Summary
Makrofag Fagocytisk aktivitet mod cancerceller, specifikt 4t1 mus-karcinom celler i brystcancer, blev afbildet i dette studie. Den levende celle coculture model blev etableret og observeret ved hjælp af en kombination af fluorescerende og differentiel interferens kontrast mikroskopi. Denne vurdering blev afbildet ved hjælp af imaging software til at udvikle multipoint time-lapse video.
Abstract
Tumor-associerede makrofager (TAMs) er blevet identificeret som en vigtig komponent for tumorvækst, invasion, metastase, og resistens over for kræft behandlinger. Men, tumor-associerede makrofager kan være skadeligt for tumoren afhængigt af tumor mikromiljø og kan reversibelt ændre deres fænotypiske egenskaber ved enten antagonisere den cytotoksiske aktivitet af immunceller eller øge anti-tumorrespons. De molekylære handlinger af makrofager og deres interaktioner med tumorceller (f. eks, fagocytose) er ikke blevet grundigt undersøgt. Derfor er samspillet mellem immunceller (M1/M2-subtype TAM) og kræftceller i tumor mikromiljøet nu et fokus for kræft immunterapi forskning. I nærværende undersøgelse, en levende celle coculture model af induceret M1 makrofager og mus bryst 4t1 karcinom celler blev udviklet til at vurdere den fagocytiske aktivitet af makrofager ved hjælp af en time-lapse videofunktion ved hjælp af fase-kontrast, fluorescerende, og differential interferens kontrast (dic) mikroskopi. Den nuværende metode kan observere og dokumentere multipunkts Live-Cell Imaging af fagocytose. Fagocytose af 4T1 celler af M1 makrofager kan observeres ved hjælp af fluorescerende mikroskopi før farvning 4T1 celler med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). Den aktuelle publikation beskriver, hvordan man coculture makrofager og tumorceller i en enkelt billedbehandlings skål, polariserer M1 makrofager, og optage multipunkt hændelser af makrofager opslugende 4T1 celler under 13 h af coculture.
Introduction
Makrofager er den første linje i immunforsvaret og spiller en rolle i orkestratering immunrespons mod patogener og fremmede materialer, herunder kræftceller. De er en specialiseret fagocyt, der ødelægger og slipper af uønskede partikler i kroppen. Makrofager bidrager med defensive funktioner såsom clearance af apoptotiske celler og mikroorganismer og rekruttering af andre immunceller1. Makrofager kan differentiere i to forskellige typer, M1 og m2 makrofager, som reaktion på Miljøsignaler2. M1-polariserede makrofager (dvs. klassisk aktiverede makrofager) aktiveres af cytokin interferon-γ (IFN-γ) og lipopolysaccharider (LPS) og er involveret i den inflammatoriske respons, patogen clearance, effektiv fagocytose og tumoricidal immunitet3,4. M2 makrofager er nært beslægtet med tumor-associerede makrofager (TAMs) og har anti-inflammatoriske og tumor forfremmelse egenskaber4.
Fagocytose, afledt af oldgræsk (phagein), hvilket betyder "at fortæde," (kytos), hvilket betyder "celle" og-Ose, hvilket betyder "proces"5. Fagocytose er en Receptor-medieret proces, hvor fagocytter (herunder makrofager, monocytter, og neutrofiler) dræbe og opsluge invaderer patogener, rydde op fremmede partikler, og klar apoptotiske celle snavs. Tumor-associerede makrofager (Tams) findes i stroma i forskellige tumorer, herunder brystkræft, og har Pro-tumor funktioner6,7, resulterer i resistens over for fagocytose. Den detaljerede mekanisme af tumor celle fagocytose af makrofager er endnu ikke forstået.
