Summary
Her beskriver vi bruken av Grafix (Gradient Fixation), en glyserol gradient sentrifugering i nærvær av en krysskobling, for å identifisere interaksjoner mellom skjøtefaktorer som binder seg forbigående til skjøteosomet.
Abstract
Pre-mRNA skjøting er en veldig dynamisk prosess som innebærer mange molekylære omorganiseringer av skjøteosomets underkomplekser under montering, RNA-behandling og frigjøring av de komplekse komponentene. Glyserol gradient sentrifugering har blitt brukt til separasjon av protein eller RNP (RiboNucleoProtein) komplekser for funksjonelle og strukturelle studier. Her beskriver vi bruken av Grafix (Gradient Fixation), som først ble utviklet for å rense og stabilisere makromolekylære komplekser for enkeltpartikkelkryo-elektronmikroskopi, for å identifisere interaksjoner mellom skjøtefaktorer som binder seg forbigående til skjøteosomet. Denne metoden er basert på sentrifugering av prøver i en økende konsentrasjon av et fikseringsreagens for å stabilisere komplekser. Etter sentrifugering av gjærtotalekstrakter lastet på glyserolgradienter, analyseres gjenopprettede fraksjoner av dot blot for identifisering av skjøteosomets underkomplekser og bestemmelse av tilstedeværelsen av individuelle skjøtefaktorer.
Introduction
Skjøting er en svært dynamisk prosess som krever binding og frigjøring av en rekke faktorer på en koordinert måte. Disse skjøtefaktorene inkluderer RNA-bindende proteiner, ATPaser, helikaser, proteinkinaser og fosfater, allestedsnærværende ligaer, blant annet1,2,3; og for å tillate molekylære omorganiseringer å finne sted, binder noen av disse faktorene svært forbigående til skjøteosomets underkomplekser, noe som gjør isolasjonen og identifiseringen av disse RNP-mellomkompleksene svært utfordrende.
Her, vi brukte Grafix-metoden4,5 for å stabilisere samspillet mellom gjærspleisefaktoren Cwc24 medB-aktkomplekset 6 for å tillate identifisering av andre faktorer bundet samtidig til den subcomplexen og avgjøre om ubiquitin ligase Prp19 spiller noen rolle i bindingen eller utgivelsen av Cwc24 til Nitten (NTC) komplekset og til 5 ' slutten av intron før aktivering og den første transesterifisering reaksjonen tar sted. Fordelen med å utsette makromolekylene for en økende konsentrasjon av krysskoblingen langs glyserolgradienten er at den unngår interkomplekser krysskoblinger4,5, og derfor dannelsen av aggregater.
Denne metoden ble brukt som en komplementering til proteinkoimmunoprecipitation og pull-down analyser, som til tross for å tillate isolering av store komplekser, kanskje ikke er pålitelig for å opprettholde forbigående interaksjoner i store dynamiske komplekser7,8. Bruken av fikseringsreagenser i glyserolgradienten stabiliserer bindingen av slike faktorer, slik at bekreftelsen av interaksjoner av spesifikke proteiner med skjøtende underkomplekser. Fordi den valgte krysskoblingen var kjemisk irreversibel, ble proteiner tilstede i de gjenvunne fraksjonene analysert av prikkflekk etter gradient sentrifugering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gjær total ekstrakt forberedelse
- Dyrk gjærcellene som uttrykker en av skjøtefaktorene som er smeltet sammen til TAP-taggen9 i 1 L YNB-limmedie (Gjær nitrogen basis supplert med 2% m / v glukose) med passende aminosyrer eller nukleiske baser, i dette tilfellet adenin (20 μg/ml), leucin (30 μg/ml), tryptofan (30 μg/ml), opptil OD600 = 1,0.
- Samle cellene fra 1 L-kulturen ved sentrifugering i tre 500 ml sentrifugeflasker ved 17 000 x g i 10 min ved 4 °C og vask to ganger med 10 ml kaldt sterilt vann.
- Resuspend de oppsamlede gjærcellene i 1/10 av cellevolumet av kaldbuffer A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v/v glyserol, 0,5 mmol L-1 DTT, EDTA-fri Protease Inhibitor Cocktail).
- Frys små dråper cellefjæring i flytende nitrogen. De små dråpene kan oppnås ved å røre den resuspenderte celleløsningen og slippe 50 μL direkte inn i flytende nitrogen.
FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake skader i kontakt med hud eller øyne. Håndter ved hjelp av egnet sikkerhetsutstyr.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. De frosne dråpene av celleoppheng kan lagres ved -80 °C. - Forbered gjærceller lyser ved å male i en Ball Mill-enhet gjennom seks sykluser ved 20 Hz / s i 3 min.
MERK: Senk beholderen i flytende nitrogen etter hver syklus for å unngå smelting. Protokollen kan settes på pause her. De frosne ekstraktene kan lagres ved -80 °C. Gjær skjøteekstrakter kan også tilberedes ved hjelp av homogenisatorer for å lysate spheroplasts10, eller ved hjelp av mørtel og pestle11,12. - Smelt ekstraktet ved å plassere rørene som inneholder dem i vann ved romtemperatur, rist av og til.
