Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

Published: December 20, 2019 doi: 10.3791/59988
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

Summary

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

Abstract

טאו הוא חלבון קשירה מיקרוטודורית המתבטאת הנוירונים הפונקציה הידועה העיקרית שלה קשורה לתחזוקה של יציבות ציטושלד. עם זאת, הראיות האחרונות הראו כי טאו נמצא גם בתאי subcellular אחרים כולל הגרעין שבו הוא מעורב הגנת ה-DNA, בתמלול rRNA, בניידות של retrotransposons ובארגון המבני של גרעינון. לאחרונה הוכיחו כי טאו גרעיני מעורב בביטוי של הגן VGluT1, מציע מנגנון מולקולרי שיכול להסביר את הגידול הפתולוגי של שחרור גלוטמט בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר. עד לאחרונה, מעורבות של הטאו הגרעיני ב מודולים את הביטוי של גנים היעד היה בטוח יחסית מעורפל בשל מגבלות טכניות שמנע את הדרה של תרומת cytoplasmic טאו או את ההשפעה של אחרים גורמים במורד הזרם. לא קשורים לטאו גרעיני כדי להתגבר על חוסר ודאות זה, פיתחנו שיטה ללמוד את הביטוי של גנים היעד במיוחד מאופנן על ידי חלבון הטאו הגרעיני. העסקנו בפרוטוקול שזוגות את השימוש באותות הלוקליזציה ובשבר הסלולר, דבר המאפשר להתיר את ההפרעה ממולקולות הטאו של הציטוטופלמיק. בעיקר, הפרוטוקול הוא קל והוא מורכב משיטות קלאסיות ואמינות החלות באופן כללי על מנת ללמוד את התפקוד הגרעיני של הטאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים סלולריים.

Introduction

הפונקציות של החלבון טאו בגרעין צברה עניין משמעותי בשנים האחרונות, כפי שהוא הוכח להיות קשור הדוק עם חומצות גרעין1,2,3,4,5,6. אכן, הגנום לאחרונה מחקר רחב הראה כי טאו נקשר רצפי DNA הגניים הבין vivo7. תפקיד בארגון נוקלאוולאר הוצע8,9,10,11. יתר על כן, טאו הציע להיות מעורב הגנת דנ א מ חמצוני היפרתרמיה5,10,12,13, ואילו מוטציה טאו היה קשור לחוסר יציבות כרומוזום ו מאנולודיה14,15,16.

עד היום, האתגרים בלימוד התפקודים של הטאו בתוך התא הגרעיני נותרו כמעט בלתי פתורים בשל הקשיים בניתוח התרומה הספציפית של הטאו הגרעיני מתרומתה של cytoplasmic טאו. יתרה מזאת, הפונקציות המיוחסות למולקולות של הטאו בתוך התא הגרעיני, עד כה, הן רק משום שהן חסרות הדגמה חד משמעית של המעורבות הישירה של החלבונים הגרעיניים של הטאו. ואכן, מעורבות של הטאו בניידות של הרטרוטרנספסונים או בתמלול או ב-DNA הגנה11,12,17,18,19 יכול להיות גם הסביר על ידי תרומת cytoplasmic טאו או על ידי השפעה של גורמים אחרים במורד הזרם לא קשור לטאו גרעיני.

כאן, אנו מספקים שיטה שיכולה לפתור בעיה זו על ידי ניצול הליך קלאסי כדי לבודד את התא הגרעיני בשילוב עם השימוש של בונה הטאו 0N4R מתויג עם לוקליזציה גרעינית (NLS) או אותות היצוא הגרעיני (NES). גישה זו מבטלת את הסוגיות המורכבות הקשורות לחפצי האמנות האפשריים בשל הגלישה של מולקולות טאו מהתא cytoplasmic. יתר על כן, המבנים של טאו-NLS וטאו-נס מעניקים להעשרה או להדרה של מולקולות של הטאו מהתא הגרעיני, בהתאמה, מתן שליטה חיובית ושלילית למעורבות של מולקולות באוניברסיטת טאו גרעינית בפונקציה מסוימת. הפרוטוקול הוא מבחינה טכנית קל והוא מורכב שיטות קלאסיות ואמינות, כי הם החלים באופן כללי כדי ללמוד את הפונקציה הגרעינית של הטאו בסוגי תאים אחרים, הבדיל או לא, כמו תאים סרטניים להפעיל מחדש את הביטוי טאו20,21. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים הנמצאים הן הציטופלסמה ואת הגרעין על מנת לנתח פונקציות ביולוגיות הקשורות לתאים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. תרבות SH-SY5Y תאים (קו תאים נוירובלסטומה האדם, CRL-2266) בינונית לחלוטין (מדיום הנשר שונה של בינונית: תערובת מזינים F12 [DMEM/F-12] בתוספת עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין 100 μg/mL סטרפטומיצין). לשמור על התאים בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לגדול תאים ב 10 ס מ לוחות ולפצל כאשר מתוך שוטפת.

