Summary
Il Tau è una proteina neuronale presente sia nel citoplasma, dove lega i microtubuli, sia nel nucleo, dove esercita funzioni non convenzionali tra cui la modulazione dei geni correlati alla malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo un metodo per studiare la funzione del Tau nucleare escludendo eventuali interferenze provenienti da citoplasmatica Tau.
Abstract
Il Tau è una proteina legante di microtubuli espressa nei neuroni e la sua principale funzione nota è legata al mantenimento della stabilità citoscheletrica. Tuttavia, prove recenti hanno indicato che Tau è presente anche in altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo in cui è implicato nella protezione del DNA, nella trascrizione del rRNA, nella mobilità dei retrotrasposoni e nell'organizzazione strutturale del nucleolus. Recentemente abbiamo dimostrato che il Tau nucleare è coinvolto nell'espressione del gene VGluT1, suggerendo un meccanismo molecolare che potrebbe spiegare l'aumento patologico del rilascio del glutammato nelle prime fasi del morbo di Alzheimer. Fino a poco tempo fa, il coinvolgimento del Tau nucleare nella modulazione dell'espressione dei geni bersaglio è stato relativamente incerto e ambiguo a causa di limitazioni tecniche che impedivano l'esclusione del contributo di Tau citoplasmico o dell'effetto di altri fattori a valle non correlati al Tau nucleare. Per superare questa incertezza, abbiamo sviluppato un metodo per studiare l'espressione di geni bersaglio specificamente modulati dalla proteina Nucleare Tau. Abbiamo impiegato un protocollo che afcoppia l'uso di segnali di localizzazione e la frazione subcellulare, consentendo l'esclusione dell'interferenza dalle molecole citoplasmiche Tau. In particolare, il protocollo è facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule e condizioni cellulari.
Introduction
Le funzioni della proteina Tau nel nucleo hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, in quanto è stato dimostrato essere strettamente associato agli acidi nucleici1,2,3,4,5,6. Ineffetti, un recente studio a livello di genoma ha dimostrato che Tau lega sequenze di DNA genico e intergenico in vivo7. Un ruolo nell'organizzazione nucleolare è stato suggerito8,9,10,11. Inoltre, è stato proposto che Tau sia coinvolto nella protezione del DNA dallo stress ossidativo e ipertermico5,10,12,13, mentre Tau mutato è stato collegato all'instabilità cromosomica e all'aneuploidità14,15,16.
Fino ad ora, le sfide nello studio delle funzioni di Tau nel compartimento nucleare sono rimaste quasi irrisolte a causa delle difficoltà nel sezionare il contributo specifico del Tau nucleare dal contributo di Citoplasma Tau. Inoltre, le funzioni attribuite alle molecole Tau nel compartimento nucleare, fino ad ora, sono correlate solo perché mancano di una dimostrazione inequivocabile del coinvolgimento diretto delle proteine Nucleari Tau. Infatti, il coinvolgimento di Tau nella mobilità dei retrotrasposoni o nella trascrizione del rRNA o nella protezione del DNA11,12,17,18,19 potrebbe essere spiegato anche dal contributo di Tau citoplasmico o dall'effetto di altri fattori a valle non legati al Tau nucleare.
Qui, forniamo un metodo che può risolvere questo problema sfruttando una procedura classica per isolare il compartimento nucleare combinato con l'uso di costrutti Tau 0N4R etichettati con localizzazione nucleare (NLS) o segnali di esportazione nucleare (NES). Questo approccio elimina i complessi problemi relativi ai possibili artefatti dovuti alla fuoriuscita di molecole Tau dal compartimento citoplasmatico. Inoltre, i costrutti Tau-NLS e Tau-NES inducono l'arricchimento o l'esclusione delle molecole Tau dal compartimento nucleare, rispettivamente, fornendo controlli positivi e negativi per il coinvolgimento delle molecole nucleari Tau in una funzione specifica. Il protocollo è tecnicamente facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule, differenziate o meno, come le cellule tumorali che riattivano l'espressione Tau20,21. Inoltre, potrebbe essere applicato anche ad altre proteine che sono presenti sia nel citoplasma che nel nucleo al fine di sezionare le funzioni biologiche relative a diversi compartimenti.