Denne undersøgelse præsenterer en to-trins metode: 1) 4t1 mus brystkarcinom celler og M1-polariserede makrofager er kulturperler, og 2) den fagocytiske aktivitet af makrofager vurderes ved hjælp af Live-Cell video mikroskopi. Cfse fluorescerende farvestof blev brugt til at plette 4t1 mus brystkarcinom celler. Pletten etiketter 4T1 celler til at skelne dem fra de kulturperler M1 makrofager i en enkeltbilled skål. RÅ 264,7 makrofager er polariseret med LPS og IFN-γ i en M1 fænotype. For at sikre en komplet polarisering blev der udført immun farvning med anti-iNOS antistof konjugeret til FITC. Efterfølgende blev en multipunkts serie af time-lapse-billeder erhvervet for at observere flere begivenheder, herunder fagocytose, inden for coculture.
En bedre forståelse af samspillet mellem tumorceller og makrofager kan føre til potentiel kræft immunterapi. Live-Cell Imaging tilbyder en detaljeret visning af cellulære dynamik i en real-time indstilling og er blevet brugt til at studere celle migration, fænotypiske screening, apoptose, og cytotoksicitet8,9 i neurovidenskab, udviklingsmæssige biologi, og Drug Discovery. Selv om den foreslåede tumor i denne undersøgelse er brystkræft, metoden kan også anvendes til flere målceller og særskilte Effector celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: afsnit 1 − 6 beskriver coculture-modellen for 4T1 Mouse-karcinom-cancerceller og rå 264,7-muse makrofager. Afsnit 7 beskriver tidsforskudt vurdering af M1-makrofager fagocyterede 4T1-celler.
1. dyrkning 4t1 mus brystkarcinom celler og rå 264,7 mus makrofager
- Der tø et hætteglas med kryogenisk konserveret 4T1 og rå 264,7 passage 6 celler ved blid agitation i et vandbad ved 37 °C eller den normale vækst temperatur for celle linjerne.
Bemærk: optøning skal ske hurtigt, ca. inden for 2 min. For at undgå kontaminering skal du fjerne hætteglasset fra vandbad og dekontaminere det ved at sprøjte med 70% ethanol. For at undgå genetisk afdrift, især for makrofager, brug en lav passage nummer (dvs., mindre end 20). - De optøede celler fortyndes i 10 mL komplet DMEM-medium i et 15 mL konisk rør og centrifugeres cellerne ved 600 x g i 5 minutter for at opnå en celle pellet.
Bemærk: komplet DMEM medium suppleret med 10% (v/v) føtal kvægserum (FBS), 200 U/mL penicillin/streptomycin, og 2 mM L-glutamin anvendes i hele protokollen. - Aspirér forsigtigt mediet, resuspension cellerne i 8 mL komplet medium og Overfør til en 25 cm2 vævskultur behandlet kolbe. Kultur både 4T1 og rå 264,7 celler i komplet DMEM medium ved 37 °C med 5% CO2.
Bemærk: Resuspender celle pillerne forsigtigt og tilsæt cellesuspensionen til dyrknings kolben dråbe for dråbe for at undgå at dræbe cellerne. - Efter 1 uges dyrkning for at tillade celle tilslutning skal kolben overvåges dagligt, og der tilsættes 8 mL komplet DMEM-medium.
2. immunofarvning af M1 polariserede rå 264,7 makrofager
- Da sammenløbet af rå 264,7-celler når 70 − 80%, kasseres kulturmediet, og 2x skylles forsigtigt med mindst 2 mL PBS.
Bemærk: før såning rå 264,7 celler, Sørg for ingen Celledifferentiering har fundet sted (dvs. dendrit-lignende fænotype og/eller øget Cellestørrelse). Hvis celle morfologi ændringer er synlige, kassere kulturen og tø en ny cellelinje fra den tidligere passage hætteglasset. - Forbered makrofager til opsamling ved forsigtigt at adskille de vedsiddende celler ved hjælp af en celle skraber og overføre dem til et 15 mL konisk rør.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer og Forbered en cellesuspension af 1 x 105 celler/fad ved hjælp af komplet DMEM medium.
- Frø 2 mL af makrofager suspension i to billedbehandlings retter. Cellerne 2 − 3 h ved 37 °C inkubates med 5% CO2 for at tillade celle tilslutning.
