Summary
A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.
Abstract
Macrófagos associados ao tumor (TAMs) têm sido identificados como um componente importante para o crescimento do tumor, invasão, metástase e resistência às terapias contra o câncer. No entanto, macrófagos associados ao tumor podem ser prejudiciais ao tumor, dependendo do microambiente tumoral e podem alterar reversivelmente suas características fenotípicas, antagonizando a atividade citotóxica das células imunes ou melhorando a resposta antitumoral. As ações moleculares dos macrófagos e suas interações com células tumorais (por exemplo, fagocitose) não foram amplamente estudadas. Portanto, a interação entre as células imunes (M1/M2-subtipo TAM) e células cancerosas no microambiente tumoral é agora um foco da pesquisa de imunoterapia do câncer. No presente estudo, foi desenvolvido um modelo de cocultura celular ao vivo de macrófagos M1 induzidos e células carcinoma mamárias de camundongos 4T1 para avaliar a atividade fagocítica dos macrófagos usando um recurso de vídeo de lapso de tempo usando microscopia de contraste de interferência de contraste de fase, fluorescente e diferencial (DIC). O método atual pode observar e documentar imagens multiponto de células vivas de fagocitose. A fagocitose das células 4T1 por macrófagos M1 pode ser observada usando microscopia fluorescente antes de colorir células 4T1 com esucinta de carboxyfluorescein (CFSE). A publicação atual descreve como cocultura macrófagos e células tumorais em um único prato de imagem, polarizar macrófagos M1, e gravar eventos multiponto de macrófagos engolindo células 4T1 durante 13 h de cocultura.
Introduction
Macrófagos são a primeira linha de defesa imunológica e desempenham um papel na orquestração de respostas imunes contra patógenos e materiais estranhos, incluindo células cancerosas. Eles são um phagocito especializado que destrói e se livra de partículas indesejadas no corpo. Macrófagos contribuem com funções defensivas, como a limpeza de células apoptóticas e microorganismos e o recrutamento de outras células imunes1. Macrófagos podem se diferenciar em dois tipos diferentes, macrófagos M1 e M2, em resposta aos sinais ambientais2. Macrófagos polarizados por M1 (ou seja, macrófagos ativados classicamente) são ativados pelo interferon-γ de citocina (IFN-γ) e lipopolissaccharides (LPS) e estão envolvidos na resposta inflamatória, limpeza de patógenos, fagocitose eficiente e imunidade tumoricida3,4. Os macrófagos M2 estão intimamente relacionados com macrófagos associados ao tumor (TAMs) e têm propriedades de promoção anti-inflamatória etumoral 4.
A fagocitose, derivada do grego antigo (fagetina), que significa "devorar", (kytos), que significa "célula" e osis, que significa "processo"5. A fagocitose é um processo mediado por receptores, onde os fagócitos (incluindo macrófagos, monócitos e neutrófilos) matam e engolfam patógenos invasores, limpam partículas estranhas e limpam detritos de células apoptóticas. Macrófagos associados ao tumor (TAMs) são encontrados no estroma em diferentes tumores, incluindo câncer de mama, e têm funçõespró-tumorais 6,7,resultando em resistência à fagocitose. O mecanismo detalhado da fagocitose celular tumoral por macrófagos ainda não é compreendido.
Este estudo apresenta um método de duas etapas: 1) as células carcinoma mamárias de camundongos 4T1 e macrófagos polarizados por M1 são coculturados, e 2) a atividade fagoscítica dos macrófagos é avaliada usando microscopia de vídeo de células vivas. O corante fluorescente CFSE foi usado para manchar as células do carcinoma mamária do camundongo 4T1. A mancha rotula as células 4T1 para distingui-las dos macrófagos M1 coculturados dentro de um único prato de imagem. Raw 264.7 macrófagos são polarizados com LPS e IFN-γ em um fenótipo M1. Para garantir uma polarização completa, foi realizada a imunocoloração com anticorpoanti-iNOS conjugado ao FITC. Posteriormente, uma série multiponto de imagens de lapso de tempo foi adquirida para observar vários eventos, incluindo a fagocitose, dentro da cocultura.
Uma melhor compreensão das interações entre células tumorais e macrófagos pode levar à imunoterapia potencial do câncer. Imagens de células vivas oferece uma visão detalhada da dinâmica celular em um ambiente em tempo real e tem sido usado para estudar a migração celular, triagem de ofenotípico, apoptose e citotoxicidade8,9 em neurociência, biologia do desenvolvimento, e descoberta de drogas. Embora o tumor proposto neste estudo seja câncer de mama, o método também pode ser aplicado a múltiplas células-alvo e células efetentes distintas.
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Protocol
NOTA: As seções 1-6 descrevem o modelo de cocultura das células carcinoma mamárias do camundongo 4T1 e macrófagos de camundongos RAW 264,7. A seção 7 descreve a avaliação do lapso de tempo das células 4T1 phagocyted dos macrófagos M1.
1. Culturing 4T1 mouse células carcinoma mamária e RAW 264,7 macrófagos do mouse
- Descongele um frasco de 4T1 criogenicamente preservado e RAW 264,7 células de passagem 6 por agitação suave em um banho de água a 37 °C ou a temperatura de crescimento normal para as linhas celulares.
NOTA: O descongelamento deve ser feito rapidamente, aproximadamente dentro de 2 min. Para evitar a contaminação, retire o frasco do banho de água e descontamine-o pulverizando com 70% de etanol. Para evitar a deriva genética, especialmente para os macrófagos, use um número de passagem baixo (ou seja, menos de 20). - Diluir as células descongeladas em 10 mL de meio DMEM completo em um tubo cônico de 15 mL e centrífuga as células em 600 x g para 5 min para obter uma pelota celular.
NOTA: Médio DMEM completo complementado com 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS), 200 U/mL penicilina/estreptomicina e 2 mM L-glutamina são usados em todo o protocolo. - Pirata cuidadosamente a mídia, resuspende as células em 8 mL de meio completo e transfira para uma cultura de tecido de 25 cm2 tratada de frasco. Cultura 4T1 e RAW 264,7 células em meio DMEM completo em 37 °C com 5% CO2.
NOTA: Resuspender as pelotas celulares suavemente e adicione a suspensão celular na queda de frasco de cultura por gota para evitar matar as células. - Após 1 semana de cultivo para permitir a adesão celular, monitorar o frasco diariamente e adicionar 8 mL de meio DMEM completo, conforme necessário.
2. Imunomancha de M1 polarizado RAW 264,7 macrófagos
- Como a confluência de células RAW 264,7 atinge 70-80%, descartar a mídia cultural e enxaguar suavemente 2x com pelo menos 2 mL de PBS.
NOTA: Antes de semeadura RAW 264,7 células, certifique-se de nenhuma diferenciação celular ocorreu (ou seja, nêótipo de dendrita e / ou aumento do tamanho celular). Se as alterações da morfologia celular são visíveis, descarte a cultura e descongele uma nova linha celular do frasco de passagem anterior. - Prepare os macrófagos para a coleta, desalojando suavemente as células aderentes usando um raspador de células e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL.
- Conte as células usando um hemocytometer e prepare uma suspensão celular de 1 x 105 células/prato usando o meio DMEM completo.
- Semente 2 mL da suspensão dos macrófagos em dois pratos de imagem. Incubar as células 2-3 h a 37 °C com 5% de CO2 para permitir a adesão celular.
- Prepare os meios de polarização M1 adicionando 100 NG/mL LPS e 20 ng/mL IFN-γ em dmem completo médio10,11.
- Descarte a cultura supernatant dos macrófagos e lave cuidadosamente os monocamadas no prato 2x com pelo menos 1 mL de PBS.
- Adicione 2 mL de mídia de polarização M1 em um dos pratos de imagem, permita que as células RAW 264,7 induzam o fenótipo de macrófago M1 e incubam 2-3 h a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: Semente RAW 264,7 macrófagos em um prato de imagem com DMEM complementado com 10% FBS como um controle para a coloração anti-iNOS anticorpos. Rotular os pratos de imagem RAW (controle) e M1 macrófagos (LPS e IFN-γ polarizado), respectivamente. - Antes da imunocoloração, conserte as células de macrófagos RAW 264,7 e M1 usando 2 mL de paraformaldeído e incubação de 4% por 15 min a 37 °C (temperatura ambiente, RT).
- Retire o supernatant e lave o monocamada celular com 1 mL de PBS pelo menos 3x.
- Saciar com 2 mL de 50 mM cloreto de amônio na PBS e incubar por 15 min em RT.
- Permeabilize usando 2 mL de 0,3% Triton X-100 em PBS por 15 min na RT.
- Retire o supernatant e lave o monocamada celular com 1 mL de PBS pelo menos 3x.
- Bloco usando 2 mL de 10% FBS em PBS por 30 min em RT.
NOTA: O passo de bloqueio na imunocoloração é minimizar a ligação não específica do anticorpo dentro da célula. - Retire o supernatant e lave o monocamada celular com 1 mL de PBS pelo menos 3x.
- Incubar com 2 mL de anti-iNOS-FITC em PBS e 1% FBS durante a noite em 4 °C.
NOTA: Rotular as células usando a diluição de anticorpos adequada de acordo com as recomendações do fabricante. Proteja os pratos da luz cobrindo-os com folha de alumínio a partir deste ponto. - Retire o supernatant e lave o monocamada celular com 1 mL de PBS pelo menos 3x.
- Incubar 1 mL de 300 nM 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em pratos de imagem por 10 min em 37 °C, no escuro, cobrindo com folha de alumínio.
- Lave as células com 1 mL de PBS pelo menos 3x e adicione 1 mL de médio DMEM completo nos pratos de imagem.
NOTA: As células estão agora prontas para imagens de fluorescência. A configuração do microscópio precisará de um estágio invertido e filtros de excitação para as manchas escolhidas (neste caso, FITC e DAPI). - Ligue o microscópio e carregue o software de imagem. Monte o prato de imagem no microscópio e ajuste o foco para observar os macrófagos RAW 264,7 e M1. Otimizar o aparecimento de imagens FITC e DAPI de contraste de fase, ajustando os tempos de luz e exposição transmitidos.
NOTA: Comece a imagem quando todos os pontos estão em foco e os canais são otimizados. - Capturar imagens FITC e DAPI de contraste de fase(Figura 1).
3. Semeadura 4T1 células de carcinoma mamária do rato
- Como a confluência das células 4T1 chega a 70 a 80%, descartar a mídia cultural e enxaguar suavemente 2x com pelo menos 2 mL de PBS. Adicione 1 mL de trippsinpré-aquecida para dissociar as células e incubar por até 20 min a 37 °C.
NOTA: Observe as células um microscópio. As células destacadas serão arredondadas. - Uma vez que as células se separam, transfira-as para um tubo cônico de 15 mL e adicione 2 mL de meio DMEM completo pré-aquecido para inativar a trippsina. Disperse suavemente o meio canalizando a superfície da camada celular para recuperar as células. Em seguida, centrífuga em 600 x g para 5 min para obter uma pelota celular.
- Retire o supernatant e resuspenda a pelota em 10 mL do meio completo pré-aquecido DMEM.
- Conte as células usando um hemocytometer e sementes 1 x 105 4T1 células em 2 mL de meio DMEM completo em cada um dos dois 35 mm pratos de imagem com fundo de vidro tratados com cultura de tecido. Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5% DE CO2.
NOTA: Células Cultura 4T1 em um dos pratos de imagem com mídia de polarização M1 e rótulo 4T1-Indutor (controle). Isto é para garantir o crescimento normal das células 4T1 quando expostos aos indutores.
4. Rotulagem de vida 4T1 células de carcinoma mamária do rato usando manchas CFSE
- Primeiro, retire a mídia existente dos pratos de imagem das células 4T1. Lave a monocamada celular pelo menos 2x com 1 mL de PBS.
- Prepare 5 μM de solução de coloração CFSE diluindo CFSE em 1 mL da PBS. Adicione 1 mL de 5 μM cfse solução de coloração em cada prato de imagem e incubar as células por 20 min em RT ou 37 °C, no escuro.
NOTA: Rotular as células usando concentração de trabalho CFSE adequada de acordo com as recomendações do fabricante e experimentos preliminares para obter a concentração de coloração CFSE ideal. A eficiência da rotulagem será maior se a CFSE for diluída no PBS. - Saciar a coloração, adicionando um volume igual de médio DMEM completo contendo 10% FBS e solução de coloração para as células e incubar por 5 min em RT no escuro.
- Descarte a solução contendo CFSE e lave as células 1x com um volume igual de mídia cultural.
NOTA: As células 4T1 agora são rotuladas fluorescentemente. - Devolva as células 4T1-CFSE às condições culturais padrão na RT com 5% de CO2.
5. Semeada RAW 264,7 macrófagos de camundongos e cocultura com 4T1
- Como a confluência do RAW 264,7 chega a 70 a 80%, descarte a mídia cultural e lave suavemente 2x com pelo menos 2 mL de PBS.
- Prepare os macrófagos para a coleta, desalojando suavemente as células aderentes usando um raspador de células e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL.
- Conte as células usando um hemocytometer e prepare uma suspensão celular de 1 x 105 células/mL diluindo a solução restante com um meio DMEM completo de acordo com a densidade de semeadura.
NOTA: Excessivamente as células de confluentes em coculturas podem reduzir severamente a fagocitose. Neste estudo, a razão de semeadura dos macrófagos: as células cancerosas foram ajustadas para uma proporção de 1:1. A razão pode ser ajustada dependendo da agressividade das células tumorais e da origem dos macrófagos. - Antes de coculturing, descarte a cultura supernatant das pilhas 4T1 semeadas um dia antes (etapa 4.5) e lave com cuidado os monolayers 2x com pelo menos 1 mL de PBS.
- Semente 1 x 105 RAW 264,7 células por 2 mL de meio DMEM completo em um dos pratos de imagem 4T1. Incubar as células 2-3 h a 37 °C com 5% de CO2 para permitir a adesão celular. Rotular o prato de imagem 4T1-M1 cocultura.
NOTA: As células 4T1 (controle) não foram coculturadas com macrófagos.
6. Polarização M1 de MACRófagos RAW 264,7
- Prepare os meios de polarização M1 adicionando 100 NG/mL LPS e 20 ng/mL IFN-γ em médio DMEM completo complementado com 10% (v/v) FBS10,11.
- Descarte a cultura supernatant dos macrófagos incubados antes (passo 5.5) e lave cuidadosamente os monocamadas no prato 2x com pelo menos 1 mL de PBS.
- Em seguida, adicione 2 mL de mídia de polarização M1 no prato de imagem e permitir que as células RAW 264,7 induzam no fenótipo de macrófago M1 incubando a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: As células de macrófagos M1 podem ocupar 2 a 3 h de incubação para alcançar a polarização completa. Experimentos preliminares precisam ser feitos para garantir o período de incubação adequado para permitir a polarização completa dos macrófagos.
7. Microscopia de vídeo de células vivas de fagocitose
NOTA: Muitos fatores precisam ser considerados ao realizar imagens de células vivas para obter um vídeo produzível, incluindo otimização da exposição à imagem, medição do tempo e correção automática de foco.
- Antes do experimento, configure a incubadora de cultura celular, ligando o termostato a 37 °C e fornecendo 5% de CO2.
NOTA: A configuração do microscópio requer um estágio invertido, uma incubadora superior de palco, controle de umidade (95%) e sistema de incubação de gás. Esta configuração é crucial para manter as células para a avaliação de microscopia de vídeo de células vivas a longo prazo. - Ligue o microscópio, incluindo o estágio piezo e carregar o software de imagem microscópio.
- Posicione as células de cocultura semeadas em um prato de imagem de 35 mm com fundo de vidro no centro do palco e parafuso suavemente na câmara superior. Use o joystick para motorizar o palco, selecionando a posição a ser imagem.
- Para visualizar a amostra, selecione o filtro de contraste de fase na torre. Depois de visualizar inicialmente a amostra, localizar os campos apropriados e trazer a amostra em foco.
NOTA: O software de imagem permite o uso de seleção objetiva totalmente automatizada, sistema de foco perfeito, série de lapso de tempo, aquisição de imagem multicanal e aquisição de imagem multiponto. - Para configurar a fluorescência multicanal para a rotulagem cfse e interferência diferencial de aquisição de contraste, abra a caixa de diálogo de aquisição de software de imagem e selecione a caixa de verificação de guia [Lambda] (Figura 2).
NOTA: Para uma imagem de lapso de tempo de 13 h, um canal de contraste de fase deve ser usado. - Selecione [Lambda] guia | [Configuração Óptica] e selecione [10X DIC] para contraste de interferência diferencial e [GFP-R] para a caixa de verificação de filtro de fluorescência verde. o [Lambda] | [Focus] coluna, selecione o [10X DIC] caixa de seleção para definir como a referência de foco.
- Abra a caixa de diálogo de aquisição de software de imagem e clique no botão [XYZ Time ...] e selecione a aba [XY].
- Mova-se para o ponto de aquisição de imagem usando o joystick no palco motorizado ao verificar a imagem ao vivo ou selecionar uma posição diferente através dos olhos. Em seguida, clique na caixa de seleção na coluna [Nome do Ponto] para definir cada ponto em cada local para captura de imagem (ver Figura 3).
NOTA: O estágio automatizado permite a aquisição de imagem multiponto de diferentes coordenadas XY para capturar vários campos. - Afinar o foco de cada amostra visualizada na tela. Use os controles na correção de foco automático.
- Use o software para configurar a captura de imagem de lapso de tempo. Na caixa de diálogo de aquisição de software de imagem, verifique a aba [Time] (ver Figura 4).
- Determine o [Intervalo] (o atraso entre o início de um ponto de tempo para outro ponto de tempo) e [Duração] (o período total de tempo do experimento). As unidades de tempo variam e podem ser selecionadas em milissegundos (ms), segundos (s), minutos (m) ou horas (h) do menu de abandono.
NOTA: O comprimento do período de imagem para a imagem de lapso de tempo de fluorescência e dic time-lapse aquisição multicanal pode variar dependendo do corante fluorescente usado neste ensaio. O photobleaching pode ocorrer se as células rotuladas forem expostas por muito tempo. - Verifique a caixa de seleção [Save to File] para salvar imagens adquiridas. De acordo com a aba [horário] clique no botão [Run now] para adquirir imagens multiponto da série de tempo (ver Figura 5).
NOTA: No software de imagem, as imagens são salvas no formato de arquivo nd2. Cada lapso de tempo pode ser salvos individualmente em um formato de arquivo MP4 mais tarde.
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Representative Results
As imagens bidimensionais (2D) de lapso de tempo do modelo de cocultura das linhas celulares do carcinoma mamária do camundongo 4T1 mostram as células 4T1 sendo engolidas por macrófagos M1 durante um período de 13 h. É importante garantir uma polarização completa dos macrófagos M1 realizando imunomanchas. Os resultados(Figura 1)mostram que a concentração de 100 lipopolissacarídeos ng/mL (LPS) e 20 ng/mL IFN-γ polarizou RAW 264,7 macrófagos no estado m1. Rotular as células-alvo com um corante fluorescente e deixar as células efetivos desmanhadas permite um modelo de cocultura de células vivas(Filme 1). Ao longo do intervalo de 13 h e 15 min, a atividade fagoscítica dos macrófagos M1 na cocultura com as células 4T1 foi documentada(Filme 2). Os seis vídeos multipontos(A-F no Filme 2)foram gravados para avaliar vários eventos dentro de um único prato de imagem de 35 mm com fundo de vidro. Filme 3 mostra as células 4T1 fagócitos por macrófagos M1. Filme 4 foi escolhido como um exemplo de um vídeo em profundidade filmado a partir deste experimento e Filme 5 mostra a captação de células 4T1 por macrófagos M1.
Figura 1: A coloração de imunofluorescência com anti-iNOS-FITC em verde, núcleos marcador DAPI em azul, e versões melhoradas de imagens fundidas. Esses painéis representam macrófagos RAW 264,7 (controle) e macrófagos M1 (LPS e IFN-γ estimulados) imunosmanchados com anti-iNOS-FITC (marcador M1) em verde e contra-testados com marcador de núcleos, DAPI em azul. (A)Mancha DAPI pode ser observada tanto RAW 264,7 e M1 macrófagos. (B) Anti-iNOS-FITC (verde) apenas fluoresce em macrófagos M1. (C)Imagens fundidas de mancha da DAPI e anti-iNOS-FITC. Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Criação de fluorescência e aquisição de imagem DIC no controle de diálogo de aquisição de software de imagem. [1] selecione a caixa de verificação [Lambda] tab, [2] selecione [Configuração Óptica] e selecione [10X DIC] e [GFP-R] para a caixa de verificação de filtro de fluorescência verde, [3] selecione [10X DIC] | [Definir este canal como a referência de foco]. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Criação de aquisição de imagem multiponto no controle de diálogo de aquisição de software de imagem. [4] Selecione a aba [XY] e em seguida [5] selecione a caixa de seleção a coluna [Point Name] para definir cada ponto para a captura de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Configuração de intervalos e duração para captura de imagem de medição de lapso de tempo. O controle de diálogo de aquisição de software de imagem para configurar a captura de imagem de lapso de tempo. Para configurar a aquisição de imagem de lapso de tempo [6] verificar na aba [Time], [7] determinar o [Intervalo] (por segundo, min, ou hora) e [8] a [Duração] (por segundo, min ou hora). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Criação de painéis de filmes multipontos para captura de imagem de medição de lapso de tempo. A prévia de seis painéis de filmes multipontos combinados após a conclusão de 13 h de cocultura. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Filme 1: Um filme representativo de macrófagos M1 não manchados e células carcinoma mamárias de camundongos manchadas de CFSE 4T1 na cocultura capturadas usando aquisição multicanal de microscopia fluorescente e DIC. Resultados mostrando CFSE na parede celular de marca verde de células carcinoma mamárias 4T1 coculturadas com macrófagos M1 não manchados. As imagens de lapso de tempo foram adquiridas por um período de cocultura de 13 h com intervalos de tempo de 15 minutos usando aquisição multicanal (passo 7.3, ver Figura 2). (A)Contraste de interferência diferencial, (círculo vermelho) mostra pequenos macrófagos M1 redondos aderindo às células 4T1, que têm uma morfologia epitelia. (B) Uma imagem de microscopia de fluorescência de células 4T1 manchadas com CFSE antes da fagocitose por macrófagos. (C) Fundiu imagens de microscopia DIC e fluorescência de células 4T1 manchadas de CFSE sendo engolidas por macrófagos M1 não manchados. As setas azuis mostram macrófagos M1 não manchados fluorescing verde como eles engolfam CFSE-rotulados 4T1 células. Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Filme 2: Filmes de microscopia de vídeo ao vivo de vários pontos de palco em um único prato de imagem mostrando a fagocitose de células carcinoma mamárias 4T1 por macrófagos M1 induzidos. Os resultados representam seis pontos diferentes(Filme 2A-F)configurados e coordenados usando software de imagem (passo 7.4, ver Figura 3−Figura 5). Os macrófagos M1 têm uma morfologia irregular, semelhante a uma panqueca, com um citoplasma poroso, enquanto os carcinomas mamárias do rato 4T1 têm uma morfologia epitelia. Macrófagos M1 e células 4T1 foram coculturados por 13 h dentro da incubadora de palco a 37 °C com 5% de CO2 antes de serem observados para microscopia de vídeo de células vivas. As imagens foram capturadas em intervalos de tempo de 15 minutos para 13 h. Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Filme 3: Filme de microscopia de vídeo ao vivo de um único ponto de coordenação(ver Filme 2) escolhido para mostrar a fagocitose de carcinomas mammary de camundongo4T1 por macrófagos M1 induzidos em detalhes. A seta vermelha mostra a fagocitose. O círculo amarelo mostra que o número de células 4T1 que saciaram o engolfamento das células 4T1. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Filme 4: Um vídeo detalhado para visualizar ainda mais o processo de fagocitose de células 4T1 por macrófagos M1. Este painel mostra células de macrófago M1 vivas com um fenótipo de citoplasma poroso. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Filme 5: Macrófagos se movendo em direção às células 4T1 para estabelecer o contato célula-célula, seguido pela captação de células 4T1 por macrófagos M1 (ver Filme 2A). O vídeo de lapso de tempo de microscopia de contraste de fase foi imagemdo em intervalos de tempo de 15 minutos para 13 h de cocultura dentro de uma incubadora de palco superior a 37 °C com 5% de CO2. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O protocolo descrito requer duas etapas: 1) cocultura de células carcinoma mamárias 4T1 e macrófagos polarizados por M1 e 2) avaliação da atividade fagocítica do macrófago usando microscopia de lapso de tempo. A cocultura de células vivas é amplamente utilizada na falese e ensaios migratórios. O modelo de cocultura de células vivas aqui é um procedimento simples e adaptável in vitro(Figura 2)que utiliza um corante fluorescente, cfse, que é usado para rotular as células-alvo 4T1. Isso é usado para rastreamento adequado dos tipos de células durante a imagem de células vivas. A imagem latente da viver-pilha do time-lapse foi usada para avaliar a atividade do phagocytic de macrófagos M1 usando a imagem latente 2D do tempo-lapso de ponto antes dos 13 h da cocultura.
O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido usando células carcinoma mamárias de camundongo4T1 e macrófagos de camundongos M1. Para distinguir as células umas das outras, as células 4T1 foram manchadas usando um corante fluorescente CFSE (ver seção 4). Cfse permite o rastreamento das células e monitoramento da divisão celular. Cfse pode passivamente difundir em células, tornando CFSE colorindo um rastreador de células adequada para visualizar a fagocitose de células-alvo. À medida que os macrófagos fagos fagos digerem e engolfam as células cancerosas, eles ocupam o corante cfse e,eventualmente,tornam-se fluorescentes12,13. É essencial para semeadura 4T1 células no prato de imagem antes dos macrófagos M1. Isto é devido aos diferentes tamanhos e formas de ambas as células. As células 4T1 têm uma morfologia epitelia que prolifera em pequenos aglomerados. Além disso, as células 4T1 devem ser manchadas com CFSE antes da cocultura com os macrófagos M1 não manchados. Antes da polarização do macrófago usando LPS e IFN-γ, os macrófagos de urina RAW 264,7 são redondos, pequenos e geralmente crescem como células únicas. Após a polarização LPS e IFN-γ, os macrófagos M1 induzidos têm uma forma relativamente achatada, semelhante a uma panqueca, com um citoplasma poroso14,15. Para garantir uma polarização adequada do RAW 264,7 para o estado M1, 100 NG/mL LPS e 20 macrófagos estimulados ng/mL IFN-γ foram imunosretidos com um marcador M1, anticorpo anti-iNOS conjugado ao FITC (Figura 1). Este protocolo é realizado antes de coculturing os macrófagos e células-alvo para garantir que os macrófagos são completamente polarizados no estado M1.
Este estudo descreve um método de microscopia fluorescente para visualizar a atividade fagos avida dos macrófagos vivos. Para minimizar o fotobranqueamento e para fornecer melhor imagem de fluorescência, a microscopia fluorescente pode ser combinada com outras técnicas de imagem que não são destrutivas para o fluorocromático, semelhante ao DIC. O protocolo atual descreve os materiais e métodos necessários para a avaliação da fagocitose das células de carcinoma mamária do camundongo por LPS e IFN-γ estimulou macrófagos usando microscopia fluorescente e DIC time-lapse. No entanto, os estudos de microscopia fluorescente têm limitações ao estudar imagens de células vivas em comparação com imagens de lapso de tempo de contraste de fase. Durante a imagem de células vivas fluorescentes, a exposição prolongada a uma alta quantidade de luz de excitação pode induzir danos celulares graves16. O photobleaching pode causar problemas significativos na imagem latente da viver-pilha. A iluminação de alta intensidade usada na imagem latente da viver-pilha pode reduzir a habilidade da tintura do CFSE à flúor. No entanto, uma avaliação de 13 h de fagagocitose foi alcançada na segunda parte deste estudo usando imagens 2D de lapso de tempo de contraste fase(Filmes 2-5).
A microscopia time-lapse oferece vantagens tais como a geração de dados de uma única experiência a qualquer ponto de hora durante todo o período de duração desejado e significativamente, os pontos múltiplos do estágio dentro de um único prato da imagem latente podem ser capturados para uma única experiência. Isso permite a observação de várias posições em um único experimento. O protocolo também pode ser usado usando vários poços de placas de cultura (por exemplo, 6, 24, 96 placas de poço). Entre os desafios técnicos mais críticos para realizar experimentos bem-sucedidos de imagem de células vivas, inclui a manutenção das células em uma condição saudável usando uma incubadora superior de palco para fornecer uma temperatura estável de 37 °C, 95% da umidade e 5% de CO2. Porque o experimento levou 13 h, garantir que as funções de microscópio normalmente ao longo era crucial.
Durante este estudo, seis pontos diferentes no prato de imagem foram capturados ao longo de uma duração de 13 h por intervalos de 15 minutos por ponto(Filme 2). Os pontos podem ser ajustados dependendo do evento da célula investigação. Considerando que existem vários pontos de estágio a serem capturados ao longo deste experimento, é significativo para se certificar de que cada ponto tem um foco estável antes de executar a gravação de vídeo ao vivo. O intervalo de tempo para a investigação deve ser otimizado. Um intervalo de tempo reduzido terá pontos mais detalhados que podem ser imageados; no entanto, o tamanho do arquivo será muito grande. O intervalo de tempo crescente conduzirá a um vídeo longo e fará o filme perder a continuidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado financeiramente por Geran Putra Berimpak (GBP), Universidades Putra Malásia: 9542800. Gostaríamos de agradecer aos laboratórios do Instituto Agro-Biotecnologia, malásia (ABI) e à instalação de imagem de microscopia. Um agradecimento especial a Mohd Daniel Hazim para ajudar na edição e gravação do vídeo experimental para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
