Summary
L'activité phagocytique de Macrophage contre des cellules cancéreuses, spécifiquement les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1, a été imaged dans cette étude. Le modèle de coculture des cellules vivantes a été établi et observé à l'aide d'une combinaison de microscopie fluorescente et de contraste d'interférence différentielle. Cette évaluation a été imageà l'aide d'un logiciel d'imagerie pour développer une vidéo en accéléré multipoints.
Abstract
Les macrophages tumeur-associés (TAMs) ont été identifiés comme composant important pour la croissance de tumeur, l'invasion, la métastase, et la résistance aux thérapies de cancer. Cependant, les macrophages tumeur-associés peuvent être nocifs à la tumeur selon le microenvironnement de tumeur et peuvent réversiblement modifier leurs caractéristiques phénotypiques en antagonisant l'activité cytotoxique des cellules immunitaires ou en améliorant la réponse antitumorale. Les actions moléculaires des macrophages et leurs interactions avec les cellules tumorales (p. ex., la phagocytose) n'ont pas fait l'objet d'études approfondies. Par conséquent, l'interaction entre les cellules immunitaires (M1/M2-sous-type TAM) et les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral est maintenant au centre de la recherche sur l'immunothérapie contre le cancer. Dans la présente étude, un modèle de coculture de cellules vivantes des macrophages induits de M1 et des cellules de carcinome 4T1 mammaires de souris a été développé pour évaluer l'activité phagocytique des macrophages utilisant une fonction vidéo de time-lapse utilisant la microscopie de contraste de phase-contraste, fluorescent, et différentielde de contraste (DIC). La méthode actuelle peut observer et documenter l'imagerie multipoint de cellules vivantes de la phagocytose. La phagocytose des cellules 4T1 par les macrophages M1 peut être observée à l'aide de la microscopie fluorescente avant de tacher les cellules 4T1 avec l'ester de succinimidyl de carboxyfluorescein (CFSE). La publication actuelle décrit comment coculture macrophages et cellules tumorales dans un seul plat d'imagerie, polariser les macrophages M1, et enregistrer les événements multipoints de macrophages engloutissant les cellules 4T1 pendant 13 h de la coculture.
Introduction
Les macrophages sont la première ligne de défense immunitaire et jouent un rôle dans l'orchestration des réponses immunitaires contre les agents pathogènes et les matériaux étrangers, y compris les cellules cancéreuses. Ils sont un phagocyte spécialisé qui détruit et se débarrasse des particules indésirables dans le corps. Les macrophages fournissent des fonctions défensives telles que le dégagement des cellules apoptotiques et des micro-organismes et le recrutement d'autres cellules immunitaires1. Les macrophages peuvent se différencier en deux types différents, les macrophages M1 et M2, en réponse aux signaux environnementaux2. Les macrophages polarisés M1 (c.-à-d. les macrophages activés classiquement) sont activés par l'interféron cytokine -M- (IFN-) et les lipopolysaccharides (LPS) et sont impliqués dans la réponse inflammatoire, le dégagement d'agent pathogène, la phagocytose efficace, et l'immunité tumoricidale3,4. Les macrophages M2 sont étroitement liés aux macrophages tumeur-associés (TAMs) et ont des propriétés anti-inflammatoires et de promotion de tumeur4.
Phagocytosis, dérivé du grec ancien (phagein), signifiant « dévorer », (kytos), signifiant « cellule » et - osis, signifiant « processus »5. La phagocytose est un processus à médiation réceptrice où les phagocytes (y compris les macrophages, les monocytes et les neutrophiles) tuent et engloutissent les agents pathogènes envahissants, nettoient les particules étrangères et déblayent les débris de cellules apoptotiques. Les macrophages tumeur-associés (TAMs) sont trouvés dans le stroma dans différentes tumeurs, y compris le cancer du sein, et ont des fonctions pro-tumorales6,7, ayant pour résultat la résistance à la phagocytose. Le mécanisme détaillé de la phagocytose de cellules de tumeur par des macrophages n'est pas encore compris.