- Forbered M1-polariserings mediet ved at tilsætte 100 ng/mL LPS og 20 ng/mL IFN-γ til komplet DMEM medium10,11.
- Kassér kultur supernatanten fra makrofager, og vask forsigtigt monolayerne i parabol 2x med mindst 1 mL PBS.
- Tilsæt 2 mL M1-polariserings medier til en af billedbehandlings retterne, lad de rå 264,7-celler inducere M1-makrofag-Fænotypen, og Inkuber 2 – 3 timer ved 37 °C med 5% CO2.
Bemærk: frø rå 264,7 makrofager i en billedbehandlings skål med DMEM suppleret med 10% FBS som en kontrol for anti-iNOS antistof farvning. Mærk billedbehandlings retterne rå (kontrol) og M1 makrofager (LPS og IFN-γ polariseret), hhv. - Før immun farvning, fix de rå 264,7 og M1 makrofager celler ved hjælp af 2 mL af 4% PARAFORMALDEHYD og inkubere i 15 min ved 37 °C (stuetemperatur, RT).
- Supernatanten fjernes, og cellen enkeltlags vaskes med 1 ml PBS mindst 3x.
- Dæmpes med 2 mL 50 mM ammoniumchlorid i PBS og Inkuber i 15 minutter ved RT.
- Permeabilize med 2 mL 0,3% Triton X-100 i PBS i 15 minutter ved RT.
- Supernatanten fjernes, og cellen enkeltlags vaskes med 1 ml PBS mindst 3x.
- Blok med 2 mL 10% FB'ER i PBS i 30 minutter ved RT.
Bemærk: blokerings trinnet i immun farvning er at minimere den ikke-specifikke binding af antistof i cellen. - Supernatanten fjernes, og cellen enkeltlags vaskes med 1 ml PBS mindst 3x.
- Inkubér med 2 mL anti-iNOS-FITC i PBS og 1% FBS natten over ved 4 °C.
Bemærk: Mærk cellerne ved hjælp af den korrekte antistof fortynding i henhold til fabrikantens anbefalinger. Beskyt retterne mod lys ved at dække dem med aluminiumsfolie fra dette punkt på. - Supernatanten fjernes, og cellen enkeltlags vaskes med 1 ml PBS mindst 3x.
- Der inkubates 1 mL 300 nM 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i billedbehandlings retter i 10 min i 37 °C, i mørke ved at dække med aluminiumsfolie.
- Vask cellerne med 1 mL PBS mindst 3x, og tilsæt 1 mL komplet DMEM-medium til billedbehandlings retterne.
Bemærk: cellerne er nu klar til fluorescens Imaging. Mikroskop opsætningen skal have en inverteret fase og excitation filtre for de valgte pletter (i dette tilfælde, FITC og DAPI). - Tænd mikroskopet, og Indlæs billedbehandlings softwaren. Monter billedbehandlings skålen på mikroskopet, og Juster fokus til at observere rå 264,7 og M1 makrofager. Optimer udseendet af FITC-og DAPI-billeder med fasekontrast ved at justere de overførte lys-og eksponeringstider.
Bemærk: Begynd billeddannelse, når alle punkter er i fokus, og kanalerne er optimeret. - Optag fasekontrast-FITC-og DAPI-billeder (figur 1).
3. såning 4t1 mus brystkarcinom celler
- Da sammenløbet af 4T1-celler når 70 − 80%, kasseres kulturmediet, og 2x skylles forsigtigt med mindst 2 mL PBS. 1 ml forvarmede trypsin tilsættes for at adskille cellerne og inkubere i op til 20 minutter ved 37 °c.
Bemærk: Overhold cellerne under et mikroskop. Løsrevet celler vil blive afrundet. - Når cellerne løsnes, skal de overføres til et 15 mL konisk rør, og der tilsættes 2 mL forvarmet komplet DMEM-medium for at inaktivere trypsin. Sprede forsigtigt mediet ved at pipettere cellelag overfladen for at genoprette cellerne. Derefter centrifugeres ved 600 x g i 5 min for at opnå en celle pellet.
- Supernatanten fjernes, og pelleten opslæmmes i 10 mL forvarmet komplet DMEM-medium.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer og frø 1 x 105 4t1 celler i 2 ml komplet DMEM medium i hver af 2 35 mm glas-bund Imaging retter behandlet med vævskultur. Cellerne inkubates natten over ved 37 °C med 5% CO2.
Bemærk: kultur 4T1-celler i en af billedbehandlings retterne med M1-polariserings medier og etiket 4t1-inducer (kontrol). Dette er for at sikre normal vækst af 4T1 celler, når de udsættes for induktorer.
4. mærkning levende 4t1 mus brystkarcinom celler ved hjælp af cfse farvning
- Først fjerne de eksisterende medier fra 4T1 celler Imaging retter. Celle enkeltlags vaskes mindst 2x med 1 ml PBS.
- Klargør 5 μM CFSE-farvningsopløsning ved at fortynde CFSE i 1 mL PBS. Tilsæt 1 mL 5 μM CFSE farvningsopløsning i hver billed skål, og Inkuber cellerne i 20 minutter ved RT eller 37 °C i mørke.
Bemærk: Mærk cellerne ved hjælp af den relevante CFSE-arbejds koncentration i henhold til fabrikantens anbefalinger og indledende eksperimenter for at opnå den optimale CFSE-farvnings koncentration. Mærkning effektivitet vil være højere, hvis CFSE fortyndes i PBS. - Slukkede farvning ved at tilføje et tilsvarende volumen af komplet DMEM medium indeholdende 10% FBS og farvningsopløsning til cellerne og inkubere i 5 min ved RT i mørket.
- Kassér den CFSE-holdige opløsning og vask cellerne 1x med samme mængde kultur medier.
Bemærk: 4T1-celler er nu fluorescently mærket. - Returner 4T1-CFSE-cellerne til standard dyrkningsbetingelser ved RT med 5% CO2.
5. såning rå 264,7 mus makrofager og coculture med 4T1
- Som konfluency af rå 264,7 nå 70 − 80%, kassere kultur medierne og forsigtigt skylle 2x med mindst 2 mL PBS.
- Forbered makrofager til opsamling ved forsigtigt at adskille de vedsiddende celler ved hjælp af en celle skraber og overføre dem til et 15 mL konisk rør.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer og Forbered en cellesuspension på 1 x 105 celler/ml ved at fortynde den resterende opløsning med et komplet DMEM-medium i henhold til sånings tætheden.
Bemærk: overdrevent konflydende celler i kokult urer kan alvorligt reducere fagocytose. I denne undersøgelse, såning forholdet mellem makrofager: kræftceller blev justeret til en 1:1 ratio. Forholdet kan justeres afhængigt af aggressivitet af tumorceller og oprindelsen af makrofager. - Før coculturing, kassér kultur supernatanten fra 4T1-cellerne, der er seedet en dag før (trin 4,5), og vask forsigtigt monolayerne 2x med mindst 1 mL PBS.
- Frø 1 x 105 rå 264,7 celler per 2 ml komplet DMEM medium i en af 4T1 Imaging retter. Cellerne 2 − 3 h ved 37 °C inkubates med 5% CO2 for at tillade celle tilslutning. Mærk billedbehandlings skålen 4T1-M1- coculture.
Bemærk: 4T1 (kontrol) cellerne blev ikke cokuleret med makrofager.
6. M1-polarisering af rå 264,7-makrofager
- Forbered M1-polariserings mediet ved at tilsætte 100 ng/mL LPS og 20 ng/mL IFN-γ til komplet DMEM-medium suppleret med 10% (v/v) FBS10,11.
- Udsmid kultur supernatanten fra de makrofager, som er inkuberet før (trin 5,5), og vask forsigtigt monolayerne i parabol 2x med mindst 1 mL PBS.
- Tilsæt derefter 2 ml M1-polariserings medier til billed skålen, og lad de rå 264,7-celler inducere ind i M1 makrofag-fænotype ved at inkube ved 37 °c med 5% Co2.
Bemærk: M1 makrophage celler kan tage op 2 − 3 h inkubation for at opnå komplet polarisering. Indledende eksperimenter skal gøres for at sikre en passende inkubationsperiode for at muliggøre fuldstændig polarisering af makrofager.
7. live-Cell video mikroskopi af fagocytose
Bemærk: mange faktorer skal overvejes, når der udføres Live-Cell Imaging for at opnå en producerbar video, herunder optimering af billedeksponering, tidsmåling og automatisk fokus korrektion.
- Før eksperimentet indstilles celle kulturinkubator ved at tænde termostat ved 37 °C og forsyne 5% CO2.
Bemærk: mikroskop opsætningen kræver en inverteret fase, en Stage top inkubator, Fugtighedskontrol (95%), og gas inkubeation system. Dette setup er afgørende for at opretholde cellerne for langsigtede Live-Cell video mikroskopi vurdering. - Tænd mikroskopet, herunder piezo-scenen, og Indlæs mikroskop billedbehandlings softwaren.
- Placer de seedede coculture-celler i en 35 mm glasbunden billedbehandlings skål i midten af scenen, og skru forsigtigt det øverste kammer af. Brug joysticket til at bilisere scenen ved at vælge den position, der skal imældes.
- Hvis du vil se eksemplet, skal du vælge fasekontrast filteret på tårnet. Efter først at have set eksemplet, finde de relevante felter og bringe prøven i fokus.
Bemærk: imaging software tillader brug af fuldt automatiseret objektiv udvælgelse, perfekt fokus system, time-lapse-serien, multikanal billed erhvervelse, og multipoint billed erhvervelse. - Hvis du vil konfigurere multikanals fluorescens for CFSE-mærkning og erhvervelse af differentialinterferens, skal du åbne dialogboksen anskaffelse af billedsoftware og vælgeafkrydsningsfeltet [lambda] (figur 2).
Bemærk: for en 13 h time-lapse billeddannelse, en fase-kontrast kanal bør anvendes. - Vælg [lambda] -fanebladet | [Optisk konfiguration] , og vælg [10x dic] for differens interferens kontrast og [gfp-R] for afkrydsningsfeltet grønt fluorescens filter. Under [lambda] | [Fokus] kolonne, skal du vælgeafkrydsningsfeltet [10x dic] for at indstille som fokus reference.
- Åbn dialogboksen anskaffelse af billedsoftware, og klik på knappen [XYZ time...] , og vælg fanen [XY] .
- Flyt til billed anskaffelses punktet ved hjælp af joysticket på den motoriserede scene, mens du tjekker livebilledet eller vælger en anden position gennem okulerne. Klik derefter på afkrydsningsfeltet under kolonnen [punkt navn] for at indstille hvert punkt på hver placering til billedoptagelse (Se figur 3).
Bemærk: den automatiserede fase tillader multipoint billede erhvervelse af forskellige XY koordinater til at fange flere felter. - Finjuster fokus for hvert eksempel, som vises på skærmen. Brug kontrolelementerne til korrektion af auto fokus.
- Brug softwaren til at opsætte tidsforskudt billedoptagelse. I dialogboksen anskaffelse af billedsoftware skal du kontrollere fanen [Time] (Se figur 4).
- Bestem [interval] (forsinkelsen mellem begyndelsen af et tidspunkt til et andet tidspunkt) og [varighed] (den samlede varighed af forsøget). Tidsenheder varierer og kan vælges i millisekunder (MS), sekunder (s), minutter (m) eller timer (h) fra rullemenuen.
Bemærk: billedbehandlings periodens længde for tidsforskudt billeddannelse af fluorescens og DIC time-lapse multikanals erhvervelse kan variere afhængigt af det fluorescerende farvestof, der anvendes i denne analyse. Der kan forekomme foto blegning, hvis de mærkede celler eksponeres for længe. - Markér afkrydsningsfeltet [Gem i fil] for at gemme erhvervede billeder. Under fanen [tidsplan] skal du klikke på knappen [Kør nu] for at hente billeder i flere punkts-tidsserier (Se figur 5).
Bemærk: i billedbehandlings softwaren gemmes billeder i ND2-filformat. Hver time-lapse kan gemmes individuelt i et MP4-filformat senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Time-lapse to-dimensionelle (2D) billeder af coculture model 4t1 mus brystkarcinom cellelinjer viser 4t1 celler bliver opslugt af M1 makrofager i løbet af en 13 h periode. Det er vigtigt at sikre en komplet polarisering af M1-makrofager ved at udføre immun farvning. Resultaterne (figur 1) viser, at koncentrationen af 100 ng/ml lipopolysaccharider (LPS) og 20 ng/ml IFN-γ POLARISEREDE rå 264,7 makrofager i M1-tilstand. Mærkning de målrettede celler med et fluorescerende farvestof og forlader Effector celler uplettet giver mulighed for en levende celle coculture model (film 1). Gennem hele 13 h og 15 min interval, den fagocytiske aktivitet af M1 makrofager i coculture med 4T1 celler blev dokumenteret (film 2). De seks multipunkt videoer (A − F i Movie 2) blev indspillet for at vurdere flere begivenheder i en enkelt 35 mm glas-bund billed skål. Film 3 viser de 4t1 celler fagocyteret af M1 makrofager. Movie 4 blev valgt som et eksempel på en dybtgående video filmet fra dette eksperiment og film 5 viser optagelsen af 4t1 celler ved M1 makrofager.
Figur 1: immunofluorescens farvning med anti-iNOS-FITC i grøn, kerner markør dapi i blå, og forbedrede versioner af fusionerede billeder. Disse paneler repræsenterer rå 264,7 makrofager (kontrol) og M1 makrofager (LPS og IFN-γ stimuleret) immun plettet med anti-iNOS-FITC (M1 markør) i grøn og kontra farvet med kerner markør, DAPI i blåt. (A) dapi-pletter kan OBSERVERES både rå 264,7 og M1 makrofager. (B) anti-INOS-FITC (grøn) kun fluorescerer på M1-makrofager. (C) fusionerede billeder af dapi Stain og anti-INOS-FITC. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opsætning af fluorescens og DIC image erhvervelse i Imaging software erhvervelse dialog kontrol. [1] Vælg afkrydsningsfeltet [lambda] , [2] Vælg [ optisk konfiguration] , og vælg [ 10X dic] og [gfp-R] for det grønne fluorescens filter, [3] Vælg [10x dic] | [Indstil denne kanal som fokus reference]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Opsætning af multipoint-billed erhvervelse i dialogboksen til erhvervelse af billedbehandlingssoftware. [4] Vælg fanen [XY] og næste [5] Marker afkrydsningsfeltet under kolonnen [punkt navn] for at indstille hvert punkt for billed indfangningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Opsætning af intervaller og varighed for billedoptagelse af tidsforskudt måling. Dialogboksen til erhvervelse af billedbehandlingssoftware til opsætning af tidsforskudt billedoptagelse. Hvis du vil konfigurere tidsforskudt billed anskaffelse [6] , skal du kontrollere [ 7] på fanen [Time] ( interval] (efter sekund, min eller time) og [8] [varighed] (efter sekund, min eller time). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Opsætning af multipoint-film paneler til billedoptagelse af tidsforskudt måling. Preview af seks multipoint film paneler kombineret efter afslutningen af 13 h af coculture. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: en repræsentativ film af unstained M1 makrofager og 4t1 cfse-farvede mus brystkarcinom celler i coculture fanget ved hjælp af multikanal erhvervelse af fluorescerende og DIC mikroskopi. Resultater fremvisning CFSE i den grøn-mærket cellevæg af 4T1 mus brystkræft karcinom celler cocultureret med unstained M1 makrofager. Tidsforskudt billeder blev erhvervet for en 13 h coculture periode med 15 min tidsintervaller ved hjælp af multikanal erhvervelse (trin 7,3, se figur 2). (A) differential interferens kontrast, (rød cirkel) viser små, runde M1 makrofager overholde 4T1 celler, som har en epitelial morfologi. B) et Fluorescens-mikroskopi-billede af 4T1-celler, der er plettet med cfse før fagocytose ved makrofager. C) fusionerede diske og Fluorescens mikroskopi billeder af cfse-farvede 4T1-celler, der er opslugt af ufarvede M1-makrofager. De blå pile viser unstained M1 makrofager fluorescerende grøn som de opsluge CFSE-mærket 4T1 celler. Scale bar = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Film 2: Live-Cell video mikroskopi film fra flere trin punkter i en enkelt billedbehandlings skål viser fagocytose af 4t1 mus brystkarcinom celler ved induceret M1 makrofager. Resultaterne repræsenterer seks forskellige punkter (Movie 2a − F), der er konfigureret og koordineret ved hjælp af billedbehandlingssoftware (trin 7,4, se figur 3−figur 5). M1 makrofager har en uregelmæssig, pandekage-lignende morfologi med en porøs cytoplasma, mens 4T1 mus brystkræft karcinomer har en epitelial morfologi. M1-makrofager og 4T1-celler blev cokuleret i 13 timer inde i fase inkubator ved 37 °C med 5% CO2 , før de blev observeret for Mikroskopi af levende celle video. Billeder blev taget med 15 minutters tidsintervaller for 13 h. Scale bar = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Film 3: Live-Cell video mikroskopi film af et enkelt koordinat punkt (Se film 2) valgt til at vise fagocytose af 4t1 mus brystkræft carcinomer ved induceret M1 makrofager i detaljer. Den røde pil viser fagocytose. Den gule cirkel viser, at antallet af 4T1 celler, der slukkede opløbet af 4T1 celler. Scale bar = 10 μm. Klik her for at downloade denne video.
Movie 4: en detaljeret video til yderligere at visualisere fagocytose processen af 4T1 celler ved M1 makrofager. Dette panel viser levende M1 makrofag celler med en porøs cytoplasma fænotype. Scale bar = 10 μm. Klik her for at downloade denne video.
Film 5: makrofager, som bevæger sig mod 4t1-celler for at etablere celle-til-celle-kontakt, efterfulgt af optagelsen af 4t1-celler med M1-makrofager (Se film 2a). Den fase-kontrast mikroskopi time-lapse video blev afbildet i 15 min tid intervaller for 13 h af coculture inde i en Stage top inkubator ved 37 °c med 5% Co2. Scale bar = 10 μm. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol kræver to trin: 1) coculture af 4t1 mus brystkarcinom celler og M1-polariserede makrofager, og 2) vurdering af makrofag Fagocytisk aktivitet ved hjælp af tidsforskudt mikroskopi. Levende celle coculture er meget udbredt i fagocytose og migration assays. Den levende celle coculture model her er en enkel, fleksibel in vitro-procedure (figur 2), der udnytter en fluorescerende farvestof, cfse, som bruges til at mærke 4T1 målrettede celler. Dette bruges til korrekt sporing af celle typerne under Live-Cell Imaging. Time-lapse Live-Cell Imaging blev brugt til at vurdere Fagocytisk aktivitet af M1 makrofager ved hjælp af multipoint time-lapse 2D Imaging før 13 h af coculture.
Den levende celle coculture model blev etableret ved hjælp af 4t1 mus brystkarcinom celler og M1 mus makrofager. For at skelne cellerne fra hinanden, blev 4T1-celler plettet ved hjælp af en CFSE fluorescerende farvestof (se punkt 4). CFSE gør det muligt at spore cellerne og overvåge celledelingen. CFSE kan passivt diffus i celler, hvilket gør CFSE farvning en passende celle tracker til at visualisere fagocytose af målrettede celler. Som fagocytiske makrofager fordøje og opsluge kræftceller, de tager op cfse farvestof og i sidste ende blive fluorescerende12,13. Det er vigtigt at frø 4T1 celler i billedbehandlings skålen før M1 makrofager. Dette skyldes de forskellige størrelser og former af begge celler. 4T1-cellerne har en epitelial morfologi, der prolifererer i små klynger. Også 4T1 celler skal farves med CFSE før coculture med de ufarvede M1 makrofager. Før makrofag polarisering ved hjælp af LPS og IFN-γ, de murine makrofager rå 264,7 er runde, små, og normalt vokse som enkeltceller. Efter LPS og IFN-γ polarisering, induceret M1 makrofager har en relativt fladede, pandekage-lignende form, med en porøs cytoplasma14,15. For at sikre korrekt polarisering af rå 264,7 mod M1 tilstand, 100 ng/mL LPS og 20 ng/mL IFN-γ stimuleret makrofager var immun farvede med en M1 markør, anti-iNOS antistof konjugeret til FITC (figur 1). Denne protokol udføres før coculturing makrofager og målrettede celler for at sikre, at makrofager er helt polariseret i M1 tilstand.
