Summary
여기에 제시된 화학적으로 정의된 프로토콜은 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 > 유전 조작 또는 하위 집단 선택과 무관하게 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 유래한다. 이 프로토콜은 26 일 이내에 원하는 세포 유형을 생성하고 신장 독성 검사 및 질병 모델링에 유용 할 수 있습니다.
Abstract
신장 병은 전 세계 인구의 10% 이상에 영향을 미치고 연방 지출에 수십억 달러의 비용이 듭니다. 신장 질환과 최종 말기 신부전의 가장 심각한 형태는 종종 신장의 여과 장벽을 형성하기 위해 내피 세포 및 구체 지하실 막과 함께 작동하는 고도로 전문화 된 상피 세포인 구체 포도세포의 손상에 의해 발생합니다. 신장 의학의 발전은 1 차 조직의 제한된 가용성과 podocytes와 같은 기능적인 인간 신장 세포의 파생을 위한 강력한 방법의 부족에 의해 방해되었습니다. 줄기 세포와 같은 재생 가능한 소스에서 podocytes를 파생하는 기능은 인간 신장 발달 및 질병의 기계장치의 현재 이해를 발전시키는 것을 도울 뿐만 아니라 치료 발견을 위한 새로운 공구를 제공할 수 있었습니다. 이 프로토콜의 목표는 고효율 및 특이성을 가진 인간 유도만능 줄기 (hiPS) 세포로부터 성숙하고 미토성 후 podocytes를 추출하고 화학적으로 정의된 조건하에서 도출하는 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 방법에 의해 생성된 hiPS 세포 유래 podocytes는 혈통 특이적 마커(nephrin, podocin 및 Wilm의 종양 1 포함)를 발현하고 성숙하고 기능적인 podocytes와 관련된 특수형태특성(1차 및 이차 발 프로세스 포함)을 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 특수 특징은 특히 현장에서 널리 사용되는 불멸의 podocyte 세포주에서 결석하며, 이는 본원에 기술된 프로토콜이 기존의 podocyte 세포주보다 발달적으로 더 성숙한 표현형을 갖는 인간 신장 podocytes를 생산한다는 것을 시사한다.
Introduction
인간 만능 줄기 세포 배양의 발전은 연구자들이인체내거의 모든 세포 유형을 얻기 위해 설계될 수 있는 생물학적 물질의 재생 가능하고 확장 가능한 근원을 제공함으로써 재생 의학, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 혁명을 일으킬 태세입니다. 이 전략은 그렇지 않으면 얻기 어려울 전문적이고 기능적인 세포 유형을 유도하는 데 특히 유용합니다. 인간 유도만능 줄기(hiPS) 세포2,3,4,5는 그들의 체세포 기원 과 개인화된 의학을 대변하는 잠재력 때문에 특히 매력적이다. 그러나, hiPS 세포로부터 다른 세포 혈통을 유도하는 방법을 개발하는 방법은 낮은 효율과 비특이적 세대의 이종세포 집단을 유도하는 제대로 정의된 배양 조건의 빈번한 사용으로 인해 여전히 어려운 남아 있다6,7.
여기에 제시된 화학적으로 정의된 조건하에서 특이성과 고효율을 가진 hiPS 세포로부터 성숙한 신장 세포세포의 유래를 위한 방법이 있다. 세포 마이크로환경 내의 다중 인자의 역할을 고려하여 세포 배양 배지에 제시된 수용성 인자의 최적화뿐만 아니라 세포외 매트릭스 성분 또는 접착제 기판과 같은 불용성 인자의 최적화를 포함하는 줄기 세포 분화 전략이 개발되었다. 포도세포 발달 및 기능에서 인테그린 신호의 중요성을 감안할 때, 세포 표면에 있는 인테그린 수용체의 발현은 처음에 검토되었다. β1 인테그린은 hiPS 세포뿐만 아니라 중질 및 중간 중질 세포를 포함하는 유도체에서도 높게 발현되었다8,9,10. 후속 실험은 β1 통합에 결합하는 리간드(라미닌 511 또는 라미닌 511-E8 단편 포함)가 아래에 설명된 수용성 유도성 매체와 함께 사용될 때 hiPS 세포의 접착 및 분화를 podocytes로 분리하는 것을 확인하였다.
세포 계보 약정의 유도는 먼저 액티빈 A, CHIR99021 및 Y27632 바위 억제제가 함유된 배지의 존재 속에서 라미닌 코팅 표면에 배양된 hiPS 세포가 초기 메소더름 마커 HAND1, 거스로이드 및 brachry81,brachry81을발현하는 세포로 분화할 수 있음을 확인함으로써 시작되었다. 14일 동안 중피세포를 골형태유전학단백질 7(BMP-7) 및 CHIR99021로 보충한 중간 중질세포를 치료하여 신장-전구 세포 마커 윌름의 종양 1(WT1), 홀수 건너뛰관련 단백질 1(OSR1) 및 12유전자(OSR1) 및 12유전자(OSR1)및12유전자(OSR1) 및12유전자를발간하였다. 성숙한 신장 구체 포도세포를 도출하기 위하여는, 중간 중구 세포는 BMP-7, 액티빈 A, 혈관 내피 성장 인자(VEGF),모든-트랜스 망막산 및 CHIR99021로 구성된 새로운 매체로 4-5 일 동안 처리되었다. 유동 세포및 면역스테인링은 생성된 세포의 >90%가 성숙한 신장 분두세포의 분자, 형태학적 및 기능적 특성을나타낸다는 것을 확인하기 위해 사용되었다8,11,13. 이러한 특성은 기본 및 이차 발 프로세스의 개발을 포함한다; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28을 포함하는 포도세포 계보 특이적 유전자의 발현및 포도신, 네프린 및 WT114,15,16을포함하는 단백질의 발현. 또한, hiPS 세포 유래 podocytes는 상용 배지8,11을 사용하여 시험관 내에서 최대 4주 동안 배양하여 유지될 수 있어 다운스트림 실험의 타이밍에 추가적인 유연성을 제공한다는 것을 발견하였다. hiPS-podocytes의 순도를 결정하는 데 사용되는 유동 세포측정패널에 대한 자세한 내용은 이전간행물(11)을참조하십시오.
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Protocol
1. 시약 준비
- 희석 해동 5x hiPS 세포 배양 매체 (CCM) hiPS 세포 배양 기저 배지에 보충 hiPS CCM의 1 x 용액을 얻을 수 있습니다.
참고 : 냉동 5x hiPS CCM 보충은 하룻밤 동안 이상적으로 4 ° C에서 느린 해동 과정이 필요합니다. 1x hiPS CCM의 알리쿼트(Aliquots)는 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다. - hiPS 세포 배양을 위한 지하 막(BM) 매트릭스 1코팅 판의 준비: 4°C에서 얼음에 하룻밤 을 해동 BM 매트릭스 1. 해동되면 제조업체에서 제안한 적절한 희석 요인으로 알리쿼트를 준비하십시오.
참고: 일반적으로 알리쿼트(aliquots)는 50mL 원추형 튜브에서 25mL의 콜드 DMEM/F12에서 후속 희석을 위해 준비된 다음 BM 매트릭스 1을 완전히 용해하고 잔류 결정의 형성을 피하기 위해 철저한 혼합을 한다. - BM 매트릭스 1용액의 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 전송하고 37°C에서 1-2h 또는 4°C에서 파라핀 필름으로 싸서. BM 매트릭스 1-코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C로 저장할 수 있다.
- 지하 멤브레인 (BM) 매트릭스 2 - 코팅 플레이트의 준비 : 5 μg / mL의 최종 농도를 준비하기 위해 9 mL 멸균 증류수에 BM 매트릭스 2의 적절한 양을 희석. BM 매트릭스 2 용액의 700 μL을 12웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
- BMP7, 액티빈 A 및 VEGF 각각 100 μg/mL 스톡 솔루션을 준비하십시오: BMP7을 0.1%(wt/vol) BSA를 함유한 멸균 증류수의 BMP7을 재구성하고 0.1%(wt/vol)를 함유한 멸균 PBS에서 별도로 액티빈 A 및 VEGF를 재구성한다. 빈번한 동결 해동 주기를 피하기 위해 각 스톡 솔루션에서 100 μL 알리코트100을 준비하고 -20°C에 최대 6개월 간 보관하십시오.
- 멸균 증류수 3.079mL에서 Y27632 10 mg을 용해하여 Y27632의 10m M 스톡 솔루션을 준비한다. 육수에서 100 μL을 알리쿼트하고 -20°C에 보관하여 최대 6개월 동안 보관합니다.
- 멸균 DMSO 143.4 μL에 CHIR99021 2 mg을 녹여 30mM 스톡 솔루션을 준비합니다. 5 μL 알리쿼트를 준비하고 최대 1개월 동안 -20°C에 보관하십시오(또는 제조업체의 권장 사항에 따라).
- 3.33mL 멸균 DMSO에 10 mg의 올트랜스 망티노산을 녹입니다. 500 μL 알리쿼트를 준비하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
2. 문화미디어 준비
- 상응하는 스톡 용액을 100 ng/mL 액티빈 A, 3 μM CHIR99021, 10μM Y27632 및 1x B27 혈청 프리 보충제로 보충하여 중피 분화 매체를 대미염 보충제와 함께 준비한다.
참고: 중피 분화 배지는 분화 단계 전에 실험의 규모에 적합한 부피로 신선하게 준비되어야 합니다(일반적으로 50mL의 배지는 2개의 12웰 플레이트에 적합). - 글루타민 보충제를 사용하여 DMEM/F12의 최종 농도 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 및 1x B27 세럼 프리 보충제로 해당 스톡 솔루션을 재구성하여 중간 중질 균분화 매체를 준비한다.
참고: 필요한 경우, 배지는 1% (vol/vol) 페니실린-연쇄절제술로 보충될 수 있습니다. 글루타민 보충제로 DMEM/F12를 사용하여 매체의 부피를 조절합니다. 이 매체는 큰 배치로 제조 될 수있다; 그러나, 반복동결 해동 주기를 피하기 위해 작은 알리쿼트(예: 50mL 원판 튜브에 45mL)에 저장하는 것이 좋습니다. 이 매체는 최대 3개월 동안 -20°C에 보관할 수 있으며 사용하기 전에 하룻밤 사이에 4°C에서 해동될 수 있다. - 최종 농도 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL 활성제 A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 혈청 프리 보충제, 및 0.1M μ-트랜스노비드 비약제 및 0.1M μ-트랜스노비드 비약 제비 로 FM2의 비료 를 보충하여 포도시테 유도 매체를 준비한다. 빛으로부터 매체를 보호하십시오(예: 호일 용지로 용기를 래핑하여).
참고:이 매체는 큰 배치로 제조하고 최대 3 개월 동안 -20 °C에서 어둠 속에서 저장할 수 있습니다. 냉동 알리쿼트사용 전에 4°C에서 하룻밤 동안 해동해야 합니다. - DMEM/F12에 10%(vol/vol) 열 비활성화 FBS를 추가하고 멸균 조건하에서 필터를 추가하여 25mL의 트립신 중화 솔루션을 준비하십시오.
- 줄기 세포 유래 podocytes의 후분화 유지를 위해 제조업체의 지침에 따라 기저 배지에 보충제를 추가하여 podocyte 유지 보수 매체로 완전한 매체를 준비하고 최대 2 주 동안 4 °C에 보관하십시오.
3. hiPS 세포 배양 배지를 이용한 피더 프리 hiPS 세포 배양
- BM 매트릭스 1의 잔류 용액을 미리 코팅된 플레이트에서 흡기하고 1~2mL의 데운 DMEM/F12로 우물을 3회 세척한다.
- 흡인은 hiPS 세포에서 hiPS CCM을 보냈고 데운 DMEM/F12로 세포를 3번 헹구었습니다. 1mL의 웜 셀 분리 용액을 추가하고 37°C에서 1분 동안 배양하여 세포를 해리시화합니다. 조직 배양 현미경하에서 세포의 육안 검사를 수행하고 세포 식민지의 가장자리가 둥글게 나타나는지 확인 한 다음 세포 분리 용액을 신속하게 흡인합니다 (세포 식민지가 여전히 접시에 부착되도록하십시오.하지만 느슨하게). DMEM/F12로 세포를 한 번 부드럽게 헹구어 세포 분리 용액을 제거합니다.
- 세포 분리 용액으로 처리된 hiPS 세포(6웰 플레이트의 각 웰)에 hiPS CCM 3mL을 추가합니다. 셀 리프터를 사용하여 콜로니를 긁어 내고, 느슨하게 부착된 세포를 제거하기 위해 부드럽게 피펫 셀 서스펜션을 위아래로 피펫합니다. 모든 세포가 수확되도록 플레이트를 철저히 세척하십시오.
참고: 셀의 과도한 전단을 피하기 위해 5mL 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다. - 새로운 BM 매트릭스 1-코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 0.5 mL을 잘 당 2 mL의 hiPS CCM을 전달한다. 피겨-8 패션으로 플레이트를 이동하여 우물 내의 세포 식민지를 분배하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 세포가 분화 또는 분화 실험 (약 70 % 수렴)에 사용될 준비가 될 때까지 매일 배지를 새로 고칩니다.
참고: iPSC의 일상적인 패싱을 위한 이상적인 식민지 크기는 hiPS CCM(ROCK 억제제 제외)를 사용하여 피더 없는 조건 하에서 200-500 μm 사이입니다. 세포가 해리 효소 또는 완충제로 치료하는 동안 개별화되는 경우, hiPS CCM은 세포 생존가능성을 향상시키기 위해 ROCK 억제제(예를 들어, 10 μM Y27632)로 보충될 수 있다.
4. hiPS 세포의 분화 는 중피 세포로 분화 (일 0-2)
- hiPS 세포 배양은 기하급수적 성장 단계(월화 후 배양 의 약 4 일 이내에 약 70 % 수렴)에 있는 동안, 식민지의 가장자리 안팎에서 자발적으로 분화 된 세포의 존재를 시각적으로 검사합니다. 필요한 경우 차균적으로 차별화 영역을 긁어냅니다.
- hiPS 세포에서 흡인 hiPS CCM을 흡인하고 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 3번 헹구세요. 37°C에서 10분 동안 효소가 없는 세포 해리 버퍼1mL로 세포를 배양하고 현미경하에서 해리를 확인한다. 상이한 hiPS 세포주 간의 내재된 차이로 인해 세포 해리 버퍼의 실제 잠복기 시간은 지정된 세포주를 위해 결정되어야 합니다.
- 느슨하게 부착된 세포를 빼내고 셀 현탁액을 15mL 원추형 튜브로 옮기고, 그 다음에 는 hiPS 세포를 개별화하기 위해 여러 번 피펫팅하여 셀 리프터로 우물을 부드럽게 긁어냅니다.
- 실온에서 290 x g에서 5 분 동안 따뜻한 DMEM / F12 및 원심 분리기로 셀 서스펜션을 15 mL 볼륨으로 가져옵니다.
- 잔류 BM 매트릭스 1 및 해리 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 상체를 부드럽게 흡인하고 따뜻한 DMEM / F12로 세포를 다시 분리하여 원심 분리의 또 다른 라운드를 제거합니다.
- 상술한 바와 같이 중피 유도 배지의 1mL에서 슈퍼네티산을 흡인하고 세포를 재중단한다. 혈류계 또는 쿨터 카운터를 사용하여 세포의 총 수를 계산하여 1 x 105 세포/mL의 농도를 달성하는 데 필요한 중피 분화 배지의 적절한 부피를 결정한다.
- BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에서 ECM 용액을 흡입하고 따뜻한 DMEM / F12로 플레이트를 두 번 헹구십시오. 몇 번 피펫팅하여 hiPS 셀 서스펜션을 부드럽게 섞습니다. BM 매트릭스 2 코팅 12웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션의 1mL를 전송한 다음 부드럽게 판을 흔들어 세포를 더 균등하게 분배합니다.
- 5% CO2 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 배양합니다. 다음 날 중피 유도 매체를 새로 고칩니다.
참고: 2일 후에, hiPS 세포 유래 중피 세포는 중간 중증 유도를 위한 준비가 될 것입니다.
5. hiPS 세포 유래 중피 세포의 분화중간경(일 2-16일)
- 차별화 프로토콜의 2일째에, 중피 유도 배지를 흡수시키고, 중간 중질도 유도 배지당 1mL로 보충한다.
- 신진 대사 활성 세포에 대한 성장 인자와 작은 분자의 정확한 임계 값을 유지하기 위해 매일 매체를 새로 고침. 미디어 영양소의 상당한 세포 성장 및 급속한 고갈이 있는 경우(매체의 황변에 의해 표시), 중간 중구 분화 배지의 부피는 12웰 플레이트의 웰당 1.3mL로 증가될 수 있다.
- 중간 중피 세포를 얻기 위해 추가 14 일 동안 배양 세포. 16일째에, 이 세포는 나중에 사용하기 위해 냉동 보존될 수 있습니다.
6. hiPS 세포 유래 중간 중질 세포의 분화(일 16 받는 사람 21)
- 37°C에서 3분 동안 0.05% 트립신-EDTA의 웰당 0.5mL의 세포 배양으로 중간 중음근 세포를 헹구는 다. 세포가 해리되기 시작되었는지 확인하기 위해 육안으로 검사를 수행합니다.
- 셀 리프터와 파이펫을 사용하여 세포를 긁어 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 개별화된 (또는 작은 덩어리) 세포를 얻습니다.
참고: 이 단계에서, 응집된 세포가 프로토콜의 타임라인 내에서 말단분화 표현형을 획득하지 못할 수 있으므로 세포가 완전히 해리되는지 확인합니다. - 트립신의 활동을 중지 트립신 중화 솔루션의 우물 당 약 2 mL을 추가합니다.
- 세포를 50mL 원상 튜브로 옮기고 DMEM/F12를 사용하여 최대 50mL의 부피를 가져온 다음 실온에서 201 x g에서 5분 동안 셀 서스펜션을 원심분리합니다.
- 초신자를 흡인하고 포도세포 유도 배지에서 세포를 재중단한다. 최적의 결과를 얻으려면 약 100,000개의 세포/웰의 최종 시드 밀도를 12개의 웰 플레이트로 보장하십시오. BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에 셀 서스펜션을 추가하고 부드럽게 세포를 더 균등하게 분배하는 데 도움이 접시를 흔들어.
- 세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양하고 21일까지 세포세포를 얻기 위해 최대 5일 동안 매일 배지를 새로 고칩니다.
참고: 결과 hiPS 세포 유래 podocytes는 podocyte 유지 보수 매체를 가진 완전한 매체를 사용하여 2-4 추가 주 동안 배양에서 유지될 수 있습니다. 일단 podocyte 유지 보수 매체에 일단, 세포는 격일로 공급될 수 있고 후속 연구 또는 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 목표는 성숙한 인간 podocytes가 화학적으로 정의된 조건의 밑에 hiPS 세포에서 파생될 수 있다는 것을 보여주기 위한 것이었습니다. 본 원고에 제시된 데이터는 처음 테스트된 DU11 hiPS세포주(17)를사용하여 생성되었으며, 마이코플라즈마가 없는 것으로 나타났다. 염색체 분석도 수행되었고, 세포는 karyo전상정상인 것으로 나타났다. 미분화 DU11 hiPS 세포를 시작으로, 본 보고서에 설명된 분화전략(도 1)은먼저 브라추리를 발현하는 중피 세포로 줄기세포(도2A)를분화하기 위해 채택되었다(도 1B 및 도 2B),PAX2 양성 중형 메소더름세포(도 2C), 및 마지막으로 성숙신장발구체(도 2C)로 분화한 후, 신장 발구체(그림2C)로분화한 후, 신장발포체로 의기화하였다. 그림 2D, 그림 3D및 그림 4). 중구 세포는 분화 프로토콜의 2일째에 의해 수득되었고, 중간 중구 세포는 16일째에 생성되었고, 성숙한 포도세포는 분화 프로토콜의 21일째에 의해 얻어졌다. 생성된 podocytes는 이 실험에 사용된 라미닌 코팅 판과 같은 평평한 조직 배양 표면에 부착될 때 약 150-200 μm 크기였다. 상기 세포 유래 podocytes는 위상 대비 현미경검사(도1),면역형광 현미경검사(도4)및 스캐닝 전자 현미경 검사법8,11을포함하는 다중 보완기술을 사용하여 시각화된 수많은 발 공정 과 같은 확장을 나타낸다. 줄기 세포 유래 podocytes는 또한 WT115 (도 2D)뿐만 아니라 계보 식별 마커 nephrin(14)에 대한 양성 염색(도 4). 흥미롭게도, 네프린의 세포세포 국소화는 주로 포도세포 발 공정 및 세포 세포질에서 성숙한 포도세포 표현형(도2D 및 도 4A,B)과일치하였다. 발달 및 포도세포 생리학 에서 단백질 네프린은 세포 핵과 세포질 사이로 회람되지만, 네프린은 세포세포가 성숙해기능 표현형18을획득함에 따라 세포질 및 발 공정에서 주로 발현된다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 분화 프로토콜을 이용하여 생성된 포도세포가 세포질 및 발 공정과 같은 구조에서 주로 발현성 네프린을 발현하는 것이 보다 성숙하거나 전문화된 포도세포의 생성을 위한 이 프로토콜의 유용성을 강조한다는 관측이다. hiPS 세포 유래 podocytes의 주사 전자 현미경 은 이전에 우리 그룹8에의해보고 된 hiPS 세포 유래 podocytes에서 1 차 및 이차 발 프로세스의 분기를 강조8,11. WT1은 신장 podocytes의 확실한 마커가 아니기 때문에, 연구원은 또한 podocin와 nephrin와 같은 podocyte 특정 마커의 동시 발현을 위한 그들의 세포를 특성화하는 것이 좋습니다. 이전에는 포도신, 네프린 및 WT1에 대한 면역스테인 양성을 이용하여 유래된 말단 분화 된 podocytes가 전구 세포 마커 PAX28,11의발현이 그에 상응하는 감소와 함께 있음을 보여주었다. 함께, 이러한 결과는 이 프로토콜을 사용하여 파생된 podocytes가 기능성 인간 신장 구체 세포에 요구되는 발달성숙 또는 전문화되어 있음을 나타낸다.
분화 방법에 대한 최적화 조건에서, 중간 중음 세포가 부적절하게 해리된 경우를 관찰하였다. 12웰 플레이트의 100,000개의 세포/웰의 권장 밀도를 크게 초과하는 밀도에서 시드된 세포는 프로토콜의 표준 타임라인 내에서 성숙한 podocytes의 예상 형태학적 표현형이 결여된 세포의 큰클러스터(그림 3A,B)를초래하였다. 이러한 이유로, 연구원은 특정 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 원하는 수 있습니다 다른 조건으로 실험 하기 전에이 프로토콜에 권장 하는 시드 밀도 사용 하는 것이 좋습니다(그림 3C,D)특정 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 원하는 수 있습니다. 함께, 이러한 결과는 위에서 설명한 화학적으로 정의된 매체를 사용하여 3주 이내에 신장 구엽 포도세포로 hiPS 세포의 지시된 분화를 나타낸다.
그림 1: 최대 세포에 대한 hiPS 세포의 분화.
(A)공동축세포의 분화를 포도세포로 유도하는 방법의 회로도 표현. BMP7, 뼈 형태 유전학 단백질 7; RA, 망사산; VEGF, 혈관 내피 성장 인자. 이 그림은 심판11에서수정되었습니다. (B)각 분화 단계에서 hiPS 세포의 대표적인 이미지. 왼쪽에서 오른쪽으로, 이미지는 0일째에 분화하기 전에 특이성 인간 iPS 세포 식민지를 보여주고, 2일간의 분화 후 중구 세포를, 그 다음에 는 분화의 약 10일에서 중간 중구 세포가, 그리고 마침내 22일째에 말기 분화된 포도세포가 있다. 스케일 바, 모든 이미지에 대한 100 μm (패널 B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: hiPS 세포의 면역 형광 이미지 및 분화 타임 라인 동안 계보 별 마커 및 핵 반소의 발현을 보여주는 그들의 분화 된 유도체.
(A)발성 마커 10월4을 발현하는 인간 iPS 세포; (B)브라류리(T)를 발현하는 중피 세포; (C)PAX2를 발현하는 중간 중질 세포; 및(D)계보 식별 마커, 네프린 및 관련 마커, WT1을 발현하는 hiPS 세포 유래 podocytes. 스케일 바, 모든 이미지에 대한 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DU11 hiPS 세포주로부터 유래된 중간 중구 세포의 분화 전위에 대한 최적 시드 밀도의 효과.
(A)초기 세포 파종 밀도가 너무 높을 때(약 500,000개의 세포/웰 12웰 플레이트), 세포는 포도시테 유도 단계에서 조밀한 골재(B)를 형성할 수 있다. (C)12웰 플레이트의 응집(100,000개의 세포/웰)을 방지하고, 포도세포 분화 단계(inset) 동안 발 공정과 같은 구조의 연장을 현미경으로 관찰하는 것이 좋습니다. 스케일 바, A-D용 200 μm; D. Inset의 경우 100 μm이 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 4: hiPS 세포 유래 podocytes 는 체외에서형태학적으로 성숙한 표현형을 나타낸다.
(A)신장에 대한 hiPS 세포 유래 포도세포의 면역염색,(B)이러한 특수 세포 구조에서 신프린의 발현뿐만 아니라 1차 및 이차 공정(white arrows)을 보여주는 podocyte 발 과정의 배율 이미지. 스케일 바, 100 μm (A); 50 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고에서는, 우리는 hiPS 세포에서 신장 구엽 포도세포의 생성을 위한 프로토콜을 기술합니다. hiPS 세포 유래 podocytes는 성숙한 신장 podocyte 표현형(13)과관련된 형태학적 및 분자 특징을 나타낸다. 이전 간행물에서, 우리는 hiPS 세포 유래 podocytes가 구체 미생물 혈관 내피 세포와 결합할 때 신장 구체 구체세포의 구조 및 선택적 여과 기능을 모방할 수 있음을 보여주었다8,11.
다음 중요한 단계는 이 프로토콜을 조정하는 데 관심이 있는 연구원들에 의해 고려되어야 합니다. 첫째, 중피 세포의 유도를 위해 라미닌 코팅 플레이트에 hiPS 세포의 파종은 중요한 단계이다. 100,000 개의 세포 / 우물의 파종 밀도가 권장되는 반면, 연구원은 연구에 사용되는 줄기 세포주의 복제 속도에 따라 초기 세포 파종 밀도를 조정할 수 있습니다. 필요한 경우, 이러한 최적화는 중구 유도 단계에서 적절한 세포 밀도를 보장하고 잠재적으로 중피, 중간 중구, 또는 포도세포 표현형의 품질을 손상시킬 수 있는 세포 응집체 또는 매우 큰 덩어리의 형성을 방지할것이다(그림 3). 또한 CHIR99021과 같은 일부 시약에 대한 제조업체 사양의 차이는 분화 된 세포의 품질에 영향을 미칠 수 있음을 주목하는 것이 중요합니다. 따라서, 독립적인 실험 간의 생물학적 활동과 일관성에 대해 다른 로트 번호 또는 공급업체 및 공급업체의 시약을 테스트하는 것이 좋습니다. 또한, 이러한 접착 매트릭스에서 원치 않는 분리및 중간 포부 동안 세포의 가능한 손실로 이어질 수 있으므로 해리 효소에 hiPS 세포의 과도한 노출을 피하는 것이 중요합니다. 주목할 만한 또 다른 중요한 단계는 포도세포 유도 매체가 광으로 인한 망막산의 비활성화를 방지하기 위해 빛으로부터 보호되도록 하는 것입니다.
인간 신장 podocytes의 분화를 위한 이전 방법에 비해, 여기에서 기술된 방법은 신장 발달 및 podocyte 기능에 관련시킨 특정 세포 신호 통로를 조절하기 위하여 필요에 따라 화학적으로 정의된 요인 (소분자, 성장 인자 및 지하 막 단백질의 특정 동소형을 포함하여, 원하는 농도)를 채택합니다. 구체적으로, hiPS 세포로부터의 중구 세포의 생성은 작은 분자 CHIR9902119를이용하여 영향을 받는 표준 Wnt 신호 경로의 활성화를 포함시켰다. 정황 Wnt 신호 경로는 생체 내에서 조직 개발 및 패터닝에 관여하는 유전자의 전사 활성뿐만 아니라 세포 증식 및이주(20,21)를조절하는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜에 사용되는 세포 유도 매체는 iPS 세포 유래 중간 중질 세포로부터 podocytes의 유도를 가능하게 한다. 이 podocyte 유도 매체는 액티빈 A, BMP7, VEGF, 망막산 및 CHIR99021로 구성됩니다. 특히, 이러한 podocyte 유도 매체는 특정 요인의 기여를 모호하게 하고 조직 개발 및 질병의 기계론 적 연구를 위한 다른 세포 분화 방법의 적용을 제한할 수 있는 태아 소 혈청과 같은 정의되지 않은 혈청 성분을 필요로 하지 않으며, 이는 신장 세포 유형22를생성하는 이전 시도에서 사용된 것과 구별되는 것으로 구별된다. 또한, FGF2 및 FGF9는 hiPS 세포6,7,22로부터신장 포도세포의 분화에 필요하지 않다는 것을 관찰하였다. 이전 방법은 배아 체 및 오르가노이드와 같은 다세포 응집체의 형성에 의존하지만, 여기서 설명된 방법은 신장 및 포도신을 포함한 계보 특이적 마커의 발현, 그리고 PAX2와 같은 전구 세포 마커의 하향 조절에 의해 형태학적으로 성숙한 표현형을 나타내는 세포를 생성한다. 이 프로토콜에 사용되는 화학 성분에 대한 지식은 향후 인간 신장 조직 개발, podocyte 계보 사양 및 질병 병인의 기계적 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
hiPS 세포 분화를 위한 이 방법은 또한 하위 인구 선택, 유전 조작 또는 xenotransplantation 없이 90% 이상의 효율을 가진 성숙한, 포스트미토틱 및 기능성 podocytes의 생성을 가능하게 합니다. 이는 높은 수준의 세포 이질성6,7,23이 번역 의학 응용을 위한 줄기 세포 분화 방법의 사용을 제한하는 이전 시도와 는 특히 다르다. 이 방법은 또한 1 차적인 조직 또는 유기인과 같은 그밖 근원에서 인간 신장 podocytes의 극단적으로 제한된 가용성과 관련되었던 도전을 주어진 필드에 대한 중요한 진보를 제시합니다. 일부 과제는 배아 체 또는 오르가노이드6,7의형성에 의존하는 방법을 사용할 때 1% 미만의 낮은 파생효율을포함한다.
이 프로토콜에 대한 한 가지 제한은 줄기 세포 배양 및 분화 단계에 필요한 시약의 상대적으로 높은 비용이며, 이는 일부 실험실 또는 연구 그룹에서의 구현을 방해할 수 있다. 또한, 셀의 마이크로 환경(즉, 용해성 및 불용성 또는 접착제 단서 모두)에 있는 다중 요인에 대한 많은 최적화가 관련되었기 때문에, 우리는 프로토콜이 설명된 대로 따르는 것이 좋습니다. 이 podocyte 분화 방법을 사용하는 데 관심이 있는 다른 사람들로부터 지적된 일반적인 실수는 BM 매트릭스 1 또는 그밖 제대로 정의된 동물 유래 단백질과 같은 부적당한 세포 접착 행렬의 사용을 포함했습니다. 프로토콜을 설명한 대로 수행하면 프로토콜에 대한 다른 수정의 효능을 검사하기 위해 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 더욱이, 상이한 인간 줄기 세포주 간의 내재된 차이로 인해, 분화 방법의 일부 양상, 예를 들어, 분화 배지 또는 세포 해리 배지에 대한 노출 타이밍, 및 세포 시축 밀도에 대한 노출 타이밍이 최적화될 필요가 있다는 점에 유의할 필요가 있다. 그러나, 이들 조건은 현재까지 시험된 hiPS 세포주 및 배아 줄기 세포주를 위해 변경되지 않았다. 이러한 podocyte 분화 방법은 PGP1, IMR-90-1 및 IISH3i-CB6뿐만 아니라 H9 배아 줄기 세포주8,11을포함한 다중 hiPS 세포주를 통해 작동한다. 본 보고서에서, 우리는 또한 동일한프로토콜(도 1 및 도 2)을사용하여 DU11 hiPS 세포주들의 성공적인 분화를 입증한다. 따라서, 다른 독립적인 연구 실험실(pre-publication)의 미공개 작업 결과를 포함하여 다양한 세포주에서 이러한 방법의 일관성을 감안할 때, 우리는 이러한 분화 프로토콜이 다양한 hiPS 세포주에서 신장 podocytes의 유도에 유용할 것으로 기대하며, 따라서, 본 프로토콜에 사용되는 것에 국한되지 않는다.
hiPS 세포의 용량을 무기한 으로 자가 갱신하는 능력을 감안할 때,이 분화 방법은 인간 신장 podocytes의 쉽게 사용할 수있는 소스를 연구원에게 제공하기 위해 사용될 수있다. 이것은 인간 신장 생물학과 질병의 현재 이해를 발전시키는 것을 도울 수 있었습니다24 뿐만 아니라 인간 신장 기능 및 치료에 대한 반응을 모델링하기위한 새로운 체외 신장 시스템의 개발을 가능하게 할 수 있습니다. 예를 들어, 본명에서 기재된 프로토콜은 최근에 인간 신장 구엽 모세관 벽의 기능적 체외 모델을 개발하기 위해 미세유체 장기-온-칩 시스템과 결합되었다. 이 사구형 칩은 화학요법 약물인 아드리아마이신8에노출되었을 때 순환 분자를 선택적으로 여과하고 약물 유발 신독성을 회수하였다. 미래에, 이 결과는 잠재적으로 인간 신장의 체외 모형을 설계하기 위하여 3D bioprinting 기술과 통합될 수 있었습니다. 이러한 발전은 약물 후보, 특히 구체 포도세포의 기능 장애로 인해 발생하는 신장 질환의 형태를 대상으로 하는 새로운 플랫폼을 제공 할 수 있습니다. 이는 동물 모델의 종별 차이와 표준 조직 배양 방법에서 일반적으로 관찰되는 장기 수준의 기능의 부족으로 인해 다양한 형태의 인간 신장질환(25)에대한 표적 치료제의 개발을 방해할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 따라서, 이 프로토콜은, 언젠가, 질병의 병신뿐만 아니라 인간 신장의 발달에 관련시킨 신호 통로를 해명할 기회를 제공할 수 있었습니다.
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Disclosures
S.M. 만능 줄기 세포에서 신장 podocytes의 생성을 위한 방법에 대한 특허 출원에 대한 저자입니다 (미국 특허 출원 14/950859). 나머지 저자는 경쟁 적인 관심사가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 듀크 대학의 공학의 프랫 학교, 듀크 의과 대학의 신장학 부문, 듀크 대학의 의과 대학에서 의자 연구 상, 그리고 S.M버로우 웰스 웰컴 펀드 PDEP 경력 전환 애드 호크 상에 의해 지원되었다. M.B국립과학재단의 대학원 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 받았습니다. 우리는 DU11 줄기 세포주를 아낌없이 우리에게 제공 버삭 연구소, 일시적으로 우리의 그룹과 자신의 조직 문화 시설을 공유 듀크 대학의 Varghese 연구소에 감사드립니다. 이 출판물은 그녀의 60번째 생일을 축하하기 위해 매사추세츠 공과 대학의 노바티스 화학 교수 인 로라 L. 키슬링 교수에게 헌정되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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