Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subretinal transplantasjon av humant embryonalt stamcelleavledet retinalvev i en katt stor dyremodell

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en kirurgisk teknikk for transplantasjon av humant pluripotent stamcelle (hPSC) -avledet retinalt vev inn i det subretinale rommet til en stor dyremodell.

Abstract

Retinal degenerative (RD) forhold assosiert med fotoreceptortap som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa (RP) og Leber medfødt amaurose (LCA) forårsaker progressivt og svekkende synstap. Det er et udekket behov for terapier som kan gjenopprette syn når fotoreceptorer har gått tapt. Transplantasjon av humant pluripotent stamcelle (hPSC) -avledet retinalvev (organoider) inn i det subretinale rommet i et øye med avansert RD bringer retinale vevsark med tusenvis av sunne mutasjonsfrie fotoreceptorer og har potensial til å behandle de fleste / alle blindende sykdommer forbundet med fotoreceptordegenerasjon med en godkjent protokoll. Transplantasjon av føtal retinalvev i det subretinale rommet til dyremodeller og personer med avansert RD har blitt utviklet vellykket, men kan ikke brukes som rutinemessig terapi på grunn av etiske bekymringer og begrenset vevsforsyning. Store øyearvelige retinal degenerasjon (IRD) dyremodeller er verdifulle for å utvikle visjonsrestaureringsterapier ved hjelp av avanserte kirurgiske tilnærminger for å transplantere retinale celler / vev inn i subretinalrommet. Likhetene i klodestørrelse og fotoreseptorfordeling (f.eks. Tilstedeværelse av makulalignende regionområde centralis) og tilgjengeligheten av IRD-modeller som nøye rekapitulerer human IRD, vil lette rask oversettelse av en lovende terapi til klinikken. Presentert her er en kirurgisk teknikk for transplantasjon av hPSC-avledet retinalvev i subretinalrommet til en stor dyremodell som tillater vurdering av denne lovende tilnærmingen i dyremodeller.

Introduction

Millioner av mennesker rundt om i verden er påvirket av retinal degenerasjon (RD) med resulterende synshemming eller blindhet forbundet med tap av lysfølsomme fotoreceptorer (PR). Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en viktig årsak til blindhet som følge av en kombinasjon av genetiske risikofaktorer og miljø- / livsstilsfaktorer. I tillegg har over 200 gener og loci blitt funnet å forårsake arvelig RD (IRD) 1. Retinitis pigmentosa (RP), den vanligste IRD, er genetisk heterogen med mer enn 3000 genetiske mutasjoner i omtrent 70 gener som rapporteres 2,3,4. Leber medfødt amaurose (LCA), som forårsaker blindhet i barndommen, er også genetisk heterogen 5,6. Genforstørrelsesterapi er utviklet og er i kliniske studier for behandling av et lite antall IRDer 3,7. Imidlertid må en separat terapi utvikles for behandling av hver distinkte genetiske form for IRD og dermed bare behandle en liten undergruppe av pasienter. Videre er genforstørrelse avhengig av tilstedeværelsen av en populasjon av redningsbare fotoreceptorer og er derfor ikke anvendelig for avansert degenerasjon.

Det er derfor et presserende og ennå uoppfylt klinisk behov for utvikling av terapier som adresserer og behandler avanserte RDs og dyp til terminal blindhet. I løpet av de siste 2 tiårene har nevroprostetiske implantater blitt utviklet og testet i store dyremodeller, som katten, før menneskelig bruk 8,9,10,11,12,13,14. På samme måte har de siste 20 årene retinal erstatningsterapier som bruker ark av embryonale eller til og med modne pattedyrs retina podet subretinalt, blitt utviklet 15,16,17,18,19,20,21,22 og til og med testet vellykket hos RD-pasienter 23,24,25. Begge tilnærmingene utnytter ideen om å introdusere nye sensorer (fotovoltaiske silisiumfotodioder når det gjelder nevroproteser26,27, og sunne mutasjonsfrie fotoreceptorer organisert i ark, i tilfelle retinalarkimplantasjon) i netthinnen med degenerert PR. Nylige studier har undersøkt bruken av stamcellebaserte tilnærminger som transplantasjon av humane pluripotente stamceller (hPSC) -avledede retinale progenitorer28,29, hPSC-fotoreceptorer 30 og hPSC-retinale organoider31,32,33. Retinale organoider muliggjør dannelse av retinalt vev i en tallerken og derivasjon av fotoreseptorark med tusenvis av mutasjonsfrie PR-er, som ligner fotoreseptorlaget i den utviklende humane føtale netthinnen 34,35,36,37,38,39,40 . Transplantasjon av hPSC-avledet retinalvev (organoider) i det subretinale rommet hos pasienter med RD-tilstander er en av de nye og lovende undersøkelsescelleterapitilnærmingene, som forfølges av en rekke lag31,32,41,42. Sammenlignet med transplantasjon av cellesuspensjonen (av unge fotoreceptorer eller retinale progenitorer), ble transplanterte ark av føtale fotoreceptorer vist å resultere i synforbedringer i kliniske studier23,24.

