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Neuroscience

Transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans un modèle félin de grand animal

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal est présentée ici.

Abstract

Les conditions dégénératives rétiniennes (DR) associées à la perte de photorécepteurs telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinite pigmentaire (RP) et l’amaurose congénitale de Leber (ACL) entraînent une perte de vision progressive et débilitante. Il existe un besoin non satisfait de thérapies capables de restaurer la vision une fois que les photorécepteurs ont été perdus. La transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) (organoïdes) dans l’espace sous-rétinien d’un œil atteint de RD avancée apporte des feuilles de tissu rétinien avec des milliers de photorécepteurs sains sans mutation et a le potentiel de traiter la plupart / toutes les maladies cécitant associées à la dégénérescence des photorécepteurs avec un protocole approuvé. La transplantation de tissu rétinien fœtal dans l’espace sous-rétinien de modèles animaux et de personnes atteintes de RD avancée a été développée avec succès mais ne peut pas être utilisée comme traitement de routine en raison de préoccupations éthiques et d’un approvisionnement tissulaire limité. Les modèles animaux de dégénérescence rétinienne héréditaire (IRD) du grand œil sont précieux pour développer des thérapies de restauration de la vision utilisant des approches chirurgicales avancées pour transplanter des cellules / tissus rétiniens dans l’espace sous-rétinien. Les similitudes dans la taille du globe et la distribution des photorécepteurs (par exemple, la présence d’une région centrale semblable à la macula) et la disponibilité de modèles IRD récapitulant étroitement l’IRD humain faciliteraient la traduction rapide d’un traitement prometteur à la clinique. Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de hPSC dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal permet d’évaluer cette approche prometteuse dans des modèles animaux.

Introduction

Des millions de personnes dans le monde sont touchées par la dégénérescence rétinienne (DR) avec une déficience visuelle ou une cécité associée à la perte des photorécepteurs (PR) de détection de la lumière. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une cause majeure de cécité résultant d’une combinaison de facteurs de risque génétiques et de facteurs environnementaux / liés au mode de vie. En outre, plus de 200 gènes et loci ont été trouvés pour causer la RD héréditaire (IRD)1. La rétinite pigmentaire (RP), l’IRD la plus courante, est génétiquement hétérogène avec plus de 3 000 mutations génétiques dans environ 70 gènes signalés 2,3,4. L’amaurose congénitale de Leber (ACL), qui provoque la cécité dans l’enfance, est également génétiquement hétérogène 5,6. La thérapie d’augmentation génique a été développée et fait l’objet d’essais cliniques pour le traitement d’un petit nombre d’IRDs 3,7. Cependant, une thérapie distincte doit être développée pour le traitement de chaque forme génétique distincte d’IRD et ne traiter ainsi qu’un petit sous-ensemble de patients. De plus, l’augmentation génique repose sur la présence d’une population de photorécepteurs récupérables et n’est donc pas applicable à la dégénérescence avancée.

Il existe donc un besoin clinique urgent et non encore satisfait pour le développement de thérapies abordant et traitant les DR avancés et la cécité profonde à terminale. Au cours des 2 dernières décennies, des implants neuroprothétiques ont été développés et testés sur de grands modèles animaux, tels que le chat, avant l’utilisation humaine 8,9,10,11,12,13,14. De même, au cours des 20 dernières années, des thérapies de remplacement de la rétine utilisant des feuilles de rétine embryonnaire ou même de mammifères matures greffées sous rétine ont été développées 15,16,17,18,19,20,21,22 et même testées avec succès chez des patients RD 23,24,25. Les deux approches utilisent l’idée d’introduire de nouveaux capteurs (photodiodes photovoltaïques en silicium dans le cas des dispositifs neuroprothétiques26,27, et photorécepteurs sains sans mutation organisés en feuilles, dans le cas de l’implantation de feuilles rétiniennes) dans la rétine avec des PR dégénérés. Des études récentes ont étudié l’utilisation d’approches basées sur les cellules souches telles que la transplantation de progéniteurs rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)28,29, de photorécepteurs hPSC 30 et d’organoïdes hPSC-rétiniens31,32,33. Les organoïdes rétiniens permettent la formation de tissu rétinien dans une boîte et la dérivation de feuilles photoréceptrices avec des milliers de RP sans mutation, qui ressemblent à la couche photoréceptrice dans la rétine fœtale humaine en développement 34,35,36,37,38,39,40. La transplantation de tissu rétinien dérivé de hPSC (organoïdes) dans l’espace sous-rétinien de patients atteints de maladies de RD est l’une des nouvelles approches prometteuses de thérapie cellulaire expérimentale, poursuivie par un certain nombre d’équipes 31,32,41,42. Par rapport à la transplantation de la suspension cellulaire (de jeunes photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens), il a été démontré que les feuilles transplantées de photorécepteurs fœtaux entraînaient des améliorations de la vision dans les essais cliniques23,24.

Le protocole présenté ici décrit, en détail, une procédure de transplantation pour l’administration sous-rétinienne des organoïdes rétiniens entiers (plutôt que des bords organoïdes33,41) comme un moyen potentiellement meilleur d’introduire des feuilles rétiniennes intactes avec des PN, d’augmenter la survie du greffon et d’améliorer la préservation de la feuille. Bien que des procédures pour introduire un morceau plat de rétine humaine et des patchs RPE aient été développées43,44,45, la transplantation de greffons 3D plus importants n’a pas été étudiée. Les organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches constituent une source inépuisable de feuilles de photorécepteurs pour le développement de technologies de restauration de la vision, sont exempts de restrictions éthiques et sont considérés comme une excellente source de tissu rétinien humain pour les thérapies axées sur le traitement de la RD avancée et de la cécité terminale46. Le développement de méthodes chirurgicales pour l’implantation sous-rétinienne précise d’organoïdes rétiniens avec une lésion minimale de la niche rétinienne de l’hôte (rétine neurale, épithélium pigmentaire rétinien et système vasculaire rétinien et choroïdien) est l’une des étapes critiques pour faire progresser cette thérapie vers des applications cliniques31,32. Les grands modèles animaux tels que les chats, les chiens, les porcs et les singes se sont révélés être de bons modèles pour étudier les méthodes d’administration chirurgicale ainsi que pour démontrer l’innocuité des feuilles de tissu implantées (cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)) et étudier l’utilisation d’organoïdes 41,44,45,47,48,49,50 . Le grand œil animal a une taille de globe similaire à celle de l’homme ainsi qu’une anatomie similaire, y compris la présence d’une région de forte densité de photorécepteurs, y compris des cônes (la zone centrale), ressemblant à la macula humaine 6,51,52.