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Protocol
1. Cultura cellulare
- Cellule SH-SY5Y di coltura (linea cellulare del neuroblastoma umano, CRL-2266) nel mezzo completo (Dulbecco's modified Eagle medium:miscela nutritiva F12 [DMEM/F-12] completata con 10% di siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicillina e 100 streptonomici). Mantenere le cellule in un'incubatrice a 37 e 5% di CO2. Crescere le cellule in piastre 10 cm e dividere quando confluente.
2. Differenziazione cellulare
- Per differenziare le cellule SH-SY5Y, il giorno dopo la placcatura, aggiungere 10 -M di acido retinoico (RA) per completare il mezzo per 5 giorni.
- Il sesto giorno sostituisce il mezzo con il mezzo di differenziazione: DMEM/F-12 integrato con 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamine. Non aggiungere FBS o antibiotici.
- Far crescere le cellule in mezzo di differenziazione per 3 giorni.
3. Costrutte chimetriche La clonazione
- Generare il costrutto Tau-NLS mediante clonazione per digestione enzimatica di restrizione nel telaio alla fine 3' della sequenza Tau 0N4R (383aa) il 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAGAGAGAGAAGGAAAAAGAA.AAGAAGAAGGTAGAAAAAAGAAGAAGA-3.
NOT: Il 3xNLS alla fine 3' di Tau è clonato nel pCMV-Tau plasmide per l'espressione dei mammiferi che sfruttano i siti di restrizione XhoI e BamHI nel sito di multicloning (MCS). - Generare il costrutto Tau-NES mediante clonazione per digestione enzimatica di restrizione nel frame alla fine 3' della sequenza Tau 0N4R (383aa) la sequenza NES: 5'-AGTGAGCGAACAAGCTGGAGAGTTGGATGGGGCTCGTACAA-3'.
NOT: Il NES alla fine 3' di Tau è clonato nel pCMV-Tau plasmide per l'espressione dei mammiferi sfruttando i siti di restrizione EcoRI e BamHI nell'MCS. - Trasformare la deformazione DH5alpha E.coli con 100 ng di DNA dal passo 3.1 o 3.2 e piastre lamino su piastre LB-Agar con 100 mg/mL di ampicillina. Lasciar crescere per una notte a 37 gradi centigradi.
- Scegli una singola colonia e spike le cellule in 5 mL di LB con ampicillina. Lasciare che le cellule crescano a 37 gradi centigradi in agitazione durante la notte.
- Estrarre il plasmide con un miniprep di DNA (Tabella dei materiali) e la sequenza per verificare i costrutti.
- Trasformare la deformazione DH5alpha E. coli con la sequenza dei costrutti e delle cellule delle lastre verificate su piastre LB-Agar con ampicillina. Lasciar crescere per una notte a 37 gradi centigradi.
- Scegli una singola colonia e spike le cellule in 5 mL di LB con ampicillina. Lasciare che le cellule crescano a 37 gradi centigradi in agitazione per 2 h.
- Mettere le celle dal passo 3.7 in 200 mL di LB con ampicillina. Lasciar crescere per una notte a 37 gradi centigradi.
- Pellere le cellule a 3.500 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Estrarre il plasmide con un maxiprep di DNA (Tabella dei materiali).
4. Trasfezione cellulare
- Seme 400.000 cellule dal passo 1.1 in piastre 6-pozzi o 20.000 cellule in 7-well diapositive camera. Piastra quattro campioni: celle di controllo da trasfetare con un vettore vuoto, cellule da trasfetare con Tau senza tag, cellule da trasfetare con Tau-NLS e cellule da trasfetare con Tau-NES.
- Il giorno dopo la seeding transfect 400 ng di DNA per ogni pozzo utilizzando i lipidi cationici (Tabella dei materiali) in piastre a 6 pozzetti o 200 ng di DNA per ogni pozzo per 8-pozzi camere diapositive, secondo le istruzioni del produttore.
- Incubare il DNA e i lipidi cationici separatamente in 250 gradi l (per piastre 6 pozze) o 25 l (per i vetrini a 8 pozzi) di mezzo siero ridotto per 5 min a RT. Quindi combinarli per generare il complesso DNA-lipidico e incubare per 20 min.
- Sostituire il supporto di coltura con 2 mL (per piastre di 6 pozze) o 250 l (per scivoli da camera a 8 pozze) di fresco mezzo di coltura completa. Aggiungete il complesso DNA-lipidico alle cellule e incubate a 37 gradi durante la notte.
- In alternativa, trasfecare il DNA con il reagente cationico in polietilenimine (PEI).
