Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

מוצגת כאן טכניקה כירורגית להשתלת רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול.

Abstract

מצבים ניווניים ברשתית (RD) הקשורים לאובדן קולטני אור כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) ואמאורוזיס מולד Leber (LCA) גורמים לאובדן ראייה מתקדם ומתיש. יש צורך בלתי מסופק בטיפולים שיכולים לשחזר את הראייה לאחר פוטורצפטורים אבדו. השתלת רקמת רשתית (אורגנואידים) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של עין עם RD מתקדם מביאה יריעות רקמת רשתית עם אלפי פוטורצפטורים בריאים ללא מוטציות ויש לה פוטנציאל לטפל ברוב/כל המחלות המסנוורות הקשורות לניוון קולטני אור עם פרוטוקול מאושר אחד. השתלת רקמת רשתית עוברית בחלל התת-רשתית של מודלים של בעלי חיים ואנשים עם RD מתקדם פותחה בהצלחה אך אינה יכולה לשמש כטיפול שגרתי בשל חששות אתיים ואספקת רקמות מוגבלת. מודלים של ניוון רשתית תורשתי בעין גדולה (IRD) הם בעלי ערך לפיתוח טיפולים לשיקום ראייה תוך שימוש בגישות כירורגיות מתקדמות להשתלת תאים/רקמות רשתית בחלל התת-רשתית. הדמיון בגודל כדור הארץ, ובפיזור קולטני האור (למשל, נוכחות של אזור מרכזי דמוי מקולה) והזמינות של מודלי IRD המסכמים מקרוב IRD אנושי יאפשרו תרגום מהיר של טיפול מבטיח למרפאה. מוצגת כאן טכניקה כירורגית של השתלת רקמת רשתית שמקורה ב-hPSC בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול, המאפשרת הערכה של גישה מבטיחה זו במודלים של בעלי חיים.

Introduction

מיליוני אנשים ברחבי העולם מושפעים מניוון רשתית (RD) עם ליקוי ראייה או עיוורון כתוצאה מכך הקשורים לאובדן קולטני האור קולטי האור (PRs). ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הוא גורם עיקרי לעיוורון הנובע משילוב של גורמי סיכון גנטיים וגורמים סביבתיים / אורח חיים. בנוסף, מעל 200 גנים ואתרים נמצאו כגורמים ל- RD תורשתי (IRD)1. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), ה-IRD הנפוץ ביותר, הוא הטרוגני מבחינה גנטית עם יותר מ-3,000 מוטציות גנטיות בכ-70 גנים המדווחים 2,3,4. Leber Congenital Amaurosis (LCA), הגורם לעיוורון בילדות הוא גם הטרוגני גנטית 5,6. טיפול בהגדלת גנים פותח ונמצא בניסויים קליניים לטיפול במספר קטן של IRDs 3,7. עם זאת, יש לפתח טיפול נפרד לטיפול בכל צורה גנטית נפרדת של IRD ובכך לטפל רק בתת-קבוצה קטנה של חולים. יתר על כן, הגדלת גנים מסתמכת על נוכחות של אוכלוסייה של פוטורצפטורים הניתנים להצלה ולכן אינה ישימה לניוון מתקדם.

יש, אם כן, צורך קליני דחוף ועדיין לא מסופק בפיתוח טיפולים המטפלים ומטפלים ב- RDs מתקדמים ובעיוורון עמוק עד סופני. במהלך 2 העשורים האחרונים שתלים נוירו-תותבים פותחו ונבדקו במודלים גדולים של בעלי חיים, כגון החתול, לפני השימוש האנושי 8,9,10,11,12,13,14. כמו כן, ב-20 השנים האחרונות פותחו טיפולים בתחליפי רשתית באמצעות יריעות רשתית עוברית או אפילו בוגרת של יונקים שהושתלו באופן תת-רשתי 15,16,17,18,19,20,21,22 ואף נבדקו בהצלחה בחולי RD 23,24,25. שתי הגישות משתמשות ברעיון של החדרת חיישנים חדשים (פוטודיודות סיליקון פוטו-וולטאיות במקרה של התקנים נוירו-תותבים26,27, ופוטורצפטורים בריאים ללא מוטציות המאורגנים ביריעות, במקרה של השתלת יריעות רשתית) לרשתית עם PRs מנוונים. מחקרים אחרונים חקרו את השימוש בגישות מבוססות תאי גזע כגון השתלת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) שמקורם באבות רשתית28,29, hPSC-photoreceptors 30 ואורגנואידים hPSC-רשתית31,32,33. אורגנואידים ברשתית מאפשרים היווצרות רקמת רשתית בצלוחית וגזירה של יריעות קולטי אור עם אלפי PRs נטולי מוטציות, הדומים לשכבת קולטי האור ברשתית העובר האנושית המתפתחת 34,35,36,37,38,39,40 . השתלת רקמת רשתית שמקורה ב-hPSC (אורגנואידים) בחלל התת-רשתית של חולים עם תנאי RD היא אחת הגישות החדשות והמבטיחות לטיפול תאי ניסיוני, הננקטת על ידי מספר צוותים 31,32,41,42. בהשוואה להשתלת תרחיף התא (של פוטורצפטורים צעירים או אבות רשתית), יריעות מושתלות של פוטורצפטורים עובריים הוכחו כמביאות לשיפור בראייה בניסויים קליניים23,24.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר, בפירוט, הליך השתלה למסירה תת-רשתית של אורגנואידים רשתית שלמים (במקום שולי אורגנואיד33,41) כדרך טובה יותר להציג יריעות רשתית שלמות עם PRs, כדי להגדיל את הישרדות השתל ולשפר את שימור היריעה. למרות שהליכים להחדרת חתיכה שטוחה של רשתית אנושית וגם מדבקות RPE פותחו 43,44,45, השתלת שתלים תלת ממדיים גדולים יותר לא נחקרה. אורגנואידים ברשתית שמקורם בתאי גזע מספקים מקור בלתי נדלה של יריעות קולטי אור לפיתוח טכנולוגיות שיקום ראייה, חופשיים ממגבלות אתיות, ונחשבים למקור מצוין של רקמת רשתית אנושית לטיפולים המתמקדים בטיפול ב- RD מתקדם ובעיוורון סופני46. פיתוח שיטות כירורגיות להשתלה תת-רשתית מדויקת של אורגנואידים ברשתית עם פגיעה מינימלית בנישת הרשתית המארחת (רשתית עצבית, אפיתל פיגמנט רשתית וכלי דם רשתית וכורואידיים) הוא אחד הצעדים הקריטיים לקידום טיפול כזה לקראת יישומים קליניים31,32. מודלים גדולים של בעלי חיים כגון חתולים, כלבים, חזירים וקופים הוכיחו את עצמם כמודלים טובים לחקר שיטות מסירה כירורגיות, כמו גם כדי להדגים את הבטיחות של יריעות רקמה מושתלות (תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) ולחקור את השימוש באורגנואידים 41,44,45,47,48,49,50 . לעין החיה הגדולה יש גודל גלובוס דומה לאדם, כמו גם אנטומיה דומה כולל נוכחות של אזור בעל צפיפות פוטורצפטור גבוהה, כולל מדוכים (האזור centralis), הדומה למקולה האנושית 6,51,52.