Cette étude présente une méthode en deux étapes : 1) les cellules mammaires du carcinome de souris 4T1 et les macrophages M1 polarisés sont cocultivés, et 2) l'activité phagocytique des macrophages est évaluée à l'aide de la microscopie vidéo à cellules vivantes. Le colorant fluorescent de CFSE a été employé pour tacher les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1. La tache étiquette les cellules 4T1 pour les distinguer des macrophages M1 cocultivés dans un seul plat d'imagerie. LES macrophages RAW 264,7 sont polarisés avec LPS et IFN-MD dans un phénotype M1. Pour assurer une polarisation complète, l'immunostaining avec l'anticorps anti-iNOS conjugué au FITC a été exécuté. Par la suite, une série multipoint d'images en time-lapse a été acquise pour observer de multiples événements, y compris la phagocytose, au sein de la coculture.
Une meilleure compréhension des interactions entre les cellules tumorales et les macrophages peut conduire à l'immunothérapie potentielle du cancer. L'imagerie cellulaire vivante offre une vue détaillée de la dynamique cellulaire en temps réel et a été utilisée pour étudier la migration cellulaire, le dépistage phénotypique, l'apoptose et la cytotoxicité8,9 en neurosciences, en biologie du développement et en découverte de médicaments. Bien que la tumeur proposée dans cette étude soit le cancer du sein, la méthode peut également être appliquée à plusieurs cellules cibles et cellules effectrices distinctes.
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Protocol
REMARQUE : Les sections 1 à 6 décrivent le modèle de coculture des cellules du carcinome mammaire de la souris 4T1 et des macrophages de souris RAW 264,7. La section 7 décrit l'évaluation en time-lapse des cellules 4T1 phagocytes de M1 de macrophages.
1. Cultiver 4T1 cellules de carcinome mammaire de souris et RAW 264.7 macrophages de souris
- Décongeler une fiole de 4T1 cryogéniquement préservée et RAW 264,7 passage 6 cellules par agitation douce dans un bain d'eau à 37 oC ou la température de croissance normale pour les lignées cellulaires.
REMARQUE : Le dégel doit être effectué rapidement, environ dans les 2 minutes. Pour éviter la contamination, retirez le flacon du bain d'eau et décontamons-le en pulvérisant à 70 % d'éthanol. Pour éviter la dérive génétique, en particulier pour les macrophages, utilisez un faible nombre de passages (c.-à-d. moins de 20). - Diluer les cellules décongelées en 10 ml de milieu DMEM complet dans un tube conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 600 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
REMARQUE : Le milieu complet de DMEM complété avec 10% (v/v) sérum bovin foetal (FBS), 200 U/mL pénicilline/streptomycine, et 2 mM L-glutamine est employé tout au long du protocole. - Aspirez soigneusement le milieu, resuspendles les cellules dans 8 ml de milieu complet et transférez dans un flacon traité de culture de tissu de 25 cm2. Culture à la fois 4T1 et RAW 264.7 cellules dans le milieu complet DMEM à 37 oC avec 5% CO2.
REMARQUE : Resuspendre doucement les granulés cellulaires et ajouter la suspension cellulaire dans le flacon de culture goutte à goutte pour éviter de tuer les cellules. - Après 1 semaine de culture pour permettre l'adhérence cellulaire, surveiller le flacon tous les jours et ajouter 8 ml de milieu Complet DMEM au besoin.
2. Immunostaining de M1 polarisé RAW 264.7 macrophages
- Comme la confluence des cellules RAW 264.7 atteint 70-80%, jeter le média de culture et rincer doucement 2x avec au moins 2 ml de PBS.
REMARQUE : Avant d'ensemencer des cellules RAW 264,7, assurez-vous qu'aucune différenciation cellulaire ne s'est produite (c.-à-d., phénotype de dendrite-comme et/ou taille accrue de cellules). Si des changements de morphologie cellulaire sont visibles, jetez la culture et dégelez une nouvelle lignée cellulaire du flacon de passage antérieur. - Préparer les macrophages pour la collecte en délogeant doucement les cellules adhérentes à l'aide d'un grattoir cellulaire et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
- Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et préparez une suspension cellulaire de 1 x 105 cellules/plat à l'aide du milieu DMEM complet.
- Graines 2 ml de suspension des macrophages en deux plats d'imagerie. Incuber les cellules de 2 à 3 h à 37 oC avec 5 % de CO2 pour permettre l'adhérence cellulaire.