2. בידול תא

  1. כדי להבדיל התאים SH-SY5Y, יום לאחר ציפוי, להוסיף 10 μM חומצה retinoic (RA) כדי להשלים בינונית עבור 5 ימים.
  2. היום השישי להחליף בינוני עם בידול בינוני: Dמאמ/F-12 בתוספת עם 50 ng/mL BDNF, 2 מ"מ L-גלוטמין. אין להוסיף FBS או אנטיביוטיקה.
  3. לגדול את התאים בידול בינוני במשך 3 ימים.

3. כימאריק בונה שיבוט

  1. צור טאו-nls לבנות על ידי שיבוט על ידי הגבלת העיכול האנזים במסגרת על 3 ' סוף הסדרה של טאו 0n4r (383aa) the 3xnls (SV40NLS): 5 '-ccaאאאגאגאאכאאגאגאכאאאגאג'אאכאאגאגאמאגאכאאאגאכאאגראagcac
    הערה: 3xNLS ב 3 ' בסוף הטאו מוכפל לתוך הפלמביותר של pCMV-טאו עבור ביטוי היונקים לנצל את האתרים הגבלת Xהוי ו BamHI לתוך האתר הרב (MCS).
  2. צור טאו-NES לבנות על ידי שיבוט על ידי הגבלה העיכול האנזים במסגרת בסוף 3 ' הרצף של טאו הסדרה 0N4R (383aa) רצף נס: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA -3 '.
    הערה: ה-NES בקצה השלישי של הטאו מוכפל לתוך הפלמאג של pCMV-טאו עבור ביטוי היונקים הניצול של אתרי ההגבלה EcoRI ו-BamHI לתוך ה-MCS.
  3. שינוי צורה DH5alpha E. coli זן עם 100 NG של ה-DNA משלב 3.1 או 3.2 ותאי צלחת בצלחות LB-אגר עם 100 Mg/mL אמפיצילין. בואו לצמוח לילה ב 37 ° c.
  4. בחר מושבה אחת ספייק את התאים לתוך 5 מ ל של LB עם אמפיצילין. תנו לתאים לצמוח ב-37 ° c בעצבנות בלילה.
  5. לחלץ פלמיד עם miniprep DNA (טבלת חומרים) ורצף כדי לאמת את המבנים.
  6. המרה DH5alpha E. coli זן עם המבנה רצף מאומת ותאי צלחת על צלחות LB-אגר עם אמפיצילין. בואו לצמוח לילה ב 37 ° c.
  7. בחר מושבה אחת ספייק את התאים לתוך 5 מ ל של LB עם אמפיצילין. תנו לתאים לצמוח ב-37 ° c בעצבנות במשך 2 שעות.
  8. לשים את התאים משלב 3.7 ב 200 mL של LB עם אמפיצילין. בואו לצמוח לילה ב 37 ° c.
  9. כדור התאים בשעה 3,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  10. לחלץ פלמיד עם מרבי DNA (טבלת חומרים).