Protokollen som presenteres her beskriver i detalj en transplantasjonsprosedyre for subretinal levering av hele retinale organoider (i stedet for organoide felger33,41) som en potensielt bedre måte å introdusere intakte retinalark med PR, for å øke transplantatoverlevelsen og forbedre arkbevaringen. Selv om prosedyrer for å introdusere et flatt stykke menneskelig retina og også RPE-patcher har blitt utviklet43,44,45, har transplantasjon av større 3D-transplantater ikke blitt undersøkt. Stamcelleavledede retinale organoider gir en uuttømmelig kilde til fotoreceptorark for å utvikle visjonsgjenopprettingsteknologier, er fri for etisk begrensning, og regnes som en utmerket kilde til humant retinalvev for terapier fokusert på behandling av avansert RD og terminal blindhet46. Utvikling av kirurgiske metoder for presis subretinal implantasjon av retinale organoider med minimal skade på vertsretinal nisje (nevral retina, retinalt pigmentepitel og retinal og koroidal vaskulatur) er et av de kritiske trinnene for å fremme slik behandling mot kliniske anvendelser31,32. Store dyremodeller som katter, hunder, griser og aper har vist seg å være gode modeller for å undersøke kirurgiske leveringsmetoder, samt å demonstrere sikkerheten til implanterte ark av vev (retinal pigmentepitel (RPE) celler) og undersøke bruken av organoider 41,44,45,47,48,49,50 . Det store dyreøyet har en lignende klodestørrelse som menneskelig, så vel som lignende anatomi, inkludert tilstedeværelsen av et område med høy fotoreseptortetthet, inkludert kjegler (området centralis), som ligner den menneskelige makulaen 6,51,52.

I dette manuskriptet beskrives en teknikk for implantasjon av hPSC-avledet retinalt vev (organoider) i det subretinale rommet til store kattemodeller (både villtype og CrxRdy/+ katter), som sammen med lovende effektresultater32,53 bygger et grunnlag for videreutvikling av slik undersøkelsesterapi mot kliniske anvendelser for å behandle RD-tilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer ble utført i samsvar med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. De ble også godkjent av Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Villtype og CrxRdy/+ katter fra en koloni av katter opprettholdt ved Michigan State University ble brukt i denne studien. Dyrene ble plassert under 12 timer: 12 timers lys-mørke sykluser og matet en kommersiell komplett kattediett.

1. Preimplantasjonsprosedyrer og kirurgisk oppsett

  1. Velg villtype eller CrxRdy/+ katter avhengig av studiedesign. Utfør en pre-kirurgisk oftalmisk undersøkelse, inkludert spaltelampe biomikroskopi og indirekte oftalmokopi. Ekskluder dyr med fundusavvik som ikke er relatert til deres genotyper.
  2. En uke før implantasjon, start dyrene på en immunsuppressiv protokoll med oral ciklosporin 2 mg/kg og prednisolon 1 mg/kg begge to ganger daglig for å forhindre transplantatavstøtning.
  3. Faste dyrene over 4 måneders alder over natten (minst 8 timer). Gi en begrenset mengde våtfôr over natten til dyrene under 4 måneder, og faste dem deretter i 2 timer før operasjonen.
  4. Utfør en generell fysisk undersøkelse, inkludert brystauskultasjon (ved hjelp av et stetoskop). Registrer hjerte- og respirasjonsfrekvens, temperatur, slimhinnefarge og kapillær påfyllingstid.
  5. Premedisinere dyrene yngre enn 4 måneder med buprenorfin (0,02 mg/kg) og de over 4 måneder med buprenorfin (0,02 mg/kg) kombinert med acepromazin (0,02 mg/kg) subkutant eller intramuskulært 30–45 minutter før generell anestesiinnledning.
  6. Påfør aktuell 1% tropikamid oftalmisk løsning og 10% fenylefrin oftalmisk løsning til den okulære overflaten minst to ganger for å utvide elevene. Gjenta hvis elevene ikke er godt utvidet.
  7. Plasser et 22 G intravenøst kateter i cephalic venen i alle dyrene: først klipp hår fra et 2 x 3 cm område over cephalic venen; Forbered huden ved først å skrubbe den med 70% etanol og deretter med en klorhexidinskrubb; Plasser kateteret og fest med medisinsk tape og skyll med heparinisert saltvann. Hos dyr under 4 måneder kan dette gjøres etter induksjon av anestesi.
  8. Indusere generell anestesi 30-45 min etter premedikasjon: dyr under 4 måneder induseres med isofluran levert på maske, de over 4 måneder induseres ved bruk av intravenøs propofol (4-6 mg / kg).
  9. Intubat med en passende størrelse på endotrakealrøret. Visualiser strupehodet med et undersøkelseslys eller laryngoskop. Spray 0,1 ml lidokain 2% på strupehodet, vent noen sekunder og intuber deretter.
  10. Oppretthold anestesi med isofluran (mellom 2%-3,5%) i oksygen (300-600 ml / kg / min) via et Bain-system.
  11. Plasser dyret i dorsalleie på en posisjoneringspute som et oppvarmet vannteppe dekket av håndklær er plassert på. Fest en pasientmonitor og overvåk hjertefrekvensen og elektrokardiogrammet (EKG), respirasjonsfrekvens, blodtrykk, oksygenmetning og karbondioksid i endevannet. Overvåk regelmessig kroppstemperaturen under prosedyren. En egnet trent person er ansvarlig for vedlikehold og overvåking av anestesi.
  12. Plasser dyret ved hjelp av posisjoneringsputen slik at hornhinnens overflate er horisontal når øyet roteres til en primær blikkposisjon. Fest hodet på plass ved hjelp av medisinsk tape.
  13. Dekk dyret med tepper for å opprettholde kroppstemperaturen.
  14. Skyll det intravenøse kateteret med heparinisert saltvann og start en intravenøs infusjon av Ringer-laktat som leveres ved 2-5 ml / kg / t i løpet av prosedyren.
  15. Forbered den okulære overflaten, konjunktivalsekken og øyelokkene for aseptisk kirurgi ved hjelp av 0,2% povidon-jod, sterile bomullspinneapplikatorer og bomullsballer.
  16. Plasser operasjonsmikroskopet med okularer som også er justert på riktig måte. Plasser fotkontrollen for mikroskopet (fokus, zoom og XY-aksekontroll) og vitrektomimaskinen slik at kirurgen kan betjene dem.
  17. Forbered deg på aseptisk kirurgi: alt personell må ha på seg kirurgiske skrubb, en kirurgisk hatt og en maske. Sørg for at kirurgen og assistenten(e) skrubber, kapper og hansker som for rutinemessig aseptisk kirurgi. Alt personell skal være kjent med aseptiske teknikker.
  18. Når personalet er skrubbet, kappet og hansket, åpner du operasjonspakkene og legger ut instrumentene. Plasser sterile manipulasjonsknapper på mikroskopjusteringsknappene slik at kirurgen eller assistenten kan justere uten å bryte asepsis. Draper dyret på en rutinemessig måte for okulær kirurgi.
  19. Forbered vitrektomimaskinen etter produsentens instruksjoner for en to-port vitrektomi.
    1. Plasser en vitrektomi kontaktlinse og to port 23 G vitrektomi på assistentens bord. Fest våtfeltkauteriet. Fest og klargjør infusjonsslangen og 23 G vitrektomi-håndstykket.
    2. Plasser vitrektomiinstrumentene og væskelinjene over det sterile drapet og hold dem på plass ved hjelp av håndkleklemmer. Sett vitrektomimaskinen i proporsjonal vakuummodus mellom 1,500 og 2,500 kutt per minutt (cpm) og maksimalt vakuum på 500 mmHg. Dette utføres ved å trykke på pilknappene (oppover eller nedover) som er tilstede på frontpanelet på vitrektomimaskinen.

2. Fremstilling av organoider for subretinal implantasjon (figur 1)

  1. Utled retinale organoider som beskrevet tidligere 31, og om nødvendig, send over natten ved37 ° C som tidligere rapportert54.
  2. Tørk av overflatene i vevskulturrommet i mottakslaboratoriet med et desinfeksjonsmiddel og oppretthold det samme høye nivået av aseptisk teknikk som i en kirurgisk suite for øyeoperasjoner, for å unngå bakteriell eller soppforurensning, og bær over til operasjonsrommet for å unngå infeksjon på operasjonsstedet.
  3. Bruk kirurgiske skodeksler, engangs laboratoriefrakker, panser, kirurgiske masker, ermer og kirurgiske skrubber inne i vevskulturrommet som er tildelt organoid forberedelse til okulære operasjoner.
  4. Pre-likevekt nevrale medier med 20 ng / ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) og 20 ng / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) i 1 time i en vevskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2). Plasser organoider i media i ultra-lave vedheftsplater ved å bruke omtrent en fjerdedel volum av betinget medium (fra forsendelsen over natten) og tre fjerdedeler volum ferskt medium31,54. Oppretthold i 24–48 timer.
  5. Forbered og smør flere ferske 60 mm plater med nevralt medium (som fremstilt i trinn 2.4) i minst 1 time i vevskulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2) før bedøvelse av det første dyret. Merk at disse platene brukes til å overføre organoider for hver enkelt operasjon, med en antagelse om at pH-forhold og CO2 -metning vil bli opprettholdt i media i minst 20 minutter, tilstrekkelig for å flytte platen til operasjonsrommet og laste organoider inn i kanylen.
  6. Bruk en fersk 60 mm plate med premettede nevrale medier for hvert transplantasjonstilfelle, samtidig som de resterende platene oppbevares i vevskulturinkubatoren ved 37 °C.
  7. Overfør 6–9 organoider til én 60 mm tallerken (med mettede medier) ved å pipette dem ut med en manuell enkanals pipette (20–200 μL) med 200 μL steril filterspiss med en bred (~0,7 mm) åpning. Disse tipsene kan utarbeides på forhånd eller under prosedyren ved å klippe av ~ 3-4 mm av spissen med en steril saks (gjort i vevskulturhetten for å unngå forurensning). Plasser 60 mm tallerkenen i en 100 mm vevskulturskål (for å unngå forurensning under transport fra rom til rom) og transporter raskt til kirurgisk suite.
  8. Plasser platen med organoider på en elektrisk varmepute på 37 °C dekket av en steril drapering.
  9. Bytt til et nytt par sterile hansker før du klargjør organoidene.
  10. Skyll organoidene i steril balansert saltløsning (BSS) (valgfritt), og legg deretter inn i injektoren, som består av en tynnvegget borosilikatglasskanyle (ytre diameter, OD 1,52 mm; indre diameter, ID 1,12 mm) med en polert, stump ende festet med sterilt plastrør til en steril 500 μL Hamilton sprøyte ferdigfylt med steril BSS.
  11. Pass kanylen til det kirurgiske teamet på en steril måte når de er klare til å injisere organoider.
  12. Hold lengden på hele prosedyren (fra å fjerne organoider fra vevskulturmedier til å laste kanylen) til 20 minutter eller mindre.
  13. Hvis det er en forsinkelse i implantering av organoider, plasser dem tilbake i vevskulturinkubatoren for å unngå endringer i pH / CO2 -metning inne i parabolen.
  14. Oppbevar ubrukte organoider i 1 uke i samme vevskulturinkubator og overvåke for tegn på forurensning.

3. Implantasjon av subretinale organoider

  1. Utfør en 0,5–1 cm lateral kantomi med Stevens tenotomi saks. Plasser et passende størrelse Barraquer øyelokkspekulum for å holde øyelokkene åpne. Sørg for at kirurgisk assistent vanner hornhinnen regelmessig med BSS i løpet av prosedyren.
  2. Sted 2 opphold suturer med 6-0 silkesutur i bindehinnen rett ved siden av limbus klokken 4 og 8 for å holde øyet i primært blikk og trekke det tredje øyelokket tilbake. Bruk 0,5 Castroviejo hornhinnebindende tang og en liten mygghemostat for å forsiktig gripe bulbar conjunctiva ved siden av limbus. La suturene være lange og klem endene med små mygghemostater for å hjelpe til med manipulasjonen.
    MERK: Det er vanskeligere å plassere suturen under det tredje øyelokket; Pass på å plassere den umiddelbart ved siden av limbus.
  3. Plasser en annen sutur klokken 12 ved limbusen, delvis gjennom tykkelsen på limbusen, pass på at du ikke trenger inn i øyet. Knut denne suturen løst og kutt endene kort. Dette gir en robust ankersutur, som brukes under operasjonen som et "håndtak" for å rotere øyet for å gi kirurgen tilgang til forskjellige deler av kloden under ulike stadier av prosedyren.
    MERK: Trinn 3.2 og 3.3 kan inverteres. Sekvensen av oppholdssuturplassering er kirurgens preferanse.
  4. Reflekter bulbar conjunctiva mellom klokken 10-2 (en perimetri). Bruk tenotomi saks, snitt conjunctiva 2-3 mm fra limbus. Undergrav det og fjern tenonens kapsel for å eksponere sclera på stedene for klokken 2 og 10 vitrektomiporter, som vil bli plassert ca. 3-5 mm fra limbus avhengig av dyrets alder. Bruk kirurgiske cellulosespyd for hemostase og for å fjerne blod.
  5. Identifiser steder for sklerotomi etter refleksjon av bindehinden og tenons kapsel ved hjelp av kalipere. Velg sklerotomisteder (klokken 2 og 10 med sikte på å passere gjennom pars plana), for å unngå de store sklerale karene som kan være fremtredende i katten. Bruk våtfeltkautery på sclera på de planlagte sklerotomistedene for å redusere skleral blødning, og planlegg for en ~ 3 mm region ved instrumentporten (klokka 10 for en høyrehendt kirurg), da dette vil bli forstørret etter vitrektomi for å tillate implantasjonskanylen å bli introdusert.
  6. Pre-place cruciate mønster suturer (6-0 eller 7-0 polyglactin sutur) uten å binde knuten på stedet for de foreslåtte sklerotomiene før vitrektomiportene plasseres.
    MERK: Dette muliggjør rask lukking av sklerotomiene ved slutten av prosedyren. Suturen for den planlagte instrumentporten må ha en lengre bit av sclera, da dette vil være et langt snitt.
  7. Når suturene er plassert, be assistenten om å hjelpe til med å posisjonere kloden ved å holde 12-tiden ved å binde eller bruke Bishop-Harmon-tang. La kirurgen stabilisere kloden også, ved hjelp av en 0,12 mm Castroviejo tang for å holde vevet ved siden av sklerotomistedet.
    1. Introduser en 23 G vitrektomiport ved hjelp av en trokar gjennom sclera både klokken 2 og klokken 10 posisjoner rettet mot optisk nerve for å unngå å kontakte linsen.
    2. Kontroller at vanningsporten er i glasslegemet ved å skyve forsiktig på porten ved hjelp av bindetang slik at spissen kan visualiseres i glasslegemet. Når riktig posisjonering er bekreftet, fest vanningsledningen til porten og plasser linjen ved hjelp av tynne selvklebende bandasjer for å tape den på plass. Sett vitrektomiinfusjonen av BSS-bufferen i utgangspunktet på 30-35 mmHg ved å trykke på pilknappene (oppover eller nedover) som er tilstede på vitrektomimaskinens frontpanel.
  8. La assistenten holde en Machemer forstørrende irrigerende vitrektomi linse på hornhinnen for å tillate visualisering av det bakre segmentet av øyet i løpet av de neste stadiene. Fest vanningsvitrektomi-linsen til et dryppsett som gir konstant væsketilførsel for å koble linsen til hornhinnen.
    MERK: Andre former for kontakt vitrektomi linse kan også brukes. Dim eller slå av romlysene for å hjelpe visualisering gjennom operasjonsmikroskopet.
  9. Sett inn 23 G vitrektomi sonde / kutter (2,500 cpm) gjennom instrumentporten (ved siden av kirurgens dominerende hånd, dvs. klokken 10 for en høyrehendt kirurg) og utfør en delvis kjerne vitrektomi.
    1. Fjern deretter glasslegemet helt fra retinaloverflaten i regionen som vil motta transplantasjonen (dette er viktig for prosedyrens suksess) ved å løsne det vitreale ansiktet fra netthinnen.
    2. Plasser vitrektomisonden over det optiske nervehodet med porten vendt bort fra retinaloverflaten og bruk høyere vakuum for å starte den vitreale ansiktsløsningen.
  10. Forbered triamcinolonkrystaller til intraokulær bruk. Hvis triamcinolonsuspensjonen ikke er spesielt for intravitreal bruk, vask krystallene og suspender deretter i BSS igjen.
    1. Filtrer først suspensjonen ved hjelp av et sterilt 0,22 μm poresprøytefilter med PES-membran (festet til en 1 ml sprøyte) for å fange krystallene.
    2. Vask deretter de fangede triamcinolonkrystallene ved å aspirere BSS i 1 ml sprøyten og skylle gjennom filteret (krystallene forblir fanget i filteret). Dette fjerner konserveringsmidlene i løsningen. Gjenta vasken 3 ganger, hvorpå krystallene suspenderes igjen i 1 ml BSS.
  11. Før nålen på sprøyten som holder triamcinolon gjennom instrumentporten. Vær forsiktig så du ikke berører linsen ved å se nålspissen gjennom pupillen mens du fører nålen gjennom instrumentporten. Injiser 0,25 til 0,5 ml krystallsuspensjon. Sett deretter vitrektomisonden gjennom instrumentporten og før den nær optisk nervehode med porten vekk fra retinaloverflaten og bruk høyt vakuum for å løsne det vitreale ansiktet fra netthinnen.
    MERK: Triamcinolonkrystallene holder seg til og fremhever dermed det gjenværende glasslegemet. Fjern forsiktig glasslegemet over og ved siden av stedet for planlagt organoidimplantasjon (f.eks. den sentrale tapetal fundus nær området centralis-regionen ).
  12. Lag en liten fokal netthinneløsning bleb på ønsket implantasjonssted ved hjelp av en subretinal injektor, f.eks. 23 G subretinal injektor med en uttrekkbar 41 G kanyle festet til en steril 250 μL gasstett Luer låsesprøyte fylt med steril BSS.
    1. Før subretinal bleb opprettes, reduser infusjonstrykket til 10 mmHg for å lette blebdannelsen.
    2. Sett injektoren gjennom instrumentporten og før den mot retinaloverflaten. Ekstruder kanylespissen og trykk den forsiktig på netthinneoverflaten. Be assistenten om å trykke litt raskt på sprøytestempelet for å starte netthinneløsningen som reduserer injeksjonstrykket slik at netthinneløsningen kan økes langsomt til ønsket størrelse oppnås (ca. 100 til 200 mikroliter BSS brukes).
  13. Hvis retinotomien som opprettes er i en passende posisjon, som unngår å kutte netthinnen mellom implantasjonsstedet og optisk nervehode for å forhindre seksjonering av nervefiberlaget avledet fra implantasjonsstedet og for å unngå store retinale blodkar (dette bestemmes også av studiedesignet, i vårt tilfelle ble den sentrale netthinnen valgt), deretter forstørre den litt ved hjelp av 41 G-kanylen til injektoren, med sikte på å lette innføringen av retinal saks.
  14. Fjern injektoren fra øyet og fjern klokken 10. Forstørr sklerotomien på dette stedet ved hjelp av en rett 2,85 mm spaltekniv / keratom orientert mot optisk nerve for å unngå å berøre linsen. Oppretthold infusjonstrykket ved 10-15 mmHg.
  15. Utvid retinotomi ved hjelp av vitreoretinal vertikal 80 ° saks med klemmehåndtak, unngå å kutte retinalkar for å forhindre retinalblødning og sørg for å kutte retina på kanten av bleb vekk fra optisk nervehode for å unngå å kutte nervefibre som fører fra netthinnen i transplantasjonsområdet til optisk nerve. Retinotomien bør ha tilstrekkelig bredde til å motta organoider.
  16. Sett inn den forhåndslastede glasskapillæren som inneholder organoidene (se trinn 2.10) gjennom den forstørrede sklerotomien og før den mot retinotomistedet under direkte visualisering.
    1. Bruk spissen av glasskapillæren til å åpne retinotomien litt for å få tilgang til åpningen i subretinal bleb.
    2. Be assistenten om å sakte trykke på stempelet på injektoren, mens du ser gjennom mikroskopet, injiserer organoider i subretinal bleb. BSS bør gå foran organoider og skylle retinotomi åpen.
    3. Skyv forsiktig organoidene i bleben med spissen av glasskapillæren hvis de er på kanten av retinotomien.
  17. Hold glasskapillæren ved retinotomi i noen sekunder for å prøve å lukke retinotomi og forhindre at organoider rømmer inn i glasslegemet.
  18. Svært sakte fjerne glasskapillæren fra øyet, unngå plutselig frigjøring av væske fra øyet for å unngå væskebevegelse i øyet som kan utvise organoider fra subretinal bleb.
  19. Øk infusjonstrykket langsomt til 20–30 mmHg for å forhindre intraokulær blødning, og pass på at infusjonsvæsken ikke vaskes direkte på blødningen. Dette utføres ved å trykke på oppoverpilknappene på frontpanelet på vitrektomimaskinen.
  20. Lukk sklerotomien med den forhåndsplasserte suturen i et korsmønster (6–0 eller 7–0 polyglaktin). Legg til flere enkle avbrutte suturer etter behov for å forsegle sklerotomien.
  21. Be assistenten om å fjerne infusjonsporten og la kirurgen raskt binde den forhåndsplasserte suturen for å forsegle sklerotomien og forhindre tap av intraokulært trykk.
  22. Lukk konjunktivsnittet (peritomi) med 6–0 eller 7–0 polyglaktin i et enkelt kontinuerlig mønster.
  23. Bilde fundus (f.eks ved hjelp av en RetCam II video fundus kamera, Clarity, eller lignende) og registrere den umiddelbare posisjonen til organoider innenfor subretinal plass.
  24. Forbered den okulære overflaten på nytt etter avbildning med 0,2% povidonjodoppløsning ved hjelp av applikatorer med bomullsspiss og bomullsdotter. Fjern de tre oppholdssuturene og lokkspekulumet.
  25. Lukk lateral canthotomy med 6-0 polyglactin sutur. Plasser en enkelt begravet sutur etterfulgt av en figur på 8 hudsuturer for å reformere lateral canthus og bruk deretter enkle avbrutte hudsuturer for å lukke resten av såret.
  26. Etter at den kirurgiske prosedyren er fullført, gi en subkonjunktival injeksjon av en steroid- og antibiotikakombinasjon (2 mg metylprednisolonacetat, 0,1 mg dexametason og 1 mg gentamicin). Plasser et oftalmisk smøremiddel (kunstige tårer) på hornhinnen.
  27. Gjenopprett dyret fra anestesi og følg nøye under utvinning for tegn på smerte som vil kreve ytterligere behandling, for eksempel markert blefarospasme, alvorlig motvilje mot å bli manipulert, sløvhet eller nedsatt appetitt og økt respiratorisk og hjertefrekvens. Gi postoperativ analgesi etter behov og overvåke nøye for ubehag.
    MERK: Kun riktig opplært personell bør ha ansvaret for bedøvelse og overvåking av kattepasientene før, under og etter operasjonen. Følg anbefalingene fra den lokale dyreetiske komiteen for postoperativ behandling.

4. Postimplantasjonsprosedyrer, postoperativ behandling og vurdering

  1. Fortsett å behandle med orale immunsuppressive medisiner (1 mg / kg prednisolon og 2 mg / kg ciklosporin oralt to ganger daglig) for å kontrollere betennelse og avvisning av organoider. Gi systemisk antibiotikadekning (f.eks. peroral doksysyklin 5 mg/kg to ganger daglig – dette antibiotikumet ble valgt på grunn av risikoen for opportunistisk mykoplasmainfeksjon hos immunsupprimerte dyr).
  2. Utfør regelmessige oftalmiske undersøkelser for å overvåke for betennelse eller utvikling av bivirkninger. Overvåk retinal bleb for flattning, som oppstår i løpet av de første dagene etter operasjonen til tross for den store retinotomien som kreves for organoider som skal injiseres i subretinalrommet. Ta opp fundusbilder ved hver undersøkelse for å registrere posisjonen og utseendet til de transplanterte organoidene.
  3. Bilde dyrene under generell anestesi ved konfokal skanning laser oftalmoskopi (cSLO) og spektraldomene - optisk koherens tomografi (SD-OCT) 5,31 i overvåkingsperioden og før avslutningen av forsøket.
  4. Avlive dyrene på en human måte ved avslutning av forsøket ved hjelp av en AVMA-godkjent metode, f.eks. intravenøs administrering av 85 mg/kg pentobarbital. Etter sedasjon, plasser et intravenøst kateter for administrering av pentobarbital for å minimere stress. Bekreft dødsfallet ved opphør av hjerterytme og gjør et snitt i thorax for å lage en pneumothorax.
  5. Fjern øynene via en standard transkonjunktiv tilnærming og fiks etter behov. For immunhistokjemi (IHC), senk øynene umiddelbart i 4% paraformaldehydoppløsning etter at 0,3 ml av fikseringsløsningen er injisert i det bakre segmentet gjennom 3 spalter laget gjennom pars plana med et 11 Parker-blad (~ 3-4 mm fra limbus).
  6. Dissekere øyekoppene etter 3,5 timers fiksering ved 4 °C. Fjern gjenværende glasslegeme, og sørg for å bevare netthinnen og organoider intakt. Legg fikseringsmiddelet tilbake i ytterligere 30 minutter ved 4 °C, og skyll deretter øyekoppene 3 ganger hver i 10 minutter i PBS. Overfør øyekoppen til 15% sukrose i 2 timer, deretter til 30% sukrose i ytterligere 2 timer.
  7. Skyll øyekoppen to ganger med PBS og legg den inn i OCT-medium (optimal skjæretemperaturforbindelse) og blitzfrys, oppbevar deretter ved -80 °C til snitting for histologi og immunkjemi.
  8. Velg antistoffer for IHC basert på studieprotokollen og målene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne prosedyren muliggjør vellykket og reproduserbar implantasjon av hPSC-avledede retinale organoider i det subretinale rommet til en stor øyedyrmodell (demonstrert her ved hjelp av 2 eksempler: villtypekatter med sunne fotoreseptorer (PR) og CrxRdy / + katter med degenererende PR og netthinnen). Ved hjelp av trinnene som er angitt i figur 1 , klargjør og last de hPSC-deriverte retinale organoidene inn i borosilikatglasskanylen på injeksjonsanordningen slik at organoidene ikke blir skadet. Dette kan bekreftes ved direkte visualisering under belastning av organoidene (trinn 2.10) og under operasjonen (trinn 3.16) (figur 2A,B) samt fundusavbildning ved operasjonsslutt (trinn 3.23, figur 2C). Tilstedeværelsen av organoidene i det subretinale rommet ved hjelp av denne teknikken bekreftes postoperativt ved oftalmisk undersøkelse og fundusavbildning (figur 3A), som registrerer organoidenes posisjon og utseende. Å vite transplantatets posisjon er svært viktig når man behandler klodene for frossen histologi og immunhistokjemi og reduserer arbeidsbelastningen betydelig, da det tar tid å seksjonere et stort øye på 12-14 μm (tykkelsen på en kryoseksjon). Før eutanasi utføres også konfokal skanning av laseroftalmoskopi (cSLO) og spektral domene-optisk koherenstomografi (SD-OCT) for å vurdere organoidenes posisjon i det subretinale rommet (figur 3A-D). Disse teknikkene demonstrerer persistensen av retinale organoider i subretinalrommet (mellom nevral retina og RPE) i mottakerøyet (figur 3E). Etter eutanasi (utført humant etter AVMA-anbefalinger) utføres histologi og immunhistokjemi (IHC) rutinemessig (se detaljer i tidligere publisert artikkel31). Histologi og IHC viser overlevelse av xenogene transplantater (hPSC-deriverte retinale organoider) i det subretinale rommet i et stort øye når dyrene var immunsupprimerte (som tidligere beskrevet31), se figur 4.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av trinnene for organoidklargjøring før implantasjonen.
Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Kirurgiske subretinale implantasjoner av organoider. (A) Direkte visualisering av organoider som leveres inn i subretinalrommet gjennom en glasskanyle uten å bli skadet, (B) Direkte visualisering av organoider i subretinal bleb, (C) Vidvinkel fundus fargebilde av subretinalt implanterte organoider umiddelbart etter operasjonen. De bleb kantene er indikert av de svarte pilspissene og retinotomistedet av de svarte stjernene.
Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Postoperativ vurdering av subretinalt implanterte organoider 3 måneder etter implantasjon i en CrxRdy/+ katt. (A) Fundusfargebilde av subretinalt implanterte organoider, (B) cSLO fundus-bilde av de subretinalt implanterte organoidene, (C) 3D-volumskanningsrekonstruksjon av området som inneholder organoidene, (D) cSLO bilde av området som inneholder subretinale organoider, (E) SD-OCT høyoppløselig, tverrsnittsbilde av de subretinalt implanterte organoider. Retinotomistedet indikeres av de svarte stjernene.
Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Humane retinale organoidderiverte fotoreseptorark (PR-markør RCVRN) i subretinalt rom av CrxRdy/+ katt, 3 måneder etter poding.  *Synaptiske boutoner (hSYP=Synaptophysin) i kattens indre nukleære lag (INL).
Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Implantasjon av hPSC-avledet retinalvev (retinale organoider) i det subretinale rommet er en lovende eksperimentell tilnærming for å gjenopprette visjon for sent stadium retinal degenerative sykdommer forårsaket av PR-celledød (dyp eller terminal blindhet). Den presenterte tilnærmingen bygger på en tidligere utviklet og vellykket testet eksperimentell terapi basert på subretinal poding av et stykke humant føtalt retinalvev23,24,25. Den presenterer bruken av en alternativ, etterfyllbar og etisk akseptabel netthinnevevskilde avledet fra hPSCs. Demonstrere kirurgisk gjennomførbarhet og okulær sikkerhet ved terapi i store øyedyrmodeller51,55 er nødvendig for å fremme denne lovende tilnærmingen til kliniske applikasjoner. Dette manuskriptet gir en detaljert metode for subretinal implantasjon av hPSC-3D retinalt vev (retinale organoider) i en stor dyremodell med både normal og degenererende retina (modell av CrxRdy/+ kattemodell av LCA). Selv om prosedyrer for å introdusere et flatt stykke menneskelig retina og også RPE-patcher har blitt utviklet43,44,45, har transplantasjon av større 3D-transplantater (nødvendig for å gjenopprette syn under forhold med avansert RD) ikke blitt undersøkt. Protokollen beskrevet her i detalj er for en transplantasjonsprosedyre for subretinal levering av hele retinale organoider (i stedet for organoide felger33,41) som også bærer noen RPE som en potensielt bedre måte å introdusere intakte retinale ark med PR, for å øke transplantatoverlevelse og forbedre arkbevaring. Merk at forskjellige deler av denne protokollen er godt etablert. For eksempel er vitrektomi mye brukt av vitreoretinale kirurger under retinal reattachment kirurgi 56,57,58,59,60. Subretinale injeksjoner blir stadig vanligere, for eksempel i genforstørrelsesterapi 3,7,61,62,63,64. Det er begrensede beskrivelser av opprettelse av adekvat retinotomi og injeksjon av relativt store organoider i subretinalrommet.

De kritiske trinnene inkluderer forsiktig posisjonering og ytelse av sklerotomi for å unngå linsen, fullstendig fjerning av glasslegemet fra retinaloverflaten over transplantasjonsstedet, kontrollert dannelse av subretinal bleb, generering av retinotomi av optimal størrelse for å imøtekomme bredden av transplantasjonskanylen, opprettholde det definerte infusjonstrykket under forskjellige trinn, og kanyleuttak. Velge riktig transplantasjonskanyle med optimalisert indre og ytre diameter (ID og OD) og lengde, kontrollere intraokulær blødning, steriliteten i hele prosedyren fra organoider til operasjonsrom og instrumenter, og operasjonens varighet (30–45 min/dyr) for å sikre optimale resultater. Forfatterne finner at de beste resultatene oppnås med 23 G vitrektomi på grunn av tykkelsen / viskositeten til katteglasset, noe som skaper en bleb med en injektor med en 41 G kanyle, og deretter utvider retinotomi ved kanten av bleb ved hjelp av 80 ° vinkel retinal saks. Andre viktige faktorer inkluderer å utvide sklerotomien ved hjelp av et 2,85 mm keratom for å passe til borosilikatglasskanylen (ytre diameter OD 1,52 mm; indre diameter, ID 1,12 mm og lengde 10,16 cm) og tillate implantasjon av større organoider i et stort øye med aksial lengde ca. 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. Bruken av en glasskapillær var den nåværende beste tilgjengelige for lasting og levering av organoider i nedstigningsstørrelse uten å skade dem under implantasjonsprosessen. Det ble funnet at å redusere infusjonstrykket fra 20-30 mmHg under vitrektomi til 10 mmHg under blebformasjonstrinnet er optimalt for å generere retinale detachments, som trengs for å skape plass til retinale organoider. I tillegg er levedyktigheten til hPSC-3D retinalvev (organoider) under langdistanseforsendelse og valg av optimalisert immunsuppresjonsregime for vedlikehold av xenogene humane transplantater kritisk som nylig rapportert31,54.

Forfatterne fant at på grunn av den svært reflekterende katttapetum var endo-belysning ikke nødvendig for å utføre operasjonen. Transplantasjon i en atapetal art (f.eks gris, nonhuman primat) ville kreve en 3-port vitrektomi som inkluderer endo-belysning. Tamponade (f.eks. med perfluorkarbon etterfulgt av silikonolje) som utført i rutinemessig retinal detachment kirurgi ble ikke utført fordi trykk på bleb ville risikere å ekstrudere organoider i glasslegemet. Fremtidig utvikling kan inkludere bruk av materialer som for tiden undersøkes for tetting av retinale hull. Dette kan brukes til å forhindre tap av organoider i glasslegemet etter implantasjon. I tillegg kan Triescence, som ligner på Kenalog-40, men inneholder konserveringsmiddelfri triamcinolon, brukes som et alternativ til å visualisere glasslegemet.

Den mindre klodestørrelsen hos yngre dyr (f.eks. 1–2 måneder) ga flere kirurgiske utfordringer sammenlignet med det store øyet (voksne dyr). Likevel, ved hjelp av metoden beskrevet her, er det mulig å levere subretinale transplantater. I CrxRdy / + LCA-modellen ble større retinale blebs funnet å ikke alltid feste seg igjen. Å holde bleb til minimumsstørrelsen som trengs for å tillate retinale organoider å bli injisert, reduserte denne komplikasjonen. Transplantasjon tidligere i RD retina (før fullstendig tap av PR når nevrale retina blir markert tynnet) er en annen retningslinje, i tråd med det tidligere arbeidet med humane føtale retina grafts20. Et annet notat - den detaljerte teknikken er ikke avhengig av å plassere retinalarket i riktig retning fordi hele retinale organoider transplanteres. Ved utvikling av flate hESC-retinalplater vil dette være viktig. Det er imidlertid ikke fokus for denne protokollen, som er rettet mot å levere intakte hESC-retinale vevsark og optimalisere subretinal bevaring av PR-ark. Når teknikken ble utviklet, var den reproduserbar i både normal og RD retina.

Det er mange potensielle komplikasjoner til denne kirurgiske prosedyren. Bare de som er dyktige i vitreoretinal kirurgi (f.eks. Trente veterinære oftalmologer eller vitreoretinale kirurger kjent med artsforskjellene i kattøyet sammenlignet med menneskelig øye) bør gjennomføre prosedyren. Mulige komplikasjoner inkluderer linseberøring under trokarplassering, skleral blødning under sklerotomiforstørrelse og subretinale eller retinale blødninger. Andre komplikasjoner som vertens immunrespons mot xenogene humane organoide transplantater som fører til ødeleggelse av transplantatet over tid eller endoftalmitt er mulige; Bruk av orale immunsuppressive midler og antibiotika medisiner bidra til å forhindre at disse oppstår. Det er også viktig å merke seg at det er en forskjell mellom implantasjon i villtype og CrxRdy/+ katter. Når det er avansert retinal degenerasjon, har retinal bleb en tendens til å spre seg bredere enn i villtypen, og i noen tilfeller kan dette forhindre fullstendig retinal reattachment etter operasjonen. Teknikken som presenteres her er anvendelig for implantasjon av organoider i øynene til store dyremodeller av IRD. Ytterligere forbedring vil være nødvendig når transplantasjonen er klar for oversettelse til klinikken.

Basert på forfatternes erfaring med å utføre komplekse vitreoretinale kirurgiske prosedyrer i store øyemodeller, bør teknikken som presenteres i dette manuskriptet gjelde for andre store dyremodeller (med inkludering av endobelysning i atapetalarter) som brukes til å oversette vitreoretinale kirurgiske teknikker til klinikken43,44,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., og Igor O. Nasonkin Ph.D. er ansatte i Lineage Cell Therapeutics, Inc. Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 og SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones er en co-PI). Forfatterne vil gjerne takke Janice Querubin (MSU RATTS) for hennes hjelp med anestesi og generell omsorg for dyrene som er inkludert i denne studien, samt hjelp med kirurgisk setting og instrumentforberedelse / sterilisering. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Paige Winkler for hjelpen med å motta organoider og plassere dem i media dagen før implantasjonen og for hjelpen på implantasjonsdagen. Forfatterne er også takknemlige for Mr. Randy Garchar (LCTX) for flittig forsendelse av retinale organoider, montering av avsenderen og nedlasting av temperatur og G-stress-poster etter hver forsendelse. Dette arbeidet ble utført mens forfatteren Igor Nasonkin var ansatt i Biotime (nå Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 174 retinal organoider katt stort øye dyr modell subretinal transplantasjon retinal degenerasjon kirurgisk teknikk
Subretinal transplantasjon av humant embryonalt stamcelleavledet retinalvev i en katt stor dyremodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter