Summary
Her beskriver vi udnyttelsen af Grafix (Gradient Fiksering), en glycerol gradient centrifugering i nærværelse af en crosslinker, for at identificere interaktioner mellem splejsning faktorer, der binder forbigående til splejsning kompleks.
Abstract
Pre-mRNA splejsning er en meget dynamisk proces, der involverer mange molekylære omlægninger af de splejsiske underkomplekser under montering, RNA-behandling og frigivelse af de komplekse komponenter. Glycerol gradient centrifugering er blevet anvendt til adskillelse af protein eller RNP (RiboNucleoProtein) komplekser til funktionelle og strukturelle undersøgelser. Her beskriver vi udnyttelsen af Grafix (Gradient Fiksering), som først blev udviklet til at rense og stabilisere makromolekyllære komplekser til enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi, for at identificere interaktioner mellem splejsning faktorer, der binder forbigående til splejse kompleks. Denne metode er baseret på centrifugering af prøver i en stigende koncentration af et fikseringsreagens for at stabilisere komplekser. Efter centrifugering af gær samlede ekstrakter læsset på glycerol gradienter, genvundet fraktioner analyseres ved prik blot til identifikation af splejsning sub-komplekser og bestemmelse af tilstedeværelsen af individuelle splejsning faktorer.
Introduction
Splejsning er en meget dynamisk proces, der kræver binding og frigivelse af en lang række faktorer på en koordineret måde. Disse splejsning faktorer omfatter RNA bindende proteiner, ATPases, helicaser, protein kinaser og fosfattaser, allestedsnærværende ligaser, blandt andre1,2,3; og for at gøre det muligt for de molekylære omlægninger at finde sted, binder nogle af disse faktorer meget forbigående til de splejsede underkomplekser, hvilket gør isoleringen og identifikationen af disse RNP-mellemkomplekser meget udfordrende.
Her brugte vi Grafix metode4,5 til at stabilisere samspillet mellem gær splejsning faktor Cwc24 med Bhandling kompleks6 at give mulighed for identifikation af andre faktorer bundet samtidig til denne subcomplex og afgøre, om den allestedsnærværende ligase Prp19 spiller nogen rolle i bindingen eller frigivelsen af Cwc24 til Nitten (NTC) kompleks og til 5 'slutningen af intron før aktivering og den første transesterificering reaktion tager sted. Fordelen ved at udsætte makromolekylerne for en stigende koncentration af crosslinkeren langs glycerolgradienten er, at den undgår interkomplekser krydslinks4,5og dermed dannelsen af aggregater.
Denne metode blev brugt som et supplement til protein coimmunoprecipitation og pull-down assays, som, på trods af at tillade isolering af store komplekser, kan ikke være pålidelige til at opretholde forbigående interaktioner inden for store dynamiske komplekser7,8. Brugen af fiksering reagenser i glycerol gradient stabiliserer bindingen af sådanne faktorer, så bekræftelse af interaktioner af specifikke proteiner med splejsning subkomplekser. Fordi den valgte crosslinker var kemisk irreversibel, proteiner til stede i de genvundne fraktioner blev analyseret ved prik blot efter gradient centrifugation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gær total ekstrakt forberedelse
- Knyt gærcellerne, der udtrykker en af splejsning faktorer smeltet til TAP tag9 i 1 L YNB-glu medier (Gær Nitrogen Basis suppleret med 2% m / v glukose) med de relevante aminosyrer eller nuklein baser, i dette tilfælde, adenin (20 μg/mL), leucin (30 μg/mL), tryptofan (30 μg/mL), op til OD600 = 1,0.
- Cellerne opsamles fra 1 L-kulturen ved at centrifugere i tre 500 mL centrifugeflasker ved 17.000 x g i 10 min ved 4 °C og vask to gange med 10 mL koldt sterilt vand.
- Brug de indsamlede gærceller i 1/10 af cellemængden af kold buffer A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glycerol, 0,5 mmol L-1 DTT, EDTA-fri Protease Inhibitor Cocktail).
- Frys små dråber celleophæng i flydende nitrogen. De små dråber kan opnås ved at pipettere den ophængte celleopløsning og tabe 50 μL direkte i flydende nitrogen.
FORSIGTIG: Flydende nitrogen kan forårsage skader i kontakt med hud eller øjne. Håndtere ved hjælp af passende sikkerhedsudstyr.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. De frosne dråber af celleaffjedring kan opbevares ved -80 °C. - Forbered gærceller lyser ved at slibe i en Ball Mill enhed gennem seks cyklusser ved 20 Hz / s i 3 min.
BEMÆRK: Efter hver cyklus nedsænkes beholderen, der huser de frosne celler i flydende nitrogen, for at undgå smeltning. Protokollen kan sættes på pause her. De frosne ekstrakter kan opbevares ved -80 °C. Gærsplejsning ekstrakter kan også fremstilles ved hjælp af homogenisatorer til at lysate spheroplasts10, eller ved hjælp af mørtel og støder11,12. - Smelt ekstraktet ved at placere rørene, der indeholder dem i vand ved stuetemperatur, ryste lejlighedsvis.
- Centrifugeekstrakter ved 45.000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Kvantificer proteinindholdet i det rensede supernatant ved BCA-metoden13.
- Tilbered aliquots af ekstrakterne, fastfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
2. Glycerol gradient forberedelse
- Der fremstilles to glycerolopløsninger i buffer A, den ene indeholder 10 % v/v og den anden indeholder 30 % v/v glycerol.
- Krydslinkstoffet glutaraldehyd til 0,1% v/v i 30% v/v glycerolopløsningen og blandes for at homogenisere.
FORSIGTIG: Håndter glutaraldehyd inde i røghætten med passende sikkerhedsudstyr. - Der tilsættes 6 mL af den kolde 10% v/v glycerolopløsning i bunden af 12 mL centrifugerøret (14 x 89 mm).
- Der tilsættes 6 mL af den kolde 30% v/v glycerolopløsning suppleret med glutaraldehyd med en sprøjte fastgjort til en lang nål, der er forsynet med Gradient Master-enheden i bunden af røret, lige under 10% v/v glycerolopløsningen.
BEMÆRK: Alternativt kan 10% v/v glycerolopløsningen forsigtigt pipetteres oven på 30% v/v glycerol/glutaraldehydopløsningen. - Brug gradientmasterenheden til at generere et kontinuerligt tæthedsgradient.
BEMÆRK: I Gradient Master-enheden placeres rørene i et passende rack og roteres kortvarigt i 1999 efter fabrikantens anbefalinger til bestemmelse af parametrene (tid/vinkel/hastighed). I dette arbejde brugte vi: 2:25 min/81.5°/11 rpm. - Tilsæt forsigtigt 200 μL af en 7% v/v glycerol/buffer En pude på toppen lige før tilsætning af cellen ekstrakter.
BEMÆRK: Glycerolkoncentrationen af puden skal være lavere end den mindre koncentrerede glycerolopløsning, der anvendes til at skabe den lineære hældning.
3. Uddrag centrifugering
- Læg ca. 2 mg samlet protein oven på hver 12 mL lineær glycerolgradient 10%-30% glutaraldehyd med pude.
- Placer rørene i en forkølet svingspandrotor.
BEMÆRK: Håndter rørene forsigtigt for at undgå blanding før ultracentrifugering. - Centrifuge ved 194.000 x g i 16 timer ved 4 °C.
- Aliquot hver 12 mL rør i fireogtyve 500 μL fraktioner ved hjælp af en tilpasset EconoSystem eller ved omhyggeligt pipettering.
BEMÆRK: Et tilpasset EconoSystem består af en peristaltisk pumpe, UV-detektoren og den fraktionsamler, der er tilsluttet rør-perforeringsenheden. Sedimentationsprofilen kan overvåges ved måling af absorbansen ved 280 nm. - Brug en 40% v/v glycerolopløsning gennem den peristaltiske pumpe til at skubbe glycerolen 10%-30% gradient fra røret til fraktionsamleren.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Opbevar brøkene ved -80 °C, indtil de anvendes. - Læg 50 μL af hver brøk direkte på nitrocellulosemembraner på en prik blot eller slot blot enhed. Detekter protein ved immunblod ved hjælp af antistof mod CBP (1:6.000, for at detektere CBP-delen af TAP-mærket) og anti-kanin IgG konjugeret med peberrodsperoxidase (1:15.000) som det sekundære antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at analysere sedimenteringsprofilen af Cwc24-TAP og afgøre, om Grafix-metoden var effektiv til at stabilisere sin binding til splejsning af underkomplekser, adskilte vi samlede gærekstrakter af celler, der udtrykker Cwc24-TAP gennem centrifugering på glycerolgradienter, i nærvær eller fravær af glutaraldehyd som et krydslinkmiddel. Prøver på 24 500 μL-fraktioner blev derefter analyseret ved slot blot med antistof mod CBP-delen af TAP-mærket. Resultaterne viser , at I mangel af crosslinker er Cwc24 koncentreret mellem fraktioner 5 og 13 (figur 1B), svarende til komplekser på ca. 80 til 200 MDa14. I nærværelse af crosslinkeren flyttes Cwc24's position på gradienten dog til fraktioner i bunden af gradienten, svarende til større komplekser (Figur 1). Disse resultater tyder på, at glutaraldehyd stabiliserer foreningen af Cwc24 med splejsning komplekser.
For at fastslå, om de komplekser, der bevarer Cwc24, svarer til Bact-komplekset, som er dannet af snRNPs U2, U5 og U6 og NTC-komplekset, sammenlignede vi Cwc24-sedimentering med U5 snRNP-underenheden Prp8 og NTC-underenheden Prp19. Gærstammer, der udtrykte, at et af disse proteiner, der var smeltet til TAP-mærket, blev udsat for Grafix, efterfulgt af prikplet til påvisning af proteinerne. Disse tre splejsede underenheder viste lignende profiler, sedimentering med større komplekser i bunden af gradienten. Cwc24 er koncentreret i de samme fraktioner, men fordi det forbinder forbigående med splevisomet, er det også til stede i de lettere fraktioner (Figur 2). Kvantificeringen af prikkerne viser disse profiler (Figur 2B).
Interessant nok er fraktioner 11 og 12 dem, hvor Prp8 og Prp19 begynder at koncentrere sig, hvilket tyder på, at dette er den del af gradienten, hvor Bact-komplekset begynder at sedimentere. For at fastslå, at disse proteiner er bundet til komplekser i disse fraktioner, blev aliquots af fraktioner 11 og 12 udsat for elektroforese på indfødte geler og efterfølgende til vestlig blot. Signaler af Prp8 og Prp19 fremstår som udstrygninger, der næppe kommer ind i en 8% acrylamidgel, hvilket viser, at de faktisk er en del af store komplekser (figur 3). Cwc24 er også til stede i brøkdel 12, men i meget lavere koncentration, i overensstemmelse med dens forbigående binding til Bact-komplekset. Disse resultater viser, at glutaraldehyd kan bruges som crosslinker til at stabilisere bindingen af forbigående faktorer til splejsning underkomplekser.
Figur 1: Grafix holder Cwc24 forbundet med større komplekser. Total gær ekstrakt af celler, der udtrykker Cwc24-TAP blev adskilt ved centrifugering på glycerol gradienter, enten i mangel eller tilstedeværelse af crosslinker glutaraldehyd. (A) Ulige fraktioner af gradienten blev udsat for slot blot til immundetektion af Cwc24-TAP med antistof mod CBP-delen af TAP-mærket. (B) Kvantificeringen af Cwc24-TAP ved hjælp af billede J viser proteinkoncentrationen gennem fraktioner af glycerolgradienten. Tilstedeværelse eller fravær af glutaraldehyd er indiceret. Y-aksen viser de relative mængder af Cwc24 gennem gradienten, beregnet som intensiteten af signalet i brøkene, i forhold til den første brøk (Fn/F1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sedimentering af splejsning faktorer gennem glycerol/glutaraldehyd gradienter. Uddrag af gærceller, der udtrykker enten Cwc24, Prp8 eller Prp19 smeltet til TAP-mærket, blev indlæst på glycerolgradienter, der indeholder glutaraldehyd og centrifugeret til adskillelse af splejsning komplekser. (A) Prøver af de fireogtyve fraktioner af gradienten blev analyseret ved dot blot og immundetektion af tap-fusionerede proteiner med antistof mod CBP-delen af TAP-mærket. (B) Kvantificeringen af de proteiner, der anvender billede J, viser deres koncentration i de nederste fraktioner af glycerol/glutaraldehydgradienten. Y-aksen viser de relative mængder af proteinerne gennem gradienten, beregnet som intensiteten af signalet i brøker, i forhold til den første brøk, der viser et signal over baggrunden (Fn/ F1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Påvisning af splejsning komplekser af indfødte PAGE og immunoblot. Aliquots af fraktioner 11 og 12 af gradienten vist i figur 2 blev adskilt af elektroforese på 8% acrylamid native gel og udsat for immunoblot med antistof mod CBP. Proteiner registreres ikke som bånd, fordi komplekser er for store til at adskille på indfødte geler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein og ribonukleinsyrer-protein interaktioner kan stabiliseres ved hjælp af crosslinking midler. Det er vigtigt, at det resulterende kompleks er stabilt til at modstå ultracentrifugering på glycerol gradient. Derudover bør bufferbetingelserne gøre det muligt at interagere, men være strenge nok til at undgå ikke-specifik binding. I de eksperimenter, der er vist her, brugte vi en bufferopløsning, der allerede er etableret til in vitro-splejsningsreaktioner15.
Centrifugeringens hastighed og tid skal optimeres til de komplekser, der analyseres. Vi testede forskellige sedimenteringsforhold, centrifugerende prøver ved 94.000 x g og 194.000 x g i 16 timer ved 4 °C, med lignende resultater. Disse kontroller er vigtige for at bestemme de betingelser, hvorunder de komplekser, der analyseres, ikke bundfalder.
Vi testede også forskellige blot metoder, pipetting direkte på membranen, ved hjælp af slot blot eller prik blot systemer, som viste, at prik blot gav mere reproducerbare resultater.
En væsentlig begrænsning ved at bruge glutaraldehyd som crosslinker er, at krydslinket ikke kan vendes tilbage. Derfor kan proteiner ikke analyseres af immunoblot efter SDS-PAGE, men kun af indfødte geler eller prik blot. Reversible krydslinkingsmidler, såsom formaldehyd, kan dog potentielt også anvendes.
Vi har tidligere brugt co-immunprecipitation af proteiner til at identificere splejsningskomplekser, men i tilfælde af forbigående eller svage interaktioner7kan crosslink hjælpe med at isolere mellemliggende komplekser til senere bestemmelse af deres komponenter ved massespektrometri. Selvom vores fokus her var det splejsede, kan denne metode helt sikkert bruges til isolering af andre dynamiske processer, der omfatter mellemliggende komplekser med varierende kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et FAPESP-tilskud (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