4. מעבר תאים

  1. זרע 400,000 תאים משלב 1.1 ב 6-היטב צלחות או 20,000 תאים ב 8-היטב שקופיות קאמרית. צלחת ארבע דגימות: שליטה בתאי להיות מזוהמים עם וקטור ריק, תאים להיות מזוהמים עם טאו לא מתויג, תאים להיות מזוהמים עם טאו-NLS ותאים להיות מזוהמים בטאו-נס.
  2. היום לאחר זריעת transfect 400 ng של ה-DNA עבור כל טוב באמצעות ליפידים הרים (שולחן חומרים) ב 6-היטב צלחות או 200 NG של DNA עבור כל טוב עבור שקופיות קאמרית 8-טוב, על פי הוראות היצרן.
    1. דגירה של ה-DNA ואת ליפידים בנפרד ב 250 μL (לוחות 6-טוב) או 25 μL (עבור 8-באר שקופיות החדר) של בינונית סרום מופחת עבור 5 דקות ב RT. ואז לשלב אותם כדי ליצור את הקומפלקס DNA-ליפיד ו דגירה עבור 20 דקות.
    2. החלף את מדיום התרבות עם 2 מ ל (לוחות 6-היטב) או 250 μL (עבור שקופיות קאמרית של 8 שפות) של בינוני תרבותי טרי מלא. הוסף את מתחם ה-DNA-ליפיד לתאים ו-דגירה ב 37 ° c בלילה.
  3. לחילופין, העברה של דנ א עם הפוליאתילן המדריתית הכימית.
    1. מערבבים 2 μg של ה-DNA ו 6 μL של פיי עם 200 μL של מדיום תרבות מלאה (עבור כל טוב ב 6-טוב צלחות), או 1 μg של ה-DNA ו 3 μL של פיי עם 100 μL של מדיום תרבות מלאה (עבור כל טוב ב 8-היטב שקופיות קאמרית) , מערבולת ו דגירה עבור 10 דקות ב RT.
    2. להוסיף את התמהיל לתאים ולהוסיף 1.8 mL של מדיום התרבות המלאה בכל טוב ב 6-היטב צלחות או 150 μL של מדיום התרבות המלאה לכל טוב ב 8-היטב שקופיות קאמרית כדי להגיע נפח הציפוי.
  4. שנה את המדיום יום לאחר השינוי והוסף את מדיית הבידול כמתואר בשלב 2.2.

5. אימונולואורנציה

  1. הסר את בינונית התרבות ולשטוף תאים עם 1x PBS. תקן תאים עם 100% קרח קר מתנול עבור 3 דקות בלי לרעוד. הסר את פתרון התיקון ושטוף בקצרה עם ה-PBS 1.
  2. החדירות עם 0.1% שאינם יוניים ב-1x PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בקצרה, לשטוף עם 1 x PBS, 3 פעמים.
  3. דגירה תאים עם מאגר חוסם (0.1% רצף 20 ו 1% BSA ב PBS) עבור 30 דקות ב-RT על שייקר מסלולית.
  4. דגירה עם נוגדנים העיקרי המתאים (למשל, העכבר מונושבטיים anti-Tau13 נוגדן) מדולל 1:500 במאגר חסימת לילה ב 4 ° c על שייקר מסלולית. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף, בקצרה, עם 1x PBS.
  5. מודלת עם נוגדנים משני מצולים פלואורואופלפור (g., העזים נגד העכבר נוגדנים מצוחלים לאלקסה Fluor 633) מדולל 1:500 במאגר חסימת עבור 1 h ב RT. להסיר את פתרון הנוגדן ולשטוף בקצרה עם PBS 1x 3 פעמים.
  6. כדי להכתים את הגרעין, הדגירה עם DAPI מדולל 1:20000 במאגר חסימת עבור 10 דקות ב RT. לשטוף עם PBS 1x 3 פעמים. שמיכות הר על שקופית באמצעות מדיום הרכבה antifade.