- Sentrifugeekstrakter ved 45 000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Kvantifisere proteininnholdet i den rensede supernatanten ved BCA-metoden13.
- Forbered aliquots av ekstraktene, frys dem raskt i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
2. Glyserol gradient forberedelse
- Forbered to glyserolløsninger i buffer A, den ene inneholder 10% v / v og den andre inneholder 30% v / v glyserol.
- Tilsett krysskoblingsmiddelet glutaraldehyd til 0,1% v/ v i 30% v / v glyseroloppløsningen og bland for å homogenisere.
FORSIKTIG: Håndter glutaraldehyd inne i avtrekkshetten ved hjelp av egnet sikkerhetsutstyr. - Tilsett 6 ml av den kalde 10 % v/v glyseroloppløsningen nederst på 12 ml sentrifugerøret (14 x 89 mm).
- Tilsett 6 ml av den kalde 30 % v/v glyseroloppløsningen supplert med glutaraldehyd med en sprøyte festet til en lang nål som følger med Gradient Master-enheten nederst på røret, like under 10 % v/v glyseroloppløsningen.
MERK: Alternativt kan 10% v/ v glyseroloppløsningen forsiktig pipetteres på toppen av 30% v / v glyserol / glutaraldehydoppløsningen. - Bruk Graderingsmal-enheten til å generere en kontinuerlig tetthetsgradient.
MERK: I Gradient Master-enheten plasseres rørene i et passende stativ og roteres kort, etter produsentens anbefalinger for å bestemme parametrene (tid / vinkel / hastighet). I dette arbeidet brukte vi: 2:25 min/81.5°/11 rpm. - Tilsett forsiktig 200 μL av en 7% v / v glyserol / buffer En pute på toppen like før tilsetningen av celleekstraktene.
MERK: Glyserolkonsentrasjonen av puten må være lavere enn den mindre konsentrerte glyseroloppløsningen som brukes til å skape den lineære gradienten.
3. Ekstrakter sentrifugering
- Last ca 2 mg totalt protein på toppen av hver 12 ml lineær glyserolgradient 10%-30% glutaraldehyd med pute.
- Plasser rørene i en forhåndskjølt svingbøtterotor.
MERK: Håndter rørene forsiktig for å unngå blanding før ultracentrifugation. - Sentrifuge ved 194 000 x g i 16 timer ved 4 °C.
- Aliquot hvert 12 ml rør i tjuefire 500 μL fraksjoner ved hjelp av et tilpasset EconoSystem eller ved forsiktig pipettering.
MERK: Et tilpasset EconoSystem består av en peristaltisk pumpe, UV-detektoren og brøksamleren som er koblet til rørperforeringsanordningen. Sedimenteringsprofilen kan overvåkes ved måling av absorbansen ved 280 nm. - Bruk en 40% v / v glyserolløsning gjennom den peristaltiske pumpen for å skyve glyserol 10% -30% gradient fra røret til brøksamleren.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar fraksjonene ved -80 °C til bruk. - Last 50 μL av hver brøkdel direkte på nitrocellulosemembraner på en prikkflekk eller sporflekkeenhet. Påvis protein ved immunoblot ved hjelp av antistoff mot CBP (1:6,000, for å oppdage CBP-delen av TAP-taggen) og antikanin IgG konjugert med pepperrot Peroxidase (1:15,000) som sekundært antistoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å analysere sedimenteringsprofilen til Cwc24-TAP og avgjøre om Grafix-metoden var effektiv for å stabilisere bindingen til skjøtende underkomplekser, separerte vi totale gjærekstrakter av celler som uttrykte Cwc24-TAP gjennom sentrifugering på glyserolgradienter, i nærvær eller fravær av glutaraldehyd som et krysskoblingsmiddel. Prøver av tjuefire 500 μL-fraksjoner ble deretter analysert av sporflekk med antistoff mot CBP-delen av TAP-taggen. Resultatene viser at i fravær av crosslinker er Cwc24 konsentrert mellom brøker 5 og 13 (Figur 1B), som tilsvarer komplekser på ca. 80 til 200 MDa14. I nærvær av krysskoblingen forskyves imidlertid plasseringen av Cwc24 på graderingen til brøker nederst i graderingen, tilsvarende større komplekser (figur 1). Disse resultatene indikerer at glutaraldehyd stabiliserer foreningen av Cwc24 med skjøtekomplekser.
For å fastslå om kompleksene som beholder Cwc24 tilsvarer Bact-komplekset, som dannes av snRNPs U2, U5 og U6 og NTC-komplekset, sammenlignet vi Cwc24 sedimentering med de av U5 snRNP-underenheten Prp8 og NTC-underenheten Prp19. Gjærstammer som uttrykte ett av disse proteinene smeltet sammen til TAP-merket ble utsatt for Grafix, Grafix. etterfulgt av dot blot for påvisning av proteiner. Disse tre skjøteosole subenhetene viste lignende profiler, sedimentering med større komplekser på bunnen av gradienten. Cwc24 er konsentrert i de samme fraksjonene, men fordi det forbinder forbigående med skjøteosomet, er det også til stede i de lettere fraksjonene (Figur 2). Kvantifisering av prikkene viser disse profilene (Figur 2B).
Interessant nok er fraksjoner 11 og 12 de der Prp8 og Prp19 begynner å konsentrere seg, noe som tyder på at dette er den delen av gradienten der Bact-komplekset begynner å sedimentere. For å fastslå at disse proteinene er bundet til komplekser i disse fraksjonene, ble aliquots av fraksjoner 11 og 12 utsatt for elektroforese på innfødte geler og deretter til vestlig blot. Signaler fra Prp8 og Prp19 vises som smør som knapt kommer inn i en 8% akrylamidgel, som viser at de faktisk er en del av store komplekser (Figur 3). Cwc24 er også til stede i brøkdel 12, men i mye lavere konsentrasjon, i samsvar med sin forbigående binding til Bact-komplekset. Disse resultatene viser at glutaraldehyd kan brukes som krysskobling for å stabilisere bindingen av forbigående faktorer til skjøting av underkomplekser.
Figur 1: Grafix har Cwc24 knyttet til større komplekser. Totalt gjærekstrakt av celler som uttrykker Cwc24-TAP ble skilt av sentrifugering på glyserolgradienter, enten i fravær eller tilstedeværelse av crosslinker glutaraldehyd. (A) Merkelige brøkdeler av gradienten ble utsatt for sporflekk for immunodeteksjonen av Cwc24-TAP med antistoff mot CBP-delen av TAP-koden. (B) Kvantifisering av Cwc24-TAP ved hjelp av bilde J viser konsentrasjonen av proteinet gjennom fraksjonene i glyserolgradienten. Tilstedeværelse eller fravær av glutaraldehyd er indikert. Y-aksen viser de relative mengdene Cwc24 gjennom graderingen, beregnet som intensiteten til signalet i brøkene, i forhold til den første brøken (Fn/F1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sedimentering av skjøtefaktorer gjennom glyserol/glutaraldehydgradienter. Ekstrakter av gjærceller som uttrykker enten Cwc24, Prp8 eller Prp19 smeltet sammen til TAP-koden, ble lastet på glyserolgradienter som inneholder glutaraldehyd og sentrifugert for separasjon av skjøtekomplekser. (A) Prøver av de tjuefire fraksjonene av gradienten ble analysert ved punktflekk og immunodeteksjon av TAP-smeltede proteiner med antistoff mot CBP-delen av TAP-taggen. (B) Kvantifisering av proteinene ved hjelp av bilde J viser konsentrasjonen ved de nederste fraksjonene av glyserol/glutaraldehydgradienten. Y-aksen viser de relative mengdene av proteinene gjennom gradienten, beregnet som intensiteten av signalet i brøkene, i forhold til den første brøkdelen som viser et signal over bakgrunnen (Fn/ F1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påvisning av skjøtekomplekser etter opprinnelig SIDE og immunoblot. Aliquots av fraksjoner 11 og 12 av gradienten vist i figur 2 ble skilt av elektroforese på 8% akrylamid innfødt gel og utsatt for immunoblot med antistoff mot CBP. Proteiner oppdages ikke som bånd fordi komplekser er for store til å skilles på innfødte geler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinprotein- og ribonukleinsyreproteininteraksjoner kan stabiliseres ved hjelp av krysskoblingsmidler. Det er viktig at det resulterende komplekset er stabilt for å tåle ultracentrifugation på glyserol gradient. I tillegg bør bufferbetingelsene tillate samhandlingen, men være strenge nok til å unngå ikke-spesifikk binding. I forsøkene som vises her, brukte vi en bufferløsning som allerede er etablert for in vitro skjøtereaksjoner15.
Hastigheten og tiden for sentrifugering bør optimaliseres for kompleksene som analyseres. Vi testet ulike sedimenteringsforhold, sentrifugeringsprøver ved 94 000 x g og 194 000 x g i 16 timer ved 4 °C, med lignende resultater. Disse kontrollene er viktige for å bestemme forholdene der kompleksene som analyseres, ikke utfelles.
Vi testet også forskjellige blotmetoder, pipettering direkte på membranen, ved hjelp av sporblod- eller prikkflekksystemer, som viste at prikkflekk ga mer reproduserbare resultater.
En stor begrensning ved bruk av glutaraldehyd som krysskobling er at krysskoblingen ikke kan tilbakestilles. Derfor kan proteiner ikke analyseres av immunoblot etter SDS-PAGE, men bare av innfødte geler eller prikkblod. Reversible krysskoblingsmidler, for eksempel formaldehyd, kan imidlertid også brukes.
Vi har tidligere brukt co-immunoprecipitation av proteiner for å identifisere skjøtekomplekser, men i tilfelle forbigående eller svake interaksjoner7, kan krysskobling hjelpe isolering av mellomliggende komplekser for senere bestemmelse av deres komponenter ved massespektrometri. Selv om vårt fokus her var skjøteosomet, kan denne metoden sikkert brukes til isolering av andre dynamiske prosesser som inkluderer mellomliggende komplekser med varierende sammensetninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et FAPESP-tilskudd (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J.
