死の形態を得点事前壊死、または壊死の表現型の進行と正常な細胞機能を比較します。これらの機能は、微絨毛の消失、平坦化、10 に至る細胞破裂膜変化 nm サイズやオルガネラ構造のゾル性細胞質のセル領域の少なくとも 30-40% の損失で 1 μ m から。
5. 脂質結合核磁気共鳴 (NMR) 分光法による MLKL
- 15N 標識 NBB1 156標準タンパク質の発現及び精製前述24を準備します。
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol アンモニウム塩 (PI 18:0) と 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) アンモニウム塩 (18:1 PI) 冷たい CHCl3各 1 Mg/ml の最終濃度 500 μ L の 500 μ g を溶解します。
- 1 mg/mL 18:0, 18:1 PI 室温で 1 分間超音波処理水お風呂で超音波を照射または氷-水混合物の 5 分まで。
-
分注 1 mg/mL 18:0, 18:1 PI 個々 の NMR 滴系列 (図 4) のきれいなガラス瓶に。ガラスの空気タイトな注射器を使用して有機溶媒中で転送脂質。
- 1 mg/mL 18:1 PI の 132 μ L 分注 (モル質量 880.137 g/mol =) CHCl3の最終的な再懸濁量 125 μ M の濃度で 1,200 μ L。
注: 5 mm NMR 管用のシリアル希薄をボリュームの準備 > 1,000 μ L と最終的な NMR サンプルのボリューム > 500 μ L。3 mm NMR 管用のシリアル希薄をボリュームの準備 > 300 μ L と最終的な NMR サンプルのボリューム > 150 μ L。
- 1 mg/mL 18:1 PI の 132 μ L 分注 (モル質量 880.137 g/mol =) CHCl3の最終的な再懸濁量 125 μ M の濃度で 1,200 μ L。
- 分注 1 mg/mL ブタ脳の 20 の L-α-ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸アンモニウム塩: 9:1 CHCl3/メタノール/H2O (脳 PI (4, 5) P2) きれいなガラス瓶に。
- アルゴン (Ar) や窒素 (N2) ガラス瓶壁に飛散することがなく有機溶媒を蒸発させるための適度な流れのガス流れの下でバイアルを配置します。5 ~ 30 分は通常 10-200 μ L 有機溶媒量十分です。
- ガラス下部に大型のピンセットを使用して真空フラスコを Büchner のバイアル ゴム栓で密封し、真空ラインに接続されているプラスチック製のチューブを接続を配置します。残留有機物を削除する一晩穏やかな真空下でフラスコを避難させます。
- 不活性ガスと脂質膜の因数をオーバーレイ、密閉ふた付きシールし、長期的な貯蔵のための使用 1 ヶ月以内または-80 ° C の-20 ° C で保存します。
- 洗剤なし NMR サンプル バッファーを準備 (-Det) を含む 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O と洗剤 (+ Det) 20 mM NaxHyPO4 pH 6.8, を含む 10% D2O、0.34 mM n-ドデシル-β-D-maltopyranoside (DDM)。
- 望ましい集中を実現し、10 分間超音波処理を交互に 30 分間水浴の超音波脂質膜とガラスの瓶に Det バッファーに続いて検査 + 追加。
注: 超音波処理のサンプルを暖かいことがあります。最終的なタンパク質サンプル調製前に 15 分間室温に冷却することができます。 - 脂質界面活性剤ミセルの + 1:1 混合物の超音波を使用して望ましい集中シリーズ Det バッファーのシリアル希薄を実行します。125 μ M の脂質の濃度を最低 15.6 μ M 脂質 0.34 mM DDM は、31.3 μ M、62.5 μ M が得られます 3 つの繰り返し。
- コントロールを準備し、タンパク質と - Det で添加物の NMR サンプルを参照し、+ Det バッファー、それぞれ。タンパク質と脂質の各希釈添加物 + Det バッファーを追加します。
注: 15N NBB156, タンパク質は 40 μ M の最終的な集中に追加され、システイン残基の減少を維持する重水素 2 mM ジチオトレイトールで補われます。 - (5.4 の手順でメモを参照してください) 5 mm または 3 mm の NMR チューブにサンプルの適切なボリュームを転送します。