6. כתם מערבי

  1. כדי לאסוף את הגלולה תא משלב 4.4, להסיר את המדיום, ולשטוף תאים עם PBS. דגירה עם 500 μL של 0.1% טריפסין עבור 4 דקות ב-37 ° c. הוסף כמות שווה של תאים בינוניים ומחדש.
  2. לאסוף תאים בצינור ובצנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות. בסוף צנטריפוגה הסירו בזהירות את הסופרנטאנט. הוסף 1 mL של PBS, צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ובזהירות להסיר את supernatant. מאחסנים כדורי תא בקרח לשימוש מיידי או בהקפאה ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך.
  3. עבור תמציות חלבון מוחלט, מודיית את הגלולה התא עבור 30 דקות על הקרח במאגר הליזה (20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 20 מ"מ הנינג, 10% גליצרול, 1% octylphenoxy פולי (ethyleneoxy) אתנול, מסועף (לוח חומרים), 10 מ"מ edta) שיושלם עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי. על פי השפע של הגלולה, להשתמש 50 μL ל 100 μL של מאגר הליזה.
    1. צנטריפוגה את התמצית ב 16,000 x g עבור 15 דקות. לאסוף את הסופרנטאנט ולכמת את ריכוז החלבון על ידי כל שיטת קוונפיקציה סטנדרטית. להכין את דגימות חלבון עבור SDS-עמוד על ידי ערבוב 20 μg של חלבונים עם 5 μL של מאגר 4x Laemmli בנפח הכולל של 20 μL ו לרתוח ב 100 ° c עבור 5 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן את המדגם ב-20 ° c.
  4. עבור הפסקות בסלולר, השהה מחדש את התאים משלב 6.2 בינוני מלא, ואסוף 1x 10 תאים לכל מדגם. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות כדי להשיג כדורי תא עבור השלבים הבאים.
    1. כדי לבודד תאים תת תאיים, אנגיופלסטיקה לפי מפרטי הערכה. כדי לבודד כל שבר, מודלת את הגלולה תא משלב 6.4 עם המאגר המתאים, צנטריפוגה, לאסוף את supernatant ולהוסיף את המאגר הבא לתוך הגלולה כפי שמתואר 6.4.1.1-6.4.1.5. להוסיף בסדר מאגר החילוץ cytoplasmic, מאגר החילוץ ממברנה, מאגר החילוץ הגרעיני, מאגר החילוץ הגרעיני שיושלם עם 5 מ"מ CaCl2 ו-3 U/μl מיקרוהחכירה ומאגר מיצוי השלד ציטומי.
      הערה: כל המאגרים חייבים להיות מצורפים עם מעכבי פרוטאז. קנה מידה של אמצעי אחסון של מאגר בהתאם לנפח של הגלולה הסלולרית.
      1. כדי לבודד את השבר cytosolic, כדורי תא כדוריות ב 100 μL של מאגר החילוץ הקרח קר cytoplasmic בתוספת מעכבי פרוטאז ב 4 ° צ' עם ערבוב עדין עבור 10 דקות. צנטריפוגה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות ולהעביר את supernatant צינורות טרום מקורר.
      2. הוסף 100 μL של מאגר החילוץ ממברנה קרח קר בתוספת מעכבי פרוטאז לגלולה משלב 6.4.1.1, ו דגירה ב 4 ° צ' עם ערבוב עדין עבור 10 דקות. צנטריפוגה ב 3,000 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant.
      3. עבור שבר גרעיני מסיס, להוסיף 50 μL של מאגר החילוץ הגרעיני בתוספת מעכבי פרוטאז אל הגלולה משלב 6.4.1.2, ומערבולת. מודלת ב 4 ° c עבור 30 דקות, צנטריפוגה ב 5,000 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולאסוף את סופרנטאנט.
      4. עבור שבר גרעיני מסיס, להוסיף 50 μl של מאגר החילוץ הגרעיני שיושלם עם מעכבי פרוטאז, cacl2 ו-micrococcal נוקלאז אל הגלולה משלב 6.4.1.3, מערבולת. דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות, ולאחר מכן מערבולת שוב. צנטריפוגה ב 16,000 x g ב RT עבור 5 דקות ולאסוף את סופרנטאנט.
      5. עבור שבר ציטושלד, להוסיף 50 μL של מאגר החילוץ ציטושלד בתוספת עם מעכבי פרוטאז אל הגלולה משלב 6.4.1.4, ומערבולת. דגירה 10 דקות ב RT. צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 x g עבור 5 דקות, לאסוף את supernatant ולמחוק את הגלולה.
        הערה: קנה מידה של אמצעי אחסון של מאגר בהתאם לאמצעי האחסון של התא, כפי שמצוין בפרוטוקול הערכה. עיין בפרוטוקול הערכה לקבלת פרטים נוספים על הדגירה והצנטריפוגה הזמן והטמפרטורה22,23,24,25,26,27,28,29. לחילופין, להשתמש בכל השיטות הסטנדרטיות30 כי, באמצעות דטרגנטים ועל ידי הגדלת כוח יונית ומהירות צנטריפוגה, מפריד את ציטוסולג, הממברנה מאוגד, השלד הציטוזה ואת השברים הגרעיניים. באמצעות ניצול מאגרי. החילוץ הגרעיניים הסטנדרטיים ניתן לאחסן את המדגם ב-20 ° c.
    2. עבור SDS-עמוד, להוסיף 7 μL של מאגר 4x Laemmli כדי 20 μL של שברים subcellular שהתקבלו משלבים 6.4.1.1-6.4.1.5, לרתוח ב 100 ° c עבור 5 דקות.
  5. לטעון דגימות על ג'ל אקרילמיד ולבצע אלקטרופורזה במתח קבוע של 120 V. העברת חלבונים כדי ניטרוגליצרין קרום תאית ב 250 mA עבור 90 דקות.
  6. בדוק אלקטרופורזה בחלבון ג'ל החלבונים ומצליחים לחסום על ידי דגירה של הקרום עבור 5 דקות בפתרון הכתמים של פוננסו. שטפו את הקרום במים מזוקקים עד שהרקע נקי. הסר את הכתם על ידי שטיפת המשך עם מלוחים טריס באגירה עם הרצף 20 (TBST) עבור 10 דקות על שייקר.
  7. דגירה הקרום עם פתרון חסימה (5% חלב ב TBST) עבור 1 h ב RT על שייקר. רוחצים 3 פעמים עם TBST עבור 5 דקות.
  8. Hybridize הקרום עם הנוגדן העיקרי בפתרון חסימה (1% חלב ב TBST) לילה ב 4 ° c. רוחצים 3 פעמים עם TBST עבור 5 דקות.
  9. Hybridize את הקרום עם הנוגדן HRP מצומשני בפתרון חסימה עבור 1 h ב RT. לשטוף 3 פעמים עם TBST עבור 5 דקות.
  10. לזהות את להקת החלבון באמצעות כימויומינסנס. לכמת את העוצמה של להקות כתמי מערביות על ידי ImageJ. לנרמל את הביטוי חלבון על המוצר של גן משק בית: היסטון H2B עבור השבר הגרעיני מסיסים ובלתי מסיס, שולי עבור שבר cytoplasmic עבור תמציות כולל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האסטרטגיה המשמשת לנתח את ההשפעה של טאו גרעיני ביטוי גנים הימנעות מתרומת חלבונים cytoplasmic טאו מתוארת באיור 1. בקצרה, החלבונים של טאו שתויגו עם NLS או NES נצברים או אינם נכללים בתא הגרעיני, בהתאמה. ההשפעה הפונקציונלית של חוסר איזון זה הוא שינוי של ביטוי הגנים שנמדד כתוצר של הגן VGluT1.

