Summary
מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (>90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.
Abstract
מחלת כליות משפיעה על יותר מ -10% מהאוכלוסייה העולמית ועולה מיליארדי דולרים בהוצאות פדרליות. הצורות החמורות ביותר של מחלת כליות ואי ספיקת כליות סופנית בסופו של דבר נגרמות לעתים קרובות על ידי הנזק לפודוציטים גלומרולריים, שהם תאי האפיתל המיוחדים ביותר המתפקדים יחד עם תאי אנדותל וקרום המרתף הגלומרולרי כדי ליצור את מחסום הסינון של הכליה. ההתקדמות ברפואה הכליתית הופרעה על ידי הזמינות המוגבלת של רקמות ראשוניות והיעדר שיטות חזקות להפקת תאי כליות אנושיים פונקציונליים, כגון פודוקיטים. היכולת להפיק פודוקיטים ממקורות מתחדשים, כגון תאי גזע, יכולה לסייע בקידום ההבנה הנוכחית של מנגנוני התפתחות הכליות והמחלות האנושיות, וכן לספק כלים חדשים לגילוי טיפולי. מטרת פרוטוקול זה הייתה לפתח שיטה להפקת פודוקיטים בוגרים, פוסט-מיטוטיים מתאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם עם יעילות וספציפיות גבוהות, ובתנאים מוגדרים כימית. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המיוצרים בשיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין (כולל נפרין, פודוקין וגידול 1 של וילם) ומציגים את המאפיינים המורפולוגיים המיוחדים (כולל תהליכי כף הרגל הראשוניים והמשניים) הקשורים לפודוציטים בוגרים ופונקציונליים. באופן מסקרן, תכונות מיוחדות אלה נעדרות באופן בולט בקו התא הפודוקיט המונצח הנמצא בשימוש נרחב בתחום, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המתואר כאן מייצר פודוקיטים של כליות אנושיות שיש להן פנוטיפ בוגר יותר מבחינה התפתחותית מאשר קווי התאים הפודוקיטים הקיימים המשמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה של כליות אנושיות.
Introduction
ההתקדמות בתרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים צפויה לחולל מהפכה ברפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וסינון תרופות על ידי מתן מקור מתחדש ומדרגי של חומר ביולוגי שניתן להנדס כדי להשיג כמעט כל סוג תא בגוףהאדם 1. אסטרטגיה זו שימושית במיוחד להפקת סוגי תאים מיוחדים ופונקציונליים שאחרת היה קשה להשיג. תאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם2,3,4,5 הם אטרקטיביים במיוחד בשל מוצא התא הסומטי שלהם ואת הפוטנציאל שהם מייצגים לרפואה מותאמת אישית. עם זאת, פיתוח שיטות לגזור שושלות תאים אחרות מתאי hiPS נשאר מאתגר בשל השימוש התכוף בתנאי תרבות מוגדרים בצורה גרועה אשר מוביל ליעילות נמוכה ודור לא ספציפי של אוכלוסיות תאים הטרוגניים6,7.
מוצג כאן היא שיטה לגירוש של podocytes כליות בוגרות מתאי hiPS עם ספציפיות ויעילות גבוהה בתנאים מוגדרים כימית. על ידי בחינת התפקידים של גורמים מרובים בתוך microenvironment התא, אסטרטגיית בידול תאי גזע פותחה כי מעורבים אופטימיזציה של גורמים מסיסים המוצגים במדיום תרבית התא, כמו גם גורמים בלתי מסיסים, כגון רכיבי מטריצה חוץ תאית או מצעים דבק. בהתחשב בחשיבות האיתות האינקגרי בהתפתחות ובתפקוד של הפודוקיטה, הביטוי של קולטנים integrin על פני התא נבדק בתחילה. β1 integrins באו לידי ביטוי מאוד לא רק בתאי hiPS, אלא גם בנגזרותיהם כולל mesoderm ותאי mesoderm ביניים8,9,10. ניסויים הבאים אישרו כי ליגנדים שנקשרים לאינטגרינים β1 (כולל למינין 511 או למינין 511-E8) תומכים בהידבקות ובידול של תאי hiPS לפודוציטים כאשר נעשה בהם שימוש בשילוב עם המדיה האינדוקטיבית המסיסה המתוארת להלן.
אינדוקציה של מחויבות שושלת התאים יזמה על ידי אישור תחילה כי תאי hiPS בתרבית על המשטחים מצופים למינין במשך יומיים בנוכחות מדיום המכיל Activin A, CHIR99021, ומעכב סלע Y27632 יכול להבדיל לתאים המבטאים את סמני mesoderm מוקדם HAND1, עור ברווז, brachyury8,11. טיפול בתאי mesoderm במשך 14 ימים עם מדיום בתוספת חלבון מורפוגנטי עצם 7 (BMP-7) ו CHIR99021 אפשר את הנגזרת של תאי mesoderm ביניים שביטא את סמני תא נפרון-אבות גידול 1 (WT1), חלבון קשור דילוג מוזר 1 (OSR1)8,11, ואת הגן תיבת מזווג 2 חלבון (PAX2)12. כדי להפיק את הפודוקיטים הגלומרולריים הבוגרים של הכליות, תאי המסודרם הבינוניים טופלו במשך 4-5 ימים במדיום חדשני המורכב מ- BMP-7, Activin A, גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), חומצה ריטינואיתטרנסית ו- CHIR99021. ציטומטריית זרימה וחיסון שימשו כדי לאשר כי >90% מהתאים המתקבלים הציגו את המאפיינים המולקולריים, המורפולוגיים והתפקודיים של פודוקייט הכליות הבוגר8,11,13. מאפיינים אלה כוללים התפתחות של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל; הביטוי של גנים ספציפיים לשושלת שושלת פודוקיטים כולל SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 וביטוי של חלבונים כולל פודוקין, נפרין, ו WT114,15,16. בנוסף, נמצא כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS ניתן לשמור בתרבות עד ארבעה שבועות במבחנה באמצעות בינוני זמין מסחרית 8,11 אשר מספקגמישותנוספת בתזמון של ניסויים במורד הזרם. לקבלת מידע נוסף לגבי לוחות ציטומטריית הזרימה המשמשים לקביעת טוהר ה- hiPS-podocytes, עיין בפרסום הקודם שלנו11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
- לדלל 5x hiPS תרבית תאים מדיה (CCM) תוספת במדיום בזלת תרבית התא hiPS כדי להשיג פתרון 1x של hiPS CCM.
הערה: תוספת CCM קפואה של 5x hiPS דורשת תהליך הפשרה איטי, באופן אידיאלי ב-4 °C (70°F) למשך הלילה. Aliquots של 1x hiPS CCM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 °C (70 °F). - הכנת מטריצת קרום המרתף (BM) 1 מצופה צלחות עבור תרבית התא hiPS: מטריצת BM להפשיר 1 לילה על קרח ב 4 °C (70 °F). לאחר הפשרה, להכין aliquots עם גורמי דילול מתאימים כפי שהוצע על ידי היצרן.
הערה: בדרך כלל, aliquots מוכנים לדילול הבא ב 25 מ"ל של DMEM קר / F12 בצינור חרוט 50 מ"ל ואחריו ערבוב יסודי כדי להמיס לחלוטין את מטריצת BM 1 ולהימנע היווצרות של גבישים שיורית. - העבר 1 מ"ל של פתרון מטריצת BM 1 לכל באר של צלחת 6 טוב ודגרה ב 37 °C (1-2 שעות) או ב 4 °C (55 °F) לכל הפחות של 24 שעות, עטוף בסרט פרפין. מטריצת BM 1 -מצופה לוחות ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד 2 שבועות.
- הכנת מטריצת קרום מרתף (BM) 2 - לוחות מצופים: לדלל כמויות מתאימות של מטריצת BM 2 במים מזוקקים סטריליים 9 מ"ל כדי להכין ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף 700 μL של פתרון מטריצת BM 2 לכל באר של צלחת 12 היטב ולדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות או לילה ב 4 °C (7 °F).
- הכן 100 פתרונות מלאי מיקרוגרם / mL כל BMP7, Activin A, ו VEGF כדלקמן: reconstitute BMP7 במים מזוקקים סטריליים המכילים 0.1% (wt/ vol) BSA ו Activin A ו- VEGF משוחזר בנפרד PBS סטרילי המכיל 0.1% (wt / vol) BSA. כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה תכופים, להכין 100 aliquots μL מכל פתרון מלאי ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
- הכן פתרון מלאי 10 mM של Y27632 על ידי המסת 10 מ"ג של Y27632 ב 3.079 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. Aliquot 100 μL מהמלאי ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
- להמיס 2 מ"ג של CHIR99021 ב 143.4 μL של DMSO סטרילי כדי להכין פתרון מלאי 30 mM. הכן 5 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (5 °F) עד חודש אחד (או על פי המלצת היצרן).
- יש להמיס 10 מ"ג של חומצהרטינואית טרנסית ב-DMSO סטרילי 3.33 מ"ל. הכן 500 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
2. הכנת מדיה תרבותית
- הכן את מדיום בידול mesoderm על ידי שחזור פתרונות מלאי מתאימים לריכוז סופי של 100 ng / mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632, 1x B27 ללא סרום תוספת בנפח מתאים של DMEM/12 עם תוסף גלוטמין.
הערה: מדיום בידול mesoderm צריך להיות מוכן טרי לפני צעדי בידול ובנפח המתאים בקנה המידה של הניסוי (בדרך כלל, 50 מ"ל של בינוני מתאים עבור שתי 12 לוחות היטב). - הכן בינוני בידול מסודרם ביניים על ידי שחזור פתרונות מלאי מתאימים לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל BMP7, 3 μM CHIR99021 ותוספת 1x B27 ללא סרום ב- DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין.
הערה: במידת הצורך, ניתן להשלים את המדיום עם 1% (vol/vol) פניצילין-סטרפטומיצין. כוונן את עוצמת המדיום באמצעות DMEM/F12 עם תוספת גלוטמין. מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות; עם זאת, מומלץ לאחסן aliquots קטן יותר (למשל, 45 מ"ל ב 50 mL צינורות חרוט) כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה חוזרים ונשנים. מדיה זו יכולה להיות מאוחסנת ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים וניתן להפשיר אותה ב 4 °C (55 °F) לילה לפני השימוש. - הכן את מדיום האינדוקציה podocyte על ידי reconstiting לריכוז הסופי 100 ng / mL BMP7, 100 ng / mL activin A, 50 ng / mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 ללא סרום תוספת, ו 0.1 μM כל טרנס חומצה רטינואית DMEM / F12 עם תוספת גלוטמין. להגן על בינוני מפני אור (למשל, על ידי עטיפה מיכל עם נייר כסף).
הערה: מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות ומאוחסנים בחושך ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים. עליקוט קפוא יש להפשיר לילה בשעה 4 °C (70 °F) לפני השימוש. - הכן 25 מ"ל של פתרון נטרול טריפסין על-ידי הוספת 10% (vol/vol) חום מומת FBS ב- DMEM / F12 ומסנן בתנאים סטריליים.
- לתחזוקה לאחר בידול של פודוקיטים שמקורם בתאי גזע, הכינו את Complete Medium עם מדיית התחזוקה של הפודוקיטים על ידי הוספת התוספת למדיום הבזל לפי הנחיות היצרן, ואחסנו ב-4 °C (7°F) למשך עד שבועיים.
3. תרבית תאי HIPS ללא מאכיל באמצעות מדיום תרבית תאים hiPS
- שאפו את התמיסה השיורית של מטריצת BM 1 מהצלחות המצולפות מראש ושטפו את הבארות 3 פעמים עם 1 עד 2 מ"ל של DMEM / F12 מחומם.
- שאיפה בילה hiPS CCM מתאי hiPS ולשטוף את התאים 3 פעמים עם DMEM / F12 מחומם. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים חמים ודגרה במשך 1 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי לעזור לנתק את התאים. בצע בדיקה חזותית של תאים תחת מיקרוסקופ תרבית רקמות וודא כי הקצוות של מושבות התא מופיעים מעוגלים, ולאחר מכן במהירות לשאוף את פתרון ניתוק התאים מהתאים (להבטיח כי מושבות התא עדיין מחוברים לצלחת, אם כי באופן רופף). יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת באמצעות DMEM/F12 כדי להסיר את פתרון ניתוק התאים.
- הוסף 3 מ"ל של hiPS CCM לתאי hiPS (בכל באר של צלחת 6-well) שטופלו בתמיסת ניתוק התא. לגרד מושבות באמצעות מרים תא, בעדינות pipette תא השעיה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים דבוקים באופן רופף. לשטוף את הצלחת ביסודיות כדי להבטיח את כל התאים נקצרים.
הערה: מומלץ להשתמש בצינור 5 מ"ל כדי למנוע גיזמה עודפת על התאים. - העבר 0.5 מ"ל של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת חדשה של מטריצת BM 1 מצופה 6-באר המכיל 2 מ"ל של hiPS CCM לבאר. הזז את הצלחת בצורה איור-שמונה כדי להפיץ מושבות תאים בתוך בארות ודגורה ב 37 °C בחממה 5 % CO2. רענן מדי יום עד שהתאים יהיו מוכנים למעבר או לשימוש לניסוי הבידול (כ-70% השפעה).
הערה: גודל המושבה האידיאלי עבור passaging שגרתי של iPSCs הוא בין 200-500 מיקרומטר בתנאים ללא מאכיל באמצעות hiPS CCM (ללא מעכב ROCK). אם תאים הם אינדיבידואליים במהלך הטיפול עם אנזימי דיסוציאציה או מאגרים, hiPS CCM ניתן להשלים עם מעכב ROCK (למשל, 10 μM Y27632) כדי לשפר את הכדאיות התא.
4. בידול של תאי hiPS לתאי mesoderm (ימים 0-2)
- בעוד תרביות התא hiPS נמצאות בשלב הצמיחה המעריכי (בערך בתוך 4 ימים של תרבות לאחר המעבר, וכ -70% השפעה), לבדוק חזותית את נוכחותם של תאים מובחנים באופן ספונטני בתוך ומסביב לקצוות המושבות. במידת הצורך, א-פסטי לגרד את אזורי בידול.
- שאפו ל-HIPS CCM מתאי HIPS ושטפו את התאים 3 פעמים ב-DMEM/F12 חם. לדגור על התאים עם 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תאים ללא אנזימים במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F) ולבדוק את הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. עקב הבדלים אינהרנטיים בין קווי תא hiPS שונים, יש לקבוע את זמן הדגירה בפועל עבור מאגר דיסוציאציה של התא עבור קו תא נתון.
- לגרד בעדינות את הבאר עם מרים תא כדי לשחרר תאים דבוקים באופן רופף ולהעביר את השעיית התא לצינור חרוטי 15 מ"ל, ואחריו צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להתאים אישית את תאי hiPS.
- הביאו את מתלה התא לנפח של 15 מ"ל עם DMEM/F12 חם וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-290 x גרם בטמפרטורת החדר.
- שאפו בעדינות את supernatant ו resuspend התאים עם DMEM חם / F12 לסיבוב נוסף של צנטריפוגה כדי להסיר את שאריות מטריצת BM 1 ורכיבי חיץ דיסוציאציה.
- שאפו את תאי העל והתוכן מחדש ב-1 מ"ל של מדיום אינדוקציה מסודרמי כמתואר לעיל. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer או מונה קולטר כדי לקבוע את הנפח המתאים של מדיום בידול mesoderm הדרוש כדי להשיג ריכוז של 1 x 105 תאים / מ"ל.
- שאפו את תמיסת ECM מלוחות המטריצה עם 2 מצופים של BM ושטפו את הצלחות פעמיים ב-DMEM/F12 חם. מערבבים את ההשעיה של תאי HIPS בעדינות על ידי צנרת כמה פעמים. מעבירים מ"ל אחד של מתלה התא לכל באר של צלחות 12-באר מטריצת BM מצופה 2 ולאחר מכן בעדינות לנער את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
- לדגור על הצלחת ב 37 °C (5° C) אינקובטורCO 2. רענן את מדיום האינדוקציה mesoderm למחרת.
הערה: לאחר יומיים, תאי mesoderm שמקורם בתא hiPS יהיו מוכנים לאינדוקציה מסודרם ביניים.
5. בידול של תאי mesoderm שמקורם בתא hiPS למסודרם ביניים (ימים 2-16)
- ביום 2 של פרוטוקול הבידול, לשאוף mesoderm אינדוקציה בינונית ולחדש עם 1 מ"ל לכל מדיום אינדוקציה mesoderm ביניים היטב.
- רענן מדיום כל יום כדי לשמור על סף מדויק של גורמי גדילה ומולקולות קטנות עבור התאים הפעילים מטבולית. אם יש צמיחת תאים משמעותית דלדול מהיר של חומרים מזינים מדיה (מסומן על ידי הצהבה של התקשורת), נפח בינוני בידול mesoderm ניתן להגדיל ל 1.3 מ"ל לכל באר של 12 לוחות היטב.
- תאי תרבות במשך 14 ימים נוספים כדי להשיג תאי mesoderm ביניים. ביום 16, תאים אלה יכולים להיות cryopreserved לשימוש מאוחר יותר.
6. הבחנה בין תאי mesoderm מתווכים שמקורם בתא HIPS לפודוציטים (ימים 16 עד 21)
- לשטוף את תאי mesoderm ביניים עם DMEM חם / F12 ואחריו דגירה של התאים עם 0.5 מ"ל לבאר של 0.05 % טריפסין-EDTA במשך 3 דקות ב 37 °C (5 ).C (70 °F). בצע בדיקה חזותית כדי לוודא שהתאים מתחילים להתנתק.
- לגרד תאים באמצעות מרים תא pipette השעיית התא מספר פעמים באמצעות קצה 1,000 μL pipette כדי להשיג אינדיבידואלי (או גושים קטנים של) תאים.
הערה: בשלב זה, ודא כי התאים מנותקים לחלוטין כמו תאים מצטברים עלול להיכשל ברכישת פנוטיפ מובחן סופני בתוך ציר הזמן של הפרוטוקול. - הוסף כ 2 מ"ל לבאר של פתרון נטרול טריפסין כדי לעצור את הפעילות של טריפסין.
- העבר תאים לצינור חרוטי 50 מ"ל ולהביא את הנפח עד 50 מ"ל באמצעות DMEM / F12, ולאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 201 x g בטמפרטורת החדר.
- שאפו את תאי העל והתוכן מחדש במדיום האינדוקציה של הפודוקיט. לקבלת תוצאות מיטביות, להבטיח צפיפות זריעה סופית של כ 100,000 תאים / באר של צלחת 12 היטב. הוסף את מתלה התא ללוחות מצופים 2 מטריצת BM ונער בעדינות את הצלחת כדי לעזור להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
- דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO2 לרענן בינוני מדי יום עד 5 ימים כדי לקבל podocytes ביום 21.
הערה: פודוקיטים שמקורם בתא hiPS וכתוצאה מכך ניתן לשמור בתרבות במשך 2-4 שבועות נוספים באמצעות מדיום מלא עם מדיה תחזוקה podocyte. פעם אחת במדיה תחזוקה podocyte, התאים ניתן להאכיל כל יומיים, עשוי לשמש למחקרים הבאים או ניתוחים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת פרוטוקול זה הייתה להדגים כי פודוקיטים אנושיים בוגרים יכולים להיגזר מתאי hiPS בתנאים מוגדרים כימית. הנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות קו התא DU11 hiPS17, אשר נבדקו לראשונה, ונמצאו נקיים ממיקופלסטיסמה. ניתוח כרומוזומלי בוצע גם, והתאים נמצאו תקינים קריוטיפיים. החל מתאי ה-DU11 hiPS הלא מובחנים, אסטרטגיית הבידול (איור 1)המתוארת בדו"ח זה הועסקה תחילה כדי להבדיל בין תאי הגזע (איור 2A) לתא מסודרם המבטאים ברכיורי (T) (איור 1B ואיור 2B),ולאחר מכן בידול לתאי מהסודרם ביניים חיוביים PAX2(איור 2C),ולבסוף לפודוציטים גלומרוליים של כליות בוגרים (איור 1B, איור 2D, איור תלת-ממדי ואיור 4. תאי Mesoderm הושגו ביום 2 של פרוטוקול הבידול, תאי mesoderm ביניים נוצרו ביום 16, ואת podocytes בוגר התקבלו ביום 21 של פרוטוקול ההבחנה. פודוקיטים וכתוצאה מכך היו כ 150-200 מיקרומטר בגודל כאשר דבק משטח תרבות רקמות שטוחות, כגון לוחות מצופים למינין המשמשים בניסוי זה. הפודוקיטים שמקורם בתאי HIPS מציגים הרחבות רבות דמויות תהליך כף הרגל שדמיינו באמצעות טכניקות משלימות מרובות, כולל מיקרוסקופיה חדות פאזה (איור 1),מיקרוסקופיה חיסונית (איור 4) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה8,11. הפודוקיטים שמקורם בתאי גזע הוכתמו גם כחיוביים עבור WT115 (איור 2D) כמוגם סמן זיהוי השושלת נפרין14 (איור 4). באופן מסקרן, הלוקליזציה התת-תאית של נפרין הייתה בעיקר בתהליכי כף הרגל של הפודוקיט ובציטופלסמה של התא, בקנה אחד עם פנוטיפ פודוקיט בוגר(איור 2D ואיור 4A,B). במהלך הפיתוח ובפיזיולוגיה של הפודוקיט, החלבון נפרין מועבר בין גרעין התא לציטופלזמה, אך נפרין מתבטא בעיקר בתהליכי הציטופלסמה והרגל כמו podocytes בוגרים לרכוש פנוטיפ פונקציונלי18. לפיכך, התצפית כי הפודוקיטים המיוצרים באמצעות פרוטוקול הבידול המתואר כאן מבטאים נפרין בעיקר במבנים דמויי תהליך הציטופלסמה והרגל מדגישה את התועלת של פרוטוקול זה ליצירת פודוקיטים בוגרים או מיוחדים יותר. סריקת מיקרוגרפים אלקטרונים של podocytes שמקורם בתא hiPS להדגיש את ההסתעפות של תהליכי כף הרגל הראשי והמשני ב podocytes שמקורם בתא hiPS כפי שדווח בעבר על ידי הקבוצה שלנו8,11. מכיוון ש- WT1 אינו כשלעצמו סמן מוחלט של פודוקיטים של כליות, מומלץ מאוד שהחוקרים יאפיינו גם את התאים שלהם לביטוי סימולטני של סמנים ספציפיים לפודוציטים כגון פודוקין ונפרין. הוכח בעבר כי podocytes מובחן סופני נגזר באמצעות שיטה זו חיסונים חיובי עבור podocin, נפרין, ו- WT1, עם ירידה מקבילה בביטוי שלסמןהתא האב PAX2 8,11. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך הפודוקיטים הנגזרים באמצעות פרוטוקול זה הם בוגרים התפתחותית או מיוחדים, כנדרש עבור podocyte גלומרולרי כליות אנושי תפקודי.
באופטימיזציה של תנאים עבור שיטת הבידול, נצפו מקרים שבהם תאי המזודרם הבינוניים היו מנותקים בצורה לא מספקת. תאים שנזרעו בצפיפות שחרגה משמעותית מהצפיפות המומלצת של 100,000 תאים/באר של צלחת 12 באר (לפני שלב האינדוקציה הסופי של הפודוקיט) גרמו לאשכולות גדולים של תאים שחסרים את הפנוטיפ המורפולוגי הצפוי של פודוקיטים בוגרים בציר הזמן הסטנדרטי של הפרוטוקול (איור 3A,B). מסיבות אלה, מומלץ לחוקרים להשתמש בצפיפות הזריעה המומלצת בפרוטוקול זה (איור 3C,D) לפני ניסויים בתנאים אחרים שעשויים להיות הרצויים עבור יישומים ספציפיים במורד הזרם. יחד, תוצאות אלה מייצגות את ההבחנה המופנית של תאי hiPS לתוך פודוקיטים גלומרולריים בכליות בתוך שלושה שבועות באמצעות המדיה המוגדרת כימית שתוארה לעיל.
איור 1: בידול של תאי hiPS לפודוציטים.
(A)ייצוג סכמטי של השיטה לבידול מכוון של תאי hiPS לפודוציטים. BMP7, חלבון מורפוגנטי בעצמות 7; RA, חומצה רטינואית; VEGF, גורם גדילה אנדותל וסקולרי. נתון זה שונה מנציג11. (B)תמונות מייצגות של תאי hiPS בכל שלב של בידול. משמאל לימין, התמונות מראות את מושבות תאי ה- IPS האנושיים האופייניים לפני דיסוציאציה לבידול ביום 0, ואחריו תאי mesoderm לאחר 2 ימים של בידול, ואז תאי mesoderm ביניים בסביבות 10 ימים של בידול, ולבסוף פודוקיטים מובחנים סופני ביום 22. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר לכל התמונות (בלוח B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות אימונופלואורסצנטיות של תאי hiPS ונגזרותיהם המובחנות המציגות את הביטוי של סמנים ספציפיים לשושלת היוחז ונגד גרעיני במהלך ציר הזמן של הבידול.
(A)תאי IPS אנושיים המבטאים את סמן הפלוריפוטנס באוקטובר 4; (B)תאי מסודרם המבטאים ברכיורי (T); (C)תאי מסודרם ביניים המבטאים PAX2; ו- (D)הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המבטאים את סמן זיהוי השושלת, נפרין והסמן המשויך, WT1. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר לכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעות של צפיפות זריעה תת-אופטימלית על פוטנציאל הבידול של תאי mesoderm ביניים הנגזרים מקו התא DU11 hiPS.
(A)כאשר צפיפות זריעת התאים הראשונית גבוהה מדי (כ- 500,000 תאים / באר של צלחת של 12 באר), תאים יכולים ליצור אגרגטים צפופים (B) במהלך שלב האינדוקציה של הפודוקיט. (C)צפיפות זריעה מומלצת למניעת גושים (100,000 תאים / באר של צלחת 12 באר), ולבחון מיקרוסקופית את ההרחבה (D) של מבנים דמויי תהליך כף הרגל במהלך שלב הבידול podocyte (inset). סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר עבור A-D; ו 100 מיקרומטר עבור inset ב D. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פודוקיטים שמקורם בתאי HIPS מציגים פנוטיפ בוגר מבחינה מורפולוגית במבחנה.
(A)חיסון של פודוקיטים שמקורם בתא hiPS עבור נפרין, ו - (B)תמונת הגדלה גבוהה יותר של תהליכי רגל podocyte המציגים תהליכים ראשוניים ומשניים (חצים לבנים) כמו גם את הביטוי של נפרין במבני תאים מיוחדים אלה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר (A); 50 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוקיטים גלומרולריים בכליות מתאי hiPS. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS מציגים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות הקשורות לפנוטיפ פודוקיט הכליות הבוגר13. בפרסומים קודמים, הראינו כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS יכולים לחקות את המבנה ואת פונקציית הסינון הסלקטיבי של הגלומרולוס של הכליות כאשר הם מתורבתים יחד עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים גלומרוליים במכשיר איברים על שבב מיקרופלואידי זלוף8,11.
הצעדים הקריטיים הבאים צריכים להילקח בחשבון על ידי חוקרים המעוניינים להתאים פרוטוקול זה. ראשית, זריעת תאי hiPS על לוחות מצופים למינין עבור אינדוקציה של תאים mesoderm הוא צעד מכריע. בעוד צפיפות זריעה של 100,000 תאים / באר מומלץ, החוקרים יכולים להתאים את צפיפות זריעת התא הראשוני בהתאם לקצב השכפול של קו תאי הגזע המשמש למחקר. במידת הצורך, אופטימיזציה זו תבטיח צפיפות תאים נאותה במהלך שלב האינדוקציה של mesoderm ותמנע היווצרות של אגרגטים תאים או גושים גדולים מאוד שעלולים לסכן את איכות mesoderm, mesoderm ביניים, או פנוטיפ podocyte (איור 3). חשוב גם לציין כי הבדלים במפרט היצרן עבור ריאגנטים מסוימים כגון CHIR99021 עשויים להשפיע על איכות התאים המובחנים. לכן, מומלץ לבדוק ריאגנטים ממספרי מגרשים שונים או ספקים וספקים לפעילותם הביולוגית ועקביותם בין ניסויים עצמאיים. כמו כן, חשוב להימנע מחשיפה מוגזמת של תאי hiPS לאנזימי דיסוציאציה שכן הדבר עלול להוביל לניתוק לא רצוי מטריצת הדבק ואובדן אפשרי של תאים במהלך שאיפה בינונית. צעד מכריע נוסף הראוי לציון הוא להבטיח כי המדיום אינדוקציה podocyte מוגן מפני אור כדי למנוע אי-יישום המושרה על ידי תמונה של חומצה רטינואית.
בהשוואה לשיטות קודמות להבחנה בין פודוקיטים של כליות אנושיות, השיטה המתוארת כאן משתמשת בגורמים מוגדרים כימית (כולל מולקולות קטנות, גורמי גדילה ואיזופורמים ספציפיים של חלבוני קרום המרתף, בריכוזים הרצויים) לפי הצורך כדי לווסת מסלולי איתות תאים ספציפיים המעורבים בהתפתחות הכליות ובתפקוד הפודוקיט. באופן ספציפי, הדור של תאי mesoderm מתאי hiPS מעורב ההפעלה של מסלול איתות Wnt קנוני שהושפע באמצעות המולקולה הקטנה CHIR9902119. מסלול האיתות הקנוני Wnt ידוע כדי לווסת את הפעילות שעתוק של גנים המעורבים בפיתוח רקמות ודפוס ב vivo, כמו גם התפשטות תאים ונדידה20,21. מדיום האינדוקציה של התא המשמש בפרוטוקול זה מאפשר נגזרת של פודוקיטים מתאי mesoderm שמקורם בתאי IPS. מדיום אינדוקציה פודוקיט זה מורכב Activin A, BMP7, VEGF, חומצה רטינואית, ו CHIR99021. ראוי לציין, זה פודוקיט אינדוקציה מדיום אינו דורש רכיבי סרום לא מוגדרים כגון סרום בקר עוברי, אשר יכול לטשטש את התרומות של גורמים ספציפיים ולהגביל את היישומים של שיטות בידול תאים אחרים למחקרים מכניים של התפתחות רקמות ומחלות, מה שהופך אותו נבדל מאלה שהועסקו בניסיונות קודמים לייצר סוגי תאי כליות22. בנוסף, נצפתה כי FGF2 ו- FGF9 אינם נדרשים לבידול של פודוקיטים כליות מתאי hiPS6,7,22. בעוד שיטות קודמות תלויות בהיווצרות אגרגטים רב תאיים כגון גופים עובריים ואורגנוידים, השיטה המתוארת כאן מייצרת תאים המציגים פנוטיפ בוגר, הן מבחינה מורפולוגית והן על ידי ביטוי של סמנים ספציפיים שושלת כולל נפרין ופודוקין, ורגולציה מטה של סמני תאים אבות כגון PAX2. זה צפוי כי הידע של הרכיבים הכימיים המועסקים בפרוטוקול זה יכול להקל על מחקרים מכניים של התפתחות רקמת כליה אנושית, מפרט שושלת שושלת פודוקייט, פתוגנזה המחלה בעתיד.
שיטה זו לבידול תאי hiPS מאפשרת גם ייצור של פופוטיטים בוגרים, פוסט-מיוטיים ופונקציונליים עם יעילות של יותר מ-90%, ללא בחירת תת-אכלוס, מניפולציות גנטיות או שנאת זרים. זה שונה במיוחד מניסיונות קודמים שבהם רמות גבוהות של הטרוגניות תאית6,7,23 הגבילו את השימוש בשיטות בידול תאי גזע ליישומי רפואה תרגומית. שיטה זו מציגה גם התקדמות משמעותית לתחום בהתחשב באתגרים הקשורים לזמינות המוגבלת ביותר של פודוקיטים כליות אנושיים ממקורות אחרים כגון רקמות ראשוניות או organoids. חלק מהאתגרים כוללים יעילות נגזרת נמוכה של פחות מ -1% בעת שימוש בשיטות הנתמכות על היווצרות גופים עובריים או organoids6,7.
מגבלה אחת לפרוטוקול זה היא העלות הגבוהה יחסית של ריאגנטים הנדרשים עבור תרבית תאי הגזע וצעדי בידול, אשר עלול לעכב את יישומו במעבדות מסוימות או קבוצות מחקר. כמו כן, מכיוון שהיו מעורבים הרבה אופטימיזציה לגורמים מרובים במיקרו-סביבה של התא (כלומר, רמזים מסיסים וניתנים מסיסים או דבקים) היו מעורבים, אנו ממליצים כי הפרוטוקול נעשה כמתואר. טעות נפוצה שציינו אחרים שהתעניינו בשיטת בידול פודוקיט זו כללה שימוש במטריצות הידבקות תאים לא הולמות כגון מטריצת BM 1 או חלבונים אחרים המוגדרים בצורה גרועה מן החי. לאחר ביצוע הפרוטוקול כמתואר, ניתן לבצע ניסויים נוספים כדי לבחון את היעילות של שינויים אחרים בפרוטוקול. יתר על כן, בשל ההבדלים המובנים בין קווי תאי גזע אנושיים שונים, ראוי לציין כי היבטים מסוימים של שיטת הבידול, למשל, תזמון החשיפה לבידול בינוני או לבן דיסוציאציה של תאים, וצפיפות זריעת תאים, עשויים להיות ממוטבים. עם זאת, תנאים אלה לא שונו עבור קווי התא hiPS וקווי תאי גזע עובריים נבדקו עד כה. שיטת בידול podocyte זו פועלת על פני קווי תאי hiPS מרובים כולל PGP1, IMR-90-1, ו- IISH3i-CB6, כמו גם קו תאי הגזע העובריים H98,11. בדוח זה, אנו מדגימים גם את ההבחנה המוצלחת של קו התא DU11 hiPS באמצעות אותו פרוטוקול (איור 1 ואיור 2). לכן, בהתחשב בעקביות של שיטה זו על פני קווי תאים שונים כולל תוצאות עבודה שלא פורסמה ממעבדות מחקר עצמאיות אחרות (טרום פרסום), אנו מצפים כי פרוטוקול בידול זה יהיה שימושי עבור נגזרת של podocytes כליות ממגוון רחב של קווי תאים hiPS, ולכן, לא רק אחד המשמש בפרוטוקול זה.
בהתחשב ביכולת של תאי hiPS לחדש את עצמם ללא הגבלת זמן, שיטת בידול זו יכולה לשמש כדי לספק לחוקרים מקור זמין של פודוקיטים כליות אנושיים. זה יכול לעזור לקדם את ההבנה הנוכחית של ביולוגיה כליות אנושית ומחלה24, כמו גם לאפשר פיתוח של מערכות כליות במבחנה חדשה למידול תפקוד הכליות האנושי ותגובות לטיפולים. לדוגמה, הפרוטוקול המתואר כאן הועסק לאחרונה ושולב עם מערכת איברים על שבב מיקרופלואידית כדי לפתח מודל במבחנה פונקציונלית של קיר נימי גלומרולרי הכליות האנושי. שבב גלומרולרי זה סינן באופן סלקטיבי מולקולות במחזור ו recapitulated נפרוטוקסיות הנגרמת על ידי סמים כאשר נחשף לתרופה כימותרפית, Adriamycin8. בעתיד, תוצאות אלה עשויות להיות משולבות עם טכנולוגיות ביו-הדפסה תלת-ממדיות כדי להנדס מודלים מורכבים יותר במבחנה של הכליה האנושית. התקדמות כזו יכולה לספק פלטפורמות חדשניות להערכת מועמדים לסמים, במיוחד אלה שמתמקדות בצורות של מחלות כליות הנובעות מתפקוד לקוי של פודוקיטים גלומרולריים. זה חשוב במיוחד כמו ההבדלים הספציפיים למינים של מודלים בעלי חיים וחוסר פונקציות ברמת האיברים שנצפו בדרך כלל בשיטות תרבות רקמות סטנדרטיות יכול לעכב את הפיתוח של טיפולים ממוקדים עבור צורות שונות של מחלות כליות אנושיות25. לכן, פרוטוקול זה יכול, יום אחד, לספק הזדמנויות לפענח את מסלולי האיתות המעורבים בהתפתחות הכליה האנושית, כמו גם את הפתוגנזה של המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. הוא מחבר על פטנט הממתין לשיטות ליצירת פודוקיטים כליות מתאי גזע פלוריפוטנטים (בקשת פטנט בארה"ב 14/950859). המחברים הנותרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר פראט להנדסה באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה בבית הספר לרפואה דיוק, פרס מחקר של יו"ר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת דיוק, ופרס מעבר קריירה PDEP של קרן בורוז וולקום ל- S.M. M.B נתמך על ידי תכנית מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע. אנו מודים למעבדת בורסאק על שסיפקה לנו בנדיבות את קו תאי הגזע DU11, ואת מעבדת ורגזה באוניברסיטת דיוק על שיתוף זמני של מתקן תרבות הרקמות שלהם עם הקבוצה שלנו. פרסום זה מוקדש לפרופ' לורה ל. קסלינג, פרופסור נוברטיס לכימיה במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, לרגל יום הולדתה ה-60.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