Denne undersøgelse beskriver en metode til fluorescerende mikroskopi for at visualisere den fagocytiske aktivitet af levende makrofager. For at minimere foto blegning og for at give bedre fluorescens Imaging, kan fluorescerende mikroskopi kombineres med andre billeddiagnostiske teknikker, der er ikke-destruktiv til fluorchromen, svarende til DIC. I denne protokol beskrives de materialer og metoder, som er nødvendige for at vurdere fagocytose af mus-karcinom-cancerceller af LPS og IFN-γ, stimuleret makrofager ved hjælp af fluorescerende og DIC time-lapse mikroskopi. Ikke desto mindre, fluorescerende mikroskopi undersøgelser har begrænsninger, når de studerer levende-celle Imaging sammenlignet med fase-kontrast tidsforskudt Imaging. Under fluorescerende Live-Cell Imaging, langvarig udsættelse for en høj mængde excitation lys kan forårsage alvorlige celleskader16. Foto blegning kan forårsage betydelige problemer med levende celle billeder. Den højintensitetsbelysning, der anvendes i live-Cell Imaging kan reducere CFSE Dye evne til at fluoresce. Ikke desto mindre, en 13 h phagocytose vurdering blev opnået i den anden del af denne undersøgelse ved hjælp af fase-kontrast time-lapse 2D Imaging (film 2 – 5).
Time-lapse mikroskopi tilbyder fordele såsom generering af data fra et enkelt eksperiment på ethvert tidspunkt i hele den ønskede varighed periode og betydeligt, flere trin punkter i en enkelt Imaging skål kan fanges for et enkelt eksperiment. Dette giver mulighed for observation af forskellige positioner i et enkelt eksperiment. Protokollen kan også anvendes ved hjælp af flere brønde fra kultur pladerne (f. eks. 6, 24, 96 brønd plader). Blandt de mest kritiske tekniske udfordringer for at udføre vellykket Live-Cell Imaging eksperiment omfatter opretholdelse af cellerne i en sund tilstand ved hjælp af en Stage top inkubator til at give en stabil temperatur på 37 °C, 95% af fugtighed, og 5% CO2. Fordi eksperimentet tog 13 timer, at sikre, at mikroskopet fungerer normalt i hele var afgørende.
I løbet af denne undersøgelse, seks forskellige punkter i billedbehandlings skålen blev fanget i hele en 13 h varighed for 15 min intervaller pr punkt (film 2). Pointene kan justeres afhængigt af hændelsen af den celle, der undersøges. I betragtning af at der er flere etape point at blive fanget i hele dette eksperiment, er det vigtigt at sikre, at hvert punkt har et stabilt fokus, før du udfører Live-Cell videooptagelse. Tidsintervallet for undersøgelse skal optimeres. Et nedsat tidsinterval vil have mere detaljerede punkter, der kan imaged; filstørrelsen vil dog være meget stor. Stigende tidsinterval vil resultere i en lang video og vil gøre filmen mister kontinuitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansielt finansieret af Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Vi vil gerne takke Agro-bioteknologi Institute, Malaysia (ABI) laboratorier, og mikroskopi Imaging facilitet. Særlig tak til Mohd Daniel Hazim for at få hjælp til at redigere og indspille den eksperimentelle video til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