- Mescolare 2 g di DNA e 6 l. di PEI con 200 l di mezzo di coltura completa (per ogni pozzo in 6 pozze di fissità), o 1 g di DNA e 3 G di PEI con 100 l di mezzo di coltura completo (per ogni pozzo in scivoli da camera a 8 pozze) , vortice e incubare per 10 min a RT.
- Aggiungete il mix alle cellule e aggiungete 1,8 mL di mezzo di coltura completo per pozzo in piatti a 6 pozzetti o 150 l di mezzo di coltura completa per pozzo in scivoli da 8 camere per raggiungere il volume di placcatura.
- Modificare il supporto il giorno dopo la trasfezione e aggiungere il supporto di differenziazione come descritto nel passaggio 2.2.
5. Immunofluorescenza
- Rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare le cellule con 1x PBS. Fissare le cellule con metanolo freddo al 100% per 3 min senza agitare. Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare brevemente con 1x PBS.
- Permeabilizzare con 0,1% di surfactant non ionico in 1x PBS per 5 min a temperatura ambiente (RT). Lavare brevemente con 1x PBS, 3 volte.
- Incubare cellule con buffer di blocco (0,1% Tween 20 e 1% BSA in PBS) per 30 min a RT su uno shaker orbitale.
- Incubare con anticorpi primari appropriati (ad esempio, anticorpo anti-Tau13 monoclonale murino) diluito 1:500 nel buffer di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con 1x PBS.
- Incubazione con anticorpi secondari coniugati al fluoroforo (ad esempio, anticorpi antito-tono di capra coniugati ad Alexa Fluor 633) diluito 1:500 nel buffer di blocco per 1 h a RT. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con 1x PBS 3 volte.
- Per macchiare i nuclei, incubare con DAPI diluito 1:20,000 nel buffer di blocco per 10 min a RT. Lavare con 1x PBS 3 volte. Montare i copricapi su una diapositiva utilizzando il supporto di montaggio antisbidisca.
6. Blot Occidentale
- Per raccogliere il pellet cellulare dal passaggio 4.4, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS. Incubare con 500 gradi l di 0,1% di metapsina per 4 min a 37 gradi centigradi. Aggiungere un volume uguale di celle medie complete e di sospensione.
- Raccogliere le cellule in un tubo e centrifugare a 500 x g per 5 min. Alla fine della centrifuga rimuovere con attenzione il super-natante. Aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare a 500 x g per 5 min e rimuovere con attenzione il supernatante. Conservare i pellet cellulari sul ghiaccio per un uso immediato o congelare a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
- Per estratti totali di proteine, incubare il pellet cellulare per 30 min sul ghiaccio nel tampone di lisi (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% di ottilfenioli poli(etileneosy)etanolo, ramificato (Tabella dei materiali), 10 mM EDTA) integrato con proteasi e fofoshare. In base all'abbondanza del pellet, utilizzare da 50 a 100 l of lysis buffer.
- Centrifugare l'estratto a 16.000 x g per 15 min. Raccogliere il supernatante e quantificare la concentrazione proteica con qualsiasi saggio di quantificazione standard. Preparare i campioni di proteine per l'SDS-PAGE mescolando 20 g di proteine con 5 g di 4x laemmli tampone in un volume totale di 20 gradi centigradi e far bollire a 100 gradi centigradi per 5 min.
NOT: Il campione può essere conservato a -20 gradi centigradi.
- Centrifugare l'estratto a 16.000 x g per 15 min. Raccogliere il supernatante e quantificare la concentrazione proteica con qualsiasi saggio di quantificazione standard. Preparare i campioni di proteine per l'SDS-PAGE mescolando 20 g di proteine con 5 g di 4x laemmli tampone in un volume totale di 20 gradi centigradi e far bollire a 100 gradi centigradi per 5 min.
- Per le frazioni subcellulari, risospendere le cellule del passaggio 6.2 nel mezzo completo e raccogliere 1 x 106 cellule per ogni campione. Centrifuga a 500 x g per 10 min per ottenere pellet cellulari per i seguenti passaggi.
- Per isolare i compartimenti subcellulari, frazionare secondo le specifiche del kit. Per isolare ogni frazione, incubare il pellet cellulare dal punto 6.4 con il buffer corrispondente, centrifugare, raccogliere il supernatante e aggiungere il buffer successivo al pellet come descritto in 6.4.1.1-6.4.1.5. Aggiungere in ordine buffer di estrazione citoplasmica, buffer di estrazione della membrana, buffer di estrazione nucleare, buffer di estrazione nucleare integrato con 5 mM CaCl2 e 3 buffer di estrazione nucoccale e citoscheletro.