- 手動で NMR 装置でサンプルをロードまたは SampleCase ローダーなどの自動化プラットフォームの手配します。
- 2 D 1H-15N 相関スペクトル最適化横緩和スペクトロス コピー (作成) のいずれかとして続いて品質管理として1H プロトン スペクトルの標準パルス プログラムを使用して複合の NMR スペクトルを取得または25pxn-1 異核複数量子コヒーレンス (SOFAST HMQC)33。
注: 3 mm NMR チューブの使い方 1 h-15N 作成 (~ 3 h) または1H-15N SOFAST HMQC (〜 90 分) の 64 件のスキャンが必要です。スキャン 5 mm NMR チューブで番号は半減します。 - 処理された 2D NMR スペクトル解析またはその他のソフトウェアのユーザーに選択の CARA リポジトリ34に追加できます。
-
注釈を付けると各蛋白質の状態の 3 つの分散であると解決ピークの 2次元 NMR 共鳴ソフトウェアを分析します。各 NBB156 (図 5A) を含むバッファー条件ごとに六つのピークのピーク振幅を記録します。
- キャラを使用してバッチ統合リストを準備します (クリックしてメイン メニューの見出し"スペクトル |セットアップ バッチ リスト". の)すべてのスペクトルの収集、単一のピークのアサインファイルを使用して解析 (をクリックしてメイン メニューの見出し"ピーク |実測をインポート". そして 6 総ピーク、内で定義された、各蛋白質の状態 3 を持つユーザー定義の .peaks ファイルを選択)。
- 設定を調整 ("インテグレーター |ピーク モデル」の「チューニング...)X 幅 0.06 ppm と Y 幅 0.30 ppm (をクリックしてメイン メニューの見出し「インテグレーター |ピーク モデル」の「チューニング...)2 つのメニュー選択 (1 最終的な出力を記録する前に。メイン メニューの見出しをクリックして「インテグレーター |"バッチ リストを統合) (2。メイン メニューの見出しをクリックして"ピーク |統合テーブルをエクスポート)」(図 5B)。
注: 残留 M21、V53 と L105 バックボーン アミド共鳴は NBB156閉じブレース状態に割り当てられています。開くブレース状態は、残基 G130 と A141 のバックボーン アミド共鳴とイプシロン プロトン側鎖の共鳴 W133 3D NMR 実験24使用に割り当てられました。
- 標準試料の 3 つ開くブレースの振幅の平均、2 つの参照を関連の正規化係数を計算によって異なる磁石またはサンプル条件から直接の比較のためのサンプルを正規化します。NBB156共鳴ゼロ (表 2) に正規化係数と設定負振幅を使用してのスケールの振幅を計算します。
例: 1) 異なる磁石からのサンプルを比較: マグネット A、NBB156+ DDM とマグネット B、NBB156DDM。2) 洗剤の比較: 0.34 mM DDM と 1.7 mM DDM。 - 縮小率の閉鎖またはオープン-ブレースすべてスペクトルの最小-最大振幅の範囲で割って収集無料 NBB156と完全に開くブレース NBB156で適切な参照を含む各共鳴の計算します。洗剤です。
- 脂質濃度の関数としてプロットの正規化された NMR 振幅と異なる条件で (図. 5 C) 開くブレース NBB156の割合を比較します。
注: また、脂質濃度に対して閉じブレース構造の割合の分析が行えます NBB156に脂質結合を比較します。我々 は、それはより速いために分数よりよいレポート完全に従事し脂質による元の分析を好みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
最小限切り捨てられた MLKL 構築、NBB140の発現誘導を介して可能にされている生きているセルの規制ネクロトーシス実行を可視化する-2xFV-金星。このコンス トラクターは、膜透過を誘導する能力を維持し、FKBP カセット (2xFV) Dim 誘起重合を介して活性化します。我々 を観察して生細胞顕微鏡イメージング、監視速度論的 (5 分ごと) 細胞不浸透性の緑色蛍光 DNA 結合色素 (図 6A) の取り込みによるネクロトーシスを定量化します。この誘導システムは非常に堅牢とmlkl-/- MEFs の完全なネクロトーシスは NBB140をエクスプレス Dox 虫の細胞の点心を介した重合時 ~ 1 h 内観察できる-2xFV-金星 (図 1A).我々 はこれらの条件を高速動力学ネクロトーシスと呼びます。金星だけで ± dim ステートメントまたは NBB140式-2xFV-Dim の不在で金星ネクロトーシス (図 6A) を誘発しなかった。我々 は通常 3 通または 24、96 または 384 ウェル プレートで 4 連で少なくとも 3 複製イメージング実験を実行します。