- Préparer les supports de polarisation M1 en ajoutant 100 ng/mL LPS et 20 ng/mL IFN-dans le milieu dMEM complet10,11.
- Jeter le supernatant de culture des macrophages et laver soigneusement les monocouches dans le plat 2x avec au moins 1 ml de PBS.
- Ajouter 2 mL de ml de m. M1 dans l'un des plats d'imagerie, permettre aux cellules RAW 264,7 d'induire le phénotype du macrophage M1, et incuber 2 à 3 h à 37 oC avec 5 % de CO2.
REMARQUE : Les macrophages RAW 264.7 de graine dans un plat d'imagerie avec DMEM complété avec 10% FBS comme commande pour la coloration d'anticorps d'anti-iNOS. Étiquetez les plats d'imagerie RAW (contrôle) et M1 macrophages (LPS et IFN-polarisé), respectivement. - Avant l'immunostaining, fixer les cellules RAW 264.7 et M1 macrophages en utilisant 2 ml de paraformaldehyde de 4% et incuber pendant 15 min à 37 oC (température ambiante, RT).
- Retirez le supernatant et lavez la monocouche cellulaire avec 1 ml de PBS au moins 3x.
- Quench avec 2 ml de chlorure d'ammonium de 50 mM en PBS et incuber pendant 15 min à RT.
- Perméabilize en utilisant 2 ml de 0,3% Triton X-100 en PBS pendant 15 min à RT.
- Retirez le supernatant et lavez la monocouche cellulaire avec 1 ml de PBS au moins 3x.
- Bloquer en utilisant 2 ml de 10% FBS en PBS pendant 30 min à RT.
REMARQUE : L'étape de blocage dans l'immunostaining est de réduire au minimum la liaison non spécifique de l'anticorps dans la cellule. - Retirez le supernatant et lavez la monocouche cellulaire avec 1 ml de PBS au moins 3x.
- Incuber avec 2 ml d'anti-iNOS-FITC en PBS et 1% de FBS pendant la nuit à 4 oC.
REMARQUE : Étiquetez les cellules en utilisant la dilution appropriée des anticorps conformément aux recommandations du fabricant. Protégez les plats de la lumière en les recouvrant de papier d'aluminium à partir de ce point. - Retirez le supernatant et lavez la monocouche cellulaire avec 1 ml de PBS au moins 3x.
- Incuber 1 ml de 300 nM 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dans des plats d'imagerie pendant 10 min en 37 oC, dans l'obscurité en recouvrant de papier d'aluminium.
- Laver les cellules avec 1 ml de PBS au moins 3x et ajouter 1 ml de milieu DMEM complet dans les plats d'imagerie.
REMARQUE : Les cellules sont maintenant prêtes pour l'imagerie par fluorescence. La configuration du microscope aura besoin d'un stade inversé et des filtres d'excitation pour les taches choisies (dans ce cas, FITC et DAPI). - Allumez le microscope et chargez le logiciel d'imagerie. Montez le plat d'imagerie sur le microscope et ajustez la mise au point pour observer les macrophages RAW 264.7 et M1. Optimisez l'apparence des images FITC et DAPI à contraste de phase en ajustant la lumière transmise et les temps d'exposition.
REMARQUE : Commencez l'imagerie lorsque tous les points sont au point et que les canaux sont optimisés. - Capturez les images FITC et DAPI en contraste de phase (Figure 1).
3. Ensemencement 4T1 cellules de carcinome mammaire de souris
- Comme la confluence des cellules 4T1 atteint 70-80%, jeter le support de culture et rincer doucement 2x avec au moins 2 ml de PBS. Ajouter 1 ml de trypsine préchauffée pour dissocier les cellules et incuber jusqu'à 20 min à 37 oC.
REMARQUE : Observez les cellules au microscope. Les cellules détachées seront arrondies. - Une fois que les cellules se détachent, transférez-les dans un tube conique de 15 ml et ajoutez 2 ml de milieu DMEM complet préréchauffé pour inactiver la trypsine. Disperser doucement le milieu en canalisant la surface de la couche cellulaire pour récupérer les cellules. Ensuite, centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
- Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 10 ml de milieu DMEM complet préchauffé.
- Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et de graines 1 x 105 cellules 4T1 dans 2 ml de milieu Complet DMEM dans chacun des deux plats d'imagerie à fond de verre de 35 mm traités avec la culture tissulaire. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2.
REMARQUE : Cellules Culture 4T1 dans l'un des plats d'imagerie avec le support de polarisation M1 et l'étiquette 4T1-Inducteur (contrôle). Il s'agit d'assurer une croissance normale des cellules 4T1 lorsqu'elles sont exposées aux inducteurs.
4. Étiquetage vivant 4T1 cellules de carcinome mammaire de souris utilisant la coloration de CFSE
- Tout d'abord, retirez les supports existants des cellules 4T1. Laver la monocouche cellulaire au moins 2x avec 1 ml de PBS.
- Préparer 5 M de solution de coloration CFSE en diluant CFSE dans 1 ml de PBS. Ajouter 1 ml de solution de coloration CFSE de 5 MM dans chaque plat d'imagerie et incuber les cellules pendant 20 min à RT ou 37 oC, dans l'obscurité.
REMARQUE : Étiquetez les cellules en utilisant une concentration de travail CFSE appropriée selon les recommandations du fabricant et les expériences préliminaires afin d'obtenir la concentration optimale de coloration CFSE. L'efficacité de l'étiquetage sera plus élevée si le SCEL est dilué dans le SCP. - Étancher la coloration en ajoutant un volume égal de milieu Complet DMEM contenant 10% FBS et solution de coloration aux cellules et incuber pendant 5 min à RT dans l'obscurité.
- Jetez la solution contenant cfSE et lavez les cellules 1x avec un volume égal de supports de culture.
REMARQUE : Les cellules 4T1 sont maintenant étiquetées fluorescentes. - Remettre les cellules 4T1-CFSE dans des conditions de culture standard à RT avec 5% de CO2.
5. Ensemencement RAW 264.7 macrophages de souris et coculture avec 4T1
- Comme la confluence de RAW 264.7 atteindre 70-80%, jeter les médias de culture et rincer doucement 2x avec au moins 2 mL de PBS.
- Préparer les macrophages pour la collecte en délogeant doucement les cellules adhérentes à l'aide d'un grattoir cellulaire et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
- Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et préparez une suspension cellulaire de 1 x 105 cellules/mL en diluant la solution restante avec un milieu DMEM complet en fonction de la densité d'ensemencement.
REMARQUE : Les cellules trop confluentes dans les cocultures peuvent réduire sévèrement la phagocytose. Dans cette étude, le rapport d'ensemencement des macrophages : les cellules cancéreuses ont été ajustées à un rapport de 1:1. Le rapport peut être ajusté en fonction de l'agressivité des cellules tumorales et de l'origine des macrophages. - Avant de coculper, jetez le supernatant de culture des cellules 4T1 ensevissé sa veille (étape 4.5) et lavez soigneusement les monocouches 2x avec au moins 1 ml de PBS.
- Seed 1 x 105 RAW 264.7 cellules par 2 ml de milieu DMEM complet dans l'un des plats d'imagerie 4T1. Incuber les cellules de 2 à 3 h à 37 oC avec 5 % de CO2 pour permettre l'adhérence cellulaire. Étiquetez le plat d'imagerie 4T1-M1 coculture.
REMARQUE : Les cellules 4T1 (contrôle) n'ont pas été cocultivées avec des macrophages.
6. Polarisation M1 des macrophages RAW 264,7
- Préparer les supports de polarisation M1 en ajoutant 100 ng/mL LPS et 20 ng/mL IFN-Dans le milieu complet d'EDMEM complété par 10% (v/v) FBS10,11.
- Jeter le supernatant de culture des macrophages incubés avant (étape 5.5) et laver soigneusement les monocouches dans le plat 2x avec au moins 1 ml de PBS.
- Ensuite, ajouter 2 ml de ml de support de polarisation M1 dans le plat d'imagerie et permettre aux cellules RAW 264,7 d'induire dans le phénotype du macrophage M1 en couvant à 37 oC avec 5% de CO2.
REMARQUE : Les cellules de macrophage de M1 peuvent prendre jusqu'à 2/3 h d'incubation pour réaliser la polarisation complète. Des expériences préliminaires doivent être faites pour assurer la période d'incubation appropriée pour permettre la polarisation complète des macrophages.