NOT: Tutti i buffer devono essere integrati con inibitori della proteasi. Ridimensiona i volumi del buffer in base al volume del pellet cellulare.- Per isolare la frazione citosolica, incubare pellet cellulari in 100 gradi di buffer di estrazione citoplasmica ghiacciata integrata con inibitori della proteasi a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione per 10 min. Centrifugi a 500 x g a 4 gradi centigradi per 5 minuti e trasferire il soldante in tubi pre-raffreddati.
- Aggiungete al pellet 100 l di macchia di estrazione della membrana ghiacciata al pellet da 6,4,1,1, e incubate a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione per 10 min. Centrifughe a 3.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min e raccogliete il supernatante.
- Per la frazione nucleare solubile, aggiungere 50 l di buffer di estrazione nucleare integrato con inibitori della proteasi al pellet dal passo 6.4.1.2, e vortice. Incubare a 4 gradi centigradi per 30 min, centrifugare a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min, e raccogliere il supernatante.
- Per la frazione nucleare insolubile, aggiungere 50 l of nuclear extraction buffer integrati con inibitori della proteasi, CaCl2 e nuclease micrococcale al pellet dal punto 6.4.1.3 e vortice. Incubare a 37 gradi centigradi per 5 min, quindi rivorare. Centrifuga a 16.000 x g a RT per 5 min e raccogliere il supernatante.
- Per la frazione citoscheletrica, aggiungere 50 lofsac che il buffer di estrazione citoscheletro integrato con inibitori della proteasi al pellet dal passo 6.4.1.4 e il vortice. Incubare 10 min a RT. Centrifugare il tubo a 16.000 x g per 5 min, raccogliere il supernatante e scartare il pellet.
NOT: Ridimensiona i volumi del buffer in base al volume della cella, come indicato nel protocollo del kit. Fare riferimento al protocollo del kit per ulteriori dettagli su incubazione e tempo di centrifugazione e temperatura22,23,24,25,26,27,28,29. In alternativa, utilizzare qualsiasi metodo standard30 che, utilizzando detergenti e aumentando la forza ionica e la velocità di centrifugazione, separa il citosolico, la membrana-bound, le frazioni citoscheletriche e nucleari. Separare la frazione nucleare solubile e la frazione nucleare insolubile sfruttando i buffer di estrazione nucleare standard. Il campione può essere conservato a -20 gradi centigradi.
- Per l'SDS-PAGE, aggiungete 7 - L di 4x Laemmli buffer a 20 - L di frazioni subcellulari ottenute dai passi 6.4.1.1.6.1.5, far bollire a 100 gradi centigradi per 5 min.
- Per isolare i compartimenti subcellulari, frazionare secondo le specifiche del kit. Per isolare ogni frazione, incubare il pellet cellulare dal punto 6.4 con il buffer corrispondente, centrifugare, raccogliere il supernatante e aggiungere il buffer successivo al pellet come descritto in 6.4.1.1-6.4.1.5. Aggiungere in ordine buffer di estrazione citoplasmica, buffer di estrazione della membrana, buffer di estrazione nucleare, buffer di estrazione nucleare integrato con 5 mM CaCl2 e 3 buffer di estrazione nucoccale e citoscheletro.
- Caricare campioni su un gel di acrilammide ed eseguire l'elettroforesi a una tensione costante di 120 V. Trasferire le proteine alla membrana di nitrocellulosa a 250 mA per 90 min.
- Controllare l'elettroforesi in gel proteico corretto e gonfiore di successo incubando la membrana per 5 min nella soluzione di colorazione Ponceau. Sciacquare la membrana in acqua distillata fino a quando lo sfondo è pulito. Rimuovere la macchia continuando il lavaggio con Tris tamponata salina con Tween 20 (TBST) per 10 min su uno shaker.
- Incubare la membrana con soluzione di blocco (5% di latte in TBST) per 1 h a RT su shaker. Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
- Ibridare la membrana con l'anticorpo primario nella soluzione di blocco (1% di latte in TBST) durante la notte a 4 gradi centigradi. Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
- Ibrida reati la membrana con l'anticorpo secondario coniugato HRP in soluzione di blocco per 1 h a RT. Lavare 3 volte con TBST per 5 min.
- Rilevare la fascia proteica utilizzando la chemiluminescenza. Quantifica l'intensità delle bande Western Blot di ImageJ. Normalizzare l'espressione proteica sul prodotto di un gene di pulizia: istone H2B per la frazione solubile e insolubile nucleare, GAPDH per la frazione citoplasmatica e per gli estratti totali.
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Representative Results
La strategia utilizzata per sezionare l'impatto del Tau nucleare nell'espressione genica evitando il contributo delle proteine Tau citoplasmiche è stata descritta nella Figura 1. In breve, le proteine Tau etichettate con NLS o NES vengono accumulate o escluse rispettivamente dal compartimento nucleare. L'effetto funzionale di questo squilibrio è l'alterazione dell'espressione genica misurata come prodotto del gene VGluT1.
Dopo la descrizione del protocollo, le cellule SH-SY5Y sono state trattate con RA per 5 giorni e poi con BDNF per 3 giorni al fine di ottenere cellule simili a neuroni post-mitotiche (Figura 2). In assenza di RA e BDNF, cellule SH-SY5Y indifferenziate assumono una morfologia più rotonda e formano grumi cellulari. Come previsto, iniziando il protocollo di differenziazione, i grumi si dissolvono e le cellule si diffondono dai neuriti; alla fine della differenziazione, le cellule sono distribuite uniformemente e interconnesse attraverso una rete di neuriti ramificati.
Il giorno dopo la semina, le cellule sono state trascate con plasmidi Tau-NLS o Tau-NES (sezione 4.2) con lipidi cationici. Per le cellule che esprimono costrutti Tau-NLS o Tau-NES, la localizzazione subcellulare Tau può essere rilevata mediante immunofluorescenza con anticorpi anti-Tau. A seconda dell'efficienza della trasfezione, le cellule mostrano una forte colorazione nucleare che si fonde con il segnale DAPI o una colorazione citoplasmica con nuclei vuoti se vengono trascate con successo con Tau-NLS o Tau-NES, rispettivamente (Figura 3). La mancanza di questi segnali specifici indica una trasfezione inefficiente.
Per analizzare le proteine arricchite in diversi compartimenti subcellulari, le cellule sono state raccolte e contate al fine di elaborare quantità uguali di cellule per campione. Qualsiasi metodo di frazionazione standard che sfrutta l'aumento della resistenza detergente e ionica e la crescente velocità di centrifugazione può essere utilizzato per separare i compartimenti cellulari l'uno dall'altro e quindi isolare il citosolico, il legato alla membrana, il citoscheletrico e le frazioni nucleari.
Una volta che i nuclei sono stati isolati, la frazione solubile nucleare e la frazione legata alla cromatina sono state separate aggiungendo 3 U/L di nucleale micrococcico e 5 mM CaCl2.
Per l'analisi western blot, volumi uguali di frazioni citoplasmatiche e membrana e metà volumi delle altre frazioni sono stati caricati su un gel di acrilammide prefabbricato a gradiente, per correggere la diversa quantità di buffer aggiunto ad ogni passo.
Per verificare l'efficiente separazione delle diverse frazioni, è stata eseguita la macchia occidentale che sfrutta i seguenti anticorpi: anti-GADPH (presente in tutte le frazioni tranne il citoscheletro e particolarmente arricchito nella frazione citoplasmica); anti-actin (particolarmente arricchito nella frazione citoscheletrica); anti-tubulina (particolarmente arricchita nelle frazioni citoplasmatiche e citoscheletriche); anti-H2B (arricchito nelle frazioni nucleari) (Figura 4).
Un arricchimento di questi marcatori in diverse frazioni subcellulari indica che la frazione non è ben eseguita. Va notato che qualsiasi protocollo per la frazione subcellulare potrebbe presentare un 10-15% di contaminazione tra le frazioni.