Dans ce manuscrit, une technique d’implantation de tissu rétinien dérivé de hPSC (organoïdes) dans l’espace sous-rétinien de grands modèles animaux félins (chats de type sauvage et CrxRdy/+) est décrite, ce qui, avec des résultats d’efficacité prometteurs32,53, jette les bases du développement ultérieur d’une telle thérapie expérimentale vers des applications cliniques pour traiter les conditions de RD.

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Protocol

Les procédures ont été menées conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et sur la vision. Ils ont également été approuvés par le Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Des chats de type sauvage et CrxRdy/+ provenant d’une colonie de chats maintenus à la Michigan State University ont été utilisés dans cette étude. Les animaux ont été logés sous des cycles clair-obscurité de 12 h : 12 h et nourris avec un régime alimentaire commercial complet pour chats.

1. Procédures préimplantatoires et montage chirurgical

  1. Sélectionnez des chats de type sauvage ou CrxRdy/+ en fonction du plan d’étude. Effectuer un examen ophtalmique préchirurgical, y compris la biomicroscopie à lampe à fente et l’ophtalmoscopie indirecte. Exclure tout animal présentant des anomalies du fond d’œil non liées à leur génotype.
  2. Une semaine avant l’implantation, commencer les animaux sur un protocole immunosuppresseur de cyclosporine orale 2 mg / kg et de prednisolone 1 mg / kg deux fois par jour pour aider à prévenir le rejet de greffe.
  3. Jeûnez les animaux de plus de 4 mois pendant la nuit (au moins 8 h). Fournir une quantité limitée de nourriture humide pendant la nuit aux animaux de moins de 4 mois, puis jeûnez-les pendant 2 heures avant la chirurgie.
  4. Effectuer un examen physique général, y compris une auscultation thoracique (à l’aide d’un stéthoscope). Notez la fréquence cardiaque et respiratoire, la température, la couleur des muqueuses et le temps de remplissage capillaire.
  5. Prémédication des animaux de moins de 4 mois avec de la buprénorphine (0,02 mg / kg) et ceux de plus de 4 mois avec de la buprénorphine (0,02 mg / kg) associée à de l’acépromazine (0,02 mg / kg) par voie sous-cutanée ou intramusculaire 30 à 45 minutes avant l’induction de l’anesthésie générale.
  6. Appliquer une solution ophtalmique topique de tropicamide à 1% et une solution ophtalmique de phényléphrine à 10% sur la surface oculaire au moins deux fois pour dilater les pupilles. Répétez si les pupilles ne sont pas bien dilatées.
  7. Placer un cathéter intraveineux de 22 G dans la veine céphalique chez tous les animaux: couper d’abord les poils d’une zone de 2 x 3 cm sur la veine céphalique; préparer la peau en la frottant d’abord avec de l’éthanol à 70%, puis avec un gommage à la chlorhexidine; Placez le cathéter et fixez-le avec du ruban adhésif médical et rincez avec une solution saline héparinisée. Chez les animaux de moins de 4 mois, cela peut être fait après l’induction de l’anesthésie.
  8. Induire une anesthésie générale 30 à 45 min après la prémédication : les animaux de moins de 4 mois sont induits avec de l’isoflurane administré par masque, ceux de plus de 4 mois sont induits par propofol par voie intraveineuse (4 à 6 mg/kg).
  9. Intuber avec une sonde endotrachéale de taille appropriée. Visualisez le larynx avec une lumière d’examen ou un laryngoscope. Vaporiser 0,1 mL de lidocaïne à 2% sur le larynx, attendre quelques secondes, puis intuber.
  10. Maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane (entre 2 % et 3,5 %) dans de l’oxygène (300 à 600 mL/kg/min) via un système Bain.
  11. Placez l’animal en position couchée dorsale sur un oreiller de positionnement sur lequel est positionnée une couverture d’eau chauffée recouverte de serviettes. Fixez un moniteur patient et surveillez la fréquence cardiaque et l’électrocardiogramme (ECG), la fréquence respiratoire, la pression artérielle, la saturation en oxygène et le dioxyde de carbone en fin de marée. Surveillez régulièrement la température corporelle pendant la procédure. Une personne dûment formée est responsable du maintien et de la surveillance de l’anesthésie.
  12. Positionnez l’animal à l’aide de l’oreiller de positionnement de manière à ce que la surface cornéenne soit horizontale lorsque l’œil est tourné dans une position de regard primaire. Fixez la tête en place à l’aide de ruban adhésif médical.
  13. Couvrez l’animal avec des couvertures pour aider à maintenir la température corporelle.
  14. Rincer le cathéter intraveineux avec une solution saline héparinée et commencer une perfusion intraveineuse de lactate de Ringer fournie à 2–5 mL/kg/h pendant toute la durée de la procédure.
  15. Préparer la surface oculaire, le sac conjonctival et les paupières pour la chirurgie aseptique en utilisant de la povidone iodée à 0,2%, des applicateurs de coton-tige stériles et des boules de coton.
  16. Positionnez le microscope opératoire avec des oculaires également ajustés de manière appropriée. Placez la pédale de commande pour le microscope (mise au point, zoom et contrôle de l’axe XY) et l’appareil de vitrectomie de manière à ce que le chirurgien puisse les utiliser.
  17. Préparez-vous à la chirurgie aseptique : tout le personnel doit porter des gommages chirurgicaux, un chapeau chirurgical et un masque. Assurez-vous que le chirurgien et le(s) assistant(s) frottent, blouse et gant comme pour la chirurgie aseptique de routine. Tout le personnel doit être familiarisé avec les techniques d’asepsie.
  18. Une fois que le personnel est nettoyé, vêtu et ganté, ouvrez les trousses chirurgicales et disposez les instruments. Placez des boutons de manipulation stériles sur les boutons de réglage du microscope pour permettre au chirurgien ou à l’assistant de s’ajuster sans rompre l’asepsie. Drapez l’animal de manière routinière pour la chirurgie oculaire.
  19. Préparez l’appareil de vitrectomie en suivant les instructions du fabricant pour une vitrectomie à deux orifices.
    1. Placez une lentille de contact de vitrectomie et une vitrectomie 23 G à deux orifices sur la table de l’assistant. Fixez la cautérisation du champ humide. Fixez et amorcez la tubulure de perfusion et la pièce à main de vitrectomie de 23 G.
    2. Placez les instruments de vitrectomie et les conduites de liquide sur le champ stérile et maintenez-les en position à l’aide de pinces à serviettes. Réglez l’appareil de vitrectomie en mode vide proportionnel entre 1 500 et 2 500 coupes par minute (cpm) et le vide maximal de 500 mmHg. Ceci est effectué en appuyant sur les boutons fléchés (vers le haut ou vers le bas) présents sur le panneau avant de l’appareil de vitrectomie.

2. Préparation des organoïdes pour l’implantation sous-rétinienne (Figure 1)

  1. Dériver les organoïdes rétiniens comme indiqué précédemment 31 et, si nécessaire, expédier pendant la nuit à37 °C comme indiqué précédemment54.
  2. Essuyez les surfaces de la salle de culture tissulaire du laboratoire récepteur avec un désinfectant et maintenez le même niveau élevé de technique aseptique que dans une salle chirurgicale pour les chirurgies oculaires, afin d’éviter la contamination bactérienne ou fongique, et transférer dans la salle d’opération pour éviter l’infection du site opératoire.
  3. Portez des couvre-chaussures chirurgicaux, des blouses de laboratoire jetables, des bonnets, des masques chirurgicaux, des manches et des gommages chirurgicaux à l’intérieur de la salle de culture tissulaire affectée à la préparation organoïde pour les chirurgies oculaires.
  4. Prééquilibrer les milieux neuronaux avec 20 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) et 20 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) pendant 1 h dans un incubateur de culture tissulaire (37 °C, 5 % CO2). Placer les organoïdes dans des milieux dans des plaques à très faible adhérence en utilisant environ un quart de volume de milieu conditionné (provenant de l’expédition de nuit) et trois quarts de volume de milieu frais31,54. Maintenir pendant 24–48 h.
  5. Préparer et équilibrer plusieurs plaques fraîches de 60 mm avec un milieu neural (tel que préparé à l’étape 2.4) pendant au moins 1 h dans l’incubateur de culture tissulaire (37 °C, 5% CO2) avant d’anesthésier le premier animal. Notez que ces plaques sont utilisées pour transférer les organoïdes pour chaque intervention chirurgicale, en supposant que les conditions de pH et de saturation en CO2 seront maintenues dans le milieu pendant au moins 20 minutes, ce qui est suffisant pour déplacer la plaque vers la salle d’opération et charger les organoïdes dans la canule.
  6. Utiliser une nouvelle plaque de 60 mm avec des milieux neuronaux présaturés pour chaque cas de transplantation, tout en conservant les plaques restantes dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C.
  7. Transférer 6 à 9 organoïdes dans une capsule de 60 mm (avec un milieu resaturé) en les pipetant avec une pipette manuelle à canal unique (20 à 200 μL) avec une pointe filtrante stérile de 200 μL ayant une ouverture large (~0,7 mm). Ces embouts peuvent être préparés à l’avance ou pendant la procédure en coupant ~3-4 mm de la pointe avec une paire de ciseaux stériles (fait dans la hotte de culture tissulaire pour éviter la contamination). Placez la capsule de 60 mm dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm (pour éviter toute contamination pendant le transport d’une pièce à l’autre) et transportez-la rapidement dans le bloc opératoire.
  8. Placer la plaque avec les organoïdes sur un coussin chauffant électrique à 37 °C recouvert d’un champ stérile.
  9. Mettez une nouvelle paire de gants stériles avant de préparer les organoïdes.
  10. Rincer les organoïdes dans une solution saline équilibrée stérile (BSS) (facultatif), puis les charger dans l’injecteur, qui consiste en une canule en verre borosilicaté à paroi mince (diamètre extérieur, DO 1,52 mm; diamètre intérieur, ID 1,12 mm) avec une extrémité émoussée polie fixée par un tube en plastique stérile à une seringue Hamilton stérile de 500 μL préremplie de BSS stérile.
  11. Passez la canule à l’équipe chirurgicale de manière stérile lorsqu’ils sont prêts à injecter les organoïdes.
  12. Maintenir la durée de l’ensemble de la procédure (du retrait des organoïdes des milieux de culture tissulaire au chargement de la canule) à 20 minutes ou moins.
  13. S’il y a un retard dans l’implantation des organoïdes, replacez-les dans l’incubateur de culture tissulaire, afin d’éviter les changements de saturation pH/CO2 à l’intérieur de la boîte.
  14. Conservez les organoïdes inutilisés pendant 1 semaine dans le même incubateur de culture tissulaire et surveillez tout signe de contamination.

3. Implantation d’organoïdes sous-rétiniens

  1. Effectuer une canthotomie latérale de 0,5 à 1 cm avec les ciseaux de ténotomie Stevens. Placez un spéculum de paupière Barraquer de taille appropriée pour garder les paupières ouvertes. Assurez-vous que l’assistant chirurgical irrigue régulièrement la cornée avec du BSS pendant toute la durée de la procédure.
  2. Placez 2 points de suture de soie 6–0 dans la conjonctive immédiatement adjacente au limbe aux positions 4 et 8 heures pour maintenir l’œil dans le regard primaire et rétracter la troisième paupière. Utilisez une pince cornéenne de 0,5 Castroviejo et un petit hémostatique de moustique pour saisir doucement la conjonctive bulbaire à côté du limbe. Laissez les sutures longues et serrez les extrémités avec de petits hémostatiques de moustiques pour faciliter leur manipulation.
    REMARQUE: Placer la suture sous la troisième paupière est plus difficile; Assurez-vous de le placer immédiatement à côté du limbe.
  3. Placez une autre suture à la position 12 heures au limbe partiellement à travers l’épaisseur du limbe en prenant soin de ne pas pénétrer dans l’œil. Nœud cette suture lâchement et coupez les extrémités courtes. Cela fournit une suture d’ancrage robuste, qui est utilisée pendant la chirurgie comme une « poignée » pour faire pivoter l’œil afin de permettre au chirurgien d’accéder à différentes parties du globe au cours des différentes étapes de la procédure.
    Remarque : Les étapes 3.2 et 3.3 peuvent être inversées. La séquence de mise en place des points de suture est la préférence du chirurgien.
  4. Réfléchir la conjonctive bulbaire entre 10 et 2 heures (une périmétrie). À l’aide de ciseaux de ténotomie, inciser la conjonctive à 2–3 mm du limbe. Sapez-le et dégagez la capsule du tenon pour exposer la sclérotique sur les sites des orifices de vitrectomie de 2 et 10 heures, qui seront placés à environ 3-5 mm du limbe en fonction de l’âge de l’animal. Utilisez des lances chirurgicales en cellulose pour l’hémostase et pour nettoyer le sang.
  5. Identifier les sites de sclérotomie après la réflexion de la conjonctive et de la capsule de tenon à l’aide d’étriers. Choisissez des sites de sclérotomie (à 2 et 10 heures visant à passer par pars plana), pour éviter les principaux vaisseaux scléraux qui peuvent être proéminents chez le chat. Utiliser la cautérisation en champ humide sur la sclérotique aux sites de sclérotomie prévus pour réduire les saignements scléraux, en prévoyant une région de ~3 mm au port d’instrument (orifice de 10 heures pour un chirurgien droitier) car celle-ci sera élargie après la vitrectomie pour permettre l’introduction de la canule d’implantation.
  6. Préplacer les sutures à motif croisé (suture polyglactine 6-0 ou 7-0) sans nouer le nœud à l’emplacement des sclérotomies proposées avant la mise en place des orifices de vitrectomie.
    NOTE: Cela facilite la fermeture rapide des sclérotomies à la fin de la procédure. La suture pour le port d’instrument prévu doit avoir une morsure plus longue de la sclérotique car ce sera une longue incision.
  7. Une fois les points de suture placés, demandez à l’assistant de vous aider à positionner le globe en tenant les points de suture de 12 heures en attachant ou en utilisant des pinces Bishop-Harmon. Laissez le chirurgien stabiliser également le globe, en utilisant une pince Castroviejo de 0,12 mm pour maintenir le tissu à côté du site de la sclérotomie.
    1. Introduire un orifice de vitrectomie de 23 G à l’aide d’un trocart à travers la sclérotique aux positions 2 heures et 10 heures dirigées vers un angle vers le nerf optique pour éviter le contact avec la lentille.
    2. Vérifiez que l’orifice d’irrigation est dans le vitré en poussant doucement sur l’orifice à l’aide d’une pince à attacher afin que la pointe puisse être visualisée dans le vitré. Une fois le positionnement correct confirmé, fixez la conduite d’irrigation au port et positionnez la ligne à l’aide de minces bandages adhésifs pour la coller en place. Réglez initialement la perfusion de vitrectomie du tampon BSS à 30–35 mmHg en appuyant sur les boutons fléchés (vers le haut ou vers le bas) présents sur le panneau avant de l’appareil de vitrectomie.
  8. Laissez l’assistant tenir une lentille de vitrectomie d’irrigation grossissante Machemer sur la cornée pour permettre la visualisation du segment postérieur de l’œil au cours des étapes suivantes. Fixez la lentille de vitrectomie irrigante à un ensemble de goutte à goutte fournissant un apport constant de liquide pour coupler la lentille à la cornée.
    REMARQUE: D’autres formes de lentilles de vitrectomie de contact pourraient également être utilisées. Tamisez ou éteignez les lumières de la pièce pour faciliter la visualisation à travers le microscope opératoire.
  9. Insérez la sonde/coupure de vitrectomie de 23 G (2 500 cpm) à travers l’orifice de l’instrument (adjacent à la main dominante du chirurgien, c’est-à-dire l’orifice de 10 heures pour un chirurgien droitier) et effectuez une vitrectomie partielle par tronçon.
    1. Ensuite, retirez complètement le vitré de la surface rétinienne dans la région qui recevra la greffe (ce qui est important pour le succès de la procédure) en détachant le visage vitréen de la rétine.
    2. Placez la sonde de vitrectomie sur la tête du nerf optique avec l’orifice tourné vers l’extérieur de la surface rétinienne et appliquez un vide plus élevé pour commencer le décollement vitréen du visage.
  10. Préparer des cristaux de triamcinolone pour une utilisation intraoculaire. Si la suspension de triamcinolone n’est pas spécifiquement destinée à une utilisation intravitréenne, laver les cristaux, puis les remettre en suspension dans du BSS.
    1. Dans un premier temps, filtrer la suspension à l’aide d’un filtre stérile à seringue à pores de 0,22 μm avec membrane PES (fixée à une seringue de 1 mL) pour piéger les cristaux.
    2. Ensuite, lavez les cristaux de triamcinolone piégés en aspirant du BSS dans la seringue de 1 ml et en rinçant à travers le filtre (les cristaux restent piégés dans le filtre). Cela élimine les conservateurs dans la solution. Répétez le lavage 3 fois, après quoi les cristaux sont remis en suspension dans 1 mL de BSS.
  11. Introduisez l’aiguille de la seringue qui maintient la triamcinolone à travers l’orifice de l’instrument. Veillez à ne pas toucher la lentille en regardant le bout de l’aiguille à travers la pupille tout en introduisant l’aiguille à travers le port de l’instrument. Injecter 0,25 à 0,5 mL de suspension cristalline. Insérez ensuite la sonde de vitrectomie à travers l’orifice de l’instrument et avancez-la près de la tête du nerf optique avec l’orifice loin de la surface rétinienne et utilisez le vide poussé pour aider à détacher le visage vitréen de la rétine.
    REMARQUE: Les cristaux de triamcinolone adhèrent et mettent ainsi en évidence le vitré restant. Retirez délicatement tout vitré au-dessus et à côté du site d’implantation organoïde prévu (p. ex., le fond d’œil tataux central près de la région centrale ).
  12. Créer un petit bleb de décollement focal de la rétine au site d’implantation souhaité à l’aide d’un injecteur sous-rétinien, par exemple un injecteur sous-rétinien de 23 G avec une canule extensible de 41 G fixée à une seringue Luer stérile étanche aux gaz de 250 μL remplie de BSS stérile.
    1. Avant de créer le bleb sous-rétinien, réduire la pression de perfusion à 10 mmHg pour faciliter la formation de bleb.
    2. Insérez l’injecteur à travers le port de l’instrument et avancez-le vers la surface rétinienne. Extruder l’extrémité de la canule et la presser doucement sur la surface rétinienne. Demandez à l’assistant de pousser légèrement rapidement sur le piston de la seringue pour démarrer le décollement de rétine qui réduit la pression d’injection pour permettre une augmentation lente du décollement de la rétine jusqu’à ce que la taille désirée soit atteinte (environ 100 à 200 μL de BSS sont utilisés).
  13. Si la rétinotomie créée est à une position appropriée, ce qui évite de couper la rétine entre le site d’implantation et la tête du nerf optique pour empêcher la section de la couche de fibres nerveuses dérivée du site d’implantation et pour éviter les vaisseaux sanguins rétiniens majeurs (ceci est également déterminé par la conception de l’étude, dans notre cas la rétine centrale a été choisie), puis, agrandissez-le légèrement à l’aide de la canule de 41 G de l’injecteur, dans le but de faciliter l’introduction de ciseaux rétiniens.
  14. Retirez l’injecteur de l’œil et retirez l’orifice scléral de 10 heures. Agrandir la sclérotomie à cet endroit à l’aide d’un couteau / kératome droit de 2,85 mm orienté vers le nerf optique pour éviter de toucher la lentille. Maintenir la pression de perfusion à 10–15 mmHg.
  15. Étendez la rétinotomie à l’aide de ciseaux verticaux vitréo-rétiniens à 80° avec poignée de compression, en évitant de couper les vaisseaux rétiniens pour prévenir l’hémorragie rétinienne et assurez-vous de couper la rétine au bord du bleb loin de la tête du nerf optique pour éviter de couper les fibres nerveuses menant de la rétine dans la zone de transplantation au nerf optique. La rétinotomie doit être d’une largeur suffisante pour recevoir les organoïdes.
  16. Insérez le capillaire en verre préchargé contenant les organoïdes (voir étape 2.10) à travers la sclérotomie élargie et avancez-le vers le site de rétinotomie sous visualisation directe.
    1. Utilisez la pointe du capillaire en verre pour ouvrir légèrement la rétinotomie afin d’accéder à l’ouverture dans le bleb sous-rétinien.
    2. Demandez à l’assistant d’appuyer lentement sur le piston de l’injecteur, tout en regardant à travers le microscope, injectant les organoïdes dans le bleb sous-rétinien. Le BSS doit précéder les organoïdes et ouvrir la rétinotomie.
    3. Poussez doucement les organoïdes à l’intérieur du bleb avec la pointe du capillaire en verre s’ils sont au bord de la rétinotomie.
  17. Maintenez le capillaire de verre au niveau de la rétinotomie pendant quelques secondes pour essayer de fermer la rétinotomie et empêcher les organoïdes de s’échapper dans le vitré.
  18. Retirez très lentement le capillaire en verre de l’œil en évitant toute libération soudaine de liquide de l’œil pour éviter le mouvement du fluide dans l’œil qui pourrait expulser les organoïdes du bleb sous-rétinien.
  19. Augmenter lentement la pression de perfusion à 20–30 mmHg pour aider à prévenir l’hémorragie intraoculaire en veillant à ce que le liquide de perfusion ne se lave pas directement sur le bleb. Ceci est effectué en appuyant sur les boutons fléchés vers le haut présents sur le panneau avant de l’appareil de vitrectomie.
  20. Fermez la sclérotomie à l’aide de la suture pré-placée dans un motif croisé (6–0 ou 7–0 polyglactine). Ajoutez des sutures simples supplémentaires interrompues au besoin pour sceller la sclérotomie.
  21. Demandez à l’assistant de retirer l’orifice de perfusion et laissez le chirurgien attacher rapidement la suture pré-placée pour sceller la sclérotomie et prévenir la perte de pression intraoculaire.
  22. Fermer l’incision conjonctivale (péritomie) en utilisant 6–0 ou 7–0 polyglactine selon un schéma simple et continu.
  23. Imagez le fond d’œil (par exemple, à l’aide d’une caméra vidéo du fond d’œil RetCam II, de Clarity ou similaire) et enregistrez la position immédiate des organoïdes dans l’espace sous-rétinien.
  24. Re-préparer la surface oculaire après l’imagerie en utilisant une solution de povidone iodée à 0,2% à l’aide d’applicateurs à pointe de coton et de boules de coton. Retirez les trois points de suture et le spéculum du couvercle.
  25. Fermer la canthotomie latérale avec une suture polyglactine 6-0. Placez une seule suture enterrée suivie d’une figure de 8 sutures cutanées pour reformer le canthus latéral, puis utilisez de simples sutures cutanées interrompues pour fermer le reste de la plaie.
  26. Une fois l’intervention chirurgicale terminée, administrer une injection sous-conjonctivale d’une combinaison de stéroïdes et d’antibiotiques (2 mg d’acétate de méthylprednisolone, 0,1 mg de dexaméthasone et 1 mg de gentamicine). Placez un lubrifiant ophtalmique (déchirures artificielles) sur la cornée.
  27. Récupérez l’animal de l’anesthésie et surveillez étroitement pendant la récupération tout signe de douleur qui nécessiterait un traitement supplémentaire, tel qu’un blépharospasme marqué, une réticence sévère à être manipulé, une léthargie ou une diminution de l’appétit et une augmentation de la fréquence respiratoire et cardiaque. Fournir une analgésie postopératoire au besoin et surveiller étroitement tout inconfort.
    REMARQUE: Seul un personnel correctement formé devrait être responsable de l’anesthésie et de la surveillance des patients félins avant, pendant et après la chirurgie. Suivez les recommandations du comité local d’éthique animale pour les soins postopératoires.

4. Procédures post-implantatoires, traitement postopératoire et évaluation

  1. Continuer à traiter avec des médicaments immunosuppresseurs oraux (1 mg / kg de prednisolone et 2 mg / kg de cyclosporine par voie orale deux fois par jour) pour aider à contrôler l’inflammation et le rejet des organoïdes. Fournir une couverture antibiotique systémique (p. ex. 5 mg/kg de doxycycline par voie orale deux fois par jour – cet antibiotique a été choisi en raison du risque d’infection opportuniste par mycoplasme chez les animaux immunodéprimés).
  2. Effectuer des examens ophtalmiques réguliers pour surveiller l’inflammation ou le développement d’événements indésirables. Surveillez le bleb rétinien pour l’aplatissement, qui se produit au cours des premiers jours suivant la chirurgie malgré la grande rétinotomie requise pour l’injection des organoïdes dans l’espace sous-rétinien. Enregistrer des images du fond d’œil à chaque examen pour enregistrer la position et l’apparence des organoïdes transplantés.
  3. Imager les animaux sous anesthésie générale par ophtalmoscopie laser à balayage confocale (cSLO) et tomographie par cohérence optique du domaine spectral (SD-OCT)5,31 pendant la période de surveillance et avant la fin de l’expérience.
  4. Euthanasier sans cruauté les animaux à la fin de l’expérience en utilisant une méthode approuvée par l’AVMA, par exemple l’administration intraveineuse de 85 mg/kg de pentobarbital. Après la sédation, placez un cathéter intraveineux pour l’administration du pentobarbital afin de minimiser le stress. Confirmez le décès par arrêt du rythme cardiaque et faites une incision dans le thorax pour créer un pneumothorax.
  5. Retirez les yeux par une approche transconjonctivale standard et fixez-les au besoin. Pour l’immunohistochimie (IHC), immerger immédiatement les yeux dans une solution de paraformaldéhyde à 4% après l’injection de 0,3 mL de la solution fixatrice dans le segment postérieur à travers 3 fentes faites à travers pars plana avec une lame Parker 11 (~3-4 mm du limbe).
  6. Disséquer les œillets après 3,5 h de fixation à 4 °C. Enlevez le vitré résiduel en veillant à préserver la rétine et les organoïdes intacts. Remettre dans le fixateur pendant 30 minutes supplémentaires à 4 °C puis rincer les œillets 3 fois chacun pendant 10 min dans du PBS. Transférer l’œilleton à 15% de saccharose pendant 2 h, puis à 30% de saccharose pendant 2 h supplémentaires.
  7. Rincer l’œilleton deux fois avec du PBS et l’incorporer dans un milieu OCT (composé à température de coupe optimale) et congeler le flash puis conserver à -80 °C jusqu’à la section pour l’histologie et l’immunochimie.
  8. Sélectionner les anticorps pour l’IHC en fonction du protocole et des objectifs de l’étude.