בעקבות תיאור הפרוטוקול, SH-SY5Y תאים טופלו RA עבור 5 ימים ולאחר מכן עם BDNF עבור 3 ימים כדי להשיג לאחר הmitotic תאים כמו תא העצב (איור 2). בהעדר RA ו-BDNF, תאים מובחן SH-SY5Y להניח מורפולוגיה מהירה וגושים תא טופס. כצפוי, התחלת הליך הבידול, הגושים והתאים מתפשטים מחוץ לנוריק; בסוף בידול, תאים מופצים בצורה אחידה ומחוברים באמצעות רשת של neurites מסווים.

היום שלאחר הזריעה, התאים התעברו עם טאו-NLS או טאו-נס פלמידס (סעיף 4.2) עם שומנים בעלי כוראיות. עבור תאים המבטאים את מבנים של טאו-NLS או טאו-נס, ניתן לזהות את הלוקליזציה של התקשורת הסלולרית בטאו בעזרת נוגדנים אנטי-טאו. בהתאם ליעילות של העברה, תאים מציגים מיזוג גרעיני חזק עם האות DAPI או כתמים cytoplasmic עם גרעינים ריקים אם הם בהצלחה באמצעות טאו-NLS או טאו-נס, בהתאמה (איור 3). חוסר הסימנים הספציפיים האלה. מעיד על העברה לא יעילה

כדי לנתח את החלבונים המועשרת בתוך תא subcellular שונים, תאים נאספו ונספרו על מנת לעבד כמויות שוות של תאים לכל מדגם. כל שיטת שבירה סטנדרטית אשר מנצלת הגדלת חומרי ניקוי וכוח יוניים והגדלת מהירות צנטריפוגה ניתן להשתמש כדי להפריד את התאים הסלולריים אחד מהשני ובכך לבודד את ציטוסולג, הממברנה מאוגד, השלד הציטוזה והשברים הגרעיניים.

לאחר הגרעין היו מבודדים, את השבר הגרעיני מסיסים והשבר המאוגד כרומטין היו מופרדים על ידי הוספת 3 U/μl של מmicrococcal נוקלאז ו 5 מ"מ cacl2.

עבור ניתוח כתמי מערבי, כרכים שווים של cytoplasmic ושברים ממברנה וחצי כרכים של שברים אחרים נטענו על הדרגתי מעבר צבע של ג'ל אקרילי, כדי לתקן את כמות שונה של מאגר נוסף בכל שלב.

כדי לאמת את ההפרדה היעילה של שברים שונים, אבן הכתם המערבית הניצול של הנוגדנים הבאים בוצעה: אנטי-GADPH (הקיים בכל השברים למעט שלד ציטוזה מועשר במיוחד בשבר cytoplasmic); אנטי-actin (מועשר במיוחד בשבר השלד); anti-טובולין (במיוחד מועשר בשברים Cytoplasmic ו ציטולדים); anti-H2B (מועשר בשברים גרעיניים) (איור 4).

העשרת הסמנים הללו בשברים תת-תאיים שונים מצביעים על כך שהמהומה אינה מבוצעת בצורה טובה. יש לציין כי כל פרוטוקול לשבר בתאי המשנה עשוי להציג 10-15% של זיהום בין שברים.

לאחר שאימת את השבר המוצלח של המדגם, בוצעה האבן החשופה המערבית כדי לבדוק את האות של טאו בתא הגרעיני ואת אות VGluT1 בתמצית הכוללת (איור 5). בעוד טאו מתויג מזיהוי בכל השברים, טאו-NLS מועשר מאוד בתא הגרעיני והוא מאוד לגילוי בשבר cytoplasmic. להיפך, טאו-NES מועשר בשבר cytoplasmic והוא פחות לגילוי בשבר הגרעיני. הנוכחות של כמות קטנה של טאו-NES לתוך השבר הגרעיני מסיס צריך להיות צפוי מאז, כמו טאו אנדוגניים, זה translocated מוקם לתוך הגרעין ופעם לתוך התא הגרעיני האות היצוא הגרעיני מאפשר טרנסלוקציה שלה הציטופלסמה. הגילוי של העשרה שונים לשני החלבונים הללו עשוי להצביע על בעיה ביעילות של העברה או בשכפול של בנייה או משבר.

ניתן לבצע ניתוח כמותי של אבן חשופה מערבית באמצעות ImageJ. הערכים מנורמלות עבור הגן של משק הבית הספציפי עבור כל שבר (החלק השני עבור השבר cytoplasmic; הייסטון H2B עבור שברים גרעיניים מסיסים כרומטין-מאוגד).

הגרף באיור 5ב מדווח על היחס של הטאו בשבר הגרעיני מסיס ו cytoplasmic שבר כדי להדגיש כי הטאו-NLS מועשר מאוד בשבר גרעיני מסיס (snf) בעוד טאו-נס הוא ירד. יתר על כן, טאו-NLS מועשר בשבר כרומטין-מאוגד (CBF) ביחס לשבר cytoplasmic (CF) בעוד טאו-NES הוא ירד. SNF/CF = 1 ו-CBF/CF = 1 מקבילים ליחס הטאו בתאי בקרה. טאו אנדוגני אינו מזהה בכל השברים כצפוי. הגרף באיור 5C מדווח על כימות הביטוי הVGluT1 בתמציות הכולל של דגימות המבטאות כמות שונה של טאו גרעיני. בתאים המבטאים את טאו-נס, ביטוי VGluT1 הוא דומה לביטוי הבסיסי בתאי השליטה. להיפך, בתאים המבטאים את טאו או את טאו-NLS, הביטוי של VGluT1 הוא יותר מאשר הוכפל.