Una volta verificata la frazione di successo del campione, è stata eseguita la macchia occidentale per controllare il segnale di Tau nel compartimento nucleare e il segnale VGluT1 nell'estratto totale (Figura 5). Mentre Tau senza tag è rilevabile in tutte le frazioni, Tau-NLS è fortemente arricchito nel compartimento nucleare ed è scarsamente rilevabile nella frazione citoplasmatica. Al contrario, Tau-NES è arricchito nella frazione citoplasmatica ed è meno rilevabile nella frazione nucleare. La presenza di una piccola quantità di Tau-NES nella frazione nucleare solubile è prevedibile poiché, come il Tau endogeno, viene traslocato nel nucleo e una volta nel compartimento nucleare il segnale di esportazione nucleare ne consente la traslocazione al citoplasma. La rilevazione di un arricchimento diverso per queste due proteine di fusione potrebbe indicare un problema nell'efficienza della trasfezione o nella clonazione di costrutti o in frazionazione.
L'analisi quantitativa della macchia occidentale può essere effettuata utilizzando ImageJ. I valori sono normalizzati per il gene delle pulidi specifiche per ogni frazione (GAPDH per frazione citoplasmica; istone H2B per frazioni nucleari e cromatine solubili).
Il grafico nella figura 5B riporta il rapporto tra Tau nella frazione nucleare solubile e nella frazione citoplasmica per evidenziare che Tau-NLS è altamente arricchito nella frazione nucleare solubile (SNF) mentre Tau-NES è diminuito. Inoltre, Tau-NLS è arricchito nella frazione legata alla cromatina (CBF) rispetto alla frazione citoplasmica (CF) mentre Tau-NES è diminuito. SNF/CF : 1 e CBF/CF 1 corrispondono al rapporto Tau nelle celle di controllo. Il Tau endogeno è debolmente rilevabile in tutte le frazioni come previsto. Il grafico in Figura 5C riporta la quantificazione dell'espressione VGluT1 negli estratti totali di campioni che esprimono diverse quantità di Tau nucleare. Nelle cellule che esprimono Tau-NES, l'espressione VGluT1 è paragonabile all'espressione di base nelle celle di controllo. Al contrario, nelle cellule che esprimono Tau o Tau-NLS senza tag, l'espressione di VGluT1 è più che raddoppiata.
Figura 1: Rappresentazione grafica della strategia utilizzata per consentire un accumulo nucleare o citoplasma societa di Tau. Tau-NLS si accumula nel compartimento nucleare, mentre Tau-NES è escluso. La lettura sperimentale è la modulazione dell'espressione VGluT1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentativa della coltura cellulare indifferenziata e differenziata. Immagine di SH-SY5Y indifferenziato (a sinistra), celle differenziate da RA (al centro) e differenziate da RA e BDNF (a destra). Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagine rappresentativa dell'arricchimento subcellulare Tau per immunofluorescenza. Immagine di cellule non trastrafazioni o che esprimono costrutti Tau, Tau-NES o Tau-NLS senza tag. Il segnale Tau è stato ottenuto mediante immunofluorescenza (rosso), il segnale nuclei è stato ottenuto mediante colorazione DAPI (blu), vengono segnalate immagini unite. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rilevamento rappresentativo delle proteine arricchite in frazioni subcellulari da macchie occidentali. Macchie occidentali di frazioni subcellulari provenienti da cellule SH-SY5Y. CF - frazione citoplasmatica; MF - frazione di membrana; SNF - frazione nucleare solubile; CBF - frazione legata alla cromatina; CKF - frazione citoscheletrica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rilevamento rappresentativo delle proteine nucleari Tau e VGluT1. (A) Macchia occidentale della proteina Tau rilevata nelle frazioni nucleari e citoplasmiche. (B) Il grafico riporta il rapporto tra Tau nelle frazioni nucleari e nella frazione citoplasmatica. I valori sono stati normalizzati sul Tau endogeno. SNF/CF - 1 e CBF/CF - 1 corrisponde al rapporto Tau endogeno nelle celle di controllo. (C) Macchia occidentale della proteina VGluT1. (D) Il grafico riporta la quantificazione dell'espressione VGluT1 negli estratti totali di campioni che esprimono diverse quantità di Tau nucleare. Test di Kruskal-Wallis ANOVA e Mann-Whitney; p < 0,001, ssp < 0.0001, n.s. p > 0,05. Tutti i risultati sono indicati come media: SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Questa cifra rappresentativa è stata modificata da Siano etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un metodo per misurare l'impatto della proteina Tau nucleare sull'espressione genica. Con questo protocollo il contributo di Tau citoplasmatica è fortemente limitato. I passaggi critici di questo protocollo sono i seguenti: la differenziazione delle cellule umane del neuroblastoma SH-SY5Y, la frazione subcellulare e la localizzazione della proteina Tau nel compartimento nucleare.
In primo luogo, come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi, la differenziazione delle cellule SH-SY5Y mediante l'aggiunta di RA e BDNF è fondamentale per ottenere una buona preparazione di cellule neuronali-come nella coltura. La densità delle cellule semi è particolarmente importante poiché una densità inferiore potrebbe influenzare la proliferazione cellulare. Inoltre, per gli esperimenti che necessitano di un elevato numero di cellule, come la frazione cellulare e la macchia occidentale, è importante notare che la fase di differenziazione BDNF blocca la proliferazione cellulare per consentire la differenziazione terminale, limitando così il numero di cellule in coltura. I protocolli di differenziazione alternativi utilizzano solo RA o NGF anziché BDNF. Tuttavia, mentre l'aggiunta di BDNF dopo RA permette di raggiungere una migliore differenziazione morfologica32,33, NGF induce una crescita neurite più debole nelle cellule SH-SY5Y34. Inoltre, è stato ampiamente dimostrato che la combinazione di RA e BDNF permette di ottenere una popolazione neuronale omogenea con espressione di marcatori neuronali e diminuzione della proliferazione35. Per questo motivo, il protocollo di differenziazione qui utilizzato combina RA e BDNF.
Tuttavia, la procedura riportata per sezionare il ruolo di Tau in diversi compartimenti subcellulari può essere utilizzata anche per cellule indifferenziate o per diversi tipi di cellule.
La frazione subcellulare è un passo molto critico ed è fondamentale avere abbastanza materiale di partenza: un kit commerciale richiede solo 1 x 106 cellule, mentre altre procedure potrebbero aver bisogno di una quantità iniziale molto più alta. Inoltre, l'uso di un kit con buffer e passaggi standard garantisce la riproducibilità dell'esperimento che è inevitabile ed essenziale. Tuttavia, poiché la composizione dei buffer è spesso proprietaria, potrebbero contenere detergenti che possono alterare la funzione della proteina di interesse e potrebbe essere difficile ottimizzare l'isolamento delle frazioni. Inoltre, anche nelle migliori condizioni, ci potrebbe essere un 10-15% di contaminazione tra le frazioni. Una scarsa resa da ogni frazione potrebbe essere superata aumentando il tempo di incubazione nei buffer di estrazione di frazioni specifiche.
Dal momento che le funzioni del Tau nucleare hanno guadagnato un notevole interesse negli ultimi anni, è particolarmente importante fornire un metodo affidabile per sezionare la funzione di Tau in diversi compartimenti cellulari. L'accoppiamento della frazione subcellulare, con l'espressione di costrutti Tau specificamente diretti o esclusi dal nucleo, permette di sintonizzare finemente la quantità di Tau in diversi compartimenti.
Un passo critico in questa parte del protocollo è la clonazione di Tau etichettato con segnale di localizzazione nucleare o con il segnale di esportazione nucleare. L'efficienza del NLS è garantita dalla presenza di una sequenza di consenso 3XNLS dal virus SV40. La traslocazione nucleare della proteina può essere facilmente controllata dall'immunofluorescenza e la mancanza di segnale nel nucleo potrebbe essere dovuta a una clonazione errata o a una trasfezione inefficiente. Al contrario, l'esportazione nucleare è garantita dalla sequenza di consenso NES. In questo caso, l'immunofluorescenza consente il controllo dell'esportazione di Tau dal nucleo. Tuttavia, un segnale nucleare debole non deve essere escluso poiché la proteina Tau-NES entra nel nucleo e poi, a causa della sequenza NES, viene esportata nel citosol.
Finora, la funzione del Tau nucleare è stata studiata solo da approcci correlati che non ne assicurano il coinvolgimento diretto. Il protocollo qui descritto fornisce il primo approccio che consente di discriminare chiaramente la funzione specifica di Tau nel compartimento nucleare. Come dimostrato in precedenza, il Tau endogeno non influisce sui risultati ottenuti da questo protocollo. Infatti, lo stesso esperimento eseguito in cellule non neuronali che non esprimono Tau endogeno, porta all'espressione alterata VGluT1. Abbiamo applicato questo protocollo per studiare l'espressione dei geni correlati alla malattia31. In ogni caso, potrebbe essere sfruttato anche per indagare su altre funzioni nucleari di Tau, come il coinvolgimento sui danni al DNA, l'interazione con i cofattori nucleari o con la cromatina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni di Normale Scuola Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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