בכתב יד זה מתוארת טכניקה להשתלת רקמת רשתית שמקורה ב-hPSC (אורגנואידים) בחלל התת-רשתי של מודלים של חיות גדולות של חתולים (הן חתולי בר והן חתולי CrxRdy/+), אשר יחד עם תוצאות יעילות מבטיחות32,53 בונה בסיס לפיתוח נוסף של טיפול ניסיוני כזה לקראת יישומים קליניים לטיפול במצבי RD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים נערכו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. הם אושרו גם על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. במחקר זה נעשה שימוש בחתולי בר וחתולי CrxRdy/+ ממושבת חתולים שהוחזקה באוניברסיטת מישיגן. בעלי החיים שוכנו תחת מחזורי אור-חושך של 12 שעות: 12 שעות והוזנו בתזונה מסחרית מלאה של חתולים.

1. הליכי טרום השתלה ומערך כירורגי

  1. בחר חתולי בר או CrxRdy/+ בהתאם לעיצוב המחקר. לבצע בדיקה אופתלמית טרום ניתוחית, כולל ביומיקרוסקופיה של מנורת סדק ואופטלמוסקופיה עקיפה. אין לכלול בעלי חיים עם הפרעות פונדוס שאינן קשורות לגנוטיפים שלהם.
  2. שבוע לפני ההשתלה, יש להתחיל את הטיפול בבעלי חיים בפרוטוקול מדכא מערכת החיסון של ציקלוספורין פומי במינון 2 מ"ג/ק"ג ופרדניזולון במינון 1 מ"ג/ק"ג פעמיים ביום כדי לסייע במניעת דחיית השתלה.
  3. צום את בעלי החיים מעל גיל 4 חודשים למשך הלילה (לפחות 8 שעות). ספקו כמות מוגבלת של מזון רטוב למשך הלילה לבעלי החיים מתחת לגיל 4 חודשים, ולאחר מכן, צמו אותם במשך שעתיים לפני הניתוח.
  4. בצע בדיקה גופנית כללית, כולל הצבת חזה (באמצעות סטטוסקופ). רשום את קצב הלב והנשימה, הטמפרטורה, צבע הקרום הרירי וזמן מילוי הנימים.
  5. טרום תרופות לבעלי חיים מתחת לגיל 4 חודשים עם buprenorphine (0.02 מ"ג / ק"ג), ואלה מעל גיל 4 חודשים עם buprenorphine (0.02 מ"ג / ק"ג) בשילוב עם acepromazine (0.02 מ"ג / ק"ג) תת עורית או תוך שרירית 30-45 דקות לפני השראת הרדמה כללית.
  6. החל מקומי 1% tropicamide פתרון אופתלמי ו 10% phenylephrine פתרון אופתלמי על פני השטח העין לפחות פעמיים כדי להרחיב את התלמידים. חזור על הפעולה אם האישונים אינם מורחבים היטב.
  7. מניחים קטטר תוך ורידי 22 G בווריד הצפלי בכל בעלי החיים: ראשית קליפ שיער מאזור 2 x 3 ס"מ מעל הווריד הצפלי; להכין את העור על ידי קרצוף אותו הראשון עם אתנול 70% ולאחר מכן עם לשפשף chlorhexidine; מניחים את הקטטר ומהדקים בעזרת סרט רפואי וסומקים במי מלח הפריניזציה. בבעלי חיים מתחת לגיל 4 חודשים, ניתן לעשות זאת לאחר השראת הרדמה.
  8. השראת הרדמה כללית 30-45 דקות לאחר טרום תרופות: בעלי חיים מתחת לגיל 4 חודשים מושרים עם איזופלורן המועבר על ידי מסכה, אלה מעל גיל 4 חודשים מושרים באמצעות פרופופול תוך ורידי (4-6 מ"ג / ק"ג).
  9. אינטובט עם גודל מתאים של צינור endotracheal. לדמיין את הגרון עם אור בדיקה או laryngoscope. יש לרסס 0.1 מ"ל לידוקאין 2% על הגרון, להמתין מספר שניות ולאחר מכן לבצע אינטובט.
  10. לשמור על הרדמה עם איזופלורן (בין 2%-3.5%) בחמצן (300-600 מ"ל/ק"ג/דקה) באמצעות מערכת Bain.
  11. הניחו את בעל החיים בשכיבה גבית על כרית מיקום שעליה מונחת שמיכת מים מחוממת מכוסה מגבות. חבר מוניטור מטופל ועקוב אחר קצב הלב והאלקטרוקרדיוגרמה (ECG), קצב הנשימה, לחץ הדם, רוויית החמצן ופחמן דו חמצני בסוף הגאות. לפקח באופן קבוע על טמפרטורת הגוף במהלך ההליך. אדם בעל הכשרה מתאימה אחראי על תחזוקה ומעקב אחר הרדמה.
  12. מקמו את בעל החיים בעזרת כרית המיקום כך שמשטח הקרנית יהיה אופקי כאשר מסובבים את העין לתנוחת מבט ראשונית. אבטחו את הראש למקומו באמצעות סרט רפואי.
  13. כסו את בעל החיים בשמיכות כדי לסייע בשמירה על טמפרטורת הגוף.
  14. יש לשטוף את הצנתר התוך-ורידי במי מלח שעברו הפריניזציה ולהתחיל בעירוי תוך ורידי של רינגר לקטט המסופק במהירות של 2-5 מ"ל/ק"ג/שעה למשך ההליך.
  15. הכינו את משטח העין, שק הלחמית והעפעפיים לניתוח אספטי באמצעות 0.2% פובידון-יוד, מוליכי צמר גפן סטריליים וכדורי צמר גפן.
  16. מקמו את מיקרוסקופ ההפעלה עם עיניות שגם הן מותאמות בהתאם. הניחו את השליטה בכף הרגל עבור המיקרוסקופ (מיקוד, זום ובקרת ציר XY) ומכשיר ויטרקטומיה כך שהמנתח יוכל לנתח אותם.
  17. היכונו לניתוח אספטי: כל אנשי הצוות חייבים לחבוש קרצוף כירורגי, כובע כירורגי ומסכה. ודא שהמנתח והעוזר (ים) מקרצפים, חלוק וכפפה כמו בניתוח אספטי שגרתי. כל אנשי הצוות צריכים להכיר טכניקות אספטיות.
  18. לאחר שאנשי הצוות משופשפים, לבושים בכפפות, פותחים את חבילות הניתוחים ופורסים את המכשירים. הניחו ידיות מניפולציה סטריליות על ידיות הכוונון של המיקרוסקופ כדי לאפשר למנתח או לעוזר להסתגל מבלי לשבור אספסיס. לעטוף את החיה באופן שגרתי לניתוח עיניים.
  19. הכינו את מכונת הויטרקטומיה בהתאם להוראות היצרן לכריתת ויטרקטומיה בעלת שתי יציאות.
    1. הניחו על שולחן העוזר עדשת מגע ויטרקטומיה ושתי יציאות ויטרקטומיה 23 G. מחברים את צריבת השדה הרטובה. חברו והפריימו את צינור העירוי ואת הידית לוויטרקטומיה 23 גרם.
    2. הניחו את מכשירי הוויטרקטומיה וקווי הנוזל מעל הווילונות הסטריליים ושמרו אותם במקומם באמצעות מהדקי מגבות. הגדר את מכונת הויטרקטומיה במצב ואקום פרופורציונלי בין 1,500 ל -2,500 חיתוכים לדקה (cpm) ואקום מרבי של 500 מ"מ כספית. פעולה זו מתבצעת על ידי לחיצה על כפתורי החצים (כלפי מעלה או כלפי מטה) הנמצאים בלוח הקדמי של מכונת הויטרקטומיה.

2. הכנת האורגנואידים להשתלה תת-רשתית (איור 1)

  1. יש להפיק אורגנואידים ברשתית כפי שתואר קודם לכן31, ובמידת הצורך לשלוח למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כפי שדווח קודם לכן54.
  2. נגבו את המשטחים בחדר תרביות הרקמה במעבדה הקולטת בחומר חיטוי ושמרו על אותה רמה גבוהה של טכניקה אספטית כמו בחדר ניתוח לניתוחי עיניים, כדי למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי, והעבירו לחדר הניתוח כדי למנוע זיהום באתר הניתוח.
  3. יש ללבוש כיסויי נעליים כירורגיים, מעילי מעבדה חד פעמיים, מצנפות, מסכות כירורגיות, שרוולים וקרצוף כירורגי בתוך חדר תרביות הרקמה שהוקצה להכנת אורגנואידים לניתוחי עיניים.
  4. שיווי משקל מראש של מדיה עצבית עם 20 ng/mL של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) ו-20 ng/mL של גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) למשך שעה אחת באינקובטור תרבית רקמות (37°C, 5% CO2). הניחו אורגנואידים במדיה בלוחות הדבקה נמוכים במיוחד תוך שימוש בכרבע נפח של מדיום ממוזג (מהמשלוח בן לילה) ושלושה רבעים נפח של מדיום טרי31,54. לשמור במשך 24-48 שעות.
  5. הכינו ושיווי משקל של מספר לוחות טריים בקוטר 60 מ"מ עם תווך עצבי (כפי שהוכן בשלב 2.4) למשך שעה לפחות באינקובטור תרבית הרקמה (37°C, 5% CO2) לפני הרדמת בעל החיים הראשון. שימו לב, לוחות אלה משמשים להעברת האורגנואידים עבור כל ניתוח בנפרד, מתוך הנחה שתנאי pH וריוויCO2 יישמרו בתקשורת למשך 20 דקות לפחות, מספיק להעברת הצלחת לחדר הניתוח ולהעמסת אורגנואידים לתוך הצינורית.
  6. השתמש בצלחת 60 מ"מ טרייה עם מדיה עצבית רוויה מראש עבור כל מקרה השתלה, תוך שמירה על הלוחות הנותרים באינקובטור תרבית הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. מעבירים 6-9 אורגנואידים לצלחת אחת בקוטר 60 מ"מ (עם מדיה רוויה מחדש) על ידי הדבקתם עם פיפטה חד-ערוצית ידנית (20-200 μL) עם קצה מסנן סטרילי של 200 μL בעל פתח רחב (~0.7 מ"מ). טיפים אלה ניתן להכין מראש או במהלך ההליך על ידי חיתוך ~ 3-4 מ"מ של קצה עם זוג מספריים סטריליים (נעשה במכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי למנוע זיהום). הניחו את צלחת 60 מ"מ בתוך צלחת תרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ (כדי למנוע זיהום במהלך הובלה מחדר לחדר) והעבירו במהירות לחדר הניתוח.
  8. הניחו את הצלחת עם אורגנואידים על כרית חימום חשמלית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס המכוסה בשפריץ סטרילי.
  9. החליפו לזוג כפפות סטריליות טריות לפני הכנת האורגנואידים.
  10. שוטפים את האורגנואידים בתמיסת מלח סטרילית מאוזנת (BSS) (אופציונלי), ולאחר מכן מעמיסים לתוך המזרק, המורכב מצינורית זכוכית בורוסיליקט בעלת דופן דקה (קוטר חיצוני, OD 1.52 מ"מ; קוטר פנימי, ID 1.12 מ"מ) עם קצה קהה מלוטש המחובר על ידי צינורות פלסטיק סטריליים למזרק סטרילי של המילטון 500 מיקרוליטר ממולא מראש ב- BSS סטרילי.
  11. מעבירים את הצינורית לצוות המנתח בצורה סטרילית כאשר הם מוכנים להזריק את האורגנואידים.
  12. שמור על אורך ההליך כולו (מהסרת האורגנואידים ממדיית תרבית הרקמה ועד טעינת הצינורית) ל- 20 דקות או פחות.
  13. אם יש עיכוב בהשתלת האורגנואידים, החזירו אותם לאינקובטור תרבית הרקמה, כדי למנוע שינויים ברוויה של pH/CO2 בתוך המנה.
  14. שמור אורגנואידים שאינם בשימוש במשך שבוע אחד באותה אינקובטור תרבית רקמה ועקוב אחר כל עדות לזיהום.

3. השתלת אורגנואידים תת-רשתית

  1. בצע קנטוטומיה צידית של 0.5-1 ס"מ עם מספריים לטנוטומיה של סטיבנס. הניחו ספקולום עפעפיים בגודל מתאים כדי לשמור על העפעפיים פתוחים. ודא כי עוזר כירורגי משקים את הקרנית באופן קבוע עם BSS למשך ההליך.
  2. יש להניח 2 תפרי משי של 6-0 בלחמית הסמוכה ללימבוס בתנוחות 4 ו-8 כדי להחזיק את העין במבט ראשוני ולמשוך את העפעף השלישי. השתמש 0.5 Castroviejo מלקחיים קשירת הקרנית ו hemostat יתוש קטן לתפוס בעדינות את הלחמית bulbar ליד הלימבוס. השאירו את התפרים ארוכים ומהדקים את הקצוות עם המוסטטים קטנים של יתושים כדי לעזור במניפולציה שלהם.
    הערה: הנחת התפר מתחת לעפעף השלישי קשה יותר; הקפד למקם אותו מיד בסמוך ללימבוס.
  3. יש להניח תפר נוסף במצב השעה 12 בלימבוס חלקית דרך עובי הלימבוס תוך הקפדה שלא לחדור לעין. קשרו את התפר הזה בצורה רופפת וחתכו את הקצוות קצרים. זה מספק תפר עוגן חזק, המשמש במהלך הניתוח כ"ידית" לסובב את העין כדי לאפשר למנתח גישה לחלקים שונים של העולם בשלבים שונים של ההליך.
    הערה: שלבים 3.2 ו-3.3 ניתנים להיפוך. רצף מיקום התפרים הוא העדפת המנתח.
  4. משקפים את לחמית הבולבר בין השעות 10-2 (היקף). בעזרת מספריים טנוטומיים, חותכים את הלחמית 2-3 מ"מ מהלימבוס. חתרו תחתיו ונקו את קפסולת הטנון כדי לחשוף את לובן העין באתרים של יציאות הוויטרקטומיה של השעה 2 ו-10, אשר ימוקמו במרחק של כ-3-5 מ"מ מהלימבוס בהתאם לגיל החיה. השתמש חניתות תאית כירורגית עבור hemostasis כדי לנקות כל דם.
  5. זיהוי אתרים לסקלוטומיה בעקבות השתקפות הלחמית והקפסולה של טנון באמצעות קליפרים. בחר אתרי sclerotomy (בשעה 2 ו 10 במטרה לעבור דרך pars plana), כדי למנוע את כלי הדם העיקריים שיכולים להיות בולטים אצל החתול. השתמש בצריבת שדה רטוב על לובן העין באתרי הסקלרוטומיה המתוכננים כדי להפחית דימום סקלרלי, תכנון אזור ~ 3 מ"מ ביציאת המכשיר (יציאה בשעה 10 למנתח ימני) מכיוון שזה יוגדל לאחר כריתת הזגוגית כדי לאפשר את החדרת צינורית ההשתלה.
  6. יש להניח מראש תפרים בתבנית הצולבת (תפר פוליגלקטין 6-0 או 7-0) מבלי לקשור את הקשר במקום הסקלרוטומיות המוצעות לפני מיקום יציאות הוויטרקטומיה.
    הערה: זה מאפשר סגירה מהירה של סקלרוטומיות בסוף ההליך. התפר של יציאת המכשיר המתוכננת צריך להיות בעל נשיכה ארוכה יותר של לובן העין מכיוון שזה יהיה חתך ארוך.
  7. לאחר מיקום התפרים, בקשו מהעוזר לעזור למקם את הגלובוס על ידי החזקת התפרים של השעה 12 על ידי קשירה או שימוש במלקחיים של בישופ-הרמון. תנו למנתח לייצב גם את הגלובוס, באמצעות מלקחיים בקוטר 0.12 מ"מ כדי להחזיק את הרקמה ליד אתר הסקלוטומיה.
    1. הציגו יציאת ויטרקטומיה של 23 G באמצעות טרוקאר דרך לובן העין הן בשעה 2 והן בשעה 10 המכוונת בזווית לכיוון עצב הראייה כדי למנוע מגע עם העדשה.
    2. בדקו שפתח ההשקיה נמצא בזגוגית על ידי לחיצה עדינה על היציאה באמצעות מלקחיים קשירה, כך שניתן יהיה לדמיין את הקצה בזגוגית. לאחר אישור המיקום הנכון, חברו את קו ההשקיה ליציאה ומקמו את הקו באמצעות תחבושות דבק דקות כדי להדביק אותו למקומו. הגדר את עירוי הוויטרקטומיה של מאגר BSS בתחילה על 30-35 מ"מ כספית על ידי לחיצה על כפתורי החצים (כלפי מעלה או כלפי מטה) הנמצאים בלוח הקדמי של מכונת הויטרקטומיה.
  8. תנו לעוזר להחזיק עדשת ויטרקטומיה מגדילה על הקרנית כדי לאפשר הדמיה של החלק האחורי של העין בשלבים הבאים. חברו את עדשת ויטרקטומיית ההשקיה למערכת טפטוף המספקת אספקת נוזלים קבועה כדי להצמיד את העדשה לקרנית.
    הערה: ניתן להשתמש גם בצורות אחרות של עדשת ויטרקטומיה מגע. עמעם או כבה את אורות החדר כדי לסייע בהדמיה דרך מיקרוסקופ ההפעלה.
  9. יש להכניס את הבדיקה/חותך הוויטרקטומיה 23 G (2,500 עותקים לדקה) דרך יציאת המכשיר (הצמודה ליד הדומיננטית של המנתח, כלומר יציאת השעה 10 למנתח ימני) ולבצע ויטרקטומיה חלקית של הליבה.
    1. לאחר מכן, הסירו לחלוטין את הזגוגית משטח הרשתית באזור שיקבל את ההשתלה (זה חשוב להצלחת ההליך) על ידי ניתוק הפנים הוויטריאליות מהרשתית.
    2. הניחו את בדיקת הוויטרקטומיה מעל ראש עצב הראייה כאשר היציאה פונה הרחק מפני הרשתית והפעילו ואקום גבוה יותר כדי להתחיל את ניתוק הפנים הוויטריאלי.
  10. הכינו גבישי טריאמצינולון לשימוש תוך עיני. אם תרחיף הטריאמצינולון אינו מיועד במיוחד לשימוש תוך ויטריאלי, שטפו את הגבישים ולאחר מכן השהו מחדש ב- BSS.
    1. בתחילה, סנן את המתלה בעזרת מסנן מזרק נקבוביות סטרילי של 0.22 מיקרומטר עם קרום PES (מחובר למזרק 1 מ"ל) כדי ללכוד את הגבישים.
    2. לאחר מכן שטפו את גבישי הטריאמצינולון הכלואים על ידי שאיפת BSS במזרק 1 מ"ל ושטיפה דרך המסנן (הגבישים נשארים לכודים בפילטר). פעולה זו מסירה את החומרים המשמרים בתמיסה. חזור על הכביסה 3 פעמים ולאחר מכן הגבישים הם תלויים מחדש ב 1 מ"ל BSS.
  11. הציגו את המחט של המזרק המחזיק את הטריאמצינולון דרך יציאת המכשיר. היזהר לא לגעת בעדשה על ידי צפייה בקצה המחט דרך האישון תוך החדרת המחט דרך יציאת המכשיר. הזריקו 0.25 עד 0.5 מ"ל של השעיית קריסטל. לאחר מכן הכנס את בדיקת הוויטרקטומיה דרך יציאת המכשיר וקדם אותה קרוב לראש עצב הראייה עם היציאה הרחק משטח הרשתית והשתמש בוואקום גבוה כדי לסייע בניתוק הפנים הוויטריאליות מהרשתית.
    הערה: גבישי הטריאמצינולון נדבקים וכך מדגישים את הזגוגית הנותרת. יש להסיר בזהירות כל זגוגית מעל וליד אתר השתלת האורגנואידים המתוכנן (למשל, פונדוס הטפטל המרכזי הקרוב לאזור סנטרליס ).
  12. צור כתם היפרדות רשתית מוקד קטן באתר ההשתלה הרצוי באמצעות מזרק תת-רשתית, למשל, מזרק תת-רשתית 23 G עם צינורית 41 G ניתנת להארכה המחוברת למזרק נעילה סטרילי 250 μL אטום לגז Luer מלא BSS סטרילי.
    1. לפני יצירת bleb subretinal, להפחית את לחץ העירוי ל 10 מ"מ כספית כדי להקל על היווצרות bleb.
    2. הכנס את המזרק דרך יציאת המכשיר וקדם אותו לעבר משטח הרשתית. הוציאו את קצה הצינורית ולחצו אותו בעדינות על משטח הרשתית. בקש מהעוזר לתת דחיפה מהירה קלה על בוכנה מזרק כדי להתחיל את היפרדות הרשתית המפחיתה את לחץ ההזרקה כדי לאפשר עלייה איטית של היפרדות הרשתית עד להשגת הגודל הרצוי (כ 100 עד 200 μL של BSS משמש).
  13. אם הרטינוטומיה הנוצרת היא במיקום מתאים, אשר נמנע מחיתוך הרשתית בין אתר ההשתלה לראש עצב הראייה כדי למנוע חתך של שכבת סיבי העצב הנגזרת מאתר ההשתלה ולהימנע מכלי דם מרכזיים ברשתית (זה נקבע גם על ידי תכנון המחקר, במקרה שלנו נבחרה הרשתית המרכזית), לאחר מכן, להגדיל אותו מעט באמצעות צינורית 41 G של המזרק, במטרה להקל על הכנסת מספריים ברשתית.
  14. הסר את המזרק מהעין והסר את היציאה הסקלרלית של השעה 10. הגדל את סקלרוטומיה באתר זה באמצעות סכין ישרה 2.85 מ"מ חריץ / keratome בכיוון עצב הראייה כדי למנוע נגיעה בעדשה. שמור על לחץ העירוי ב 10-15 מ"מ כספית.
  15. יש להרחיב את הרטינוטומיה באמצעות מספריים אנכיים של זגוגית 80° עם ידית לחיצה, להימנע מחיתוך כלי דם ברשתית כדי למנוע דימום ברשתית ולהקפיד לחתוך את הרשתית בקצה המשקוף הרחק מראש עצב הראייה כדי למנוע חיתוך סיבי עצב המובילים מהרשתית באזור ההשתלה לעצב הראייה. הרטינוטומיה צריכה להיות ברוחב מספיק כדי לקבל את האורגנואידים.
  16. הכנס את נימי הזכוכית הטעונים מראש המכילים את האורגנואידים (ראה שלב 2.10) דרך סקלרוטומיה מוגדלת וקדם אותו לעבר אתר הרטינוטומיה תחת הדמיה ישירה.
    1. השתמש בקצה של נימי הזכוכית כדי לפתוח מעט את רטינוטומיה כדי לגשת לפתח לתוך bleb subretinal.
    2. בקשו מהעוזר ללחוץ באיטיות על הבוכנה של המזרק, תוך כדי צפייה דרך המיקרוסקופ, תוך הזרקת האורגנואידים לתוך הבוכה התת-רשתית. BSS צריך להקדים את האורגנואידים ולשטוף את הרטינוטומיה פתוחה.
    3. דחפו בעדינות את האורגנואידים בתוך השכבה עם קצה נימי הזכוכית אם הם נמצאים בקצה הרטינוטומיה.
  17. החזיקו את נימי הזכוכית ברטינוטומיה למשך מספר שניות כדי לנסות לסגור את הרטינוטומיה ולמנוע מהאורגנואידים לברוח לתוך הזגוגית.
  18. הסר לאט מאוד את נימי הזכוכית מהעין תוך הימנעות מכל שחרור פתאומי של נוזל מהעין כדי למנוע תנועת נוזלים בתוך העין שעלולה לגרש את האורגנואידים מהבלבל התת רשתית.
  19. הגדל לאט את לחץ העירוי ל 20-30 מ"מ כספית כדי לסייע במניעת דימום תוך עיני, תוך הקפדה על כך שנוזל העירוי לא יישטף ישירות על הבלב. פעולה זו מתבצעת על ידי לחיצה על כפתורי החצים כלפי מעלה הנמצאים בלוח הקדמי של מכונת הויטרקטומיה.
  20. סגור את הסקלרוטומיה באמצעות התפר שהונח מראש בתבנית צולבת (6-0 או 7-0 פוליגלקטין). הוסף תפרים קטועים פשוטים נוספים לפי הצורך כדי לאטום את סקלרוטומיה.
  21. בקש מהעוזר להסיר את יציאת העירוי ולתת למנתח לקשור במהירות את התפר שהונח מראש כדי לאטום את סקלרוטומיה ולמנוע אובדן לחץ תוך עיני.
  22. סגור את חתך הלחמית (פריטומיה) באמצעות 6-0 או 7-0 פוליגלקטין בתבנית רציפה פשוטה.
  23. דמיינו את הפונדוס (למשל, באמצעות מצלמת פונדוס וידאו RetCam II, Clarity או דומה) ותיעדו את המיקום המיידי של האורגנואידים בתוך החלל התת-רשתית.
  24. הכינו מחדש את משטח העין לאחר הדמיה באמצעות תמיסת יוד פובידון 0.2% בעזרת אפליקטורים של צמר גפן וכדורי צמר גפן. מוציאים את שלושת התפרים ואת ספקולום המכסה.
  25. סגור את הקנטוטומיה הצידית עם תפר פוליגלקטין 6-0. הניחו תפר קבור יחיד ואחריו דמות של 8 תפרי עור כדי לתקן את הקנטוס הצידי ולאחר מכן השתמשו בתפרי עור פשוטים קטועים כדי לסגור את שאר הפצע.
  26. לאחר השלמת ההליך הכירורגי, יש לתת זריקה תת-לחמית של שילוב סטרואידים ואנטיביוטיקה (2 מ"ג מתילפרדניזולון אצטט, 0.1 מ"ג דקסמתזון ו-1 מ"ג גנטמיצין). מניחים חומר סיכה אופתלמי (דמעות מלאכותיות) על הקרנית.
  27. לשחזר את בעל החיים מן ההרדמה לפקח מקרוב במהלך ההתאוששות עבור כל סימנים של כאב שידרוש טיפול נוסף, כגון blepharospasm מסומן, חוסר רצון חמור להיות מניפולציה, עייפות או ירידה בתיאבון, וקצב נשימה ולב מוגבר. ספק משככי כאבים לאחר הניתוח לפי הצורך ועקוב מקרוב אחר כל אי נוחות.
    הערה: רק אנשי צוות מיומנים כראוי צריכים להיות אחראים על הרדמה ומעקב אחר מטופלי החתולים לפני, במהלך ואחרי הניתוח. עקוב אחר המלצות ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים לטיפול לאחר ניתוח.

4. הליכים לאחר ההשתלה, טיפול לאחר הניתוח והערכה

  1. המשך לטפל עם תרופות דרך הפה לדיכוי מערכת החיסון (1 מ"ג / ק"ג פרדניזולון ו -2 מ"ג / ק"ג ציקלוספורין דרך הפה פעמיים ביום) כדי לעזור לשלוט בדלקת ודחייה של האורגנואידים. לספק כיסוי אנטיביוטי סיסטמי (למשל, דוקסיציקלין פומי 5 מ"ג/ק"ג פעמיים ביום – אנטיביוטיקה זו נבחרה בגלל הסיכון לזיהום מיקופלסמלי אופורטוניסטי בבעלי חיים מדוכאי חיסון).
  2. בצע בדיקות עיניים קבועות כדי לפקח על דלקת או התפתחות של תופעות לוואי. יש לעקוב אחר ההשטחה של הרשתית, המתרחשת בימים הראשונים שלאחר הניתוח, למרות הרטינוטומיה הגדולה הנדרשת להזרקת אורגנואידים לחלל התת רשתית. רשום תמונות פונדוס בכל בדיקה כדי לתעד את המיקום והמראה של האורגנואידים המושתלים.
  3. דמיינו את בעלי החיים בהרדמה כללית באמצעות סריקה קונפוקלית, לייזר, אופטלמוסקופיה (cSLO) ותחום ספקטרלי – טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית (SD-OCT)5,31 במהלך תקופת הניטור ולפני סיום הניסוי.
  4. המתת חסד הומנית של בעלי החיים בסיום הניסוי בשיטה מאושרת AVMA, למשל, מתן תוך ורידי של 85 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל. לאחר טשטוש, מניחים קטטר תוך ורידי למתן הפנטוברביטל כדי למזער את הלחץ. לאשר את המוות על ידי הפסקת פעימות הלב ולעשות חתך לתוך בית החזה כדי ליצור pneumothorax.
  5. הסר את העיניים בגישה טרנס-לחמית סטנדרטית ותקן לפי הצורך. עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC), לטבול מיד את העיניים בתמיסת 4% paraformaldehyde לאחר 0.3 מ"ל של תמיסה קיבוע מוזרק לתוך החלק האחורי דרך 3 חריצים שנעשו דרך pars plana עם להב 11 Parker (~ 3-4 מ"מ מן הלימבוס).
  6. לנתח את המשקפיים לאחר 3.5 שעות של קיבוע ב 4 ° C. הסירו את שאריות הזגוגית והקפידו לשמור על שלמות הרשתית והאורגנואידים. יש להחזיר לקיבוע למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 4°C ולאחר מכן לשטוף את המשקפיים 3 פעמים כל אחת למשך 10 דקות ב-PBS. מעבירים את העין ל-15% סוכרוז למשך שעתיים, ולאחר מכן ל-30% סוכרוז למשך שעתיים נוספות.
  7. יש לשטוף את המשקפיים פעמיים עם PBS ולהטמיע בתווך OCT (תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית) ולהקפיא במהירות הבזק ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לחתך לצורך היסטולוגיה ואימונוכימיה.
  8. בחר נוגדנים עבור IHC בהתבסס על פרוטוקול המחקר ומטרותיו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליך זה מאפשר השתלה מוצלחת וניתנת לשחזור של אורגנואידים ברשתית שמקורם ב-hPSC בחלל התת-רשתית של מודל של בעלי חיים גדולים (שהודגם כאן באמצעות 2 דוגמאות: חתולי בר עם פוטורצפטורים בריאים (PRs) וחתולי CrxRdy/+ עם PRs ורשתית מנוונים). באמצעות השלבים המצוינים באיור 1, הכינו וטענו את אורגנואידי הרשתית שמקורם ב-hPSC לתוך צינורית זכוכית בורוסיליקט של מכשיר ההזרקה, כך שהאורגנואידים לא ייפגעו. ניתן לאשר זאת על-ידי הדמיה ישירה במהלך העמסת האורגנואידים (שלב 2.10) ובמהלך הניתוח (שלב 3.16) (איור 2, A,B), כמו גם על-ידי הדמיית פונדוס בסוף הניתוח (שלב 3.23, איור 2C). נוכחותם של האורגנואידים בחלל התת-רשתית באמצעות שיטה זו מאושרת לאחר הניתוח על-ידי בדיקה אופתלמית והדמיית פונדוס (איור 3A), אשר מתעדת את המיקום והמראה של האורגנואידים. ידיעת מיקום ההשתלה חשובה מאוד בעת עיבוד הגלובוסים עבור היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה קפואה ומפחיתה באופן משמעותי את עומס העבודה, שכן חתך עין גדולה ב 12-14 מיקרומטר (עובי של הקפאה) לוקח זמן. לפני המתת חסד, מבוצעות גם הדמיה של אופטלמוסקופיה בלייזר לסריקה קונפוקלית (cSLO) והדמיית טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (SD-OCT) כדי להעריך את מיקום האורגנואידים בחלל התת-רשתית (איור 3A-D). השיטות האלה מדגימות את ההתמדה של אורגנואידים ברשתית בחלל התת-רשתית (בין הרשתית העצבית ל-RPE) של העין המקבלת (איור 3E). לאחר המתת חסד (הנעשית באופן הומני בעקבות המלצות AVMA) מתבצעת באופן שגרתי ההיסטולוגיה והאימונוהיסטוכימיה (IHC) (ראה פירוט במאמר31 שפורסם בעבר). ההיסטולוגיה וה-IHC מדגימים את הישרדותם של שתלים קסנוגניים (אורגנואידים ברשתית שמקורם ב-hPSC) בחלל התת-רשתית של עין גדולה כאשר החיות היו מדוכאות חיסון (כפי שתואר קודם לכן31), ראו איור 4.

Figure 1
איור 1: סכמה של השלבים להכנת אורגנואידים לפני ההשתלה.
אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השתלות תת-רשתיות כירורגיות של אורגנואידים. (A) הדמיה ישירה של אורגנואידים המועברים לחלל התת-רשתית דרך צינורית זכוכית מבלי להיפגע, (B) הדמיה ישירה של אורגנואידים בבלב התת-רשתית, (C) תמונת צבע פונדוס רחבת זווית של האורגנואידים המושתלים תת-רשתית מיד לאחר הניתוח. הקצוות מסומנים על ידי ראשי החץ השחורים ואתר הרטינוטומיה על ידי הכוכבים השחורים.
אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכה לאחר הניתוח של אורגנואידים מושתלים תת-רשתית 3 חודשים לאחר ההשתלה בחתול CrxRdy/+ . (A) תמונת צבע פונדוס של האורגנואידים המושתלים תת-רשתית, (B) תמונת פונדוס cSLO של האורגנואידים המושתלים תת-רשתית, (C) שחזור נפח תלת-ממדי של האזור המכיל את האורגנואידים, (D) תמונת cSLO של האזור המכיל אורגנואידים תת-רשתית, (E) תמונת SD-OCT ברזולוציה גבוהה, חתך רוחב של האורגנואידים המושתלים תת-רשתית. אתר הרטינוטומיה מסומן על ידי הכוכבים השחורים.
אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: יריעות פוטורצפטור שמקורן ברשתית אנושית (סמן יחסי ציבור RCVRN) בחלל תת-רשתית של חתול CrxRdy/+ , 3 חודשים לאחר ההשתלה.  *בוטונים סינפטיים (hSYP=Synaptophysin) בשכבה הגרעינית הפנימית של החתול (INL).
אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השתלת רקמת רשתית שמקורה ב-hPSC (אורגנואידים ברשתית) בחלל התת-רשתית היא גישה ניסיונית מבטיחה להשבת הראייה למחלות ניווניות של הרשתית בשלב מאוחר הנגרמות על ידי מוות של תאי PR (עיוורון עמוק או סופני). הגישה המוצגת מתבססת על טיפול ניסיוני מוקדם יותר שפותח ונבדק בהצלחה המבוסס על השתלה תת-רשתית של פיסת רקמת רשתית עוברית אנושית23,24,25. הוא מציג את השימוש במקור רקמת רשתית חלופי, מתחדש ומקובל מבחינה אתית הנגזר מ- hPSCs. הוכחת היתכנות כירורגית ובטיחות עינית של טיפול במודלים של בעלי חיים גדולים51,55 נדרשת לקידום גישה מבטיחה זו לקראת יישומים קליניים. כתב יד זה מספק שיטה מפורטת להשתלה תת-רשתית של רקמת רשתית hPSC-3D (אורגנואידים ברשתית) במודל של בעלי חיים גדולים עם רשתית רגילה ומנוונת (מודל של CrxRdy/+ חתולי מודל של LCA). למרות שהליכים להחדרת חתיכה שטוחה של רשתית אנושית וגם מדבקות RPE פותחו43,44,45, השתלות של שתלים תלת ממדיים גדולים יותר (הדרושים להשבת ראייה בתנאים עם RD מתקדם) לא נחקרו. הפרוטוקול המתואר כאן בפירוט הוא עבור הליך השתלה למסירה תת-רשתית של אורגנואידים ברשתית כולה (במקום שולי אורגנואיד33,41) הנושאים גם RPE כלשהו כדרך טובה יותר להציג יריעות רשתית שלמות עם PRs, כדי להגדיל את הישרדות השתל ולשפר את שימור היריעה. שים לב שחלקים שונים של פרוטוקול זה מבוססים היטב. לדוגמה, ויטרקטומיה נמצאת בשימוש נרחב על ידי מנתחי זגוגית במהלך ניתוח חיבור מחדש של הרשתית 56,57,58,59,60. זריקות תת-רשתית הופכות נפוצות יותר, למשל, בטיפול בהגדלת גנים 3,7,61,62,63,64. ישנם תיאורים מוגבלים של יצירת רטינוטומיה נאותה והזרקת אורגנואידים גדולים יחסית לחלל התת-רשתית.

השלבים הקריטיים כוללים מיקום וביצוע זהירים של הסקלרוטומיה כדי למנוע את העדשה, הסרה מלאה של קליפת המוח הזגוגית מפני הרשתית מעל אתר ההשתלה, היווצרות מבוקרת של הבל התת רשתית, יצירת רטינוטומיה בגודל אופטימלי כדי להתאים לרוחב צינורית ההשתלה, שמירה על לחץ העירוי המוגדר במהלך שלבים שונים, וגמילה מצינורית. בחירת צינורית ההשתלה הנכונה עם קוטר ואורך פנימיים וחיצוניים אופטימליים (ID ו-OD), שליטה בדימום תוך עיני, סטריליות של כל ההליך מאורגנואידים לחדר ניתוח ומכשירים, ומשך הניתוח (30-45 דקות לחיה) כדי להבטיח תוצאות אופטימליות. החוקרים מצאו כי התוצאות הטובות ביותר מתקבלות עם ויטרקטומיה של 23 G בשל עובי/צמיגות זגוגית החתול, יצירת כתם עם מזרק עם צינורית 41 גרם, ולאחר מכן, הרחבת הרטינוטומיה בקצה הבלם באמצעות מספריים רשתית זווית של 80°. גורמים חשובים אחרים כוללים הארכת סקלרוטומיה באמצעות קרטומה בקוטר 2.85 מ"מ כך שתתאים לצינורית זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני OD 1.52 מ"מ; קוטר פנימי, ID 1.12 מ"מ; ואורך 10.16 ס"מ) והתרת השתלת אורגנואידים גדולים יותר בעין גדולה עם אורך ציר כ-20.5 מ"מ (20.91 מ"מ ± 0.53 מ"מ)55. השימוש בנימי זכוכית היה הטוב ביותר הזמין כיום להעמסה ואספקה של אורגנואידים בגודל ירידה מבלי לפגוע בהם במהלך תהליך ההשתלה. נמצא כי הפחתת לחץ העירוי מ 20-30 מ"מ כספית במהלך ויטרקטומיה ל 10 מ"מ כספית בשלב היווצרות bleb הוא אופטימלי ליצירת היפרדות רשתית, הדרוש ליצירת מקום עבור אורגנואידים ברשתית. בנוסף, הכדאיות של רקמת רשתית hPSC-3D (אורגנואידים) במהלך משלוח למרחקים ארוכים ובחירת משטר הדיכוי החיסוני הממוטב לתחזוקה של שתלים אנושיים קסנוגניים הם קריטיים כפי שדווח לאחרונה31,54.

החוקרים מצאו כי בשל החתול הרפלקטיבי מאוד, לא נדרשה הארה אנדו-אילורטיבית כדי לבצע את הניתוח. השתלה במין אטפטלי (למשל, חזיר, פרימט לא אנושי) תדרוש ויטרקטומיה בעלת 3 יציאות הכוללת אנדו-אילומיניישן. טמפונדה (למשל, עם פרפלואורוקרבון ואחריו שמן סיליקון) כפי שבוצע בניתוח ניתוק רשתית שגרתי לא בוצע מכיוון שלחץ על הבלב יסתכן בהוצאת האורגנואידים לתוך הזגוגית. פיתוחים עתידיים עשויים לכלול שימוש בחומרים הנחקרים כיום לאיטום חורים ברשתית. זה יכול לשמש כדי למנוע כל אובדן לאחר ההשתלה של אורגנואידים לתוך הזגוגית. בנוסף, Triescence, הדומה ל-Kenalog-40 אך מכיל טריאמצינולון ללא חומרים משמרים, יכול לשמש כחלופה להדמיית הזגוגית.

גודל הגלובוס הקטן יותר בבעלי חיים צעירים יותר (למשל, 1-2 חודשים) הציב אתגרים כירורגיים רבים יותר בהשוואה לעין הגדולה (חיות בוגרות). עם זאת, באמצעות השיטה המתוארת כאן, ניתן להעביר את השתלים subretinal. במודל CrxRdy/+ LCA, נמצאו כתמי רשתית גדולים יותר שלא תמיד מתחברים מחדש. שמירה על ה- bleb לגודל המינימלי הדרוש כדי לאפשר הזרקת אורגנואידים ברשתית, הפחיתה סיבוך זה. השתלה מוקדמת יותר ברשתית RD (לפני אובדן מוחלט של PRs כאשר הרשתית העצבית הופכת להיות דלילה במידה ניכרת) היא קו מנחה נוסף, בקנה אחד עם העבודה הקודמת עם שתלי רשתית עוברית אנושית20. הערה נוספת – הטכניקה המפורטת אינה תלויה בהנחת יריעת הרשתית בכיוון הנכון מכיוון שכל אורגנואידי הרשתית מושתלים. עם התפתחות של יריעות hESC-רשתית שטוחות, זה יהיה חשוב. עם זאת, זה לא המוקד של פרוטוקול זה, אשר נועד לספק יריעות שלמות hESC-רשתית רקמה אופטימיזציה של שימור subretinal של יריעות PR. לאחר פיתוח הטכניקה, היא הייתה ניתנת לשחזור הן ברשתית רגילה והן ברשתית RD.

ישנם סיבוכים פוטנציאליים רבים להליך כירורגי זה. רק אלה המיומנים בניתוחי זגוגית (למשל, רופאי עיניים וטרינריים מיומנים או מנתחי זגוגית המכירים את הבדלי המינים בעין החתול לעומת עין האדם) צריכים לבצע את ההליך. סיבוכים אפשריים כוללים מגע עדשה במהלך מיקום טרוקאר, דימום סקלרלי במהלך הגדלת סקלרוטומיה, ודימומים תת רשתית או רשתית. סיבוכים אחרים כגון התגובה החיסונית של המארח לשתלי אורגנואידים אנושיים קסנוגניים המובילים להרס השתל לאורך זמן או אנדופטלמיטיס אפשריים; השימוש בתרופות מדכאות חיסון ואנטיביוטיות דרך הפה מסייע למנוע את התרחשותם. חשוב גם לציין שיש הבדל בין השתלה בחתולי בר לבין השתלה בחתולי CrxRdy/+ . כאשר יש ניוון רשתית מתקדם, הבלם ברשתית נוטה להתפשט רחב יותר מאשר בטבע, ובמקרים מסוימים, זה יכול למנוע חיבור מחדש של הרשתית לאחר הניתוח. הטכניקה המוצגת כאן ישימה להשתלת אורגנואידים בעיניהם של מודלים גדולים של בעלי חיים של IRDs. יהיה צורך בחידוד נוסף ברגע שההשתלה תהיה מוכנה לתרגום למרפאה.

בהתבסס על ניסיונם של המחברים בביצוע הליכים כירורגיים מורכבים בזגוגית במודלים של עיניים גדולות, הטכניקה המוצגת בכתב יד זה צריכה להיות ישימה למודלים אחרים של בעלי חיים גדולים (עם הכללת אנדו-הארה במינים אטפטאליים) המשמשים לתרגום טכניקות כירורגיות זגוגיות למרפאה43,44,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., פרנסואה בינט, Ph.D., ואיגור O. Nasonkin Ph.D. הם עובדים של Lineage Cell Therapeutics, Inc. . המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי NEI Fast-Track SBIR grant R44-EY027654-01A1 ומענק SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; ד"ר פיטרסן-ג'ונס הוא co-PI). המחברים רוצים להודות לגב' ג'ניס קרובין (MSU RATTS) על עזרתה בהרדמה ובטיפול כללי בבעלי החיים שנכללו במחקר זה, כמו גם על עזרתה בהכנה / עיקור של מכשירים כירורגיים. המחברים רוצים להודות לד"ר פייג' וינקלר על העזרה בקבלת האורגנואידים והצבתם במדיה ביום שלפני ההשתלה ועל העזרה ביום ההשתלה. המחברים אסירי תודה גם למר רנדי גרצ'ר (LCTX) על משלוח חרוץ של אורגנואידים ברשתית, הרכבת השולח והורדת רשומות טמפרטורה ומתח G לאחר כל משלוח. עבודה זו בוצעה בזמן שהסופר איגור נסונקין הועסק על ידי Biotime (כיום Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 174 אורגנואידים ברשתית חתול מודל בעלי חיים גדולים בעין השתלה תת רשתית ניוון רשתית טכניקה כירורגית
השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter