Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Модуляция субклеточной локализации Тау как инструмент для исследования экспрессии генов, связанных с болезнями

Published: December 20, 2019 doi: 10.3791/59988
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

Summary

Тау является нейрональным белком, присутствующим как в цитоплазме, где он связывает микротрубочки, так и в ядре, где он оказывает нетрадиционные функции, включая модуляцию генов, связанных с болезнью Альцгеймера. Здесь мы описываем метод исследования функции ядерного Тау, исключая при этом любые помехи, исходящие от цитоплазмии Тау.

Abstract

Тау является микротрубочным связывающим белком, выраженным в нейронах, и его основная известная функция связана с поддержанием цитоскелетной стабильности. Тем не менее, последние данные показали, что Тау присутствует также в других субклеточных отсеках, включая ядро, где он вовлечен в защиту ДНК, в транскрипции RRNA, в мобильности ретротранспозонов и в структурной организации ядро. Недавно мы показали, что ядерный Тау участвует в экспрессии гена VGluT1, предлагая молекулярный механизм, который мог бы объяснить патологическое увеличение высвобождения глутамата на ранних стадиях болезни Альцгеймера. До недавнего времени участие ядерного Тау в модуляции экспрессии генов-мишеней было относительно неопределенным и неоднозначным из-за технических ограничений, которые препятствовали исключению вклада цитоплазмии Тау или эффекта других ниже по течению факторов, не связанных с ядерной Тау. Чтобы преодолеть эту неопределенность, мы разработали метод для изучения экспрессии генов-мишеней, специально модулируемых ядерным белком Тау. Мы использовали протокол, который соединяет использование сигналов локализации и субклеточной фракционирования, что позволяет исключить помехи из цитоплазмических молекул Тау. В частности, протокол прост и состоит из классических и надежных методов, которые в широком смысле применимы для изучения ядерной функции Тау в других типах клеток и клеточных условиях.

Introduction

Функции тау белка в ядре получили значительный интерес в последние годы, как было показано, тесно связаны с нуклеиновыми кислотами1,2,3,4,5,6. Действительно, недавнее исследование генома показало, что Тау связывает генные и межгенные последовательности ДНК in vivo7. Роль в нуклеолярной организации было предложено8,9,10,11. Кроме того, Тау было предложено принять участие в защите ДНК от окислительного и гипертермического стресса5,10,12,13, в то время как мутировавший Тау был связан с хромосомой нестабильности и анеуплоидии14,15,16.

До сих пор проблемы в изучении функций Тау в ядерном отсеке оставались практически нерешенными из-за трудностей в расчленении конкретного вклада ядерного Тау из вклада цитоплазмита Тау. Более того, функции, приписываемые молекулам Тау в ядерном отсеке, до сих пор лишь коррелируют, поскольку в них отсутствует недвусмысленная демонстрация прямого участия ядерных белков Тау. Действительно, участие Тау в мобильности ретротранспозонов или в транскрипции RRNA или в защите ДНК11,12,17,19,19 может быть также объяснено вкладциоплазмическим Тау или влияние других факторов вниз по течению, не связанных с ядерным Тау.

Здесь мы предоставляем метод, который может решить эту проблему, используя классическую процедуру для изоляции ядерного отсека в сочетании с использованием Tau конструкций 0N4R помечены ядерной локализации (NLS) или ядерных экспортных сигналов (NES). Такой подход устраняет сложные вопросы, связанные с возможными артефактами из-за распространения молекул Тау из цитоплазмического отсека. Кроме того, конструкции Тау-НЛС и Тау-НЕС вызывают обогащение или исключение молекул Тау из ядерного отсека, соответственно, обеспечивая положительный и отрицательный контроль за вовлечением ядерных молекул Тау в конкретную функцию. Протокол технически прост, и он состоит из классических и надежных методов, которые широко применимы для изучения ядерной функции Тау в других типах клеток, дифференцированных или нет, таких как раковые клетки, которые активируют Тау выражение20,21. Кроме того, он может быть применен и к другим белкам, которые присутствуют как в цитоплазме, так и в ядре для того, чтобы вскрыть биологические функции, связанные с различными отсеками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток

  1. Культурные клетки SH-SY5Y (линия клеток нейробластомы человека, CRL-2266) в полной среде (модифицированная среда Eagle Dulbecco:питательная смесь F12 «DMEM/F-12» дополнена 10% сывороткой крупного рогатого скота плода ,FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 U/mL пенициллина и 100 мл streptomycin). Поддержание клеток в инкубаторе при состоянии 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Выращивайте клетки в 10 см пластин и расщепляйте при слиянии.

2. Дифференциация клеток

  1. Чтобы дифференцировать клетки SH-SY5Y, на следующий день после покрытия, добавьте 10 мкм ретинойной кислоты (РА) для завершения среды в течение 5 дней.
  2. Шестой день заменяет среднюю дифференциацию: DMEM/F-12 дополнен 50 нг/мЛ BDNF, 2 мМ L-глютамин. Не добавляйте FBS или антибиотики.
  3. Выращивайте клетки в среде дифференциации в течение 3 дней.

3. Химерическая конструкции клонирования

  1. Создание Tau-NLS построить путем клонирования путем ограничения фермента пищеварения в кадре на 3 ' конец Тау последовательности 0N4R (383aa) 3xNLS (SV40NLS):5'-CCAAAAAAGaGAGAAAAГАЗА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3xNLS в 3'end Тау клонируется в pCMV-Tau плазмид для выражения млекопитающих, эксплуатирующих места ограничения XhoI и BamHI в многоклонный сайт (MCS).
  2. Создание Tau-NES построить путем клонирования путем ограничения фермента пищеварения в кадре на 3 ' конец Тау последовательности 0N4R (383aa) Nes последовательности: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAGAGTGGCTCTCGAGAGTGGCTCTCGAGAGTGGCTCTCGA-3'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РЭШ в 3'end Тау клонируется в pCMV-Tau плазмид для выражения млекопитающих эксплуатации EcoRI и BamHI места ограничения в MCS.
  3. Преобразуйте штамм DH5alpha E.coli с 100 нг ДНК со ступени 3.1 или 3.2 и клеток пластинна на пластинах LB-Agar с ампициллином 100 мг/мл. Пусть расти в одночасье при 37 градусах Цельсия.
  4. Выберите одну колонию и шип клетки в 5 мл LB с ампициллин. Пусть клетки растут при 37 градусов по Цельсию в возбуждении в одночасье.
  5. Извлеките плазмид с мини-препкой дна (Таблица материалов)и последовательность для проверки конструкций.
  6. Преобразование ШТАММа DH5alpha E. coli с последовательностью проверенных конструкций и пластинна клеток на пластинах LB-Agar с ампициллин. Пусть расти в одночасье при 37 градусах Цельсия.
  7. Выберите одну колонию и шип клетки в 5 мл LB с ампициллин. Пусть клетки растут при 37 градусах Цельсия в возбуждении в течение 2 ч.
  8. Положите клетки со ступени 3,7 в 200 мл LB с ампициллин. Пусть расти в одночасье при 37 градусах Цельсия.
  9. Пеллетите клетки при 3500 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  10. Экстракт плазмиды с ДНК maxiprep (Таблица материалов).

4. Трансфекция клеток

  1. Семена 400000 клеток от шага 1.1 в 6-колодцпластины или 20000 клеток в 8-коловидной камерной горки. Плита четыре образца: контрольные клетки, которые будут трансфицироваться с пустым вектором, клетки, которые будут трансфицироваться с немаркированных Тау, клетки, которые будут трансфицироваться с Тау-NLS и клетки, которые будут трансфицироваться с Тау-NES.
  2. На следующий день после посева transfect 400 нг ДНК для каждого колодца с использованием катионных липидов (Таблица материалов) в 6-ну хорошо пластин или 200 нг ДНК для каждого колодца для 8-колодец камеры слайды, в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Инкубировать ДНК и катионные липиды отдельно в 250 Л (для 6-ну колодцев) или 25 Л (для 8-колодцев камерных слайдов) пониженной среды сыворотки в течение 5 мин на РТ. Затем объединить их для создания ДНК-липидного комплекса и инкубировать в течение 20 минут.
    2. Замените культурную среду 2 мл (для 6-ну колодцев) или 250 л (для 8-колодцев камерных слайдов) свежей полноценной культуры среды. Добавьте в клетки комплекс ДНК-липидов и инкубируйте при 37 градусах Цельсия за одну ночь.
  3. Кроме того, трансфект ДНК с катионным реагентом полиэтиленина (PEI).
    1. Смешайте 2 мкг ДНК и 6 л PEI с 200 злителю полной культуры среды (для каждой скважины в 6-ну хорошо пластин), или 1 мкг ДНК и 3 мкг PEI с 100 зл и полной среде культуры (для каждого колодца в 8-колодцевых камерных слайдах) , вихрь и инкубировать в течение 10 минут на RT.
    2. Добавьте смесь к клеткам и добавьте 1,8 мл полной культуры среды на скважину в 6-ну скважинных пластинах или 150 л полной культуры среды на хорошо в 8-колодские камеры слайды для достижения покрытия объема.
  4. Измените среду на следующий день после трансфекции и добавьте медиадифференциации, описанные в шаге 2.2.

5. Иммунофлуоресценция

  1. Удалите культуры среднего и промыть клетки с 1x PBS. Исправить клетки со 100% холодным метанолом в течение 3 мин без тряски. Удалите решение крепления и кратко промыть 1x PBS.
  2. Пермяки с 0,1% неионического сурфактанта в 1x PBS в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Кратко, мыть с 1x PBS, 3 раза.
  3. Инкубировать клетки с блокирующим буфером (0,1% Tween 20 и 1% BSA в PBS) в течение 30 минут на RT на орбитальном шейкере.
  4. Инкубировать с соответствующими первичными антителами (например, мышь моноклонального анти-Tau13 антитела) разбавленной 1:500 в блокировании буфера ночь на 4 кв С на орбитальной шейкер. Удалите раствор антитела и промыть, кратко, с 1x PBS.
  5. Инкубировать вторичными антителами, спряженных с фторфором (например, антителами против мышей, спряженных с Alexa Fluor 633), разбавленным 1:500 в блокирующем буфере на 1 ч на RT. Удалите раствор антитела и кратко помойте 1x PBS 3 раза.
  6. Чтобы испачкать ядра, инкубировать с DAPI разбавленной 1:20,000 в блокирующем буфере в течение 10 минут на RT. Wash с 1x PBS 3 раза. Гора покрываетна на слайде с помощью антифадейсмонтажной среды.

6. Западная подись

  1. Чтобы собрать клеточные гранулы со ступени 4.4, удалите среду и вымойте клетки с помощью PBS. Инкубировать с 500 злитрового 0,1% трипсина в течение 4 мин при 37 градусах Цельсия. Добавьте равный объем полных средних и повторной работы ячеек.
  2. Собирайте клетки в трубке и центрифуге при 500 х г в течение 5 мин. В конце центрифугации тщательно удалите супернатант. Добавьте 1 мл PBS, центрифугу при 500 х г в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант. Храните пеллеты для клеток на льду для немедленного использования или замораживание при -80 градусах по Цельсию для длительного хранения.
  3. Для общего экстракта белка, инкубировать клеточные гранулы в течение 30 минут на льду в буфере лизиса (20 мм Tris-HCl pH 8, 20 мМ NaCl, 10% глицерола, 1% octylphenoxy поли (этиленокси) этанол, разветвленный(Таблица материалов),10 мМ EDTA добавки с протфф. В зависимости от обилия гранул, используйте от 50 до 100 л буфера из лиза.
    1. Centrifuge экстракт на 16000 х г в течение 15 мин. Соберите супернатант и количественно концентрации белка по любому стандартному анализу количественной оценки. Подготовьте образцы белка для SDS-PAGE, смешивая 20 мкг белков с 5 qL 4x laemmli буфера в общей сумме 20 qL и кипятить при 100 кс в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может храниться при -20 градусах Цельсия.
  4. Для субклеточных фракционирования, resuspend клетки от шага 6.2 в полной среде, и собрать 1 х 106 клеток на каждый образец. Центрифуга при 500 х г в течение 10 минут для получения клеточных гранул для следующих шагов.
    1. Чтобы изолировать субклеточные отсеки, фракционные в соответствии с комплектом спецификаций. Чтобы изолировать каждую фракцию, инкубировать клеточные гранулы со ступени 6.4 с соответствующим буфером, центрифугой, соберите супернатант и добавьте следующий буфер к грануле, как описано в 6.4.1.1-6.4.5. Добавьте в порядок цитоплазмический буфер экстракции, буфер извлечения мембраны, буфер ядерной добычи, буфер ядерной добычи, дополненный 5 мМ CaCl2 и 3 U/L микрококковой нуклеайзой и буфером цитоскелетной добычи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы должны быть дополнены ингибиторами протеазы. Масштабируйте объемы буфера в зависимости от объема клеточной гранулы.
      1. Чтобы изолировать цитозолическую фракцию, инкубировать клеточные гранулы в 100 л ледяного цитоплазмического эксплуатанта, дополненного ингибиторами протеазы при 4 градусах Цельсия с нежным смешиванием в течение 10 мин. Центрифуга при 500 х г при 4 кв с в течение 5 мин и перенесите супернатант на предварительно охлажденные трубки.
      2. Добавьте 100 qL ледяного мембранного буфера экстракции, дополненного ингибиторами протеазы, к грануле со ступени 6.4.1.1 и инкубировать при 4 градусах Цельсия с нежным смешиванием в течение 10 мин. Центрифуга при 3000 х г при 4 кв. м. в течение 5 мин и соберите супернатан.
      3. Для растворимых ядерных фракций добавьте 50 qL ядерного буфера добычи, дополненного ингибиторами протеазы, к грануле со ступени 6.4.1.2 и вихрем. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин, центрифуги при 5000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин, и собирать супернатант.
      4. Для нерастворимых ядерных фракций добавьте 50 qL буфера ядерной добычи, дополненного ингибиторами протеазы, CaCl2 и микрококковой нуклеаза к грануле от шага 6.4.1.3, и вихря. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин, а затем вихрь снова. Центрифуга на 16000 х г на RT в течение 5 минут и собирать супернатант.
      5. Для цитоскелетной фракции добавьте 50 qL цитоскелетного буфера экстракции, дополненного ингибиторами протеазы, к гранулям от шага 6.4.1.4 и вихря. Инкубировать 10 мин на RT. Центрифуга трубки на 16000 х г в течение 5 минут, собирать супернатант и отказаться от гранул.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Масштабируйте объемы буфера в соответствии с объемом ячейки, как указано в протоколе набора. Для получения более подробной информации об инкубации и центрифугации и температуре22,23,24,25,26,27,28,29. Кроме того, используйте любые стандартные методы30, которые, используя моющие средства и увеличивая ионную прочность и скорость центрифугирования, отделяют цитосолико, мембранно-связанные, цитоскелеты и ядерные фракции. Разделите растворимую ядерную фракцию и нерастворимую ядерную фракцию, используя стандартные буферы ядерной добычи. Образец может храниться при -20 градусах Цельсия.
    2. Для SDS-PAGE добавьте 7 qL 4x буфера Laemmli к 20 qL субклеточных фракций, полученных из шагов 6.4.1.1-6.4.1.5, кипятить при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  5. Загружайте образцы на акриламидный гель и выполняйте электрофорез при постоянном напряжении 120 В. Перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы при 250 мА за 90 мин.
  6. Проверьте надлежащий электрофорез протеинового геля и успешное промсвязьбуние путем инкубации мембраны в течение 5 минут в растворе окрашивающего понсо. Промыть мембрану в дистиллированной воде до тех пор, пока фон не будет чистым. Удалите пятно путем продолжения мытья с Tris буферных соления с Tween 20 (TBST) в течение 10 минут на шейкер.
  7. Инкубировать мембрану с блокирующим раствором (5% молока в TBST) на 1 ч при РТ на шейкере. Вымойте 3 раза с TBST в течение 5 мин.
  8. Гибридизировать мембрану с первичным антителом в блокирующем растворе (1% молока в TBST) на ночь при 4 градусах Цельсия. Вымойте 3 раза с TBST в течение 5 мин.
  9. Гибридизуйте мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом в блокирующем растворе для 1 ч на RT. Вымойте 3 раза с TBST в течение 5 мин.
  10. Обнаружение белковой полосы с использованием хемилюминесценции. Количественная интенсивность западных полос Blot ImageJ. Нормализуйте экспрессию белка на продукт домашнего гена: гистон H2B для ядерно-растворимых и нерастворимых фракций, GAPDH для цитоплазмической фракции и для общего экстракта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стратегия, используемая для вскрытия воздействия ядерного Тау в экспрессии генов, избегая вклада цитоплазмических белков Тау, была изображена на рисунке 1. Кратко, белки Tau маркированные с NLS или NES аккумулируются в или исключены от ядерного отсека, соответственно. Функциональным эффектом этого дисбаланса является изменение экспрессии гена, измеренное как продукт гена VGluT1.

После описания протокола, SH-SY5Y клетки лечились с РА в течение 5 дней, а затем с BDNF в течение 3 дней для того, чтобы получить пост-митотические нейрон-подобные клетки (Рисунок 2). В отсутствие РА и BDNF, недифференцированные клетки SH-SY5Y предполагают более круглую морфологию и образуют клеточные сгустки. Как и ожидалось, начиная с протокола дифференциации, скопления раскручиваются, а клетки рассеиваются невритами; в конце дифференциации клетки равномерно распределены и взаимосвязаны через сеть разветвленных невритов.

На следующий день после посева клетки были заражены плазмидами Тау-НЛС или Тау-НЕС (раздел 4.2) с катионными липидами. Для клеток, выражающих конструкции Tau-NLS или Tau-NES, субклеточная локализация Тау может быть обнаружена с помощью иммунофлуоресценции с антитау-антителами. В зависимости от эффективности трансфекции, клетки отображают сильное ядерное окрашивание слияния с сигналом DAPI или цитоплазматическое окрашивание с пустыми ядрами, если они успешно трансфицируются Тау-NLS или Tau-NES, соответственно (Рисунок 3). Отсутствие этих специфических сигналов указывает на неэффективную трансфекцию.

Для анализа белков, обогащенных в различных субклеточных отсеках, клетки были собраны и подсчитаны для того, чтобы обрабатывать равное количество клеток на образец. Любой стандартный метод фракционирования, который использует увеличение моющего средства и ионных сил и увеличение скорости центрифугирования могут быть использованы для отделения клеточных отсеков друг от друга и, таким образом, изолировать цитозолические, мембраны связаны, цитоскелет и ядерные фракции.

После того, как ядра были изолированы, ядерная растворимые фракции и хроматин связанная фракция были разделены путем добавления 3 U / Зл микрококковой нуклеазы и 5 мМ CaCl2.

Для анализа западной подевой промышни, равные объемы цитоплазмических и мембранных фракций и половина объемов других фракций были загружены на градиент precast акриламид гель, чтобы исправить для различного количества буфера добавил на каждом шагу.

Для проверки эффективного разделения различных фракций была выполнена западная поместье, использующие следующие антитела: анти-ГАДПХ (присутствует во всех фракциях, кроме цитоскелета и особенно обогащенной цитоплазматической фракцией); антиактин (особенно обогащенный цитоскелетной фракцией); антитубулин (особенно обогащенный цитоплазмическими и цитоскелетными фракциями); анти-H2B (обогащенные ядерными фракциями)(рисунок 4).

Обогащение этих маркеров в различных субклеточных фракциях указывает на то, что фракция не выполняется хорошо. Следует отметить, что любой протокол для субклеточной фракции может представлять 10-15% загрязнения между фракциями.

После проверки успешной фракционации образца, западная подательная была выполнена для проверки сигнала Тау в ядерном отсеке и сигнала VGluT1 в общем экстракте(рисунок 5). В то время как непомеченный Тау обнаруживается во всех фракциях, Тау-НЛС сильно обогащается в ядерном отсеке и плохо обнаруживается в цитоплазмической фракции. Напротив, Тау-НЕС обогащается цитоплазмической фракцией и менее обнаруживается в ядерной фракции. Присутствие небольшого количества Тау-НЕС в растворимых ядерных фракциях следует ожидать, поскольку, как и эндогенный Тау, оно трансируется в ядро и, попав в ядерный отсек, ядерный экспортный сигнал позволяет его перебазировать в цитоплазму. Обнаружение различных обогащений для этих двух белков синтеза может указывать на проблему в эффективности трансфекции или в клонировании конструкций или в фракционировании.

Количественный анализ западной подьение может быть сделано с помощью ImageJ. Значения нормализованы для гена домашнего хозяйства, специфичного для каждой фракции (GAPDH для цитоплазмической фракции; гистон H2B для растворимых ядерных и хроматин-связанных фракций).

На рисунке на рисунке 5B сообщается о соотношении Тау в растворимых ядерных фракциях и цитоплазмической фракции, чтобы подчеркнуть, что Тау-НЛС сильно обогащается в растворимых ядерных фракциях (SNF), в то время как Тау-НЕС уменьшается. Кроме того, Тау-НЛС обогащается в фракции, связанной с хроматином (CBF) по отношению к цитоплазматической фракции (CF), в то время как Тау-NES уменьшается. SNF/CF No 1 и CBF/CF - 1 соответствуют соотношению Тау в контрольных ячейках. Эндогенный Тау слабо обнаруживается во всех фракциях, как и ожидалось. На рисунке на рисунке 5C сообщается о количественной оценке выражения VGluT1 в общем количестве образцов, выражающих различное количество ядерного Тау. В ячейках, выражающих Тау-НЕС, экспрессия VGluT1 сравнима с базовым выражением в контрольных ячейках. Напротив, в ячейках, выражающих немаркированные Тау или Тау-NLS, выражение VGluT1 более чем в два раза.

Figure 1
Рисунок 1: Графическое представление стратегии, используемой для обеспечения ядерного или цитоплазмического накопления Тау. Тау-НЛС скапливается в ядерном отсеке, а Тау-Нес исключен. Экспериментальное считывание является модуляцией выражения VGluT1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель недифференцированной и дифференцированной клеточной культуры. Изображение недифференцированных SH-SY5Y (слева), клеток, дифференцированных РА (средний) и дифференцированных РА и BDNF (справа). Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативное изображение субклеточного обогащения Тау с помощью иммунофлуоресценции. Изображение клеток, нетрансинфицированных или выражающих немаркированные конструкции Тау, Тау-НЕС или Тау-NLS. Тау сигнал был получен иммунофлуоресценции (красный), ядра сигнал был получен DAPI окрашивания (синий), объединены изображения сообщаются. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативное обнаружение белков, обогащенных субклеточными фракциями западным пятном. Западная поместье субклеточных фракций из клеток SH-SY5Y. CF - цитоплазмическая фракция; MF - мембранная фракция; SNF - растворимые ядерные фракции; CBF и фракция связанной хроматина; CKF - цитоскелетная фракция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативное обнаружение ядерных белков Тау и VGluT1. (A) Западная поместье белка Тау обнаружено в ядерных и цитоплазматических фракциях. (B) График сообщает соотношение Тау в ядерных фракциях и цитоплазматических фракциях. Значения были нормализованы на эндогенном Тау. SNF/CF No 1 и CBF/CF No 1 соответствует эндогенного соотношению Тау в контрольных клетках. (C) Западная поместье белка VGluT1. (D) График сообщает о количественной оценке выражения VGluT1 в общем количестве образцов, выражающих различное количество ядерного Тау. Тест Крускал-Валлис АНОВА и Манн-Уитни; р/л; 0,001, п.л.; 0,0001, n.s. p Все результаты показаны как средние - SEM по крайней мере из трех независимых экспериментов. Эта репрезентативная цифра была изменена с Siano et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описываем метод измерения влияния ядерного белка Тау на экспрессию генов. С этим протоколом вклад цитоплазмикТа Тау сильно ограничен. Критические шаги этого протокола следующие: дифференциация клеток SH-SY5Y человека, субклеточная фракционирование и локализация белка Тау в ядерном отсеке.

Во-первых, как показано в разделе репрезентативных результатов, дифференциация SH-SY5Y клеток путем добавления РА и BDNF имеет решающее значение для получения хорошей подготовки нейронных клеток в культуре. Плотность посеянных клеток особенно важна, так как более низкая плотность может повлиять на пролиферацию клеток. Кроме того, для экспериментов, которые нуждаются в большом количестве клеток, таких как клеточная фракционная и западная подавливая, важно отметить, что шаг дифференциации BDNF блокирует клеточную пролиферацию, чтобы позволить терминальной дифференциации, тем самым ограничивая количество клеток в культуре. Альтернативные протоколы дифференциации используют только РА или NGF вместо BDNF. Однако, при добавлении BDNF после РА позволяет достичь лучшей морфологической дифференциации32,33, NGF вызывает слабый неврит ный рост в SH-SY5Y клеток34. Кроме того, было широко продемонстрировано, что сочетание РА и BDNF позволяет получить однородную нейронную популяцию с выражением нейрональных маркеров и снижением пролиферации35. По этой причине используемый здесь протокол дифференциации сочетает в себе РА и BDNF.

Тем не менее, процедура сообщили вскрыть роль Тау в различных субклеточных отсеков могут быть использованы также для недифференцированных клеток или для различных типов клеток.

Субклеточная фракционация является очень важным шагом, и это имеет решающее значение для того, чтобы иметь достаточно исходного материала: коммерческий комплект требует только 1 х 106 клеток, в то время как другие процедуры, возможно, потребуется гораздо большее количество стартового. Кроме того, использование комплекта со стандартными буферами и шагами гарантирует воспроизводимость эксперимента, который неизбежен и необходим. Однако, поскольку состав буферов часто является собственностью, они могут содержать моющие средства, которые могут изменять функцию белка, представляющего интерес, и может быть трудно оптимизировать изоляцию фракций. Более того, даже в лучшем состоянии может быть 10-15% загрязнения между фракциями. Низкий урожай от каждой фракции можно было бы преодолеть за счет увеличения времени инкубации в буферах добычи конкретных фракций.

Поскольку функции ядерного Тау приобрели значительный интерес в последние годы, особенно важно обеспечить надежный метод для вскрытия функции Тау в различных сотовых отсеков. Соединение субклеточной фракционности, с выражением Tau конструкций специально направлены или исключены из ядра, позволяет тонко настроить количество Тау в различных отсеках.

Важным шагом в этой части протокола является клонирование Тау с сигналом ядерной локализации или с сигналом ядерного экспорта. Эффективность NLS гарантируется наличием последовательности консенсуса 3XNLS от вируса SV40. Ядерная транслокация белка может быть легко проверена иммунофлуоресценцией, а отсутствие сигнала в ядро может быть вызвано неправильным клонированием или неэффективным трансфекцией. Напротив, ядерный экспорт гарантируется консенсусной последовательностью РЭШ. В этом случае иммунофлуоресценция позволяет проверять вывоз Тау из ядра. Однако слабый ядерный сигнал не следует исключать, так как белок Тау-НЕС попадает в ядро, а затем, из-за последовательности РЭШ, он экспортируется в цитозол.

До сих пор функция ядерного Тау изучалась только коррелятивными подходами, которые не гарантируют его непосредственного участия. В описанном здесь протоколе предусмотрен первый подход, позволяющий четко различать конкретную функцию Тау в ядерном отсеке. Как было показано ранее, эндогенный Тау не влияет на результаты, полученные этим протоколом. Действительно, тот же эксперимент, проведенный в ненейрональных клетках, которые не выражают эндогенных Тау, приводит к VGluT1 измененное выражение. Мы применили этот протокол для изучения экспрессии генов, связанных с болезнями31. Во всяком случае, он может быть использован также для расследования других ядерных тау функций, таких, как участие на повреждение ДНК, взаимодействие с ядерными кофакторами или с хроматином.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10,000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1,000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Tags

Генетика Выпуск 154 ядерный Тау дифференцированный SH-SY5Y ядерные фракции сигналы локализации субклеточная фракционация западная поместье
Модуляция субклеточной локализации Тау как инструмент для исследования экспрессии генов, связанных с болезнями
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco,… More

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter