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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

सह-संस्कृतियों में एम 1 मैक्रोफेज-4T1 माउस मैमेरी कार्सिनोमा कोशिकाओं में फागोसाइटिक गतिविधि की समय-चूक 2डी इमेजिंग

Published: December 14, 2019 doi: 10.3791/60281
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 4, 1,2
1Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia, 2Institute of Tropical Forestry and Forestry Products (INTROP), Universiti Putra Malaysia, 3Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Malaya, 4Agro-Biotechnology Institute (ABI), National Institute of Biotechnology Malaysia (NIBM)

Summary

कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ मैक्रोफेज फागोसाइटिक गतिविधि, विशेष रूप से 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं, इस अध्ययन में चित्रित किया गया था । लाइव सेल सहसंस्कृति मॉडल की स्थापना की और फ्लोरोसेंट और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग कर मनाया गया था । मल्टीपॉइंट टाइम-लैप्स वीडियो विकसित करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इस मूल्यांकन को चित्रित किया गया था।

Abstract

ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) ट्यूमर के विकास, आक्रमण, मेटास्टासिस, और कैंसर चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के लिए एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में पहचान की गई है । हालांकि, ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के आधार पर ट्यूमर के लिए हानिकारक हो सकते हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिक गतिविधि का विरोध करके या एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया को बढ़ाने से अपनी फेनोटाइपिक विशेषताओं को बदल सकते हैं। मैक्रोफेज के आणविक कार्यों और ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे, फागोसाइटोसिस) के साथ उनकी बातचीत का बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है। इसलिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं (M1/M2-subtype टैम) और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत अब कैंसर इम्यूनोथेरेपी अनुसंधान का ध्यान केंद्रित है । वर्तमान अध्ययन में, प्रेरित एम 1 मैक्रोफेज और माउस मैमेरी 4T1 कार्सिनोमा कोशिकाओं का एक लाइव सेल सहसंस्कृति मॉडल चरण-विपरीत, फ्लोरोसेंट, और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक समय-चूक वीडियो सुविधा का उपयोग करके मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था। वर्तमान विधि का निरीक्षण और दस्तावेज मल्टीपॉइंट लाइव-सेल इमेजिंग फेगोसाइटोसिस कर सकता है। एम1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस को कार्बोसिफ्लोरेसिन सिसिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) के साथ 4T1 कोशिकाओं को धुंधला करने से पहले फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। वर्तमान प्रकाशन का वर्णन कैसे एक ही इमेजिंग डिश में मैक्रोफेज और ट्यूमर कोशिकाओं सहसंस्कृति के लिए, ध्रुवीकरण M1 मैक्रोफेज, और मैक्रोफेज की रिकॉर्ड बहुबिंदु घटनाओं को 13 घंटे के दौरान 4T1 कोशिकाओं छा ।

Introduction

मैक्रोफेज प्रतिरक्षा रक्षा की पहली पंक्ति हैं और कैंसर कोशिकाओं सहित रोगजनकों और विदेशी सामग्रियों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आर्केस्ट्रा में भूमिका निभाते हैं। वे एक विशेष फागोसाइट हैं जो शरीर में अवांछित कणों को नष्ट कर देता है और छुटकारा पा ता है। मैक्रोफेज एपोप्टोटिक कोशिकाओं और सूक्ष्मजीवों की निकासी और अन्य प्रतिरक्षाकोशिकाओंकी भर्ती जैसे रक्षात्मक कार्यों का योगदान करते हैं । मैक्रोफेज पर्यावरणीय संकेतों2के जवाब में दो अलग-अलग प्रकार, एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज में अंतर कर सकते हैं। M1-polarized मैक्रोफेज (यानी, शास्त्रीय रूप से सक्रिय मैक्रोफेज) साइटोकिन इंटरफेरॉन-ए(आईएफएन-ए) और लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस) द्वारा सक्रिय होते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रिया, रोगजनक निकासी, कुशल फैगोसाइटोसिस, और ट्यूमरीडल प्रतिरक्षा3,4में शामिल होते हैं। M2 मैक्रोफेज ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) से निकटता से संबंधित हैं और इसमें एंटी-भड़काऊ और ट्यूमर प्रमोशन गुण4हैं।

फागोसाइटोसिस, प्राचीन ग्रीक (phagein) से व्युत्पन्न, जिसका अर्थ है "खा," (kytos), जिसका अर्थ है "सेल," और-ओसिस, जिसका अर्थ है "प्रक्रिया"5। फागोसाइटोसिस एक रिसेप्टर-मध्यस्थता प्रक्रिया है जहां फागोसाइट्स (मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल सहित) रोगजनकों पर हमला करने, विदेशी कणों को साफ करने और स्पष्ट अपोप्टिक सेल मलबे को मारते हैं और निगल जाते हैं। ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (टीएएमएस) स्तन कैंसर सहित विभिन्न ट्यूमर में स्ट्रोमा में पाए जाते हैं, और ट्यूमर प्रो-ट्यूमर कार्य6,7होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फागोसाइटोसिस का प्रतिरोध होता है। मैक्रोफेज द्वारा ट्यूमर सेल फागोसाइटोसिस का विस्तृत तंत्र अभी तक समझ में नहीं आया है।

यह अध्ययन एक दो चरण विधि प्रस्तुत करता है: 1) 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और M1-polarized मैक्रोफेज cocultured हैं, और 2) मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है । सीएफएस फ्लोरोसेंट डाया का उपयोग 4T1 माउस मैमैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं को दाग देने के लिए किया गया था। दाग लेबल 4T1 कोशिकाओं को एक ही इमेजिंग डिश के भीतर cocultured M1 मैक्रोफेज से अलग करने के लिए । रॉ 264.7 मैक्रोफेज एलपीएस और आईएफएन-ए के साथ एम 1 फेनोटाइप में ध्रुवीकृत हैं। पूर्ण ध्रुवीकरण सुनिश्चित करने के लिए, फिच के लिए संयुग्मित एंटी-आईनोस एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया। बाद में, सहसंस्कृति के भीतर फागोसाइटोसिस सहित कई घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए समय-चूक छवियों की एक बहुबिंदु श्रृंखला का अधिग्रहण किया गया था।

ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच बातचीत की बेहतर समझ संभावित कैंसर इम्यूनोथेरेपी का कारण बन सकती है। लाइव-सेल इमेजिंग वास्तविक समय की स्थापना में सेलुलर गतिशीलता का एक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है और इसका उपयोग तंत्रिका विज्ञान, विकासात्मक जीव विज्ञान और दवा खोज में सेल माइग्रेशन, फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग, एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिकिटी8,9 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि इस अध्ययन में प्रस्तावित ट्यूमर स्तन कैंसर है, विधि भी कई लक्ष्य कोशिकाओं और अलग प्रभावक कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: धारा 1−6 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और रॉ 264.7 माउस मैक्रोफेज के सहसंस्कृति मॉडल का वर्णन करती है। धारा 7 में एम 1 मैक्रोफेज फागोसाइटेड 4T1 कोशिकाओं के समय-चूक मूल्यांकन का वर्णन किया गया है।

1. 4T1 माउस मैमैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं और रॉ 264.7 माउस मैक्रोफेज की संचरित

  1. क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित 4T1 और रॉ 264.7 मार्ग 6 कोशिकाओं की एक शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में कोमल आंदोलन या कोशिका रेखाओं के लिए सामान्य वृद्धि तापमान द्वारा पिघला हुआ था।
    नोट: विगलन तेजी से किया जाना चाहिए, लगभग 2 मिनट के भीतर । संदूषण से बचने के लिए, शीशी को पानी के स्नान से हटा दें और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव करके इसे दूषित करें। विशेष रूप से मैक्रोफेज के लिए जेनेटिक बहाव से बचने के लिए कम पैसेज संख्या (यानी 20 से कम) का इस्तेमाल करें।
  2. एक 15 mL शंकुन ट्यूब में पूर्ण DMEM माध्यम के 10 मिलीग्राम में गल कोशिकाओं को पतला और एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिन के लिए ६०० x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित ।
    नोट: पूर्ण DMEM माध्यम 10% (v/v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), २०० U/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 mM एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक प्रोटोकॉल भर में प्रयोग किया जाता है ।
  3. ध्यान से मीडिया aspirate, पूर्ण माध्यम के 8 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक 25 सेमी2 ऊतक संस्कृति में स्थानांतरित फ्लास्क इलाज किया । संस्कृति दोनों 4T1 और रॉ 264.7 कोशिकाओं को पूरा DMEM माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2के साथ .
    नोट: सेल छर्रों को धीरे से फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को मारने से बचने के लिए ड्रॉप द्वारा संस्कृति फ्लास्क ड्रॉप में सेल निलंबन जोड़ें।
  4. सेल पालन की अनुमति देने के लिए पुलिया के 1 सप्ताह के बाद, फ्लास्क दैनिक निगरानी और जरूरत के अनुसार पूर्ण DMEM माध्यम के 8 mL जोड़ें ।

2. एम 1 ध्रुवीकृत रॉ 264.7 मैक्रोफेज का इम्यूनोस्टेनिंग

  1. चूंकि रॉ 264.7 कोशिकाओं की स्थिरता 70−80% तक पहुंच जाती है, संस्कृति मीडिया को त्यागदें और पीबीएस के कम से कम 2 मिलील के साथ धीरे-धीरे 2x कुल्ला करें।
    नोट: रॉ २६४.७ कोशिकाओं को बोने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोई सेल भेदभाव (यानी, dendrite की तरह phenotype और/या वृद्धि सेल आकार) हुआ है । यदि सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन दिखाई दे रहे हैं, संस्कृति को त्यागें और पहले पारित होने शीशी से एक नई सेल लाइन गल ।
  2. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं को धीरे से उखाड़ फेंककर संग्रह के लिए मैक्रोफेज तैयार करें और उन्हें 15 मीटर शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और पूर्ण DMEM माध्यम का उपयोग कर 1 x 105 कोशिकाओं/पकवान के एक सेल निलंबन तैयार करते हैं ।
  4. मैक्रोफेज के बीज 2 mL दो इमेजिंग व्यंजनों में निलंबन। कोशिकापालन की अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं 2−3 घंटे को इनक्यूबेट करें।
  5. एम1 ध्रुवीकरण मीडिया को 100 एनजी/एमएल एलपीएस और 20 एनजी/एमएल आईएफएन-ए को पूर्ण डीएमईएम मीडियम10,11में जोड़कर तैयार करें ।
  6. मैक्रोफेज से कल्चर सुपरनेटेंट को त्यागें और डिश 2x में मोनोलेयर को कम से कम 1 मिलील पीबीएस से ध्यान से धोएं।
  7. इमेजिंग व्यंजनों में से एक में एम 1 ध्रुवीकरण मीडिया के 2 mL जोड़ें, रॉ 264.7 कोशिकाओं को एम 1 मैक्रोफेज फेनोटाइप को प्रेरित करने की अनुमति दें, और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे इनक्यूबेट करें।
    नोट: डीएमईएम के साथ एक इमेजिंग डिश में बीज रॉ 264.7 मैक्रोफेज एंटी-आईनोस एंटीबॉडी धुंधला के लिए नियंत्रण के रूप में 10% एफबीएस के साथ पूरक हैं। इमेजिंग व्यंजन कच्चे (नियंत्रण) और M1 मैक्रोफेज (एलपीएस और IFN-एक ध्रुवीकृत), क्रमशः लेबल ।
  8. इम्यूनोस्टेनिंग से पहले, रॉ 264.7 और एम 1 मैक्रोफेज कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 2 mL का उपयोग करके ठीक करें और 37 डिग्री सेल्सियस (कमरे का तापमान, आरटी) पर 15 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. अधिनेता निकालें और सेल मोनोलेयर को कम से कम 3x पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें।
  10. पीबीएस में 50 एम एम अमोनियम क्लोराइड के 2 एमएल के साथ बुझाएं और आरटी में 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. आरटी में 15 मिन के लिए पीबीएस में 0.3% ट्राइटन एक्स-100 के 2 mL का उपयोग करके Permeabilize।
  12. अधिनेता निकालें और सेल मोनोलेयर को कम से कम 3x पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें।
  13. आरटी में 30 मिन के लिए पीबीएस में 10% एफबीएस के 2 mL का उपयोग कर ब्लॉक।
    नोट: इम्यूनोस्टेनिंग में अवरुद्ध कदम सेल के भीतर एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करना है।
  14. अधिनेता निकालें और सेल मोनोलेयर को कम से कम 3x पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें।
  15. पीबीएस में एंटी-आईनोस-एफआईटीसी के 2 एमएल और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 1% एफबीएस के साथ इनक्यूबेट।
    नोट: निर्माता की सिफारिशों के अनुसार उपयुक्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग कर कोशिकाओं लेबल। इस बिंदु से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ उन्हें कवर करके प्रकाश से व्यंजनों की रक्षा करें।
  16. अधिनेता निकालें और सेल मोनोलेयर को कम से कम 3x पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें।
  17. 300 एनएम 6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल (DAPI) का इनक्यूबेट 1 mL एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करके अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस में 10 मिन के लिए इमेजिंग व्यंजन में।
  18. कम से कम 3x पीबीएस के 1 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं और इमेजिंग व्यंजनों में पूर्ण डीएमईएम माध्यम का 1 mL जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं को अब फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए तैयार हैं । माइक्रोस्कोप सेटअप को चुने गए दाग (इस मामले में, फिटसी और डीएपीआई) के लिए एक उल्टे चरण और उत्तेजना फिल्टर की आवश्यकता होगी।
  19. माइक्रोस्कोप चालू करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर लोड करें। माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग डिश माउंट और कच्चे २६४.७ और M1 मैक्रोफेज का निरीक्षण करने के लिए ध्यान समायोजित करें । संचारित प्रकाश और एक्सपोजर समय को समायोजित करके चरण-विपरीत फिच और डीपीआई छवियों की उपस्थिति का अनुकूलन करें।
    नोट: जब सभी बिंदु ध्यान में हों और चैनल अनुकूलित हों तो इमेजिंग शुरू करें।
  20. चरण-विपरीत फिईसी और डीपीआई छवियों(चित्र 1)पर कब्जा करें।

3. सीडिंग 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं

  1. चूंकि 4T1 कोशिकाओं की स्थिरता 70−80% तक पहुंच जाती है, संस्कृति मीडिया को त्यागदें और पीबीएस के कम से कम 2 मिलील के साथ धीरे-धीरे 2x कुल्ला करें। कोशिकाओं को अलग करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 00 तक के लिए इनक्यूबेट करने के लिए प्रीवार्म्ड ट्राइप्सिन का 1 मिलील जोड़ें।
    नोट: माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। अलग कोशिकाओं गोल किया जाएगा।
  2. एक बार कोशिकाओं को अलग करने के बाद, उन्हें 15 मिलील शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें और ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए प्रीवार्म्ड पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 2 मिलील जोड़ें। कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कोशिका परत सतह को पाइप करके माध्यम को धीरे से तितर-बितर करें। फिर, एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. अधिनायक को हटा दें और प्रीवार्म्ड पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 10 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. ऊतक संस्कृति के साथ इलाज किए गए दो 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग व्यंजनों में से प्रत्येक में पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 2 मिलील में हीमोसाइटोमीटर और बीज 1 x 105 4T1 कोशिकाओं का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनक्यूबेटकरें।
    नोट: M1 ध्रुवीकरण मीडिया और लेबल 4T1-प्रेरक (नियंत्रण) के साथ इमेजिंग व्यंजनों में से एक में संस्कृति 4T1 कोशिकाओं । यह प्रेरकों के संपर्क में आने पर 4T1 कोशिकाओं की सामान्य वृद्धि सुनिश्चित करने के लिए है।

4. सीएफएस धुंधला का उपयोग कर 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं में रहने वाले लेबलिंग

  1. सबसे पहले, 4T1 कोशिकाओं इमेजिंग व्यंजन से मौजूदा मीडिया को हटा दें। सेल मोनोलेयर को पीबीएस के 1 एमएल के साथ कम से कम 2x धोएं।
  2. पीबीएस के 1 एमएल में सीएफएसई को कमजोर करके सीएफएसई धुंधला समाधान के 5 माइक्रोन तैयार करें। प्रत्येक इमेजिंग डिश में 5 माइक्रोन सीएफएसई धुंधला समाधान का 1 mL जोड़ें और अंधेरे में आरटी या 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इष्टतम CFSE धुंधला एकाग्रता प्राप्त करने के लिए निर्माता की सिफारिशों और प्रारंभिक प्रयोगों के अनुसार उचित CFSE काम एकाग्रता का उपयोग कर कोशिकाओं लेबल । यदि पीबीएस में सीएफएसई पतला होता है तो लेबलिंग दक्षता अधिक होगी।
  3. 10% एफबीएस और कोशिकाओं के लिए धुंधला समाधान युक्त पूर्ण DMEM माध्यम की एक समान मात्रा जोड़कर धुंधला बुझाना और अंधेरे में आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  4. सीएफएसई युक्त समाधान को त्यागें और कोशिकाओं को 1x को संस्कृति मीडिया की समान मात्रा के साथ धोएं।
    नोट: 4T1 कोशिकाओं को अब फ्लोरोसेंटी लेबल कर रहे हैं ।
  5. 5% सीओ 2 के साथ आरटी में मानक संस्कृति की स्थिति के लिए 4T1-CFSE कोशिकाओं को वापसकरें ।

5. 4T1 के साथ रॉ 264.7 माउस मैक्रोफेज और सहसंस्कृति सीडिंग

  1. रॉ 264.7 की स्थिरता 70−80% तक पहुंचने के रूप में, संस्कृति मीडिया को त्यागदें और पीबीएस के कम से कम 2 मिलील के साथ धीरे से 2x कुल्ला करें।
  2. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं को धीरे से उखाड़ फेंककर संग्रह के लिए मैक्रोफेज तैयार करें और उन्हें 15 मीटर शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और सीडिंग घनत्व के अनुसार एक पूर्ण DMEM माध्यम के साथ शेष समाधान कमजोर करके 1 x 105 कोशिकाओं/mL के एक सेल निलंबन तैयार करते हैं ।
    नोट: सहसंस्कृतियों में अत्यधिक अनुकूल कोशिकाओं को गंभीर रूप से phagocytosis कम कर सकते हैं । इस अध्ययन में, मैक्रोफेज का सीडिंग अनुपात: कैंसर कोशिकाओं को 1:1 अनुपात में समायोजित किया गया था। अनुपात ट्यूमर कोशिकाओं की आक्रामकता और मैक्रोफेज की उत्पत्ति के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  4. coculturing से पहले, 4T1 कोशिकाओं से संस्कृति supernatant त्यागें (चरण ४.५) और ध्यान से PBS के कम से कम 1 mL के साथ मोनोलेयर 2x धोने ।
  5. बीज 1 x 105 रॉ 264.7 कोशिकाओं को 4T1 इमेजिंग व्यंजनों में से एक में पूरा DMEM माध्यम के 2 mL प्रति 2. कोशिकापालन की अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं 2−3 घंटे को इनक्यूबेट करें। इमेजिंग डिश 4T1-M1 सहसंस्कृति लेबल।
    नोट: 4T1 (नियंत्रण) कोशिकाओं मैक्रोफेज के साथ cocultured नहीं थे ।

6. रॉ 264.7 मैक्रोफेज का एम1 ध्रुवीकरण

  1. एम1 ध्रुवीकरण मीडिया को 100 एनजी/एमएल एलपीएस और 20 एनजी/एमएल आईएफएन-10% (v/v) एफबीएस10,11के साथ पूरक पूर्ण DMEM माध्यम में जोड़कर एम1 ध्रुवीकरण मीडिया तैयार करें ।
  2. (चरण 5.5) से पहले इनक्यूबेटेड मैक्रोफेज से संस्कृति को छोड़दें और ध्यान से पीबीएस के कम से कम 1 मिलील के साथ डिश 2x में मोनोलेयर धोएं।
  3. फिर, इमेजिंग डिश में एम 1 ध्रुवीकरण मीडिया के 2 mL जोड़ें और रॉ 264.7 कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके एम1 मैक्रोफेज फेनोटाइप में प्रेरित करने की अनुमति दें।
    नोट: एम 1 मैक्रोफेज कोशिकाओं को पूर्ण ध्रुवीकरण प्राप्त करने के लिए ऊष्मायन के 2−3 घंटे तक ले जा सकते हैं। मैक्रोफेज के पूर्ण ध्रुवीकरण की अनुमति देने के लिए उपयुक्त ऊष्मायन अवधि सुनिश्चित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग किए जाने की आवश्यकता है ।

7. फागोसाइटोसिस की लाइव-सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी

नोट: छवि एक्सपोजर का अनुकूलन, समय मापन और स्वचालित फोकस सुधार सहित एक उत्पादक वीडियो प्राप्त करने के लिए लाइव-सेल इमेजिंग करते समय कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता होती है।

  1. प्रयोग से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोस्टेट चालू करके सेल कल्चर इनक्यूबेटर स्थापित करें और 5% सीओ2की आपूर्ति करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप सेटअप एक उल्टे मंच, एक मंच शीर्ष इनक्यूबेटर, आर्द्रता नियंत्रण (९५%), और गैस ऊष्मायन प्रणाली की आवश्यकता है । यह सेटअप दीर्घकालिक लाइव-सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. पीजो स्टेज सहित माइक्रोस्कोप चालू करें और माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर लोड करें।
  3. चरण के केंद्र में 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग डिश में वरीयता प्राप्त सहसंस्कृति कोशिकाओं को स्थिति और शीर्ष कक्ष पर धीरे-धीरे पेंच। इमेजड करने के लिए स्थिति का चयन करके मंच को मोटराइज़ करने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग करें।
  4. नमूने को देखने के लिए, बुर्ज पर चरण-विपरीत फिल्टर का चयन करें। शुरू में नमूना देखने के बाद, उपयुक्त क्षेत्रों का पता लगाएं और नमूना को ध्यान में लाएं।
    नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर पूरी तरह से स्वचालित उद्देश्य चयन, परफेक्ट फोकस सिस्टम, टाइम-लैप्स श्रृंखला, मल्टीचैनल छवि अधिग्रहण और मल्टीपॉइंट छवि अधिग्रहण के उपयोग की अनुमति देता है।
  5. सीएफएसई लेबलिंग और अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट अधिग्रहण के लिए मल्टीचैनल फ्लोरेसेंस स्थापित करने के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर अधिग्रहण संवाद बॉक्स खोलें और [लैम्ब्डा] टैब चेकबॉक्स(चित्रा 2)का चयन करें।
    नोट: 13 घंटे का समय-चूक इमेजिंग के लिए, एक चरण-विपरीत चैनल का उपयोग किया जाना चाहिए।
  6. चुनें [लैम्ब्डा] टैब । [ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन] और हरे फ्लोरेसेंस फिल्टर चेकबॉक्स के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत और [जीएफपी-आर] के लिए [10X डीआईसी] का चयन करें। [लैम्ब्डा] के तहत । [फोकस] कॉलम, फोकस संदर्भ के रूप में सेट करने के लिए [10X डीआईसी] चेकबॉक्स का चयन करें।
  7. इमेजिंग सॉफ्टवेयर अधिग्रहण संवाद बॉक्स खोलें और [XYZ समय ...] बटन पर क्लिक करें और [XY] टैब का चयन करें।
  8. लाइव इमेज की जांच करते समय मोटराइज्ड स्टेज पर जॉयस्टिक का इस्तेमाल करते हुए इमेज एक्विजिशन पॉइंट पर जाएं या आईपीस के जरिए अलग स्थिति का चयन करें । फिर इमेज कैप्चर के लिए प्रत्येक स्थान में प्रत्येक बिंदु को सेट करने के लिए [पॉइंट नेम] कॉलम के तहत चेकबॉक्स पर क्लिक करें (चित्रा 3देखें)।
    नोट: स्वचालित चरण कई क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए विभिन्न XY निर्देशांक के मल्टीपॉइंट छवि अधिग्रहण की अनुमति देता है।
  9. स्क्रीन पर देखे गए प्रत्येक नमूने के लिए फोकस को ठीक-ठाक करें। ऑटो फोकस सुधारपर नियंत्रण का उपयोग करें ।
  10. समय-चूक छवि कैप्चर स्थापित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर अधिग्रहण संवाद बॉक्स में, [समय] टैब की जांच करें (चित्रा 4देखें) ।
  11. [अंतराल] (एक समय बिंदु की शुरुआत के बीच देरी को दूसरे समय बिंदु तक) और [अवधि] (प्रयोग के समय की कुल लंबाई) निर्धारित करें। समय की इकाइयां बदलती हैं और ड्रॉपडाउन मेनू से मिलीसेकंड (एमएस), सेकंड (एस), मिनट (एम), या घंटे (एच) में चुनी जा सकती हैं।
    नोट: फ्लोरेसेंस और डीआईसी समय-चूक मल्टीचैनल अधिग्रहण की समय-चूक इमेजिंग के लिए इमेजिंग अवधि की लंबाई इस परख में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंग के आधार पर भिन्न हो सकती है। यदि लेबल की कोशिकाएं बहुत लंबे समय तक उजागर होती हैं तो फोटोब्लीचिंग हो सकती है।
  12. अधिग्रहीत छवियों को बचाने के लिए [सेव टू फाइल] चेकबॉक्स देखें। [समय अनुसूची] टैब के तहत मल्टीपॉइंट टाइम-सीरीज छवियों को प्राप्त करने के लिए [अब भागो] बटन पर क्लिक करें (चित्रा 5देखें)।
    नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, छवियों को nd2 फ़ाइल प्रारूप में सहेजा जाता है। प्रत्येक बार-चूक को बाद में एमपी 4 फ़ाइल प्रारूप में व्यक्तिगत रूप से सहेजा जा सकता है।

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Representative Results

4T1 माउस मैममैरी कार्सिनोमा सेल लाइनों के सहसंस्कृति मॉडल की समय-चूक दो आयामी (2डी) छवियां 13 घंटे की अवधि के दौरान एम 1 मैक्रोफेज द्वारा घिरा हुआ 4T1 कोशिकाओं को दिखाती हैं। इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन करके एम1 मैक्रोफेज का पूर्ण ध्रुवीकरण सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। परिणाम(चित्रा 1)से पता चलता है कि एम 1 राज्य में १०० एनजी/mL लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस) और 20 एनजी/एमएल आईएफएन-ध्रुवीकृत रॉ २६४.७ मैक्रोफेज की एकाग्रता । फ्लोरोसेंट रंगे के साथ लक्षित कोशिकाओं को लेबल करना और प्रभावक कोशिकाओं को अनदाग छोड़ना एक लाइव-सेल सहसंस्कृति मॉडल(मूवी 1)के लिए अनुमति देता है। 13 एच और 15 मिन अंतराल के दौरान, 4T1 कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति में M1 मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि(मूवी 2)प्रलेखित की गई थी। छह मल्टीपॉइंट वीडियो (मूवी 2मेंए−एफ) को एक 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग डिश के भीतर कई घटनाओं का आकलन करने के लिए रिकॉर्ड किया गया था। मूवी 3 M1 मैक्रोफेज द्वारा phagocytosed 4T1 कोशिकाओं से पता चलता है । मूवी 4 को इस प्रयोग से फिल्माए गए एक इन-डेप्थ वीडियो के उदाहरण के रूप में चुना गया था और मूवी 5 एम 1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 कोशिकाओं के तेज को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिरक्षण विरोधी iNOS-हरे रंग में फ़ीच के साथ धुंधला, नीले रंग में नाभिक मार्कर DAPI, और विलय छवियों के बढ़ाया संस्करण । ये पैनल रॉ 264.7 मैक्रोफेज (नियंत्रण) और एम 1 मैक्रोफेज (एलपीएस और आईएफएन-उत्तेजित) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो हरे रंग में एंटी-आईनोस-फिटेक (एम1 मार्कर) के साथ इम्यूनोदाग और नीले रंग में न्यूक्लिकी मार्कर, डीपीआई के साथ प्रतिदागित हैं। (A)डीपीआई दाग रॉ 264.7 और एम 1 मैक्रोफेज दोनों देखा जा सकता है। (ख)एंटी-आईनोस-फिईसी (ग्रीन) केवल M1 मैक्रोफेज पर फ्लोरेस । (ग)डीपीआई दाग और एंटी-आईनोस-फिईसी की छवियों का विलय। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग सॉफ्टवेयर अधिग्रहण संवाद नियंत्रण में फ्लोरेसेंस और डीआईसी छवि अधिग्रहण की स्थापना। [1] [लैम्ब्डा] टैब चेकबॉक्स का चयन करें, [2] चुनें [ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन] और ग्रीन फ्लोरेसेंस फिल्टर चेकबॉक्स के लिए [10X डीआईसी] और [जीएफपी-आर] का चयन करें, [3] [10X डीआईसी] का चयन करें । [इस चैनल को फोकस संदर्भ के रूप में सेट करें]। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इमेजिंग सॉफ्टवेयर अधिग्रहण संवाद नियंत्रण में मल्टीपॉइंट छवि अधिग्रहण की स्थापना। [4] इमेज कैप्चर के लिए प्रत्येक बिंदु सेट करने के लिए [पॉइंट नेम] कॉलम के तहत चेकबॉक्स का चयन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: समय-चूक माप छवि कैप्चर के लिए अंतराल और अवधि निर्धारित करना। इमेजिंग सॉफ्टवेयर अधिग्रहण संवाद नियंत्रण समय चूक छवि कब्जा स्थापित करने के लिए। समय-चूक छवि अधिग्रहण [6] [समय] टैब पर जांच करने के लिए, [7] [अंतराल] (सेकंड, मिन, या घंटे से) और [8] [अवधि] (सेकंड, मिन या घंटे से) निर्धारित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: समय चूक माप छवि कैप्चर के लिए मल्टीपॉइंट मूवी पैनल स्थापित करना। सहसंस्कृति के 13 घंटे के पूरा होने के बाद संयुक्त छह मल्टीपॉइंट फिल्मों पैनलों का पूर्वावलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
मूवी 1: फ्लोरोसेंट और डीआईसी माइक्रोस्कोपी के मल्टीचैनल अधिग्रहण का उपयोग करके सहसंस्कृति में अनस्ड एम 1 मैक्रोफेज और 4T1 CFSE-दाग माउस मैममैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि फिल्म। 4T1 माउस मैममैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं की हरी लेबल वाली सेल दीवार में सीएफएसई को प्रदर्शित करने वाले परिणाम अनदाग M1 मैक्रोफेज के साथ सहसंस्कृत । मल्टीचैनल अधिग्रहण (चरण 7.3, देखें चित्र 2)का उपयोग करके 15 मिन समय अंतराल के साथ 13 घंटे की सहसंस्कृति अवधि के लिए समय-चूक छवियों का अधिग्रहण किया गया था। (A)अंतर हस्तक्षेप विपरीत, (लाल सर्कल) 4T1 कोशिकाओं का पालन करने वाले छोटे, गोल एम 1 मैक्रोफेज दिखाता है, जिसमें एक एपिथेलियल आकृति विज्ञान होता है। (ख)मैक्रोफेज द्वारा फागोसाइटोसिस से पहले सीएफएसई से सना हुआ 4T1 कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवि । (C)सीएफएसई-दाग 4T1 कोशिकाओं की डीआईसी और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों को अनदाग एम 1 मैक्रोफेज से घिरा हुआ मिला । नीले तीर अरंजित M1 मैक्रोफेज फ्लोरोस्किंग हरे रंग के रूप में वे CFSE लेबल 4T1 कोशिकाओं निगल दिखाते हैं । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Movie 2
मूवी 2: लाइव-सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी फिल्में एक ही इमेजिंग डिश में कई स्टेज पॉइंट्स से प्रेरित M1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 माउस मैममैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं के phagocytosis दिखा । परिणाम छह अलग-अलग बिंदुओं(मूवी 2A−F)इमेजिंग सॉफ्टवेयर (चरण 7.4, देखें चित्रा 3−चित्रा 5)का उपयोग करके छह अलग-अलग बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। M1 मैक्रोफेज में एक असुरक्षित साइटोप्लाज्म के साथ एक अनियमित, पैनकेक जैसी आकृति विज्ञान होता है, जबकि 4T1 माउस मैमैरी कार्सिनोमा में एक एपिथेलियल मॉर्फोलॉजी होती है। लाइव-सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए मनाए जाने से पहले 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टेज इनक्यूबेटर के अंदर 13 घंटे के लिए एम 1 मैक्रोफेज और 4T1 कोशिकाओं को सहसंस्कारी किया गया था। छवियों को 13 घंटे स्केल बार = 50 माइक्रोन के लिए 15 मिन के अंतराल पर कैप्चर किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Movie 3
मूवी 3: लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी फिल्म एक ही समन्वय बिंदु की(मूवी 2 देखें)विस्तार से प्रेरित M1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 माउस मैमरी कार्सिनोमास के phagocytosis दिखाने के लिए चुना । लाल तीर फागोसाइटोसिस दिखाता है। पीला सर्कल से पता चलता है कि 4T1 कोशिकाओं की संख्या है कि 4T1 कोशिकाओं की छाई बुझा । स्केल बार = 10 माइक्रोन इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Movie 4
मूवी 4: एम 1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 कोशिकाओं की फागोसाइटोसिस प्रक्रिया को और अधिक कल्पना करने के लिए एक विस्तृत वीडियो। यह पैनल एक छिद्रपूर्ण साइटोप्लाज्म फेनोटाइप के साथ लाइव एम 1 मैक्रोफेज कोशिकाओं को दिखाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Movie 5
मूवी 5: सेल-टू-सेल संपर्क स्थापित करने के लिए 4T1 कोशिकाओं की ओर बढ़ रहे मैक्रोफेज, इसके बाद M1 मैक्रोफेज द्वारा 4T1 कोशिकाओं का तेज(मूवी 2ए देखें)। चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी समय-चूक वीडियो को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक चरण शीर्ष इनक्यूबेटर के अंदर 13 घंटे के सहसंस्कृति के लिए 15 मिन समय अंतराल में चित्रित किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल के लिए दो चरणों की आवश्यकता होती है: 1) 4T1 माउस स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और एम 1-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज की सहसंस्कृति, और 2) समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मैक्रोफेज फागोसाइटिक गतिविधि का आकलन। लाइव सेल सहसंस्कृति का उपयोग फेगोसाइटोसिस और माइग्रेशन परख में व्यापक रूप से किया जाता है। यहां लाइव सेल कोकल्चर मॉडल एक सरल, अनुकूलनीय इन विट्रो प्रक्रिया(चित्रा 2)है जो फ्लोरोसेंट डाया, सीएफएसई का उपयोग करता है, जिसका उपयोग 4T1 लक्षित कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग लाइव-सेल इमेजिंग के दौरान सेल प्रकारों की उचित ट्रैकिंग के लिए किया जाता है। सहसंस्कृति के 13 एच से पहले मल्टीपॉइंट टाइम-लैप्स 2डी इमेजिंग का उपयोग करके एम 1 मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए समय-चूक लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग किया गया था।

लाइव सेल कोकल्चर मॉडल की स्थापना 4T1 माउस मैममैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं और एम 1 माउस मैक्रोफेज का उपयोग करके की गई थी। कोशिकाओं को एक-दूसरे से अलग करने के लिए, सीएफएसई फ्लोरोसेंट डाया (सेक्शन 4 देखें) का उपयोग करके 4T1 कोशिकाओं को दाग दिया गया था। CFSE कोशिकाओं और निगरानी सेल डिवीजन पर नज़र रखने के लिए अनुमति देता है । सीएफएसई निष्क्रिय रूप से कोशिकाओं में फैलाना कर सकता है, जिससे सीएफएसई लक्षित कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस की कल्पना करने के लिए एक उपयुक्त सेल ट्रैकर धुंधला कर सकता है। जैसे-जैसे थैलोसीटिक मैक्रोफेज कैंसर कोशिकाओं को पचाते हैं और निगल जाते हैं, वे सीएफएसई डाइ लेते हैं और अंततः फ्लोरोसेंट12,13बन जाते हैं। एम1 मैक्रोफेज से पहले इमेजिंग डिश में 4T1 कोशिकाओं को बीज करना आवश्यक है। यह दोनों कोशिकाओं के विभिन्न आकारों और आकारों के कारण है। 4T1 कोशिकाओं में एक एपिथेलियल आकृति विज्ञान होता है जो छोटे समूहों में पैदा होता है। इसके अलावा, 4T1 कोशिकाओं को अनदाग M1 मैक्रोफेज के साथ सहसंस्कृति से पहले CFSE के साथ दाग दिया जाना चाहिए । एलपीएस और आईएफएन-ए-का उपयोग करके मैक्रोफेज ध्रुवीकरण से पहले, मूत्र मैक्रोफेज रॉ 264.7 गोल, छोटे हैं, और आमतौर पर एकल कोशिकाओं के रूप में बढ़ते हैं। एलपीएस और आईएफएन-ए-ध्रुवीकरण के बाद, प्रेरित एम 1 मैक्रोफेज में एक अपेक्षाकृत चपटा, पैनकेक जैसा आकार होता है, जिसमें एक असुरक्षित साइटोप्लाज्म14,15होता है। एम 1 राज्य की ओर रॉ २६४.७ का उचित ध्रुवीकरण सुनिश्चित करने के लिए, १०० एनजी/एमएल एलपीएस और 20 एनजी/mL IFN-" उत्तेजित मैक्रोफेज एक M1 मार्कर के साथ इम्यूनोदाग, एंटी-आईएनओएस एंटीबॉडी को फिटेक(चित्रा 1)के साथ इम्यूनोदाग किया गया । यह प्रोटोकॉल मैक्रोफेज और लक्षित कोशिकाओं को सहरूपित करने से पहले किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मैक्रोफेज पूरी तरह से एम 1 राज्य में ध्रुवीकृत हैं।

यह अध्ययन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि जीवित मैक्रोफेज की फागोसाइटिक गतिविधि की कल्पना की जा सके। फोटोब्लीचिंग को कम करने और बेहतर फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रदान करने के लिए, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को अन्य इमेजिंग तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है जो डीआईसी के समान फ्लोरोक्रोम के लिए गैर-विनाशकारी हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में एलपीएस और आईएफएन-एक्सउत्तेजित मैक्रोफेज द्वारा फ्लोरोसेंट और डीआईसी समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माउस मैममैरी कार्सिनोमा कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस के आकलन के लिए आवश्यक सामग्री और तरीकों का वर्णन किया गया है। बहरहाल, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी अध्ययन की सीमाएं होती हैं जब चरण-विपरीत समय-चूक इमेजिंग की तुलना में लाइव-सेल इमेजिंग का अध्ययन किया जाता है। फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग के दौरान, उत्तेजना प्रकाश की एक उच्च राशि के लिए लंबे समय तक जोखिम गंभीर सेल क्षति16प्रेरित कर सकते हैं । फोटोब्लीचिंग लाइव-सेल इमेजिंग में महत्वपूर्ण समस्याएं पैदा कर सकती है। लाइव-सेल इमेजिंग में उपयोग की जाने वाली उच्च तीव्रता वाली रोशनी सीएफएएसई की मात्रा को फ्लोरेस करने की क्षमता को कम कर सकती है। फिर भी, चरण-विपरीत समय-चूक 2डी इमेजिंग(सिनेमा 2-5)का उपयोग करके इस अध्ययन के दूसरे भाग में 13 एच फागोसाइटोसिस मूल्यांकन प्राप्त किया गया था।

टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी वांछित अवधि अवधि के दौरान किसी भी समय बिंदु पर एक ही प्रयोग से डेटा की उत्पादन जैसे लाभ प्रदान करती है और गौरतलब है कि एक ही इमेजिंग डिश के भीतर कई चरण बिंदुओं को एक ही प्रयोग के लिए कैप्चर किया जा सकता है। यह एक ही प्रयोग में विभिन्न पदों के अवलोकन की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल का उपयोग संस्कृति प्लेटों (जैसे, 6, 24, 96 अच्छी प्लेटों) से कई कुओं का उपयोग करके भी किया जा सकता है। सफल लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों में 37 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता का 95% और 5% सीओ2का स्थिर तापमान प्रदान करने के लिए एक चरण शीर्ष इनक्यूबेटर का उपयोग करके कोशिकाओं को स्वस्थ स्थिति में बनाए रखना शामिल है। क्योंकि प्रयोग 13 घंटे ले लिया, यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोस्कोप आम तौर पर कार्य करता है महत्वपूर्ण था ।

इस अध्ययन के दौरान, इमेजिंग डिश में छह अलग-अलग बिंदुओं को 13 घंटे की अवधि में 15 मिनट के अंतराल के लिए प्रति बिंदु(मूवी 2)के लिए कैप्चर किया गया था। जांच के तहत सेल की घटना के आधार पर बिंदुओं को समायोजित किया जा सकता है। इस प्रयोग में कैप्चर किए जाने के लिए कई चरण बिंदु हैं, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लाइव-सेल वीडियो रिकॉर्डिंग करने से पहले प्रत्येक बिंदु पर स्थिर ध्यान दिया जाए। जांच के लिए समय अंतराल अनुकूलित किया जाना चाहिए । एक कम समय अंतराल में अधिक विस्तृत अंक होंगे जिन्हें चित्रित किया जा सकता है; हालांकि फाइल का साइज काफी बड़ा होगा। समय अंतराल बढ़ाने से एक लंबा वीडियो होगा और फिल्म निरंतरता खो देगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आर्थिक रूप से गेरन पुत्र Berimpak (GBP), विश्वविद्यालयों पुत्र मलेशिया: ९५४२८०० द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम कृषि जैव प्रौद्योगिकी संस्थान, मलेशिया (एबीआई) प्रयोगशालाओं, और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । संपादन और इस काम के लिए प्रयोगात्मक वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ मदद के लिए मोहम्मद डैनियल Hazim के लिए विशेष धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-INOS antibody conjugated FITC Miltenyi Biotec REA982 150 µg in 1 mL
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Invitrogen C1157 25 mg
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 10 mg
DMEM/high glucose HyClone SH30003.04 670.0 g
Fetal bovine serum Tico Europe FBSEU500 500 mL
Lipopolysaccharides Sigma L4516-1MG 1 mg
Mouse recombinant interferon-gamma Stemcell Technologies 78021 100 µg
Penicillin-streptomycin solution Cellgro 30-003-CI 100 mL
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Trypsin EDTA Cellgro 25-052-CI 1X, 100 mL
1000 µL pipette tips WhiteBox WB-301-01-052 5000 tips/case
2 mL serological pipette JET BIOFIL GSP012002 Non-pryogenic
200 µL pipette tips WhiteBox WB-301-02-302 20,000 tps/case
25 cm2 cell culture flask Corning CLS430639 Tissue culture treated
Bench top centrifuge Dynamica FA15C Model: Velocity 14R
Biological safety fume hood Nuaire NU-565-400 Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood
CO2/air mixer Chamlide (Live Cell Instrument) FC-R-20 FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter
Cell scrapper NEST 710001 220 mm
CO2 cell incubator Panasonic N/A Model: MCO-19M(UV)
Confocal microscope Nikon Instruments Inc. N/A Nikon Ti-Eclipse
Glass bottom dish Ibidi 81218-200 35 mm
NIS elements software Nikon Instruments Inc. Available online download
Pipette controller CappAid PA-100 CappController pipette controller, 0.1-100ml
Thermostat Shinko Discontinued JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm

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References

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Zaidi, N. E., Shazali, N. A. H.,… More

Zaidi, N. E., Shazali, N. A. H., Chor, A. L. T., Osman, M. A., Ibrahim, K., Jaoi-Edward, M., Afizan Nik Abd Rahman, N. M. Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures. J. Vis. Exp. (154), e60281, doi:10.3791/60281 (2019).

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