7. Microscopie vidéo en direct de la phagocytose
REMARQUE : De nombreux facteurs doivent être pris en considération lors de l'exécution de l'imagerie cellulaire en direct pour obtenir une vidéo productible, y compris l'optimisation de l'exposition à l'image, la mesure du temps et la correction automatique de la mise au point.
- Avant l'expérience, mettre en place l'incubateur de culture cellulaire en allumant le thermostat à 37 oC et en fournissant 5 % de CO2.
REMARQUE : La configuration du microscope nécessite une scène inversée, un incubateur de scène, un contrôle de l'humidité (95 %) et un système d'incubation de gaz. Cette configuration est cruciale pour maintenir les cellules pour l'évaluation à long terme de la microscopie vidéo à cellules vivantes. - Allumez le microscope, y compris le stade piezo et chargez le logiciel d'imagerie au microscope.
- Placez les cellules de coculture ensedues dans un plat d'imagerie à fond de verre de 35 mm au centre de la scène et vissez doucement sur la chambre supérieure. Utilisez le joystick pour motoriser la scène en sélectionnant la position à imager.
- Pour afficher l'échantillon, sélectionnez le filtre de contraste de phase sur la tourelle. Après avoir d'abord consulté l'échantillon, localisez les champs appropriés et placez l'échantillon au point.
REMARQUE : Le logiciel d'imagerie permet l'utilisation d'une sélection objective entièrement automatisée, d'un système de mise au point parfait, d'une série de time-lapse, d'acquisition d'images multicanaux et d'acquisition d'images multipoints. - Pour configurer la fluorescence multicanal pour l'étiquetage CFSE et l'acquisition différentielle de contrastes d'interférence, ouvrez la boîte de dialogue d'acquisition de logiciels d'imagerie et sélectionnez la case à cocher de l'onglet [Lambda] (Figure 2).
REMARQUE : Pour une imagerie en accéléré de 13 h, un canal de contraste de phase doit être utilisé. - Sélectionnez l'onglet [Lambda] [Configuration optique] et sélectionnez [10X DIC] pour le contraste différentiel d'interférence et [GFP-R] pour la case à cocher du filtre à fluorescence verte. Sous le [Lambda] [Focus] colonne, sélectionnez la case à cocher [10X DIC] à définir comme la référence de mise au point.
- Ouvrez la boîte de dialogue d'acquisition de logiciel d'imagerie et cliquez sur le bouton [XYZ Time ...] et sélectionnez l'onglet [XY].
- Déplacez-vous vers le point d'acquisition d'image à l'aide du joystick sur la scène motorisée tout en vérifiant l'image en direct ou sélectionnez une position différente à travers les oculaires. Cliquez ensuite sur la case à cocher sous la colonne [Nom de point] pour définir chaque point dans chaque emplacement pour la capture d'image (voir Figure 3).
REMARQUE : L'étape automatisée permet l'acquisition d'images multipoints de différentes coordonnées XY pour capturer plusieurs champs. - Affinez la mise au point pour chaque échantillon vu à l'écran. Utilisez les contrôles sur la correction auto-focus.
- Utilisez le logiciel pour configurer la capture d'image time-lapse. Dans la boîte de dialogue d'acquisition de logiciels d'imagerie, cochez l'onglet [Temps] (voir la figure 4).
- Déterminer l'intervalle (le délai entre le début d'un point de temps à un autre point de temps) et [Durée] (la durée totale de l'expérience). Les unités de temps varient et peuvent être sélectionnées en millisecondes (ms), secondes (s), minutes (m), ou heures (h) du menu déroulant.
REMARQUE : La durée de la période d'imagerie pour l'imagerie en accéléré de la fluorescence et l'acquisition multicanal de time-lapse de DIC peut varier selon le colorant fluorescent utilisé dans cet test. Le photoblanchiment peut se produire si les cellules étiquetées sont exposées trop longtemps. - Vérifiez la case à cocher [Save to File] pour enregistrer les images acquises. Sous l'onglet [Horaire] cliquez sur le bouton [Run now] pour acquérir des images multipoints de la série chronologique (voir Figure 5).
REMARQUE : Dans le logiciel d'imagerie, les images sont enregistrées en format de fichier nd2. Chaque time-lapse peut être enregistré individuellement dans un format de fichier MP4 plus tard.
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Representative Results
Les images bidimensionnelles en time-lapse (2D) du modèle de coculture des lignées cellulaires mammaires 4T1 de carcinome de souris montrent les cellules 4T1 englouties par des macrophages M1 pendant une période de 13 heures. Il est important d'assurer une polarisation complète des macrophages M1 en effectuant l'immunostaining. Les résultats (figure 1) montrent que la concentration de 100 lipopolysaccharides (LPS) et de 20 ng/mL IFN--polarisé RAW 264,7 macrophages dans l'état M1. L'étiquetage des cellules ciblées avec un colorant fluorescent et en laissant les cellules effectrices non tachées permet un modèle de coculture à cellules vivantes (Movie 1). Tout au long de l'intervalle de 13 h et 15 min, l'activité phagocytique des macrophages M1 en coculture avec les cellules 4T1 a été documentée (Film 2). Les six vidéosmultipoints (A-F dans Movie 2) ont été enregistrées pour évaluer plusieurs événements dans un seul plat d'imagerie à fond de verre de 35 mm. Le film 3 montre les cellules 4T1 phagocytosed par les macrophages M1. Movie 4 a été choisi comme exemple d'une vidéo en profondeur filmée à partir de cette expérience et Movie 5 montre l'apport de cellules 4T1 par les macrophages M1.
Figure 1 : Coloration immunofluorescence avec anti-iNOS-FITC en vert, marqueur nucléique DAPI en bleu, et versions améliorées d'images fusionnées. Ces panneaux représentent des macrophages RAW 264,7 (contrôle) et M1 macrophages (LPS et IFN-stimulé) immunostained avec anti-iNOS-FITC (marqueur M1) en vert et contre-taché avec le marqueur de noyaux, DAPI en bleu. (A) Tache DAPI peut être observée à la fois RAW 264.7 et M1 macrophages. (B) Anti-iNOS-FITC (vert) seulement fluoresce sur les macrophages M1. (C) Images fusionnées de la tache DAPI et anti-iNOS-FITC. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Mise en place de la fluorescence et de l'acquisition d'images DIC dans le contrôle du dialogue d'acquisition de logiciels d'imagerie. [1] Sélectionnez la case à cocher [Lambda], [2] sélectionnez [Optical Configuration] et sélectionnez [10X DIC] et [GFP-R] pour la case à cocher le filtre à fluorescence verte, [3] sélectionnez [10X DIC] . [Définir ce canal comme référence de mise au point]. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mise en place d'une acquisition d'images multipoints dans le contrôle du dialogue d'acquisition de logiciels d'imagerie. [4] Sélectionnez l'onglet [XY] et sélectionnez la case à cocher sous la colonne [Nom de point] pour définir chaque point pour la capture d'image. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Configuration des intervalles et de la durée de la capture d'image de mesure en time-lapse. Le contrôle du dialogue d'acquisition de logiciels d'imagerie pour configurer la capture d'image time-lapse. Pour configurer l'acquisition d'images en time-lapse [6] vérifier sur l'onglet [Time], [7] déterminent le [Interval] (par sec, min, ou heure) et [8] la [Durée] (par sec, min, ou heure). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Configuration de panneaux de film multipoints pour la capture d'image de mesure time-lapse. L'aperçu de six panneaux de films multipoints combinés après l'achèvement de 13 h de coculture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1 : Un film représentatif de macrophages M1 non tachés et de cellules de carcinome mammaire de souris souillées de CFSE CFSE dans la coculture capturée s'appuyant sur l'acquisition multicanal de microscopie fluorescente et DIC. Résultats mettant en vedette CFSE dans la paroi cellulaire étiquetée verte de 4T1 cellules de carcinome mammaire de souris cocultivées avec des macrophages M1 non tachés. Les images en time-lapse ont été acquises pour une période de coculture de 13 heures avec des intervalles de temps de 15 min à l'aide de l'acquisition multicanal (étape 7.3, voir Figure 2). (A) Contraste différentiel d'interférence, (cercle rouge) montre de petits macrophages ronds de M1 adhérant aux cellules 4T1, qui ont une morphologie épithéliale. (B) Une image de microscopie de fluorescence des cellules 4T1 tachées avec CFSE avant la phagocytose par macrophages. (C) Images de microscopie DE DIC et de fluorescence fusionnées des cellules 4T1 souillées de CFSE étant englouties par des macrophages M1 non tachés. Les flèches bleues montrent des macrophages M1 non tachés fluorant vert lorsqu'ils engloutissent des cellules 4T1 étiquetées CFSE. Barre d'échelle de 50 m. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Film 2 : Films de microscopie vidéo en direct à partir de plusieurs points de scène dans un seul plat d'imagerie montrant la phagocytose des cellules du carcinome mammaire de souris 4T1 par des macrophages induits de M1. Les résultats représentent six points différents (Film 2A-F) mis en place et coordonné à l'aide d'un logiciel d'imagerie (étape 7.4, voir Figure 3- Figure5). Les macrophages M1 ont une morphologie irrégulière ressemblant à une crêpe avec un cytoplasme poreux, tandis que les carcinomes mammaires de souris 4T1 ont une morphologie épithéliale. Les macrophages M1 et les cellules 4T1 ont été cocultivés pendant 13 h à l'intérieur de l'incubateur de scène à 37 oC avec 5 % de CO2 avant d'être observés pour la microscopie vidéo à cellules vivantes. Les images ont été capturées à intervalles de temps de 15 min pendant 13 h. Barre à l'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Film 3: Film de microscopie vidéo live-cellule d'un seul point de coordonnées ( voir Film2) choisi pour montrer la phagocytose des carcinomes mammaires de souris 4T1 par des macrophages induits M1 en détail. La flèche rouge montre la phagocytose. Le cercle jaune montre que le nombre de cellules 4T1 qui ont étanchéité l'engloutissement des cellules 4T1. Barre d'échelle de 10 m. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Film 4: Une vidéo détaillée pour visualiser davantage le processus de phagocytose des cellules 4T1 par macrophages M1. Ce panneau montre des cellules macrophages Vivantes DeM1 avec un phénotype poreux de cytoplasme. Barre d'échelle de 10 m. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Film 5 : Macrophages se déplaçant vers les cellules 4T1 pour établir le contact de cellule à cellule, suivi de l'élimination des cellules 4T1 par les macrophages M1 (voir Film 2A). La vidéo de microscopie en accéléré de contraste de phase a été imaged dans des intervalles de temps de 15 min pour 13 h de coculture à l'intérieur d'un incubateur de dessus de scène à 37 oC avec 5% co2. Barre d'échelle de 10 m. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le protocole décrit exige deux étapes : 1) coculture des cellules mammaires de carcinome de souris 4T1 et des macrophages M1-polarisés, et 2) l'évaluation de l'activité phagocytique de macrophage utilisant la microscopie de time-lapse. La coculture cellulaire vivante est largement utilisée dans les tests de phagocytose et de migration. Le modèle de coculture des cellules vivantes ici est une procédure in vitro simple et adaptable (Figure 2) qui utilise un colorant fluorescent, CFSE, qui est utilisé pour étiqueter les cellules ciblées 4T1. Ceci est utilisé pour le suivi approprié des types de cellules pendant l'imagerie des cellules vivantes. La formation image de cellules vivantes de time-lapse a été employée pour évaluer l'activité phagocytic des macrophages de M1 utilisant la formation image 2D de time-lapse de multipoint avant les 13 h de la coculture.
Le modèle de coculture de cellules vivantes a été établi en utilisant les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1 et les macrophages de souris De M1. Pour distinguer les cellules les unes des autres, les cellules 4T1 ont été tachées à l'aide d'un colorant fluorescent CFSE (voir la section 4). CFSE permet de suivre les cellules et de surveiller la division cellulaire. CfSE peut se diffuser passivement dans les cellules, ce qui rend cfSE coloration un tracker cellulaire approprié pour visualiser la phagocytose des cellules ciblées. Comme les macrophages phagocytiques digérer et engloutir les cellules cancéreuses, ils prennent le colorant CFSE et finissent par devenirfluorescent12,13. Il est essentiel de semer des cellules 4T1 dans le plat d'imagerie avant les macrophages M1. Cela est dû aux différentes tailles et formes des deux cellules. Les cellules 4T1 ont une morphologie épithéliale qui prolifère en petits groupes. En outre, les cellules 4T1 doivent être tachées avec CFSE avant la coculture avec les macrophages M1 non tachés. Avant la polarisation des macrophages à l'aide de LPS et d'IFN-MD, les macrophages murines RAW 264.7 sont ronds, petits, et se développent habituellement en tant que cellules simples. Après la polarisation LPS et IFN-MD, les macrophages Induits M1 ont une forme relativement aplatie, en forme de crêpe, avec un cytoplasme poreux14,15. Afin d'assurer une polarisation appropriée de RAW 264,7 vers l'état M1, 100 ng/mL LPS et 20 ng/mL des macrophages stimulés par l'IFN ont été immunotachés d'un marqueur M1, anticorps anti-iNOS conjugués au FITC (Figure 1). Ce protocole est exécuté avant de coculper les macrophages et les cellules ciblées pour s'assurer que les macrophages sont complètement polarisés dans l'état M1.
Cette étude décrit une méthode pour la microscopie fluorescente pour visualiser l'activité phagocytique des macrophages vivants. Afin de minimiser le blanchiment photo et de fournir une meilleure imagerie par fluorescence, la microscopie fluorescente peut être combinée à d'autres techniques d'imagerie qui ne sont pas destructrices du fluorochrome, semblable au DIC. Le protocole actuel décrit les matériaux et les méthodes nécessaires à l'évaluation de la phagocytose des cellules du carcinome mammaire de la souris par les macrophages stimulés par LPS et IFN à l'aide de microscopie fluorescente et dic time-lapse. Néanmoins, les études de microscopie fluorescente ont des limites lors de l'étude de l'imagerie des cellules vivantes par rapport à l'imagerie en temps mort en contraste de phase. Pendant l'imagerie fluorescente des cellules vivantes, une exposition prolongée à une grande quantité de lumière d'excitation peut induire des dommages graves aux cellules16. Le photoblanchiment peut causer des problèmes importants dans l'imagerie des cellules vivantes. L'éclairage de haute intensité utilisé dans l'imagerie cellulaire vivante peut réduire la capacité de colorant CFSE à la fluorescence. Néanmoins, une évaluation de 13 h de phagocytose a été réalisée dans la deuxième partie de cette étude en utilisant l'imagerie 2D time-lapse de phase-contraste(Films 2-5).
La microscopie en accéléré offre des avantages tels que la génération de données d'une seule expérience à tout moment tout au long de la période de durée désirée et, de manière significative, plusieurs points d'étape au sein d'un seul plat d'imagerie peuvent être capturés pour une seule expérience. Cela permet d'observer différentes positions dans une seule expérience. Le protocole peut également être utilisé à l'aide de plusieurs puits provenant de plaques de culture (p. ex., 6, 24, 96 plaques de puits). Parmi les défis techniques les plus critiques pour effectuer avec succès l'expérience d'imagerie des cellules vivantes comprend le maintien des cellules dans un état sain en utilisant un incubateur de dessus de scène pour fournir une température stable de 37 oC, 95% de l'humidité, et 5% CO2. Parce que l'expérience a pris 13 h, s'assurer que le microscope fonctionne normalement tout au long était crucial.
Au cours de cette étude, six points différents dans le plat d'imagerie ont été capturés tout au long d'une durée de 13 heures pour 15 minutes d'intervalles par point (Film 2). Les points peuvent être ajustés en fonction du cas de la cellule à l'étude. Considérant qu'il ya plusieurs points d'étape à capturer tout au long de cette expérience, il est important de s'assurer que chaque point a un accent stable avant d'effectuer l'enregistrement vidéo live-cell. L'intervalle de temps pour l'enquête doit être optimisé. Un intervalle de temps réduit aura des points plus détaillés qui peuvent être représentés; cependant, la taille du fichier sera très grande. L'augmentation de l'intervalle de temps se traduira par une longue vidéo et fera perdre la continuité du film.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé financièrement par Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaisie: 9542800. Nous tenons à remercier les laboratoires de l'Institut agro-biotechnologique, les laboratoires de Malaisie (ABI) et l'installation d'imagerie par microscopie. Un merci spécial à Mohd Daniel Hazim pour son aide au montage et à l'enregistrement de la vidéo expérimentale pour ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
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