Figure 1
איור 1: ייצוג גרפי של האסטרטגיה המשמשת כדי לאפשר הצטברות גרעינית או cytoplasmic של טאו. טאו-NLS נצבר בתא הגרעין בזמן שטאו-נס לא נכלל. הבדיקה הניסיונית היא האפנון של הביטוי VGluT1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הנציג מובחן והבדיל תרבות התא. תמונה של מובחן SH-SY5Y (משמאל), תאים הבדיל על ידי RA (באמצע) ו הבדיל על ידי RA ו BDNF (מימין). סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דמותו הייצוגית של העשרה הביותאית של הטאו על ידי מאימונולובורנציה. תמונה של תאים שלא הייתה מפועלת או מבטאת ביטוי של טאו מתויג, טאו-נס או טאו-NLS. האות טאו הושג על ידי מimmunofluorescence (אדום), האות גרעינים הושג על ידי כתמים DAPI (כחול), תמונות ממוזגות מדווחים. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי מייצג של חלבונים המועשרת בשברים תת-תאיים על-ידי אבן החשופה המערבית. הכתם המערבי של שברים תת-סלולריים מ-SH-SY5Y תאים. CF = שבר cytoplasmic; MF = שבר ממברנה; SNF-שבר גרעיני מסיס; שבר כרוך בכרומטין CBF =; CKF = שבר השלד הציטומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: זיהוי מייצג של טאו גרעיני וחלבונים VGluT1. (א) הכתם המערבי של חלבון הטאו זוהה בשברים גרעיניים ו cytoplasmic. (ב) הגרף מדווח על יחס הטאו של השברים הגרעיניים והשבר הציטוסמטי. הערכים הנורמו בטאו האנדוגניים. SNF/CF = 1 ו-CBF/CF = 1 מתאים ליחס אנדוגני בתאי הבקרה. (C) הכתם המערבי של חלבון VGluT1. (ד) הגרף מדווח על כימות הביטוי של VGluT1 בתמציות הכולל של דגימות המבטאות כמות שונה של טאו גרעיני. מבחן קרוקל-ווליס אנובה ומאן-ויטני; p < 0.001, * * * * p < 0.0001, נ p > 0.05. כל התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים לפחות. דמות מייצגת זו שונתה מתוך Siano et al.31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים שיטה למדוד את ההשפעה של חלבון הטאו גרעיני על ביטוי גנים. עם הפרוטוקול הזה התרומה. של cytoplasmic טאו מוגבלת מאוד צעדים קריטיים של פרוטוקול זה הם הבאים: הבידול של האדם נוירובלסטומה SY5Y תאים, את השבר הסלולר ואת הלוקליזציה של חלבון הטאו בתא הגרעיני.

ראשון, כפי שמוצג בסעיף תוצאות נציג, הבידול של SH-SY5Y תאים על ידי הוספת RA ו BDNF הוא חיוני כדי לקבל הכנה טובה של תאים כמו תא העצב בתרבות. צפיפות התאים הנזרע חשובה במיוחד מאחר שצפיפות נמוכה יותר עלולה להשפיע על תפוצת תאים. יתר על כן, עבור ניסויים הזקוקים למספר גבוה של תאים, כמו משבר הסלולר והכתם המערבי, חשוב לציין כי BDNF בידול צעד חוסם את התפשטות הסלולר כדי לאפשר בידול הטרמינל, ובכך להגביל את מספר התאים בתרבות. פרוטוקולי בידול חלופיים להשתמש רק RA או NGF במקום BDNF. עם זאת, בעוד הוספת bdnf לאחר RA מאפשר להגיע לבידול מורפולוגית טובה יותר32,33, ngf משרה neurite מוצלח חלשה יותר SH-SY5Y תאים34. יתר על כן, זה כבר הוכיחה בהרחבה כי השילוב של RA ו BDNF מאפשר להשיג אוכלוסיה נוירולית הומוגנית עם ביטוי של סמנים עצביים וירידה התפשטות35. מסיבה זו, פרוטוקול הבידול מנוצל כאן משלב RA ו-BDNF.

עם זאת, ההליך שדווח לנתח את התפקיד של טאו בתאי subcellular שונים ניתן להשתמש גם עבור תאים מובחן או עבור סוגי תאים שונים.

משבר הסלולר הוא צעד קריטי מאוד וזה חיוני שיש מספיק חומר מתחיל: ערכת מסחרית דורש רק 1 x 106 תאים, ואילו הליכים אחרים עשויים להזדקק לכמות ההתחלתית הרבה יותר גבוהה. יתר על כן, השימוש בערכה עם מאגרים סטנדרטיים ומדרגות מבטיח את האפשרות הנוזטה של הניסוי כי הוא בלתי נמנע וחיוני. עם זאת, כיוון שהרכב של מאגרים הוא לעתים קרובות קנייני, הם עשויים להכיל חומרי ניקוי העשויים לשנות את הפונקציה של חלבון הריבית, וייתכן שיהיה קשה למטב את הבידוד של השברים. יתר על כן, גם במצב הטוב ביותר, יכול להיות 10-15% של זיהום בין שברים. תשואה גרועה מכל שבר ניתן להתגבר על ידי הגדלת זמן הדגירה של מאגרי החילוץ של שברים ספציפיים.

מאחר שהפונקציות של טאו גרעיני זכו לעניין משמעותי בשנים האחרונות, חשוב במיוחד לספק שיטה אמינה לנתח את תפקידה של הטאו בתאים סלולריים שונים. הצמד את משבר התקשורת התת, כאשר הביטוי של טאו בונה באופן ספציפי או נשלל מהגרעין, מאפשר לאחד לכוונן את כמות הטאו בתאים שונים.

צעד קריטי בחלק זה של הפרוטוקול הוא שיבוט של טאו המתויג עם אות לוקליזציה גרעינית או עם אות היצוא הגרעיני. היעילות של ה-NLS מובטחת על ידי הימצאות של רצף הסכמה של 3XNLS מהוירוס SV40. את הטרנסלוקציה הגרעינית של החלבון ניתן לבדוק בקלות על-ידי מעטפת חיסונית, וחוסר האות לתוך הגרעין עשוי להיות עקב שיבוט שגוי או לזיהום לא יעיל. להיפך, היצוא הגרעיני מובטח ברצף הקונצנזוס של נס. במקרה זה, החיסונית מאפשר לבדוק את היצוא של טאו מן הגרעין. עם זאת, אות גרעיני חלש אינו ניתן להוצאה מאז החלבון של טאו-NES נכנס לגרעין ולאחר מכן, בשל הרצף NES, הוא מיוצא אל הציטוסול.

עד עכשיו, הפונקציה של טאו גרעיני נחקרה רק על ידי מגישות שאינן מבטיחות את מעורבותו הישירה. הפרוטוקול המתואר כאן, מספק את הגישה הראשונה המאפשרת להפלות בבירור את התפקוד הספציפי של הטאו לתוך התא הגרעיני. כפי שהראו בעבר, טאו אנדוסוגני אינו משפיע על התוצאות שהתקבלו על ידי פרוטוקול זה. אכן, אותו ניסוי שבוצע בתאים שאינם עצביים שאינם מבטאים את טאו אנדוגני, מוביל לביטוי VGluT1 שונה. החלתי פרוטוקול זה כדי ללמוד את הביטוי של גנים הקשורים למחלות31. בכל מקרה, ניתן לנצל את זה גם כדי לחקור פונקציות אחרות של טאו גרעיני, כגון מעורבות בנזקי DNA, אינטראקציה עם קופנים גרעיניים או עם כרומטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Scuola Normale הסופרור (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10,000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1,000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Tags

גנטיקה סוגיה 154 הגרעין הגרעיני הבדיל SH-SY5Y שברים גרעיניים אותות לוקליזציה שבירה משנית אבן חשופה מערבית
מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco,… More

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter