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Neuroscience

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.

Abstract

Las afecciones degenerativas de la retina (DR) asociadas con la pérdida de fotorreceptores, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinitis pigmentosa (RP) y la amaurosis congénita de Leber (LCA) causan pérdida de visión progresiva y debilitante. Existe una necesidad insatisfecha de terapias que puedan restaurar la visión una vez que se han perdido los fotorreceptores. El trasplante de tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) (organoides) en el espacio subretiniano de un ojo con RD avanzada aporta láminas de tejido retiniano con miles de fotorreceptores sanos libres de mutaciones y tiene el potencial de tratar la mayoría / todas las enfermedades cegadoras asociadas con la degeneración de los fotorreceptores con un protocolo aprobado. El trasplante de tejido retiniano fetal en el espacio subretiniano de modelos animales y personas con DR avanzada se ha desarrollado con éxito, pero no se puede utilizar como tratamiento de rutina debido a preocupaciones éticas y suministro limitado de tejido. Los modelos animales de degeneración retiniana hereditaria (IRD) del ojo grande son valiosos para desarrollar terapias de restauración de la visión que utilizan enfoques quirúrgicos avanzados para trasplantar células / tejidos de la retina en el espacio subretiniano. Las similitudes en el tamaño del globo y la distribución de los fotorreceptores (por ejemplo, la presencia de área central de la región similar a la mácula) y la disponibilidad de modelos IRD que recapitulan estrechamente el IRD humano facilitarían la traducción rápida de una terapia prometedora a la clínica. Aquí se presenta una técnica quirúrgica de trasplante de tejido retiniano derivado de hPSC en el espacio subretiniano de un modelo animal grande que permite la evaluación de este enfoque prometedor en modelos animales.

Introduction

Millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la degeneración de la retina (DR) con la consiguiente discapacidad visual o ceguera asociada con la pérdida de los fotorreceptores sensibles a la luz (PR). La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es una causa importante de ceguera como resultado de una combinación de factores de riesgo genéticos y factores ambientales / de estilo de vida. Además, se ha encontrado que más de 200 genes y loci causan DR hereditaria (IRD)1. La retinitis pigmentosa (RP), el IRD más común, es genéticamente heterogénea con más de 3.000 mutaciones genéticas en aproximadamente 70 genes que se han descrito 2,3,4. La amaurosis congénita de Leber (ACV), que causa ceguera en la infancia, también es genéticamente heterogénea 5,6. La terapia de aumento génico ha sido desarrollada y está en ensayos clínicos para el tratamiento de un pequeño número de IRD 3,7. Sin embargo, se debe desarrollar una terapia separada para el tratamiento de cada forma genética distinta de IRD y, por lo tanto, solo tratar a un pequeño subconjunto de pacientes. Además, el aumento de genes se basa en la presencia de una población de fotorreceptores rescatables y, por lo tanto, no es aplicable para la degeneración avanzada.

Por lo tanto, existe una necesidad clínica urgente y aún no satisfecha para el desarrollo de terapias que aborden y traten las DR avanzadas y la ceguera profunda a terminal. Durante las últimas 2 décadas, los implantes neuroprotésicos se han desarrollado y probado en modelos animales grandes, como el gato, antes del uso humano 8,9,10,11,12,13,14. Asimismo, en los últimos 20 años se han desarrollado terapias de reemplazo de retina utilizando láminas de retina embrionaria o incluso de mamíferos maduros injertadas subretinalmente 15,16,17,18,19,20,21,22 e incluso probadas con éxito en pacientes con DR 23,24,25. Ambos enfoques utilizan la idea de introducir nuevos sensores (fotodiodos de silicio fotovoltaico en el caso de dispositivos neuroprotésicos26,27, y fotorreceptores sanos libres de mutaciones organizados en láminas, en el caso de la implantación de láminas retinianas) en retina con PR degenerados. Estudios recientes han investigado el uso de enfoques basados en células madre, como el trasplante de progenitores retinianos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC)28,29, fotorreceptores hPSC 30 y organoides retinianos hPSC31,32,33. Los organoides retinianos permiten la formación de tejido retiniano en una placa y la derivación de láminas fotorreceptoras con miles de PR libres de mutación, que se asemejan a la capa fotorreceptora en la retina fetal humana en desarrollo 34,35,36,37,38,39,40. El trasplante de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides) en el espacio subretiniano de pacientes con enfermedades de DR es uno de los nuevos y prometedores enfoques de terapia celular en investigación, perseguido por varios equipos31,32,41,42. En comparación con el trasplante de la suspensión celular (de fotorreceptores jóvenes o progenitores retinianos), se demostró que las láminas trasplantadas de fotorreceptores fetales resultan en mejoras de la visión en ensayos clínicos23,24.

El protocolo presentado aquí describe, en detalle, un procedimiento de trasplante para la administración subretiniana de los organoides retinianos completos (en lugar de los bordes organoides33,41) como una forma potencialmente mejor de introducir láminas retinianas intactas con PR, para aumentar la supervivencia del injerto y mejorar la preservación de la hoja. Aunque se han desarrollado procedimientos para introducir una pieza plana de retina humana y también parches de EPR43,44,45, no se ha investigado el trasplante de injertos 3D más grandes. Los organoides retinianos derivados de células madre proporcionan una fuente inagotable de láminas fotorreceptoras para el desarrollo de tecnologías de restauración de la visión, están libres de restricciones éticas y se consideran una excelente fuente de tejido retiniano humano para terapias centradas en el tratamiento de la DR avanzada y la ceguera terminal46. El desarrollo de métodos quirúrgicos para la implantación subretiniana precisa de organoides retinianos con una lesión mínima en el nicho retiniano huésped (retina neural, epitelio pigmentario retiniano y vasculatura retiniana y coroides) es uno de los pasos críticos para avanzar en dicha terapia hacia aplicaciones clínicas31,32. Los modelos animales grandes como gatos, perros, cerdos y monos han demostrado ser buenos modelos para investigar métodos de administración quirúrgica, así como para demostrar la seguridad de las láminas de tejido implantadas (células del epitelio pigmentario de la retina (EPR)) e investigar el uso de organoides 41,44,45,47,48,49,50 . El ojo grande del animal tiene un tamaño de globo similar al humano, así como una anatomía similar, incluida la presencia de una región de alta densidad de fotorreceptores, incluidos los conos (el área central), que se asemeja a la mácula humana 6,51,52.

En este manuscrito, se describe una técnica para la implantación de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides) en el espacio subretiniano de modelos animales felinos grandes (gatos de tipo salvaje y CrxRdy/+), que, junto con resultados prometedores de eficacia32,53 construye una base para un mayor desarrollo de dicha terapia de investigación hacia aplicaciones clínicas para tratar afecciones de DR.

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Protocol

Los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. También fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan. En este estudio se utilizaron gatos de tipo salvaje y CrxRdy/+ de una colonia de gatos mantenida en la Universidad Estatal de Michigan. Los animales fueron alojados en ciclos de luz-oscuridad de 12 h y alimentados con una dieta comercial completa para gatos.

1. Procedimientos preimplantacionales y configuración quirúrgica

  1. Seleccione gatos de tipo salvaje o CrxRdy/+ según el diseño del estudio. Realizar un examen oftalmológico prequirúrgico, incluyendo biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta. Excluir cualquier animal con anomalías del fondo de ojo no relacionadas con sus genotipos.
  2. Una semana antes de la implantación, inicie a los animales con un protocolo inmunosupresor de ciclosporina oral 2 mg / kg y prednisolona 1 mg / kg, ambos dos veces al día para ayudar a prevenir el rechazo del trasplante.
  3. Ayunar a los animales mayores de 4 meses de edad durante la noche (al menos 8 h). Proporcione una cantidad limitada de alimentos húmedos durante la noche a los animales menores de 4 meses de edad, y luego, ayune durante 2 horas antes de la cirugía.
  4. Realizar un examen físico general, incluyendo auscultación torácica (usando un estetoscopio). Registre la frecuencia cardíaca y respiratoria, la temperatura, el color de la membrana mucosa y el tiempo de llenado capilar.
  5. Premedicar a los animales menores de 4 meses de edad con buprenorfina (0,02 mg/kg) y a los mayores de 4 meses de edad con buprenorfina (0,02 mg/kg) combinada con acepromazina (0,02 mg/kg) por vía subcutánea o intramuscular 30-45 min antes de la inducción de la anestesia general.
  6. Aplique la solución oftálmica tópica de tropicamida al 1% y la solución oftálmica de fenilefrina al 10% en la superficie ocular al menos dos veces para dilatar las pupilas. Repita si las pupilas no están bien dilatadas.
  7. Colocar un catéter intravenoso de 22 G en la vena cefálica en todos los animales: primero cortar el pelo de un área de 2 x 3 cm sobre la vena cefálica; preparar la piel frotándola primero con etanol al 70% y luego con un exfoliante de clorhexidina; Coloque el catéter y asegúrelo con cinta médica y enjuague con solución salina heparinizada. En animales menores de 4 meses, esto se puede hacer después de la inducción de la anestesia.
  8. Inducir anestesia general 30-45 min después de la premedicación: los animales menores de 4 meses de edad son inducidos con isoflurano administrado por máscara, los mayores de 4 meses de edad son inducidos usando propofol intravenoso (4-6 mg / kg).
  9. Intubar con un tamaño apropiado de tubo endotraqueal. Visualice la laringe con una luz de examen o laringoscopio. Rocíe 0.1 ml de lidocaína al 2% en la laringe, espere unos segundos y luego intube.
  10. Mantener la anestesia con isoflurano (entre 2% y 3,5%) en oxígeno (300–600 ml/kg/min) a través de un sistema de baño.
  11. Coloque al animal en decúbito dorsal sobre una almohada de posicionamiento sobre la que se coloca una manta de agua caliente cubierta por toallas. Conecte un monitor de paciente y controle la frecuencia cardíaca y el electrocardiograma (ECG), la frecuencia respiratoria, la presión arterial, la saturación de oxígeno y el dióxido de carbono al final de la espiración. Controle regularmente la temperatura corporal durante el procedimiento. Una persona adecuadamente capacitada es responsable del mantenimiento y monitoreo de la anestesia.
  12. Coloque al animal con la ayuda de la almohada de posicionamiento de modo que la superficie corneal quede horizontal cuando el ojo se gira en una posición de mirada primaria. Asegure la cabeza en su lugar con cinta médica.
  13. Cubra al animal con mantas para ayudar a mantener la temperatura corporal.
  14. Enjuague el catéter intravenoso con solución salina heparinizada e inicie una infusión intravenosa de lactato de Ringer suministrado a 2-5 ml/kg/h durante el procedimiento.
  15. Prepare la superficie ocular, el saco conjuntival y los párpados para la cirugía aséptica con povidona yodada al 0,2%, aplicadores de hisopo de algodón estéril y bolas de algodón.
  16. Coloque el microscopio de operación con oculares también ajustados adecuadamente. Coloque el control del pie para el microscopio (enfoque, zoom y control del eje XY) y la máquina de vitrectomía de modo que el cirujano pueda operarlos.
  17. Prepárese para la cirugía aséptica: todo el personal debe usar exfoliantes quirúrgicos, un sombrero quirúrgico y una máscara. Asegúrese de que el cirujano y el asistente (s) froten, batan y guantes como para la cirugía aséptica de rutina. Todo el personal debe estar familiarizado con las técnicas asépticas.
  18. Una vez que el personal esté fregado, vestido y enguantado, abra los paquetes quirúrgicos y coloque los instrumentos. Coloque perillas de manipulación estéril en las perillas de ajuste del microscopio para permitir que el cirujano o el asistente se ajusten sin romper la asepsia. Cubra al animal de manera rutinaria para la cirugía ocular.
  19. Prepare la máquina de vitrectomía siguiendo las instrucciones del fabricante para una vitrectomía de dos puertos.
    1. Coloque una lente de contacto de vitrectomía y una vitrectomía de dos puertos 23 G en la mesa del asistente. Coloque la cauterización de campo húmedo. Coloque y prepare el tubo de infusión y la pieza de mano de vitrectomía de 23 G.
    2. Coloque los instrumentos de vitrectomía y las líneas de líquido sobre la cortina estéril y manténgalos en posición con abrazaderas de toalla. Ajuste la máquina de vitrectomía en modo de vacío proporcional entre 1.500 y 2.500 cortes por minuto (cpm) y vacío máximo de 500 mmHg. Esto se realiza presionando los botones de flecha (hacia arriba o hacia abajo) presentes en el panel frontal de la máquina de vitrectomía.

2. Preparación de los organoides para la implantación subretiniana (Figura 1)

  1. Derivar organoides retinianos como se describió anteriormente 31, y, si es necesario, enviar durante la noche a37 ° C como se informó anteriormente54.
  2. Limpie las superficies en la sala de cultivo de tejidos en el laboratorio receptor con un desinfectante y mantenga el mismo alto nivel de técnica aséptica que en una sala quirúrgica para cirugías oculares, para evitar la contaminación bacteriana o fúngica, y transfiera a la sala quirúrgica para evitar la infección del sitio quirúrgico.
  3. Use cubiertas para zapatos quirúrgicos, batas de laboratorio desechables, gorros, máscaras quirúrgicas, mangas y batas quirúrgicas dentro de la sala de cultivo de tejidos asignada para la preparación de organoides para cirugías oculares.
  4. Preequilibrar los medios neurales con 20 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y 20 ng/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) durante 1 h en una incubadora de cultivo de tejidos (37 °C, 5%CO2). Colocar organoides en medios en placas de adhesión ultrabaja utilizando aproximadamente un cuarto de volumen de medio acondicionado (del envío nocturno) y tres cuartos de volumen de medio fresco31,54. Mantener durante 24-48 h.
  5. Preparar y equilibrar varias placas frescas de 60 mm con medio neural (como se prepara en el paso 2.4) durante al menos 1 h en la incubadora de cultivo de tejidos (37 °C, 5% deCO2) antes de anestesiar al primer animal. Tenga en cuenta que estas placas se utilizan para transferir los organoides para cada cirugía individual, con la suposición de que las condiciones de pH y la saturación deCO2 se mantendrán en el medio durante al menos 20 minutos, suficiente para mover la placa a la sala quirúrgica y cargar organoides en la cánula.
  6. Utilice una placa fresca de 60 mm con medios neurales presaturados para cada caso de trasplante, manteniendo las placas restantes en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C.
  7. Transfiera 6–9 organoides a una placa de 60 mm (con medios resaturados) pipeteándolos con una pipeta manual de un solo canal (20–200 μL) con punta de filtro estéril de 200 μL con una abertura ancha (~0,7 mm). Estas puntas se pueden preparar con anticipación o durante el procedimiento cortando ~ 3-4 mm de la punta con un par de tijeras estériles (hechas en la campana de cultivo de tejidos para evitar la contaminación). Coloque la placa de 60 mm dentro de una placa de cultivo de tejidos de 100 mm (para evitar la contaminación durante el transporte de habitación a habitación) y transpótela rápidamente a la sala quirúrgica.
  8. Coloque la placa con organoides en una almohadilla térmica eléctrica a 37 °C cubierta por un paño estéril.
  9. Cámbiese a un nuevo par de guantes estériles antes de preparar los organoides.
  10. Enjuague los organoides en una solución salina balanceada estéril (BSS) (opcional) y luego cárguelos en el inyector, que consiste en una cánula de vidrio de borosilicato de pared delgada (diámetro exterior, OD 1.52 mm; diámetro interior, ID 1.12 mm) con un extremo romo pulido unido por un tubo de plástico estéril a una jeringa Hamilton estéril de 500 μL precargada con BSS estéril.
  11. Pase la cánula al equipo quirúrgico de manera estéril cuando estén listos para inyectar los organoides.
  12. Mantenga la duración de todo el procedimiento (desde la extracción de los organoides de los medios de cultivo de tejidos hasta la carga de la cánula) a 20 minutos o menos.
  13. Si hay un retraso en la implantación de los organoides, colóquelos de nuevo en la incubadora de cultivo de tejidos, para evitar cambios en la saturación de pH / CO2 dentro de la placa.
  14. Conserve los organoides no utilizados durante 1 semana en la misma incubadora de cultivo de tejidos y controle cualquier evidencia de contaminación.

3. Implantación de organoides subretinianos

  1. Realice una cantotomía lateral de 0,5 a 1 cm con tijeras de tenotomía Stevens. Coloque un espéculo de párpado Barraquer del tamaño adecuado para mantener los párpados abiertos. Asegúrese de que el asistente quirúrgico irrige la córnea regularmente con BSS durante la duración del procedimiento.
  2. Coloque 2 suturas de seda 6-0 en la conjuntiva inmediatamente adyacente al limbo en las posiciones de las 4 y 8 en punto para sostener el ojo en la mirada primaria y retraer el tercer párpado. Use fórceps de atado corneal Castroviejo 0.5 y un pequeño hemostático de mosquito para agarrar suavemente la conjuntiva bulbar junto al limbo. Deje las suturas largas y sujete los extremos con pequeños hemostáticos de mosquitos para ayudar con su manipulación.
    NOTA: Colocar la sutura debajo del tercer párpado es más difícil; Asegúrese de colocarlo inmediatamente adyacente al limbo.
  3. Coloque otra sutura en la posición de las 12 en punto en el limbo parcialmente a través del grosor del limbo teniendo cuidado de no penetrar en el ojo. Anude esta sutura libremente y corta los extremos. Esto proporciona una sutura de anclaje robusta, que se utiliza durante la cirugía como un "mango" para rotar el ojo para permitir que el cirujano acceda a diferentes partes del mundo durante las diferentes etapas del procedimiento.
    NOTA: Los pasos 3.2 y 3.3 se pueden invertir. La secuencia de colocación de las suturas de estancia es la preferencia del cirujano.
  4. Refleja la conjuntiva bulbar entre las 10 y las 2 en punto (una perimetría). Usando tijeras de tenotomía, incise la conjuntiva a 2–3 mm del limbo. Socavarlo y limpiar la cápsula de la espiga para exponer la esclerótica en los sitios para los puertos de vitrectomía de las 2 y 10 en punto, que se colocarán a unos 3-5 mm del limbo dependiendo de la edad del animal. Use lanzas quirúrgicas de celulosa para la hemostasia y para limpiar cualquier sangre.
  5. Identificar sitios para la esclerotomía después del reflejo de la conjuntiva y la cápsula de espiga usando calibradores. Elija sitios de esclerotomía (a las 2 y 10 en punto con el objetivo de pasar por la pars plana), para evitar los principales vasos esclerales que pueden ser prominentes en el gato. Use cauterización de campo húmedo en la esclerótica en los sitios de esclerotomía planificados para reducir el sangrado escleral, planificando una región de ~ 3 mm en el puerto del instrumento (puerto de las 10 en punto para un cirujano diestro) ya que esto se ampliará después de la vitrectomía para permitir que se introduzca la cánula de implantación.
  6. Suturas de patrón cruzado pre-lugar (sutura de poliglactina 6-0 o 7-0) sin atar el nudo en el sitio de las esclerotomías propuestas antes de colocar los puertos de vitrectomía.
    NOTA: Esto facilita el cierre rápido de las esclerotomías al final del procedimiento. La sutura para el puerto de instrumentos planificado debe tener una mordida más larga de esclerótica, ya que será una incisión larga.
  7. Una vez que se coloquen las suturas, pídale al asistente que ayude a colocar el globo sosteniendo las suturas de estadía de las 12 en punto atando o usando pinzas Bishop-Harmon. Deje que el cirujano estabilice el globo también, usando un fórceps Castroviejo de 0,12 mm para mantener el tejido junto al sitio de la esclerotomía.
    1. Introduzca un puerto de vitrectomía de 23 G usando un trócar a través de la esclerótica en las posiciones de las 2 en punto y de las 10 en punto dirigidas en ángulo hacia el nervio óptico para evitar el contacto con la lente.
    2. Verifique que el puerto de irrigación esté en el vítreo empujando suavemente el puerto con pinzas de atado para que la punta se pueda visualizar en el vítreo. Una vez que se confirme el posicionamiento correcto, conecte la línea de riego al puerto y coloque la línea con vendajes adhesivos finos para pegarla en su lugar. Ajuste la infusión de vitrectomía del tampón BSS inicialmente a 30-35 mmHg presionando los botones de flecha (hacia arriba o hacia abajo) presentes en el panel frontal de la máquina de vitrectomía.
  8. Deje que el asistente sostenga una lente de vitrectomía de irrigación de aumento Machemer en la córnea para permitir la visualización del segmento posterior del ojo durante las siguientes etapas. Conecte la lente de vitrectomía de irrigación a un conjunto de goteo que proporcione un suministro constante de líquido para acoplar la lente a la córnea.
    NOTA: También se pueden usar otras formas de lentes de vitrectomía de contacto. Atenúe o apague las luces de la habitación para ayudar a la visualización a través del microscopio operativo.
  9. Inserte la sonda/cortador de vitrectomía de 23 G (2,500 cpm) a través del puerto del instrumento (adyacente a la mano dominante del cirujano, es decir, el puerto de las 10 en punto para un cirujano diestro) y realice una vitrectomía central parcial.
    1. Luego, retire completamente el vítreo de la superficie de la retina en la región que recibirá el trasplante (esto es importante para el éxito del procedimiento) separando la cara vítrea de la retina.
    2. Coloque la sonda de vitrectomía sobre la cabeza del nervio óptico con el puerto orientado hacia afuera de la superficie de la retina y aplique un vacío más alto para iniciar el desprendimiento de la cara vítrea.
  10. Preparar cristales de triamcinolona para uso intraocular. Si la suspensión de triamcinolona no es específicamente para uso intravítreo, lave los cristales y luego vuelva a suspender en BSS.
    1. Inicialmente, filtre la suspensión con la ayuda de un filtro de jeringa de poros estéril de 0,22 μm con membrana PES (unida a una jeringa de 1 ml) para atrapar los cristales.
    2. Luego lave los cristales de triamcinolona atrapados aspirando BSS en la jeringa de 1 ml y enjuagando a través del filtro (los cristales permanecen atrapados en el filtro). Esto elimina los conservantes en la solución. Repita el lavado 3 veces, después de lo cual los cristales se vuelven a suspender en 1 ml de BSS.
  11. Introduzca la aguja de la jeringa que sostiene la triamcinolona a través del puerto del instrumento. Tenga cuidado de no tocar la lente observando la punta de la aguja a través de la pupila mientras introduce la aguja a través del puerto del instrumento. Inyecte de 0.25 a 0.5 ml de suspensión de cristal. Luego inserte la sonda de vitrectomía a través del puerto del instrumento y avance cerca de la cabeza del nervio óptico con el puerto lejos de la superficie de la retina y use alto vacío para ayudar a separar la cara vítrea de la retina.
    NOTA: Los cristales de triamcinolona se adhieren y resaltan así el vítreo restante. Retire con cuidado cualquier vítreo por encima y al lado del sitio de implantación de organoide planificado (por ejemplo, el fondo de ojo tapetal central cerca de la región del área central ).
  12. Cree una pequeña ampolla de desprendimiento de retina focal en el sitio de implantación deseado utilizando un inyector subretiniano, por ejemplo, un inyector subretiniano de 23 G con una cánula extensible de 41 G conectada a una jeringa Luer hermética estéril de 250 μL llena de BSS estéril.
    1. Antes de crear la ampolla subretiniana, reduzca la presión de infusión a 10 mmHg para facilitar la formación de ampollas.
    2. Inserte el inyector a través del puerto del instrumento y avance hacia la superficie de la retina. Extruya la punta de la cánula y presiónela suavemente sobre la superficie de la retina. Pídale al asistente que dé un ligero empujón rápido en el émbolo de la jeringa para iniciar el desprendimiento de retina que reduce la presión de inyección para permitir un aumento lento del desprendimiento de retina hasta que se alcance el tamaño deseado (se usa aproximadamente 100 a 200 μL de BSS).
  13. Si la retinotomía creada se encuentra en una posición adecuada, lo que evita cortar la retina entre el sitio de implantación y la cabeza del nervio óptico para evitar la sección de la capa de fibra nerviosa derivada del sitio de implantación y evitar vasos sanguíneos retinianos importantes (esto también está determinado por el diseño del estudio, en nuestro caso se eligió la retina central), luego, agrandarlo ligeramente usando la cánula 41 G del inyector, con el objetivo de facilitar la introducción de tijeras retinianas.
  14. Retire el inyector del ojo y retire el puerto escleral de las 10 en punto. Amplíe la esclerotomía en este sitio con un cuchillo / queratomo recto de 2,85 mm orientado hacia el nervio óptico para evitar tocar la lente. Mantenga la presión de infusión en 10–15 mmHg.
  15. Extienda la retinotomía usando tijeras verticales vitreorretinianas de 80° con mango de compresión, evitando cortar los vasos retinianos para prevenir la hemorragia retiniana y asegúrese de cortar la retina en el borde de la ampolla lejos de la cabeza del nervio óptico para evitar cortar las fibras nerviosas que van desde la retina en el área del trasplante hasta el nervio óptico. La retinotomía debe ser de anchura suficiente para recibir los organoides.
  16. Inserte el capilar de vidrio precargado que contiene los organoides (ver paso 2.10) a través de la esclerotomía agrandada y avance hacia el sitio de la retinotomía bajo visualización directa.
    1. Use la punta del capilar de vidrio para abrir ligeramente la retinotomía para acceder a la abertura en la ampolla subretiniana.
    2. Pídale al asistente que presione lentamente el émbolo del inyector, mientras observa a través del microscopio, inyectando los organoides en la ampolla subretiniana. BSS debe preceder a los organoides y enjuagar la retinotomía abierta.
    3. Empuje suavemente los organoides dentro de la ampolla con la punta del capilar de vidrio si están en el borde de la retinotomía.
  17. Sostenga el capilar de vidrio en la retinotomía durante unos segundos para tratar de cerrar la retinotomía y evitar que los organoides se escapen al vítreo.
  18. Retire muy lentamente el capilar de vidrio del ojo evitando cualquier liberación repentina de líquido del ojo para evitar el movimiento de líquido dentro del ojo que podría expulsar los organoides de la ampolla subretiniana.
  19. Aumente lentamente la presión de infusión a 20-30 mmHg para ayudar a prevenir la hemorragia intraocular teniendo cuidado de que el líquido de infusión no se lave directamente sobre la ampolla. Esto se realiza presionando los botones de flecha hacia arriba presentes en el panel frontal de la máquina de vitrectomía.
  20. Cierre la esclerotomía usando la sutura precolocada en un patrón cruzado (6-0 o 7-0 poliglactina). Agregue suturas interrumpidas simples adicionales según sea necesario para sellar la esclerotomía.
  21. Pídale al asistente que retire el puerto de infusión y deje que el cirujano ate rápidamente la sutura precolocada para sellar la esclerotomía y evitar la pérdida de presión intraocular.
  22. Cierre la incisión conjuntival (peritomía) usando 6-0 o 7-0 poliglactina en un patrón continuo simple.
  23. Imagen del fondo de ojo (por ejemplo, usando una cámara de fondo de ojo de video RetCam II, Clarity o similar) y registre la posición inmediata de los organoides dentro del espacio subretiniano.
  24. Vuelva a preparar la superficie ocular después de obtener imágenes utilizando una solución de povidona yodada al 0,2% con la ayuda de aplicadores de punta de algodón y bolas de algodón. Retire las tres suturas de estancia y el espéculo de la tapa.
  25. Cerrar la cantotomía lateral con sutura de poliglactina 6-0. Coloque una sola sutura enterrada seguida de una figura de 8 suturas de piel para reformar el canto lateral y luego use suturas simples de piel interrumpida para cerrar el resto de la herida.
  26. Después de completar el procedimiento quirúrgico, administre una inyección subconjuntival de una combinación de esteroides y antibióticos (2 mg de acetato de metilprednisolona, 0,1 mg de dexametasona y 1 mg de gentamicina). Coloque un lubricante oftálmico (lágrimas artificiales) en la córnea.
  27. Recupere al animal de la anestesia y vigile de cerca durante la recuperación cualquier signo de dolor que requiera tratamiento adicional, como blefaroespasmo marcado, renuencia severa a ser manipulado, letargo o disminución del apetito y aumento de la frecuencia respiratoria y cardíaca. Proporcione analgesia postoperatoria según sea necesario y controle de cerca cualquier molestia.
    NOTA: Solo el personal debidamente capacitado debe estar a cargo de anestesiar y monitorear a los pacientes felinos antes, durante y después de la cirugía. Siga las recomendaciones del comité local de ética animal para el cuidado postoperatorio.

4. Procedimientos postimplantacionales, tratamiento postoperatorio y evaluación

  1. Continuar el tratamiento con medicamentos inmunosupresores orales (1 mg/kg de prednisolona y 2 mg/kg de ciclosporina por vía oral dos veces al día) para ayudar a controlar la inflamación y el rechazo de los organoides. Proporcionar cobertura antibiótica sistémica (p. ej., doxiciclina oral 5 mg/kg dos veces al día; este antibiótico se seleccionó debido al riesgo de infección micoplasmática oportunista en animales inmunodeprimidos).
  2. Realice exámenes oftalmológicos regulares para controlar la inflamación o el desarrollo de eventos adversos. Controle la ampolla retiniana para detectar aplanamiento, que ocurre durante los primeros días después de la cirugía a pesar de la gran retinotomía requerida para que los organoides se inyecten en el espacio subretiniano. Registre imágenes de fondo de ojo en cada examen para registrar la posición y apariencia de los organoides trasplantados.
  3. Imagen de los animales bajo anestesia general mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO) y dominio espectral – tomografía de coherencia óptica (SD-OCT)5,31 durante el período de monitorización y antes de la finalización del experimento.
  4. Sacrificar humanamente a los animales al final del experimento utilizando un método aprobado por AVMA, por ejemplo, la administración intravenosa de 85 mg / kg de pentobarbital. Después de la sedación, coloque un catéter intravenoso para la administración del pentobarbital para minimizar el estrés. Confirme la muerte por cese de los latidos cardíacos y haga una incisión en el tórax para crear un neumotórax.
  5. Retire los ojos a través de un enfoque transconjuntival estándar y corrija según sea necesario. Para inmunohistoquímica (IHC), sumergir inmediatamente los ojos en una solución de paraformaldehído al 4% después de inyectar 0,3 ml de la solución fijadora en el segmento posterior a través de 3 hendiduras hechas a través de la pars plana con una cuchilla Parker 11 (~ 3-4 mm del limbo).
  6. Diseccionar los oculares después de 3,5 h de fijación a 4 °C. Retire el vítreo residual asegurándose de preservar intactos la retina y los organoides. Vuelva a colocar en fijador durante 30 minutos adicionales a 4 °C y luego enjuague los oculares 3 veces cada uno durante 10 minutos en PBS. Transfiera el ocular al 15% de sacarosa durante 2 h, luego al 30% de sacarosa durante otras 2 h.
  7. Enjuague el ocular dos veces con PBS e insértelo en medio OCT (compuesto de temperatura de corte óptima) y congele rápidamente y luego guárdelo a -80 °C hasta seccionarlo para histología e inmunoquímica.
  8. Seleccionar anticuerpos para IHQ según el protocolo y los objetivos del estudio.

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Representative Results

Este procedimiento permite la implantación exitosa y reproducible de organoides retinianos derivados de hPSC en el espacio subretiniano de un modelo animal de ojo grande (demostrado aquí usando 2 ejemplos: gatos salvajes con fotorreceptores sanos (PR) y gatos CrxRdy/+ con PRs y retina degenerados). Siguiendo los pasos indicados en la Figura 1 , prepare y cargue los organoides retinianos derivados de hPSC en la cánula de vidrio de borosilicato del dispositivo de inyección para que los organoides no se dañen. Esto puede confirmarse mediante la visualización directa durante la carga de los organoides (paso 2.10) y durante la cirugía (paso 3.16) (Figura 2A, B), así como mediante imágenes del fondo de ojo al final de la cirugía (paso 3.23, Figura 2C). La presencia de los organoides en el espacio subretiniano mediante esta técnica se confirma postoperatoriamente mediante examen oftalmológico e imagen del fondo de ojo (Figura 3A), que registra la posición y apariencia de los organoides. Conocer la posición del trasplante es muy importante cuando se procesan los globos para histología e inmunohistoquímica congeladas y reduce sustancialmente la carga de trabajo, ya que la sección de un ojo grande a 12-14 μm (grosor de una criosección) lleva tiempo. Antes de la eutanasia, también se realizan oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO) e imágenes de dominio espectral: tomografía de coherencia óptica (SD-OCT) para evaluar la posición de los organoides en el espacio subretiniano (Figura 3A-D). Estas técnicas demuestran la persistencia de organoides retinianos en el espacio subretiniano (entre la retina neural y el EPR) del ojo receptor (Figura 3E). Después de la eutanasia (realizada humanamente siguiendo las recomendaciones de AVMA) la histología e inmunohistoquímica (IHC) se realiza de forma rutinaria (ver detalles en el artículo31 publicado anteriormente). La histología y la IHQ demuestran la supervivencia de injertos xenogénicos (organoides retinianos derivados de hPSC) en el espacio subretiniano de un ojo grande cuando los animales estaban inmunosuprimidos (como se describió anteriormente31), ver Figura 4.

Figure 1
Figura 1: Esquema de los pasos para la preparación de organoides antes de la implantación.
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Figure 2
Figura 2: Implantes subretinianos quirúrgicos de organoides. (A) Visualización directa de organoides que se administran en el espacio subretiniano a través de una cánula de vidrio sin dañarse, (B) Visualización directa de organoides en la ampolla subretiniana, (C) Imagen en color de fondo de ojo gran angular de los organoides implantados subretinalmente inmediatamente después de la cirugía. Los bordes de la ampolla están indicados por las puntas de flecha negras y el sitio de la retinotomía por las estrellas negras.
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Figure 3
Figura 3: Evaluación postoperatoria de organoides implantados subretinalmente 3 meses después de la implantación en un gato CrxRdy/+ . (A) imagen en color del fondo de ojo de los organoides implantados subretinalmente, (B) imagen del fondo de ojo cSLO de los organoides implantados subretinalmente, (C) reconstrucción por escaneo de volumen 3D del área que contiene los organoides, (D) imagen cSLO del área que contiene organoides subretinianos, (E) imagen de sección transversal de alta resolución SD-OCT de los organoides implantados subretinalmente. El sitio de la retinotomía está indicado por las estrellas negras.
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Figure 4
Figura 4: Láminas fotorreceptoras derivadas de organoides retinianos humanos (marcador PR RCVRN) en el espacio subretiniano de CrxRdy/+ gato, 3 meses después del injerto.  *Boutons sinápticos (hSYP=Sinaptofisina) en la capa nuclear interna del gato (INL).
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Discussion

La implantación de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides retinianos) en el espacio subretiniano es un enfoque experimental prometedor para restaurar la visión de las enfermedades degenerativas de la retina en etapa tardía causadas por la muerte celular PR (ceguera profunda o terminal). El enfoque presentado se basa en una terapia experimental desarrollada y probada con éxito basada en el injerto subretiniano de un pedazo de tejido retiniano fetal humano23,24,25. Presenta el uso de una fuente de tejido retiniano alternativa, reponible y éticamente aceptable derivada de hPSCs. Demostrar la viabilidad quirúrgica y la seguridad ocular de la terapia en modelos animales oculares grandes51,55 es necesario para avanzar de este enfoque prometedor hacia aplicaciones clínicas. Este manuscrito proporciona un método detallado para la implantación subretiniana de tejido retiniano hPSC-3D (organoides retinianos) en un modelo animal grande con retina normal y degenerada (modelo de CrxRdy/+ modelo de gatos de LCA). Aunque se han desarrollado procedimientos para introducir una pieza plana de retina humana y también parches de EPR43,44,45, no se ha investigado el trasplante de injertos 3D más grandes (necesarios para restaurar la visión en condiciones con DR avanzada). El protocolo descrito aquí en detalle es para un procedimiento de trasplante para la administración subretiniana de los organoides retinianos completos (en lugar de los bordes organoides33,41) que también llevan algo de EPR como una forma potencialmente mejor de introducir láminas retinianas intactas con PR, para aumentar la supervivencia del injerto y mejorar la preservación de la hoja. Tenga en cuenta que las diferentes partes de este protocolo están bien establecidas. Por ejemplo, la vitrectomía es ampliamente utilizada por los cirujanos vitreorretinianos durante la cirugía de reinserción retiniana 56,57,58,59,60. Las inyecciones subretinianas son cada vez más utilizadas, por ejemplo, en la terapia de aumento de genes 3,7,61,62,63,64. Hay descripciones limitadas de la creación de una retinotomía adecuada y la inyección de organoides relativamente grandes en el espacio subretiniano.

Los pasos críticos incluyen el posicionamiento cuidadoso y la realización de la esclerotomía para evitar la lente, la eliminación completa de la corteza vítrea de la superficie de la retina sobre el sitio del trasplante, la formación controlada de la ampolla subretiniana, la generación de retinotomía del tamaño óptimo para acomodar el ancho de la cánula de trasplante, el mantenimiento de la presión de infusión definida durante los diferentes pasos, y la retirada de cánulas. Elegir la cánula de trasplante adecuada con diámetro y longitud internos y externos optimizados (ID y OD), controlar el sangrado intraocular, la esterilidad de todo el procedimiento, desde los organoides hasta la sala quirúrgica y los instrumentos, y la duración de la cirugía (30-45 min/animal) para garantizar resultados óptimos. Los autores encuentran que los mejores resultados se obtienen con la vitrectomía 23 G debido al grosor / viscosidad del vítreo del gato, creando una ampolla con un inyector con una cánula de 41 G y luego, extendiendo la retinotomía en el borde de la ampolla utilizando tijeras retinianas de ángulo de 80 °. Otros factores importantes incluyen la extensión de la esclerotomía utilizando un queratomo de 2,85 mm para ajustar la cánula de vidrio de borosilicato (diámetro exterior DO 1,52 mm; diámetro interno, ID 1,12 mm; y longitud 10,16 cm) y permitir la implantación de organoides más grandes en un ojo grande con una longitud axial de aproximadamente 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. El uso de un capilar de vidrio fue el mejor disponible actualmente para cargar y entregar organoides de tamaño descendente sin dañarlos durante el proceso de implantación. Se encontró que reducir la presión de infusión de 20-30 mmHg durante la vitrectomía a 10 mmHg durante la etapa de formación de ampollas es óptimo para generar desprendimientos de retina, necesarios para crear espacio para los organoides retinianos. Además, la viabilidad del tejido retiniano hPSC-3D (organoides) durante el envío a larga distancia y la elección del régimen de inmunosupresión optimizado para el mantenimiento de injertos humanos xenogénicos son críticos como se informó recientemente31,54.

Los autores encontraron que debido a la cinta de gato altamente reflectante no se requería endo-iluminación para realizar la cirugía. El trasplante en una especie atapetal (por ejemplo, cerdo, primate no humano) requeriría una vitrectomía de 3 puertos que incluye endoiluminación. El taponamiento (p. ej., con perfluorocarbono seguido de aceite de silicona) como se realiza en la cirugía de desprendimiento de retina de rutina no se realizó porque la presión sobre la ampolla correría el riesgo de extruir los organoides en el vítreo. Los desarrollos futuros podrían incluir el uso de materiales que actualmente se están investigando para sellar agujeros retinianos. Esto podría usarse para prevenir cualquier pérdida post-implantación de organoides en el vítreo. Además, Triescence, que es similar a Kenalog-40 pero contiene triamcinolona sin conservantes, podría usarse como una alternativa para visualizar el vítreo.

El tamaño más pequeño del globo en animales más jóvenes (por ejemplo, 1-2 meses) presentó más desafíos quirúrgicos en comparación con el ojo grande (animales adultos). Sin embargo, utilizando el método descrito aquí, es posible administrar los injertos subretinianos. En el modelo CrxRdy/+ LCA, se encontró que las ampollas retinianas más grandes no siempre se vuelven a unir. Mantener la ampolla al tamaño mínimo necesario para permitir que se inyecten los organoides retinianos, redujo esta complicación. El trasplante más temprano en la retina RD (antes de la pérdida completa de PR cuando la retina neural se adelgaza marcadamente) es otra guía, en línea con el trabajo anterior con injertos de retina fetal humana20. Otra nota: la técnica detallada no depende de colocar la lámina retiniana en la orientación correcta porque se trasplantan todos los organoides de la retina. Con el desarrollo de láminas planas de hESC en la retina, esto será importante. Sin embargo, no es el foco de este protocolo, que tiene como objetivo entregar hojas de tejido hESC intactas de la retina y optimizar la preservación subretiniana de las hojas de PR. Una vez desarrollada la técnica, fue reproducible tanto en retina normal como en RD.

Hay muchas complicaciones potenciales para este procedimiento quirúrgico. Solo aquellos expertos en cirugía vitreorretiniana (por ejemplo, oftalmólogos veterinarios capacitados o cirujanos vitreorretinianos familiarizados con las diferencias de especies en el ojo de gato en comparación con el ojo humano) deben realizar el procedimiento. Las posibles complicaciones incluyen el toque del cristalino durante la colocación del trócar, sangrado escleral durante el agrandamiento de la esclerotomía y hemorragias subretinianas o retinianas. Otras complicaciones, como la respuesta inmune del huésped a los injertos de organoides humanos xenogénicos que conducen a la destrucción del injerto con el tiempo o la endoftalmitis son posibles; El uso de inmunosupresores orales y medicamentos antibióticos ayudan a prevenir que ocurran. También es importante tener en cuenta que hay una diferencia entre la implantación en gatos wildtype y CrxRdy/+ . Cuando hay degeneración retiniana avanzada, la ampolla retiniana tiende a extenderse más que en el tipo salvaje y, en algunos casos, esto puede evitar la reinserción completa de la retina después de la cirugía. La técnica presentada aquí es aplicable para la implantación de organoides en ojos de grandes modelos animales de IRDs. Se necesitaría un mayor refinamiento una vez que el trasplante esté listo para su traducción a la clínica.

Con base en la experiencia de los autores con la realización de procedimientos quirúrgicos vitreorretinianos complejos en modelos oculares grandes, la técnica presentada en este manuscrito debe ser aplicable a otros modelos animales grandes (con la inclusión de endoiluminación en especies atétales) que se utilizan para traducir las técnicas quirúrgicas vitreorretinianas a la clínica43,44,45.

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Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., e Igor O. Nasonkin Ph.D. son empleados de Lineage Cell Therapeutics, Inc. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 y SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones es un co-PI). Janice Querubin (MSU RATTS) por su ayuda con la anestesia y el cuidado general de los animales incluidos en este estudio, así como la ayuda con el entorno quirúrgico y la preparación / esterilización de instrumentos. Paige Winkler por la ayuda en recibir los organoides y colocarlos en los medios el día anterior a la implantación y por la ayuda el día de la implantación. Los autores también agradecen al Sr. Randy (LCTX) por el envío diligente de los organoides retinianos, el montaje del remitente y la descarga de los registros de temperatura y estrés G después de cada envío. Este trabajo se realizó mientras el autor Igor Nasonkin era empleado por Biotime (ahora Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes
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Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

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