Summary
Presentert her er en kjemisk definert protokoll for avledning av humane nyre podocytter fra induserte pluripotente stamceller med høy effektivitet (>90%) og uavhengig av genetiske manipulasjoner eller subpopulation utvalg. Denne protokollen produserer ønsket celletype innen 26 dager og kan være nyttig for nefrotoksisitetstesting og sykdomsmodellering.
Abstract
Nyresykdom påvirker mer enn 10% av den globale befolkningen og koster milliarder av dollar i føderale utgifter. De mest alvorlige former for nyresykdom og eventuell nyresvikt i sluttfasen skyldes ofte skaden på de glomerulære podocyttene, som er de høyt spesialiserte epitelcellene som fungerer sammen med endotelceller og den glomerulære kjellermembranen for å danne nyrenes filtreringsbarriere. Fremskritt innen nyremedisin har blitt hindret av begrenset tilgjengelighet av primærvev og mangel på robuste metoder for avledning av funksjonelle menneskelige nyreceller, som podocytter. Evnen til å utlede podocytter fra fornybare kilder, som stamceller, kan bidra til å fremme dagens forståelse av mekanismene for menneskelig nyreutvikling og sykdom, samt gi nye verktøy for terapeutisk oppdagelse. Målet med denne protokollen var å utvikle en metode for å utlede modne, post-mitotiske podocytter fra menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPS) med høy effektivitet og spesifisitet, og under kjemisk definerte forhold. HiPS celle-avledede podocytter produsert av denne metoden uttrykker avgrensningsspesifikke markører (inkludert nephrin, podocin og Wilms Tumor 1) og viser de spesialiserte morfologiske egenskapene (inkludert primære og sekundære fotprosesser) forbundet med modne og funksjonelle podocytter. Interessant nok er disse spesialiserte funksjonene merkbart fraværende i den udødeliggjorte podocyttcellelinjen som er mye brukt i feltet, noe som antyder at protokollen som er beskrevet her, produserer menneskelige nyrekapocytter som har en utviklingsmessig mer moden fenotype enn de eksisterende podocytcellelinjene som vanligvis brukes til å studere menneskelig nyrebiologi.
Introduction
Fremskritt innen menneskelig pluripotent stamcellekultur er klar til å revolusjonere regenerativ medisin, sykdomsmodellering og legemiddelscreening ved å gi forskere en fornybar, skalerbar kilde til biologisk materiale som kan konstrueres for å oppnå nesten hvilken som helst celletype i menneskekroppen1. Denne strategien er spesielt nyttig for å utlede spesialiserte og funksjonelle celletyper som ellers ville være vanskelig å få tak i. Menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPS)2,3,4,5 er spesielt attraktive på grunn av deres somatiske celleopprinnelse og potensialet de representerer for personlig medisin. Imidlertid er utviklingsmetoder for å utlede andre celleavstamninger fra hiPS-celler fortsatt utfordrende på grunn av hyppig bruk av dårlig definerte kulturforhold som fører til lav effektivitet og ikke-spesifikk generasjon av heterogene cellepopulasjoner6,7.
Presentert her er en metode for avledning av modne nyre podocytter fra hiPS celler med spesifisitet og høy effektivitet under kjemisk definerte forhold. Ved å vurdere rollene til flere faktorer i det cellulære mikromiljøet, ble det utviklet en stamcelledifferensieringsstrategi som involverte optimalisering av løselige faktorer presentert i cellekulturmediet, samt uoppløselige faktorer, for eksempel ekstracellulære matrisekomponenter eller limsubstrater. Gitt betydningen av integrinsk signalering i podocyttutvikling og funksjon, ble uttrykket av integrinske reseptorer på celleoverflaten først undersøkt. β1 integrins ble sterkt uttrykt ikke bare i hiPS-celler, men også i deres derivater, inkludert mesoderm og mellomliggende mesodermceller8,9,10. Påfølgende eksperimenter bekreftet at ligander som binder seg til β1 integrins (inkludert laminin 511 eller laminin 511-E8 fragment) støtter adhesjon og differensiering av hiPS-celler i podocytter når de brukes sammen med det løselige induktive mediet beskrevet nedenfor.
Induksjon av cellelinjeforpliktelse ble initiert ved først å bekrefte at hiPS-celler dyrket på lamininbelagte overflater i to dager i nærvær av et medium som inneholder Activin A, CHIR99021 og Y27632 Rock-hemmer kan skille seg ut i celler som uttrykker de tidlige mesodermmarkørene HAND1, goosecoid og brachy braury8,11. Behandling av mesodermcellene i 14 dager med et medium supplert med benmorfogenetisk protein 7 (BMP-7) og CHIR99021 gjorde det mulig å avlede mellomliggende mesodermceller som uttrykte nefro cellemarkører wilm's Tumor 1 (WT1), oddetallsrelatert protein 1 (OSR1)8,11og parret boksgen 2 protein (PAX2)12. For å utlede de modne nyreglomerulære podocyttene ble de mellomliggende mesodermcellene behandlet i 4-5 dager med et nytt medium bestående av BMP-7, Activin A, vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF),all-trans retinoinsyre og CHIR99021. Flowcytometri og immunostaining ble brukt til å bekrefte at >90% av de resulterende cellene viste de molekylære, morfologiske og funksjonelle egenskapene til den modne nyrekapocytten8,11,13. Disse egenskapene inkluderer utvikling av primære og sekundære fotprosesser; uttrykk for podocyttlinjespesifikke gener, inkludert SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 og uttrykk for proteiner, inkludert podocin, nephrin og WT114,15,16. I tillegg ble det funnet at hiPS celle-avledede podocytter kan opprettholdes i kultur i opptil fire uker in vitro ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig medium8,11 som gir en ekstra fleksibilitet i tidspunktet for nedstrøms eksperimenter. Hvis du vil ha mer informasjon om strømningscytometripanelene som brukes til å bestemme renheten til hiPS-podocyttene, kan du se vår forrige publikasjon11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser
- Fortynn tint 5x hiPS cellekulturmedier (CCM) supplement i hiPS cellekultur basal medium for å oppnå en 1x løsning av hiPS CCM.
MERK: Frossen 5x hiPS CCM supplement krever en langsom opptiningsprosess, ideelt i 4 °C for natten. Aliquots av 1x hiPS CCM kan lagres i opptil 6 måneder ved -20 °C. - Tilberedning av kjellermembran (BM) matrise 1-belagte plater for hiPS cellekultur: Tine BM matrise 1 over natten på is ved 4 °C. Når de er tint, lag aliquots med passende fortynningsfaktorer som foreslått av produsenten.
MERK: Vanligvis fremstilles aliquots for etterfølgende fortynning i 25 ml kald DMEM /F12 i et 50 ml konisk rør etterfulgt av grundig blanding for å fullstendig oppløse BM-matrisen 1 og unngå dannelse av gjenværende krystaller. - Overfør 1 ml av BM-matrisen 1 oppløsning til hver brønn på en 6 brønnplate og inkuber ved 37 °C i 1-2 timer eller ved 4 °C i minst 24 timer, innpakket i parafinfilm. BM-matrisen 1-belagte plater kan lagres ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Fremstilling av kjellermembran (BM) matrise 2 - belagte plater: Fortynn passende mengder BM-matrise 2 i 9 ml sterilt destillert vann for å forberede en endelig konsentrasjon på 5 μg / ml. Tilsett 700 μL av BM-matrise 2-oppløsningen til hver brønn på en 12 brønnplate og inkuber platen ved romtemperatur i 2 timer eller over natten ved 4 °C.
- Forbered 100 μg/ml lagerløsninger hver av BMP7, Activin A og VEGF som følger: Rekonstituer BMP7 i sterilt destillert vann som inneholder 0,1 % (wt/vol) BSA og rekonstituer Activin A og VEGF separat i steril PBS som inneholder 0,1 % (wt/vol) BSA. For å unngå hyppige fryse-tine sykluser, forberede 100 μL aliquots fra hver lagerløsning og lagre ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- Forbered en 10 mM lagerløsning av Y27632 ved å oppløse 10 mg Y27632 i 3,079 ml sterilt destillert vann. Aliquot 100 μL fra lageret og lagre ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- Løs opp 2 mg CHIR99021 i 143,4 μL steril DMSO for å lage en 30 mM lagerløsning. Forbered 5 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C i opptil 1 måned (eller i henhold til produsentens anbefaling).
- Løs opp 10 mgall-trans retinoinsyre i 3,33 ml steril DMSO. Forbered 500 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C i opptil 6 måneder.
2. Utarbeidelse av kulturmedier
- Forbered mesoderm differensieringsmediet ved å rekonstituere tilsvarende lagerløsninger til en endelig konsentrasjon på 100 ng/ml Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 og 1x B27 serumfritt tilskudd i et passende volum DMEM/12 med glutamintilskudd.
MERK: Mesoderm differensieringsmediet bør tilberedes ferskt før differensieringstrinn og med et volum som passer for eksperimentets skala (vanligvis er 50 ml medium tilstrekkelig for to 12 brønnplater). - Forbered mellomliggende mesoderm differensieringsmedium ved å rekonstituere tilsvarende lagerløsninger til en endelig konsentrasjon på 100 ng/ml BMP7, 3 μM CHIR99021 og 1x B27 serumfritt tilskudd i DMEM/F12 med et glutamintilskudd.
MERK: Om nødvendig kan mediet suppleres med 1% (vol / vol) Penicillin-Streptomycin. Juster volumet på mediet ved å bruke DMEM/F12 med glutamintilskudd. Dette mediet kan tilberedes i store partier; Det anbefales imidlertid å lagre i mindre aliquots (f.eks. 45 ml i 50 ml koniske rør) for å unngå gjentatte fryse-tine sykluser. Dette mediet kan oppbevares ved -20 °C i opptil 3 måneder og kan tines ved 4 °C over natten før bruk. - Forbered podocytinduksjonsmediet ved å rekonstituere til en endelig konsentrasjon 100 ng/ml BMP7, 100 ng/ml aktivin A, 50 ng/ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfritt tilskudd og 0,1 μM all-trans retinoinsyre i DMEM/F12 med glutamintilskudd. Beskytt mediet mot lys (f.eks. ved å pakke beholderen med foliepapir).
MERK: Dette mediet kan tilberedes i store partier og lagres i mørket ved -20 °C i opptil 3 måneder. Frosne aliquots skal tines over natten ved 4 °C før bruk. - Forbered 25 ml trypsinnøytrerende oppløsning ved å tilsette 10 % (vol/vol) varmeinaktivert FBS i DMEM/F12 og filtrer under sterile forhold.
- For postdifferensieringsvedlikehold av stamcelleavledede podocytter, klargjør Du fullfører medium med podocyttvedlikeholdsmedier ved å legge til tilskuddet til basalmediet i henhold til produsentens retningslinjer, og lagre ved 4 °C i opptil to uker.
3. Feeder-fri hiPS cellekultur ved hjelp av hiPS cellekultur medium
- Aspirer restløsningen av BM-matrise 1 fra de forhåndsbelagte platene og vask brønnene 3 ganger med 1 til 2 ml oppvarmet DMEM/F12.
- Aspirer brukt hiPS CCM fra hiPS-cellene og skyll cellene 3 ganger med oppvarmet DMEM / F12. Tilsett 1 ml varm celleavløsning og inkuber i 1 min ved 37 °C for å bidra til å fjerne cellene. Utfør visuell inspeksjon av celler under et vevskulturmikroskop og sørg for at kantene på cellekoloniene vises avrundet, og aspirer deretter raskt celleavløsning fra cellene (slik at cellekoloniene fortsatt er festet til platen, om enn løst). Skyll cellene forsiktig én gang med DMEM/F12 for å fjerne celleavløsningsløsningen.
- Tilsett 3 ml hiPS CCM i hiPS-cellene (i hver brønn på en 6-brønns plate) som ble behandlet med celleavløsningsløsningen. Skrap kolonier ved hjelp av en celleløfter, og forsiktig pipettecelleoppheng opp og ned for å løsne de løst festede cellene. Vask platen grundig for å sikre at alle cellene høstes.
MERK: Bruk av en 5 ml pipette anbefales for å unngå overflødig skjær på cellene. - Overfør 0,5 ml av cellefjæringen til hver brønn i en ny BM-matrise 1-belagt 6-brønnsplate som inneholder 2 ml hiPS CCM per brønn. Flytt platen på figur-åtte måte for å distribuere cellekolonier i brønner og inkubere ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator. Oppdater medium daglig til cellene er klare til å passeres eller brukes til differensieringseksperimentet (ca. 70 % samløp).
MERK: Den ideelle kolonistørrelsen for rutinemessig passaging av iPSCer er mellom 200-500 μm under materfrie forhold ved hjelp av hiPS CCM (uten ROCK-hemmer). Hvis celler individualiseres under behandling med dissosiasjonsenzymer eller buffere, kan hiPS CCM suppleres med ROCK-hemmer (f.eks. 10 μM Y27632) for å forbedre celle levedyktigheten.
4. Differensiering av hiPS-celler i mesodermceller (dager 0-2)
- Mens hiPS-cellekulturene er i den eksponentielle vekstfasen (omtrent innen 4 dager etter passivisering, og rundt 70% samløp), inspiser visuelt for tilstedeværelsen av spontant differensierte celler innenfor og rundt kantene på koloniene. Om nødvendig, aseptisk skrape av områder av differensiering.
- Aspirer hiPS CCM fra hiPS-celler og skyll cellene 3 ganger med varm DMEM / F12. Inkuber cellene med 1 ml enzymfri celledissosiasjonsbuffer i 10 min ved 37 °C og se etter dissosiasjonen under et mikroskop. På grunn av iboende forskjeller mellom forskjellige hiPS-cellelinjer, må den faktiske inkubasjonstiden for celledissosiasjonsbufferen bestemmes for en gitt cellelinje.
- Skrap forsiktig brønnen med en celleløfter for å løsne løst festede celler og overføre celleopphenget til et 15 ml konisk rør, etterfulgt av pipettering opp og ned flere ganger for å individualisere hiPS-cellene.
- Ta cellefjæring til 15 ml volum med varm DMEM/F12 og sentrifuger i 5 min ved 290 x g ved romtemperatur.
- Aspirer forsiktig de supernatante og resuspend cellene med varm DMEM / F12 for en ny runde sentrifugering for å fjerne gjenværende BM-matrise 1 og dissosiasjonsbufferkomponenter.
- Aspirer de supernatante og resuspendcellene i 1 ml mesoderm induksjonsmedium som beskrevet ovenfor. Tell det totale antallet celler ved hjelp av et hemocytometer eller coulter teller for å bestemme riktig volum mesoderm differensieringsmedium som er nødvendig for å oppnå en konsentrasjon på 1 x 105 celler / ml.
- Aspirer ECM-oppløsning fra BM-matrisen 2-belagte plater og skyll platene to ganger med varm DMEM /F12. Bland hiPS-cellefjæringen forsiktig ved å pipettere et par ganger. Overfør 1 ml celleoppheng til hver brønn av BM-matrisen 2-belagte 12-brønnsplater og rist deretter platene forsiktig for å fordele cellene jevnere.
- Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator. Oppdater mesoderm induksjonsmediet neste dag.
MERK: Etter 2 dager ville hiPS celle-avledede mesodermceller være klare for mellomliggende mesoderm induksjon.
5. Differensiering av hiPS celle-avledede mesodermceller i mellomliggende mesoderm (dager 2-16)
- På dag 2 av differensieringsprotokollen aspirerer mesoderm induksjonsmedium og etterfyller med 1 ml per brønn mellomliggende mesoderm induksjonsmedium.
- Oppdater medium hver dag for å opprettholde en nøyaktig terskel for vekstfaktorer og små molekyler for de metabolsk aktive cellene. Hvis det er betydelig cellevekst og rask uttømming av medienæringsstoffer (indikert ved av media), kan volumet av mellomliggende mesoderm differensieringsmedium økes til 1,3 ml per brønn av de 12 brønnplatene.
- Kulturceller i ytterligere 14 dager for å oppnå mellomliggende mesodermceller. Ved dag 16 kan disse cellene kryopreserveres til senere bruk.
6. Differensiering av hiPS celleavledede mellomliggende mesodermceller i podocytter (dager 16 til 21)
- Skyll de mellomliggende mesodermcellene med varm DMEM/F12 etterfulgt av inkubasjon av cellene med 0,5 ml per brønn på 0,05 % trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 °C. Utfør visuell inspeksjon for å sikre at cellene begynner å ta avstand.
- Skrap celler ved hjelp av en celleløfter og pipette celleopphenget flere ganger ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss for å oppnå individualiserte (eller små klumper av) celler.
MERK: På dette stadiet må du sørge for at cellene er fullstendig dissosiert, da aggregerte celler kanskje ikke klarer å skaffe seg en terminalt differensiert fenotype innenfor protokollens tidslinje. - Tilsett ca 2 ml per brønn av trypsin nøytraliserende løsning for å stoppe aktiviteten til trypsin.
- Overfør celler til et konisk rør på 50 ml og ta volumet opp til 50 ml ved hjelp av DMEM/F12, og sentrifuger cellefjæringen i 5 minutter ved 201 x g ved romtemperatur.
- Aspirer de supernatante og resuspendcellene i podocyttinduksjonsmediet. For optimale resultater, sørg for en endelig såddtetthet på ca. 100 000 celler/brønn på en 12 brønnplate. Tilsett cellefjæringen i BM-matrisen 2-belagte plater og rist platen forsiktig for å fordele cellene jevnere.
- Inkuber celler ved 37 °C og 5 % CO2 og oppdater medium daglig i opptil 5 dager for å få podocytter innen dag 21.
MERK: De resulterende hiPS celleavledede podocyttene kan opprettholdes i kulturen i 2-4 ekstra uker ved å bruke komplett medium med podocyte vedlikeholdsmedier. En gang i podocyte vedlikeholdsmedier kan cellene mates annenhver dag og kan brukes til etterfølgende studier eller nedstrømsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne protokollen var å demonstrere at modne menneskelige podocytter kan avledes fra hiPS-celler under kjemisk definerte forhold. Dataene som presenteres i dette manuskriptet ble generert ved hjelp av DU11 hiPS cellelinje17, som først ble testet for, og funnet å være fri for mykoplasma. Kromosomal analyse ble også utført, og cellene ble funnet å være karyotypisk normale. Starter med de uavklarte DU11 hiPS-cellene, differensieringsstrategien (figur 1) som er skissert i denne rapporten, ble først brukt til å skille stamcellene (figur 2A) i mesodermcellen som uttrykker Brachyury (T) (Figur 1B og figur 2B), etterfulgt av differensiering i PAX2-positive mellomliggende mesodermceller (figur 2C), og til slutt i modne nyreglomerulære podokytter (figur 1B, Figur 2D, Figur 3Dog Figur 4). Mesoderm-celler ble oppnådd ved dag 2 av differensieringsprotokollen, mellomliggende mesodermceller ble generert av dag 16, og de modne podocyttene ble oppnådd ved dag 21 av differensieringsprotokollen. De resulterende podocyttene var omtrent 150-200 μm i størrelse når de ble festet til en flat vevskulturoverflate, for eksempel lamininbelagte plater som brukes i dette eksperimentet. HiPS-celleavledede podocytter viser mange fotprosesslignende utvidelser som ble visualisert ved hjelp av flere komplementære teknikker, inkludert fasekontrastmikroskopi (figur 1), immunfluorescerende mikroskopi (figur 4) og skanning elektronmikroskopi8,11. Stamcelleavledede podocytter farget også positivt for WT115 (figur 2D) samt avstamningsidentifikasjonsmarkøren nephrin14 (figur 4). Interessant nok var den subcellulære lokaliseringen av nephrin hovedsakelig i podocyttfotprosessene og cellecytoplasma, i samsvar med en moden podocyttfenotype (Figur 2D og figur 4A,B). Under utvikling og i podocyttfysiologi blir proteinet nephrin skyttet mellom cellekjernen og cytoplasma, men nephrin blir overveiende uttrykt i cytoplasma og fotprosesser når podocytter modnes og får en funksjonell fenotype18. Dermed understreker observasjonen som podocyttene produsert ved hjelp av differensieringsprotokollen beskrevet heri, nephrin i stor grad i cytoplasma- og fotprosesslignende strukturer, nytten av denne protokollen for generering av mer modne eller spesialiserte podocytter. Skanning elektronmikrografer av hiPS celleavledede podocytter fremhever forgreningen av de primære og sekundære fotprosessene i hiPS-celleavledede podocytter som tidligere rapportert av vår gruppe8,11. Fordi WT1 ikke i seg selv er en definitiv markør for nyrepodocytter, anbefales det sterkt at forskere også karakteriserer cellene sine for samtidig uttrykk for podocyttspesifikke markører som podocin og nephrin. Det ble tidligere vist at terminalt differensierte podocytter avledet ved hjelp av denne metoden immunostain positiv for podocin, nephrin og WT1, med en tilsvarende reduksjon i uttrykk for stamcellemarkøren PAX28,11. Sammen indikerer disse resultatene at podocyttene avledet ved hjelp av denne protokollen er utviklingsmodne eller spesialiserte, som kreves for en funksjonell menneskelig nyre glomerulær podocytt.
Ved optimalisering av forhold for differensieringsmetoden ble det observert tilfeller der de mellomliggende mesodermcellene ble utilstrekkelig dissosiert. Celler frøet ved tettheter som betydelig oversteg den anbefalte tettheten av 100.000 celler / brønn av en 12 brønnplate (før det endelige podocyttinduksjonstrinnet) resulterte i store klynger av celler som manglet forventet morfologisk fenotype av modne podocytter innenfor standardtidslinjen til protokollen (Figur 3A, B). Av disse grunnene anbefales det at forskere bruker såingstetthetene som anbefales i denne protokollen (Figur 3C,D) før de eksperimenterer med andre forhold som kan være ønsket for spesifikke nedstrømsapplikasjoner. Sammen representerer disse resultatene rettet differensiering av hiPS-celler til nyreglomerulære podocytter innen tre uker ved hjelp av de kjemisk definerte mediene beskrevet ovenfor.
Figur 1: Differensiering av hiPS-celler til podocytter.
(A) Skjematisk representasjon av metoden for rettet differensiering av hiPS-celler til podocytter. BMP7, benmorfogenetisk protein 7; RA, retinoinsyre; VEGF, vaskulær endotel vekstfaktor. Dette tallet er endret fra referanse11. (B) Representative bilder av hiPS-celler i hvert trinn av differensiering. Fra venstre til høyre viser bilder de karakteristiske menneskelige iPS-cellekoloniene før dissosiasjon for differensiering på dag 0, etterfulgt av mesodermceller etter 2 dager med differensiering, deretter mellomliggende mesodermceller på rundt 10 dager med differensiering, og til slutt de terminalt differensierte podocyttene på dag 22. Skalalinje, 100 μm for alle bilder (i panel B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunfluoreserende bilder av hiPS-celler og deres differensierte derivater som viser uttrykket av avstamningsspesifikke markører og kjernefysiske mottiltak under differensieringstidslinjen.
(A) Menneskelige iPS-celler som uttrykker pluripotensmarkøren Okt4; (B) mesoderm celler som uttrykker brachyury (T); (C) mellomliggende mesodermceller som uttrykker PAX2; og (D) de hiPS celleavledede podocyttene som uttrykker avgrensningsidentifikasjonsmarkøren, nephrin og den tilknyttede markøren, WT1. Skalalinje, 100 μm for alle bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av sub-optimal såing tetthet på differensieringspotensialet til mellomliggende mesoderm celler avledet fra DU11 hiPS cellelinjen.
(A) Når den første cellesåtettheten er for høy (ca. 500 000 celler/brønn i en 12 brønnplate), kan cellene danne tette aggregater (B) under podocyttinduksjonsfasen. (C) Anbefalte såddtettheter for å forhindre klumping (100 000 celler/brønn i en 12 brønnplate), og for å mikroskopisk observere (D) forlengelsen av fotprosesslignende strukturer under podocyttdifferensieringsfasen (innfelling). Skalastang, 200 μm for A-D; og 100 μm for innfellingen i D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: HiPS celleavledede podocytter viser morfologisk modne fenotype in vitro.
(A) Immunostaining av hiPS celleavledede podocytter for nephrin, og (B) høyere forstørrelsesbilde av podocyttfotprosesser som viser primære og sekundære prosesser (hvite piler) samt uttrykket av nephrin i disse spesialiserte cellestrukturene. Skalastang, 100 μm (A); 50 μm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten beskriver vi en protokoll for generering av nyreglomerulære podocytter fra hiPS-celler. HiPS celleavledede podocytter viser morfologiske og molekylære egenskaper forbundet med den modne nyre podocyttfenotypen13. I tidligere publikasjoner viste vi at hiPS-celleavledede podocytter kan etterligne strukturen og selektiv filtreringsfunksjonen til nyreglomerulus når de er kokulturert med glomerulære mikrovaskulære endotelceller i en parfymerbar mikrofluidisk organ-på-en-chip-enhet8,11.
Følgende kritiske skritt bør vurderes av forskere som er interessert i å tilpasse denne protokollen. For det første er såing av hiPS-celler på lamininbelagte plater for induksjon av mesodermceller et avgjørende skritt. Mens en såddtetthet på 100 000 celler/brønn anbefales, kan forskerne justere den første cellefrøtettheten avhengig av replikeringshastigheten til stamcellelinjen som brukes for studien. Om nødvendig vil denne optimaliseringen sikre tilstrekkelig celletetthet under mesoderminduksjonsfasen og forhindre dannelse av cellemengder eller svært store klumper som potensielt kan kompromittere kvaliteten på mesodermen, mellomliggende mesoderm eller podocyttfenotype (figur 3). Det er også viktig å merke seg at forskjeller i produsentspesifikasjoner for noen reagenser som CHIR99021 kan påvirke kvaliteten på differensierte celler. Dermed er det tilrådelig å teste reagenser fra forskjellige partinumre eller leverandører og leverandører for deres biologiske aktivitet og konsistens mellom uavhengige eksperimenter. Det er også viktig å unngå overdreven eksponering av hiPS-celler for dissosiasjonsenzymer, da dette kan føre til uønsket løsrivelse fra limmatrisen og mulig tap av celler under middels aspirasjon. Et annet viktig skritt verdig notat er å sikre at podocyttinduksjonsmediet er beskyttet mot lys for å forhindre fotoindusert inaktivering av retinoinsyre.
Sammenlignet med tidligere metoder for differensiering av humane nyrepodocytter, bruker metoden beskrevet her kjemisk definerte faktorer (inkludert små molekyler, vekstfaktorer og spesifikke isoformer av kjellermembranproteiner, ved ønskede konsentrasjoner) etter behov for å regulere spesifikke cellesignaleringsveier involvert i nyreutvikling og podocyttfunksjon. Spesielt involverte genereringen av mesodermceller fra hiPS-celler aktiveringen av den kanoniske Wnt-signalveien som ble utført ved hjelp av det lille molekylet CHIR9902119. Den kanoniske Wnt-signalveien er kjent for å regulere transkripsjonsaktiviteten til gener som er involvert i vevsutvikling og mønster in vivo, samt celleproliferasjon og migrasjon20,21. Celleinduksjonsmediet som brukes i denne protokollen muliggjør avledning av podocytter fra iPS-celleavledede mellomliggende mesodermceller. Dette podocyttinduksjonsmediet består av Activin A, BMP7, VEGF, retinoinsyre og CHIR99021. Spesielt krever dette podocyttinduksjonsmediet ikke udefinerte serumkomponenter som føtal bovint serum, noe som kan skjule bidragene fra spesifikke faktorer og begrense anvendelsen av andre celledifferensieringsmetoder for mekanistiske studier av vevsutvikling og sykdom, noe som gjør det forskjellig fra de som brukes i tidligere forsøk på å generere nyrecelletyper22. I tillegg ble det observert at FGF2 og FGF9 ikke er nødvendig for differensiering av nyre podocytter fra hiPS-celler6,7,22. Mens tidligere metoder som er avhengige av dannelsen av multicellulære aggregater som embryoide legemer og organoider, produserer metoden som er beskrevet her celler som viser en moden fenotype, både morfologisk og ved uttrykk for avstamningsspesifikke markører, inkludert nephrin og podocin, og nedregulering av stamcellemarkører som PAX2. Det forventes at kunnskapen om de kjemiske komponentene som brukes i denne protokollen, kan lette mekanistiske studier av utvikling av humant nyrevev, podocyttlinjespesifikasjon og sykdomspatogenese i fremtiden.
Denne metoden for hiPS-celledifferensiering muliggjør også generering av modne, postmitotiske og funksjonelle podocytter med mer enn 90% effektivitet, uten valg av delbefolkning, genetiske manipulasjoner eller xenotransplantasjon. Dette er spesielt forskjellig fra tidligere forsøk der høye nivåer av cellulær heterogenitet6,7,23 begrenset bruken av stamcelledifferensieringsmetodene for translasjonelle medisinapplikasjoner. Denne metoden presenterer også et betydelig fremskritt for feltet gitt utfordringene forbundet med ekstremt begrenset tilgjengelighet av humane nyre podocytter fra andre kilder som primærvev eller organoider. Noen av utfordringene inkluderer lav avledningseffektivitet på mindre enn 1% ved bruk av metoder som er avhengige av dannelse av embryoide legemer eller organoider6,7.
En begrensning i denne protokollen er de relativt høye kostnadene for reagensene som kreves for stamcellekulturen og differensieringstrinnene, noe som kan hindre implementeringen i noen laboratorier eller forskningsgrupper. Fordi mye optimalisering for flere faktorer i cellens mikromiljø (dvs. både løselige og uoppløselige eller selvklebende signaler) var involvert, anbefaler vi at protokollen følges som beskrevet. En vanlig feil notert fra andre som var interessert i å bruke denne podocyttdifferensieringsmetoden inkluderte bruk av upassende celleadhesjonsmatriser som BM-matrise 1 eller andre dårlig definerte animalske avledede proteiner. Når protokollen er fulgt som beskrevet, kan ytterligere eksperimenter utføres for å undersøke effekten av andre modifikasjoner i protokollen. Videre, på grunn av de iboende forskjellene mellom forskjellige menneskelige stamcellelinjer, er det verdt å merke seg at noen aspekter av differensieringsmetoden, for eksempel tidspunktet for eksponering for differensieringsmedium eller celledissosiasjonsmedium, og cellefrøtetthet, kanskje må optimaliseres. Disse forholdene ble imidlertid ikke endret for hiPS-cellelinjene og embryonale stamcellelinjer som er testet til dags dato. Denne podocyttdifferensieringsmetoden fungerer på tvers av flere hiPS-cellelinjer, inkludert PGP1, IMR-90-1 og IISH3i-CB6 samt H9 embryonal stamcellelinje8,11. I denne rapporten demonstrerer vi også den vellykkede differensieringen av DU11 hiPS-cellelinjen ved hjelp av samme protokoll (figur 1 og figur 2). Gitt konsistensen av denne metoden på tvers av ulike cellelinjer, inkludert resultater fra upublisert arbeid fra andre uavhengige forskningslaboratorier (prepublisering), forventer vi at denne differensieringsprotokollen vil være nyttig for avledning av nyre podocytter fra et bredt utvalg av hiPS-cellelinjer, og derfor ikke begrenset til den som brukes i denne protokollen.
Gitt kapasiteten til hiPS-celler til å fornye seg selv på ubestemt tid, kan denne differensieringsmetoden brukes til å gi forskere en lett tilgjengelig kilde til humane nyrepodocytter. Dette kan bidra til å fremme den nåværende forståelsen av menneskelig nyrebiologi og sykdom24, samt muliggjøre utvikling av nye in vitro nyresystemer for modellering av menneskelig nyrefunksjon og respons på terapeutiske stoffer. For eksempel ble protokollen beskrevet her nylig ansatt og integrert med et mikrofluidisk organ-på-en-chip-system for å utvikle en funksjonell in vitro-modell av den menneskelige nyreglomerulære kapillærveggen. Denne glomerulære brikken filtrerte selektivt sirkulerende molekyler og rekapitulert legemiddelindusert nefrotoksisitet når den ble utsatt for kjemoterapimedisinen, Adriamycin8. I fremtiden kan disse resultatene potensielt integreres med 3D bioprinting teknologier for å konstruere mer komplekse in vitro modeller av den menneskelige nyre. Slike fremskritt kan gi nye plattformer for evaluering av narkotikakandidater, spesielt de som retter seg mot former for nyresykdommer som oppstår fra dysfunksjon av glomerulære podocytter. Dette er spesielt viktig da de artsspesifikke forskjellene mellom dyremodeller og mangel på organnivåfunksjoner som vanligvis observeres i standard vevskulturmetoder, kan hindre utviklingen av målrettede terapeutiske midler for ulike former for menneskelige nyresykdommer25. Dermed kan denne protokollen en dag gi muligheter til å avdekke signalveiene som er involvert i utviklingen av den menneskelige nyre, samt patogenesen av sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. er forfatter på et patent som venter på metoder for generering av nyre podocytter fra pluripotente stamceller (amerikansk patentsøknad 14/950859). De resterende forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Pratt School of Engineering ved Duke University, Divisjon for nefrologi ved Duke Medical School, A Chair's Research Award fra Institutt for medisin ved Duke University, og en Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award til S.M.. M.B ble støttet av National Science Foundations Graduate Research Fellowship Program. Vi takker Bursac Lab for sjenerøst å gi oss DU11 stamcellelinjen, og Varghese Lab ved Duke University for midlertidig å dele deres vevskulturanlegg med gruppen vår. Denne publikasjonen er dedikert til prof. Laura L. Kiessling, Novartis professor i kjemi ved Massachusetts Institute of Technology, i feiringen av hennes 60-årsdag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