NBB140の強制二量体化による高速動力学ネクロトーシス-2xFV-金星 (図 6A) 膜破裂の推定死刑執行人としての MLKL の役割をサポートしています。NBB140の再分配を可視化する-2xFV-ネクロトーシス、生きているセルの共焦点顕微鏡の中に膜に金星は金星蛍光を監視に使用されます。Dim は、培養の 2-3 分以内の高速動力学ネクロトーシス中細胞周囲のコーティングを観察すると、金星は漸進的なセル (映画 1) を丸めが続きます。NBB140-2xFV-プラズマ膜で金星の蓄積は細胞質プラズマ膜ガラス界面で細胞体積に焦点を当てて、全反射共焦点顕微鏡による可視化します。ビーナスの涙点の膜関連、Dim (映画 2) の孵化の 1-2 分以内で表示されます。したがって、NBB140の重合を適用-2xFV-金星は原形質膜の急速な再配布を誘導します。
走査電子顕微鏡 (SEM) ネクロトーシスを受ける細胞の形態学的変化を明らかにするための強力なツールです。NBB140の重合による高速ネクロトーシス下-2xFV-金星、細胞に通常の細長い図形 (時間 0 分) からの変更形態丸め (5 分) を部分的に破裂 (10 分) に膨らんだし、細胞質が広範囲にわたって解体(20 分) (図 6B) が消えた。SEM は、生細胞顕微鏡膜破裂と細胞膜への MLKL のローカリゼーションの相関から以前の観測を補完します。提示した顕微鏡技術がモニター、評価し細胞レベルでネクロトーシスを定量化、NBB140を巻き込むに相補的な手段を提供する全体的な-2xFV-細胞膜破壊の実行で金星。
MLKL がプラズマ膜を直接連絡できるかどうかを決定するには、体外脂質結合実験組換え NBB156NMR 分光法による監視を行います。2次元 NMR による脂質洗剤ミセル、洗剤 (脂質プレゼンテーション用車両) の一定濃度と変数の脂質濃度、使用のシリアル希薄15N 標識 NBB156へのバインディングのテストをタンパク質の結合によるモニターの変更。NBB156脂質抑制性かっこ地域 (アミノ酸 132 156) 閉鎖からヘリカルを転置するバインディング (閉じかっこ) とオープンと天然変性構造 (開くブレース) (図 7 の主要な構造変化を経る A)。両方コンフォーマ (図 7 b ・ 7 C) の混合物の残留についてごと二次元 NMR 分光法を提供します。我々 は以前、両方コンフォーマ24のバックボーン アミドを割り当てられます。5A-C を数字で説明するよう我々 に簡単に与えられたサンプルの閉じた状態と開いた conformers の割合を監視できます。我々 は NBB156 (図 5B) をバインディングに不活性 DDM 中性洗剤でピップに NBB156バインディングを探るこの結合の試金を使用して。この分析では、PIP2は 125 μ M (図 5C) で抑制性かっこのフルなオープニングを誘導する最適 NBB156リガンドです。対照的に、飽和 (18:0) 不飽和 (18:1)-pi が貧しい NBB156リガンド誘導 (図 5C) 同一条件を開く部分のかっこ。私たち NMR による脂質結合の試金はリン脂質で MLKL NBB156の相互作用を支持する証拠を提供し、MLKL と原形質膜との間の直接のリンクを示唆しています。
図 1:安定したセルラインの変更されたテトの 3 G 誘導システムをかくまっている。(A) 安定したセルラインは pRetroX-TRE3G-NBB140続いて pTREX-情報を頼むことの爆発と/mlkl-/- MEFs のレトロ ウイルスの伝達によって生成された-2xFV-金星-プーロ。1 週間以降の解析に進む前に抗生物質の選択が各伝達が続いた。(B) 誘導性 MLKL 発現系の模式図。このシステムは 2 つの薬物誘導規制手順に基づいて: i) MLKL 遺伝子発現と蛋白質の生産 (+ Dox) と ii) (+ 点心) 重合による活性化。事前に、+ Dox の蛋白質の生産を誘発高速動力学ネクロトーシスはトリガーすることができます +、薄暗い。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 高速動力学ネクロトーシスの住セルイメージ投射を明らかに MLKL の急速な膜染色体。(A) 高速動態イメージング システムの図 1 bのように誘発ネクロトーシスを監視できます。ネクロトーシスは細胞不浸透性の緑の蛍光染料の通風管によって獲得しました。落射蛍光と全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡による解析と高速動力学ネクロトーシスの住セルイメージ投射の模式図 (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 走査電子顕微鏡 (SEM) 試料調製と分析の概略図。図 1に示すように誘導される高速動力学ネクロトーシスからセルは、Dim の付加の後で異なる時点でプレートに固定されます。細胞はそれから SEM 分析のためこするとプール、重金属染色、樹脂埋め込み、およびイリジウム コーティング セクション 4 で説明されているように準備されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:NMR 滴15N NBB156と脂質洗剤ミセルの準備とデータ採取します。この分析と解析は通常 3-4 日で実行されます: 1 日中脂質因数を調剤し、一夜干し。2 日目、中に脂質膜はアッセイ バッファー ± 洗剤、超音波処理、および希釈した (2 つ折り) で水分を補給された脂質液の脂質フリー バッファーの平等なボリュームを混合することによって復元されました。各希釈は均一混合、その後希釈前に洗剤のミセルの脂質の分布を確認する超音波処理します。蛋白質のサンプルが混合脂質界面活性剤ミセルのシリアル希薄で、適切な NMR チューブに読み込まれている、SampleCase ローダーに配置 (または手動で読み込まれる) と NMR データの自動収集を開始しました。それに続く日の間に NMR データ コレクションは完了し、2次元 NMR 分析によって続きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 2次元 NMR を用いて NBB156の脂質結合設定します。(A)、(赤) (青) の有無 125 μ M PI (4, 5) P2キャラで視覚化される DDM 0.34 mM で1H -15 15N NBB156 N 作成スペクトルを重ね合わせた。(B) 1 次元スライス共振振幅測定および正規化に使用します。生 (緑) のスペクトルは振幅と統合のため境界プログラム キャラで重なって表示されます。(C) 脂質濃度に対してプロット NBB156ホスホイノシチド DDM ミセル存在下における振幅を正規化します。PIP2は、ブレースのフルなオープニングを誘導します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: NBB140の重合による高速動力学ネクロトーシス-2xFV- mlkl-/- MEFs 金星。(A) 細胞不浸透性、DNA 結合の緑色蛍光色素の吸収の高スループット蛍光イメージングによるネクロトーシス定量化。堅牢なネクロトーシス誘導は NBB140の Dim 誘起重合時に観察されるだけ-2xFV-金星、Dim の不在ではないです。ヴィーナス専用の制御実験を行うも.すべての条件が 3 通で行われ、1 つの代表から SD をレプリケート平均としてプロットされます。(B) 高速動力学ネクロトーシス誘導薄暗い電子顕微鏡で可視化します。コース明らかに形態変更セル丸め、(5 分)、腫れなど基になるネクロトーシスには原形質膜 (10 分)、破裂し、細胞質 (20 分) の血管外漏出を完了します。各サンプルは、時間 0 分でセルの同じような数を持っていた。左から右に、拡大エリアには、26、32、23、および 36 の細胞の核が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: イノシトールリン脂質 NMR 分光法による監視に NBB156のバインドします。(A) 1H -15N 作成スペクトル15N NBB156。閉じたブレース スペクトルの正規化やオープン状態の定量化に使用される共鳴の化学シフトはそれぞれ正方形または円で強調表示されます。脂質界面活性剤ミセルの有無で検出 NMR 署名の右、模式図。NBB156イノシトールリン脂質の不在で DDM 洗剤ミセルをバインドしません。(B) 1H -15N 作成15N NBB156それぞれ脂質界面活性剤ミセル存在下におけるスペクトルを重ね合わせた。(C) シングル1H -15N 作成15パネル B. からそれぞれ脂質界面活性剤ミセル存在下における N NBB156のスペクトル2 つの構造の混合物で開いた、閉じる構造を明確に検出することにより与えられたサンプル 2 つ conformers の割合を数値化します。PIP2は最寄りの脂質リガンド NBB156 MLKL と細胞膜のリン脂質との間の直接リンクを提供するのです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| PCR バッファー (10 倍) | 5.0 Μ L |
| テンプレート DNA (100 ng/μ L) | 1.0 Μ L |
| Cdna MLKL、2 x FKBP、金星) | |
| dNTPs (25 mM 各 NTP) | 0.5 Μ L |
| PCR のプライマーを転送 (F) (100 ng/μ L) | 1.3 Μ L |
| PCR のプライマーを転送 (FR (100 ng/μ L) | 1.3 Μ L |
| NBB140 F | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| ヴィーナス F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| 金星 R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA ポリメラーゼ (2.5 U/μ L) | 1.0 Μ L |
| 脱イオン蒸留水 (ddH2O) | 39.9 Μ L |
| 全反応量 | 50.0 Μ L |
| PCR サイクリング パラメーター | |
| 1 サイクル | 94-98 ° C;45 s |
| 25-30 サイクル | 94-98 ° C;45 s |
| 58 ° C;45 s | |
| 72 ° C;1-2 分 | |
| 1 サイクル | 72 ° C;10 分 |
表 1: NB の PCR 反応140-2xFV-pRetroX-TRE3G のクローニング制限酵素ベースの金星。
表 2: 計算される平均かっこ状態第 2 NMR 磁石から NMR スペクトル データの正規化変換を示す図 5 で提示の生データを収集します。この表の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: 高速動力学ネクロトーシス NBB の重合による140-2xFV-金星 mlkl-/- MEFs 。NBB140の急速な移行を示す共焦点顕微鏡をライブ-2xFV-FKBP ドメイン強制重合後細胞膜と細胞質からの金星。セルは、図 1 に示すように扱われました。黄色: NBB140-2xFV-金星。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 2: 全反射型顕微鏡の高速動力学ネクロトーシス。Mlkl-/- NBB140を表現する MEFs、Dim の添加によって血しょう膜の高速 (~ 2 分) 染色体と MLKL の集計を示す全反射型顕微鏡-2xFV-金星。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
膜破断24の推定死刑執行人として MLKL に関与する、我々 を組み合わせた技術のためのプロトコルを提供します。MLKL を介したネクロトーシスを調節する制御ネットワークを解読する、に加えてこれらのテクニックがない独立して使用できる他適切な生物学的システムを特徴付けるため。実質的に言えば、これらのテクニックは、中-低スループット探索ツールです。
我々 は日常的に NBB140の住セルイメージ投射を使用している-2xFV-金星-ネクロトーシスとネクロトーシス変異と小分子化学を使用して MLKL の規制を機械論的に解剖する他の MLKL 構造による仲介プローブ。特に、我々 や他のグループを示している人間、NBB の最小限の領域を含む MLKL のマウス構成ことができますひとネクロトーシスとマウス細胞株を仲介します。1 つは MLKL を介したネクロトーシスを支配する注意点は TNF、smac 模倣およびカスパーゼ阻害の組み合わせによって上流の刺激時に観察される種間の交差反応を防ぐことができます RIPK3 と MLKL の相互作用の種特異性を報告25,,3536。したがって、人間とマウスの RIPK3 と MLKL 蛋白質はこれらの条件25,35,36の下で交差反応を行います。種間の制限をバイパスする突然変異人間 MLKL をアクティブ化または NBB140重合カセットをここで示すように、使用を紹介-2xFV-金星24。人間の NBB140は阻害領域を維持し、したがって NBB140のコンテキストで非アクティブのまま構築-2xFV-金星。2xFV の二量化は、ブレースを外して NBB140をアクティブにすると考えられます。対照的に、人間の NBB182はこのコンストラクトは自発的に24を oligomerize することができるので重合の不在でもネクロトーシスを誘導します。また、ポイント突然変異体 (R30A、R30E、E136A、および E136R)24RIPK3 リン酸化によって活性化の必要性を克服するフルレングスの人間 MLKL のコンテキストで NB 地域を活性化します。さらに、我々 は dimerizable の人間 RIPK3 を再構成した (セルリアン-2xFV-RIPK3)、Dox 誘導フルレングス人間 MLKL-金星、互換性があり確実に/ripk3-/- mlkl-/- MEFs24ネクロトーシスを誘発します。.他は最近追加変異または人間マウス ドメイン25種特異性の障壁を克服することがあります MLKL 構造をスワップを明らかにしました。
我々 は通常、96 ウェル プレートでいくつかの測距実験を行いネクロトーシス アッセイ条件を最適化します。私たちは、24 ウェル プレート、相補的な蛍光活性化細胞選別 (FACS) を多重化するための十分なセルと同じサンプルに対してその後西部のしみが付く分析を提供する最適化された実験とフォロー アップ直後に最終的な時間ポイントをイメージングします。現在、住セルイメージ投射は、多くのアプリケーションのラベルの可能性が制限、緑と赤の蛍光性の検出に基づいています。緑色の蛍光色素への共通の代わりは細胞不浸透性 DNA 結合色素 propidium ヨウ (PI です)。デュアル カラー イメージング機器は、相補的な緑色または赤色蛍光タンパク質を用いたネクロトーシス イメージング ユーティリティと情報コンテンツを強化するこれらの染料を使用するオプションを提供しています。
MLKL の能力はその活性化した細胞膜に若しライブ顕微鏡この蛋白質の生物学を調査する選択の技術は、リアルタイムで次の形態変更を基になるネクロトーシス。全反射型顕微鏡は、共存して細胞膜にマーカーの存在下で実行されるときに特にはっきりと MLKL タンパク質凝集体の細胞膜を解決します。細胞膜の共局在24のマーカーとして LCK C RFP を使いました。タグ、異なった fluorophores が付いている興味の蛋白質に能力も同じプロセスに関与する複数の蛋白質の活動を同時に研究可能です。次世代超解像顕微鏡法の部分的に標準的な共焦点顕微鏡回折制限の問題を克服して MLKL を介したネクロトーシスの追加機能を明らかにする可能性を秘めています。
ネクロトーシスの特徴の 1 つは細胞膜透過です。場合でも、いくつかのテクニック直接定量化したり膜破裂を示す、EM だけは MLKL によるプラズマ膜の完全性の不連続性を視覚化できます。TEM では、解像度の最高の力を持っている、SEM より大きい標本領域をマップする機能を持っています。この機能により、データの大きなボリュームを管理することができる新しい、強力なソフトウェアの開発と細胞形態解析における SEM の有用性を高めた。また、SEM も収束イオンビームなどの他のシステムと結合したとき、3 D 再構築できます連続サンプルのセクションをスキャンすることです。EM 解析の欠点のいくつか、サンプル処理と解析計測とメンテナンスのコスト、専門性の高いスタッフ、そして膨大な時間の必要性があります。
点のしみの試金は MLKL、細胞膜リン脂質16,27間の直接接続をするもともと使用されています。私たち NMR による脂質結合の試金は決定的に特定のリン脂質の結合、PIP2を強調表示選択の MLKL リガンドとしての MLKL を関係づけます。我々 の結果は、ホスファチジルイノシトールに NBB156バインディングのアシル鎖飽和の有害な効果を発揮します。それにもかかわらず、どのように MLKL PIP2、および可能性のある他のリン脂質に結合膜破断は不明の結果します。このプロトコルを使用して他のリン脂質は、MLKL へのバインディングのテスト可能性があります。脂質結合への特定の貢献を正確に、MLKL と様々 なリガンドの突然変異体と使用されることができます、我々 の分析は MLKL 仲介ネクロトーシスの新たなモデルをテストするための素晴らしいツールとして機能します。さらに、その結合脂質を尋問する他の関連付けられる膜システムのそれを使用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
なし。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