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Representative Results

Cette procédure permet l’implantation réussie et reproductible d’organoïdes rétiniens dérivés de hPSC dans l’espace sous-rétinien d’un modèle animal grand œil (démontré ici à l’aide de 2 exemples: chats de type sauvage avec photorécepteurs (PR) sains et chats CrxRdy/+ avec PR et rétine dégénérés). En suivant les étapes indiquées à la figure 1 , préparer et charger les organoïdes rétiniens dérivés de l’hPSC dans la canule en verre borosilicaté du dispositif d’injection afin que les organoïdes ne soient pas endommagés. Ceci peut être confirmé par une visualisation directe lors de la mise en charge des organoïdes (étape 2.10) et pendant la chirurgie (étape 3.16) (Figure 2A,B) ainsi que par imagerie du fond d’œil à la fin de la chirurgie (étape 3.23, Figure 2C). La présence des organoïdes dans l’espace sous-rétinien à l’aide de cette technique est confirmée postopératoirement par l’examen ophtalmique et l’imagerie du fond d’œil (Figure 3A), qui enregistre la position et l’apparence des organoïdes. Connaître la position de la greffe est très important lors du traitement des globes pour l’histologie et l’immunohistochimie congelées et réduit considérablement la charge de travail, car la section d’un gros œil à 12-14 μm (épaisseur d’une cryosection) prend du temps. Avant l’euthanasie, l’ophtalmoscopie confocale au laser à balayage (cSLO) et l’imagerie par tomographie par cohérence optique du domaine spectral (SD-OCT) sont également effectuées pour évaluer la position des organoïdes dans l’espace sous-rétinien (Figure 3A-D). Ces techniques démontrent la persistance des organoïdes rétiniens dans l’espace sous-rétinien (entre la rétine neurale et l’EPR) de l’œil récepteur (Figure 3E). Après l’euthanasie (pratiquée sans cruauté selon les recommandations de l’AVMA), l’histologie et l’immunohistochimie (IHC) sont systématiquement effectuées (voir les détails dans l’article31 publié précédemment). L’histologie et l’IHC démontrent la survie de greffons xénogéniques (organoïdes rétiniens dérivés de hPSC) dans l’espace sous-rétinien d’un gros œil lorsque les animaux étaient immunodéprimés (comme décrit précédemment31), voir Figure 4.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des étapes de préparation des organoïdes avant l’implantation.
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Figure 2
Figure 2 : Implantations chirurgicales sous-rétiniennes d’organoïdes. (A) Visualisation directe des organoïdes administrés dans l’espace sous-rétinien à travers une canule en verre sans être endommagés, (B) Visualisation directe des organoïdes dans le bleb sous-rétinien, (C) Image couleur grand angle du fond d’œil des organoïdes implantés sous-rétiniens immédiatement après la chirurgie. Les bords du bleb sont indiqués par les pointes de flèches noires et le site de rétinotomie par les étoiles noires.
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Figure 3
Figure 3 : Évaluation postopératoire des organoïdes implantés sous-rétiniens 3 mois après l’implantation chez un chat CrxRdy/+ . (A) image couleur du fond d’œil des organoïdes implantés sous-rétiniens, (B) image du fond d’œil cSLO des organoïdes implantés sous-rétiniens, (C) reconstruction par balayage volumétrique 3D de la zone contenant les organoïdes, (D) image cSLO de la zone contenant les organoïdes sous-rétiniens, (E) image SD-OCT haute résolution en coupe transversale des organoïdes implantés sous-rétiniens. Le site de rétinotomie est indiqué par les étoiles noires.
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Figure 4
Figure 4 : Feuillets photorécepteurs dérivés d’organoïdes rétiniens humains (marqueur PR RCVRN) dans l’espace sous-rétinien du chat CrxRdy/+ , 3 mois après la greffe.  *Boutons synaptiques (hSYP=Synaptophysine) dans la couche nucléaire interne du chat (INL).
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Discussion

L’implantation de tissu rétinien dérivé de hPSC (organoïdes rétiniens) dans l’espace sous-rétinien est une approche expérimentale prometteuse pour restaurer la vision des maladies dégénératives rétiniennes à un stade avancé causées par la mort des cellules PR (cécité profonde ou terminale). L’approche présentée s’appuie sur une thérapie expérimentale précédemment développée et testée avec succès basée sur la greffe sous-rétinienne d’un morceau de tissu rétinien fœtal humain23,24,25. Il présente l’utilisation d’une source de tissu rétinien alternative, reconstituable et éthiquement acceptable dérivée des CSPh. La démonstration de la faisabilité chirurgicale et de l’innocuité oculaire de la thérapie dans des modèles animaux de gros yeux51,55 est nécessaire pour faire progresser cette approche prometteuse vers des applications cliniques. Ce manuscrit fournit une méthode détaillée pour l’implantation sous-rétinienne de tissu rétinien hPSC-3D (organoïdes rétiniens) dans un grand modèle animal avec une rétine normale et dégénérative (modèle de CrxRdy/+ modèles de LCA chez les chats). Bien que des procédures pour introduire un morceau plat de rétine humaine et des patchs RPE aient été développées43,44,45, la transplantation de greffons 3D plus grands (nécessaires pour restaurer la vision dans des conditions de RD avancée) n’a pas été étudiée. Le protocole décrit ici en détail concerne une procédure de transplantation pour l’administration sous-rétinienne des organoïdes rétiniens entiers (plutôt que des bords organoïdes33,41) portant également un peu d’EPR comme moyen potentiellement meilleur d’introduire des feuilles rétiniennes intactes avec des PR, d’augmenter la survie du greffon et d’améliorer la préservation des feuilles. Notez que différentes parties de ce protocole sont bien établies. Par exemple, la vitrectomie est largement utilisée par les chirurgiens vitréo-rétiniens lors de la chirurgie de rattachement rétinien 56,57,58,59,60. Les injections sous-rétiniennes sont de plus en plus couramment utilisées, par exemple, dans la thérapie d’augmentation génique 3,7,61,62,63,64. Il existe peu de descriptions de la création d’une rétinotomie adéquate et de l’injection d’organoïdes relativement grands dans l’espace sous-rétinien.

Les étapes critiques comprennent un positionnement et une performance minutieux de la sclérotomie pour éviter le cristallin, l’élimination complète du cortex vitré de la surface rétinienne sur le site de transplantation, la formation contrôlée du bleb sous-rétinien, la génération d’une rétinomie de la taille optimale pour s’adapter à la largeur de la canule de transplantation, le maintien de la pression de perfusion définie pendant les différentes étapes, et le retrait des canules. Choisir la bonne canule de transplantation avec un diamètre intérieur et extérieur optimisé (ID et OD) et une longueur, contrôler les saignements intraoculaires, la stérilité de l’ensemble de la procédure, des organoïdes à la salle d’opération et aux instruments, et la durée de la chirurgie (30 à 45 min/animal) pour assurer des résultats optimaux. Les auteurs constatent que les meilleurs résultats sont obtenus avec une vitrectomie 23 G en raison de l’épaisseur / viscosité du chat vitré, créant un bleb avec un injecteur avec une canule de 41 G, puis prolongeant la rétinotomie au bord du bleb à l’aide de ciseaux rétiniens à angle de 80°. D’autres facteurs importants incluent l’extension de la sclérotomie à l’aide d’un kératome de 2,85 mm pour s’adapter à la canule en verre borosilicaté (diamètre extérieur OD 1,52 mm; diamètre intérieur, ID 1,12 mm; et longueur 10,16 cm) et permettre l’implantation d’organoïdes plus grands dans un gros œil d’une longueur axiale d’environ 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. L’utilisation d’un capillaire en verre était la meilleure actuellement disponible pour charger et livrer des organoïdes de la taille de descente sans les endommager pendant le processus d’implantation. Il a été constaté que la réduction de la pression de perfusion de 20-30 mmHg pendant la vitrectomie à 10 mmHg pendant l’étape de formation du bleb est optimale pour générer des décollements de rétine, nécessaires pour créer de l’espace pour les organoïdes rétiniens. En outre, la viabilité du tissu rétinien hPSC-3D (organoïdes) pendant l’expédition sur de longues distances et le choix du schéma d’immunosuppression optimisé pour le maintien des greffons humains xénogéniques sont critiques, comme l’ont récemment rapporté31,54.

Les auteurs ont constaté qu’en raison du tapetum de chat hautement réfléchissant, l’endo-éclairage n’était pas nécessaire pour effectuer la chirurgie. La transplantation chez une espèce atapétale (p. ex. porc, primate non humain) nécessiterait une vitrectomie à 3 orifices comprenant une endo-illumination. La tamponnade (p. ex. avec du perfluorocarbone suivi d’huile de silicone) telle qu’elle a été effectuée lors d’une chirurgie de routine par décollement de rétine n’a pas été effectuée parce que la pression sur le bleb risquerait d’extruder les organoïdes dans le vitré. Les développements futurs pourraient inclure l’utilisation de matériaux actuellement à l’étude pour sceller les trous rétiniens. Cela pourrait être utilisé pour prévenir toute perte post-implantatoire d’organoïdes dans le vitré. De plus, Triescence, qui est similaire à Kenalog-40 mais contient de la triamcinolone sans conservateur, pourrait être utilisé comme alternative pour visualiser le vitré.

La plus petite taille du globe chez les animaux plus jeunes (p. ex. 1 à 2 mois) présentait plus de défis chirurgicaux que le grand œil (animaux adultes). Néanmoins, en utilisant la méthode décrite ici, il est possible de délivrer les greffes sous-rétiniennes. Dans le modèle CrxRdy/+ LCA, on a constaté que les bulles rétiniennes plus grandes ne se rattachaient pas toujours. Le maintien du bleb à la taille minimale nécessaire pour permettre l’injection des organoïdes rétiniens a réduit cette complication. La transplantation plus précoce dans la rétine RD (avant la perte complète des RP lorsque la rétine neurale devient nettement amincie) est une autre ligne directrice, conformément aux travaux antérieurs sur les greffes de rétine fœtale humaine20. Une autre remarque – la technique détaillée ne dépend pas de la mise en place de la feuille rétinienne dans une orientation correcte car les organoïdes rétiniens entiers sont transplantés. Avec le développement de feuilles plates hESC-rétiniennes, cela sera important. Cependant, ce n’est pas l’objectif de ce protocole, qui vise à fournir des feuilles de tissu hESC-rétiniennes intactes et à optimiser la préservation sous-rétinienne des feuilles PR. Une fois la technique développée, elle était reproductible à la fois dans la rétine normale et RD.

Il existe de nombreuses complications potentielles à cette intervention chirurgicale. Seules les personnes qualifiées en chirurgie vitréo-rétinienne (par exemple, les ophtalmologistes vétérinaires formés ou les chirurgiens vitréo-rétiniens familiers avec les différences entre les espèces dans l’œil de chat par rapport à l’œil humain) devraient entreprendre la procédure. Les complications possibles comprennent le toucher du cristallin lors de la mise en place du trocart, les saignements scléraux lors de l’élargissement de la sclérotomie et les hémorragies sous-rétiniennes ou rétiniennes. D’autres complications telles que la réponse immunitaire de l’hôte aux greffes organoïdes humaines xénogéniques conduisant à la destruction du greffon au fil du temps ou à l’endophtalmie sont possibles; L’utilisation d’immunosuppresseurs oraux et d’antibiotiques aide à prévenir ces événements. Il est également important de noter qu’il existe une différence entre l’implantation chez les chats de type sauvage et les chats CrxRdy/+ . Lorsqu’il y a une dégénérescence rétinienne avancée, le bleb rétinien a tendance à se propager plus large que dans le type sauvage, et, dans certains cas, cela peut empêcher le rattachement rétinien complet après la chirurgie. La technique présentée ici est applicable pour l’implantation d’organoïdes dans les yeux de grands modèles animaux d’IRD. D’autres améliorations seraient nécessaires une fois que la transplantation sera prête à être traduite à la clinique.

Sur la base de l’expérience des auteurs dans la réalisation d’interventions chirurgicales vitréo-rétiniennes complexes dans des modèles de grands yeux, la technique présentée dans ce manuscrit devrait être applicable à d’autres grands modèles animaux (avec l’inclusion de l’endo-illumination chez les espèces atapétales) qui sont utilisés pour traduire les techniques chirurgicales vitréo-rétiniennes à la clinique43,44,45.

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Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., et Igor O. Nasonkin Ph.D. sont des employés de Lineage Cell Therapeutics, Inc. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la subvention SBIR accélérée R44-EY027654-01A1 de NEI et la subvention SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Le Dr Petersen-Jones est cochercheur principal). Les auteurs aimeraient remercier Mme Janice Querubin (MSU RATTS) pour son aide à l’anesthésie et aux soins généraux pour les animaux inclus dans cette étude ainsi que pour son aide avec le cadre chirurgical et la préparation / stérilisation des instruments. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Paige Winkler pour l’aide apportée à la réception des organoïdes et à leur placement dans les milieux la veille de l’implantation et pour l’aide apportée le jour de l’implantation. Les auteurs sont également reconnaissants à M. Randy Garchar (LCTX) pour l’expédition diligente des organoïdes rétiniens, l’assemblage de l’expéditeur et le téléchargement des enregistrements de température et de stress G après chaque expédition. Ce travail a été réalisé alors que l’auteur Igor Nasonkin était employé par Biotime (maintenant Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

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Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

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