Summary
Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), une centrifugation de gradient de glycérol en présence d’un réticulateur, pour identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe d’épissage.
Abstract
L’épissage pré-ARNm est un processus très dynamique qui implique de nombreux réarrangements moléculaires des sous-complexes spliceosomes lors de l’assemblage, du traitement de l’ARN et de la libération des composants complexes. La centrifugation du gradient de glycérol a été utilisée pour la séparation de complexes protéiques ou RNP (RiboNucleoProtein) pour des études fonctionnelles et structurelles. Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), qui a d’abord été développé pour purifier et stabiliser les complexes macromoléculaires pour la cryo-microscopie électronique à particule unique, afin d’identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe spliceosome. Cette méthode est basée sur la centrifugation d’échantillons en une concentration croissante d’un réactif de fixation pour stabiliser les complexes. Après centrifugation d’extraits totaux de levure chargés sur des gradients de glycérol, les fractions récupérées sont analysées par transfert de points pour l’identification des sous-complexes de spliceosomes et la détermination de la présence de facteurs d’épissage individuels.
Introduction
L’épissage est un processus très dynamique qui nécessite la liaison et la libération d’une multitude de facteurs de manière coordonnée. Ces facteurs d’épissage comprennent les protéines de liaison à l’ARN, les ATPases, les hélicases, les protéines kinases et les phosphatases, les ligas d’ubiquitine, entre autres1,2,3; et pour permettre aux réarrangements moléculaires d’avoir lieu, certains de ces facteurs se lient très transitoirement aux sous-complexes spliceosomes, ce qui rend l’isolement et l’identification de ces complexes intermédiaires RNP très difficiles.
Ici, nous avons utilisé la méthode Grafix4,5 pour stabiliser l’interaction du facteur d’épissage de levure Cwc24 avec le complexed’acte B6 afin de permettre l’identification d’autres facteurs liés concomitamment à ce sous-complexe et de déterminer si l’ubiquitine ligase Prp19 joue un rôle dans la liaison ou la libération de Cwc24 au complexe Nineteen (NTC) et à l’extrémité 5' de l’intron avant l’activation et la première réaction de transestérification prend lieu. L’avantage d’exposer les macromolécules à une concentration croissante du réticulant le long du gradient de glycérol est qu’il évite les réticulations inter-complexes4,5, et donc, la formation d’agrégats.
Cette méthode a été utilisée en complément de la coimmunoprécipitation des protéines et des essais de traction vers le bas, qui, bien que permettant l’isolement de grands complexes, peuvent ne pas être fiables pour maintenir les interactions transitoires au sein de grands complexes dynamiques7,8. L’utilisation de réactifs de fixation dans le gradient de glycérol stabilise la liaison de ces facteurs, permettant la confirmation des interactions de protéines spécifiques avec des sous-complexes d’épissage. Parce que le réticulateur choisi était chimiquement irréversible, les protéines présentes dans les fractions récupérées ont été analysées par transfert de points après la centrifugation du gradient.
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Protocol
1. Préparation de l’extrait total de levure
- Cultiver les cellules de levure exprimant l’un des facteurs d’épissage fusionnés à la balise TAP9 dans un milieu YNB-glu de 1 L (base d’azote de levure complétée par 2% m/v de glucose) avec les acides aminés ou les bases nucléiques appropriés, dans ce cas, l’adénine (20 μg/mL), la leucine (30 μg/mL), le tryptophane (30 μg/mL), jusqu’à OD600 = 1,0.
- Prélever les cellules de la culture 1 L en centrifugant dans trois flacons de centrifugeuse de 500 mL à 17 000 x g pendant 10 min à 4 °C et laver deux fois avec 10 mL d’eau stérile froide.
- Resuspendez les cellules de levure collectées dans 1/10 du volume cellulaire du tampon froid A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L-1 MgCl2,50 mmol L-1 KCl, 5% v / v glycérol, 0,5 mmol L-1 DTT, cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA).
- Congeler de petites gouttes de suspension cellulaire dans de l’azote liquide. Les petites gouttes peuvent être obtenues en pipetant la solution cellulaire remise enssantée et en laissant tomber 50 μL directement dans l’azote liquide.
ATTENTION : L’azote liquide peut causer des blessures au contact de la peau ou des yeux. Manipuler à l’aide d’un équipement de sécurité approprié.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les gouttes congelées de suspension cellulaire peuvent être conservées à -80 °C. - Préparer les lysates des cellules de levure en les broyant dans un appareil de broyage à billes pendant six cycles à 20 Hz / s pendant 3 min.
REMARQUE: Après chaque cycle, immergez le récipient abritant les cellules congelées dans de l’azote liquide pour éviter de fondre. Le protocole peut être mis en pause ici. Les extraits congelés peuvent être conservés à -80 °C. Les extraits d’épissage de levure peuvent également être préparés à l’aide d’homogénéisateurs pour lyser les sphéroplastes10, ou à l’aide de mortier et de pilon11,12. - Faire fondre l’extrait en plaçant les tubes qui les contiennent dans de l’eau à température ambiante, en agitant de temps en temps.
- Extraits de centrifugeuse à 45 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
- Quantifier la teneur en protéines du surnageant éliminé par la méthode BCA13.
- Préparer les aliquotes des extraits, les congeler rapidement dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Préparation du gradient de glycérol
- Préparer deux solutions de glycérol dans le tampon A, l’une contenant 10% v/v et l’autre contenant 30% v/v de glycérol.
- Ajouter l’agent de réticulation glutaraldéhyde à 0,1 % v/v dans la solution de glycérol à 30 % v/v et mélanger pour homogénéiser.
ATTENTION : Manipulez le glutaraldéhyde à l’intérieur de la hotte à l’aide de l’équipement de sécurité approprié. - Ajouter 6 mL de la solution froide de glycérol à 10 % v/v au fond du tube centrifuge de 12 mL (14 x 89 mm).
- Ajouter 6 mL de la solution froide de glycérol à 30 % v/v complétée par du glutaraldéhyde avec une seringue attachée à une longue aiguille fournie avec le dispositif Gradient Master au fond du tube, juste en dessous de la solution de glycérol à 10 % v/v.
REMARQUE: Alternativement, la solution de glycérol à 10% v / v peut être soigneusement pipetée sur le dessus de la solution de glycérol / glutaraldéhyde à 30% v / v. - Utilisez le dispositif Gradient Master pour générer un gradient de densité continu.
REMARQUE: Dans le dispositif Gradient Master, les tubes sont placés dans un rack approprié et pivotés brièvement, conformément aux recommandations du fabricant pour déterminer les paramètres (temps / angle / vitesse). Dans ce travail, nous avons utilisé: 2:25 min / 81.5 ° / 11 tr / min. - Ajouter soigneusement 200 μL d’un coussin de glycérol/tampon A à 7 % v/v sur le dessus juste avant l’ajout des extraits cellulaires.
REMARQUE: La concentration de glycérol du coussin doit être inférieure à la solution de glycérol moins concentrée utilisée pour créer le gradient linéaire.
3. Extraits centrifugation
- Chargez environ 2 mg de protéines totales sur le dessus de chaque gradient linéaire de glycérol de 12 mL à 10% de glutaraldéhyde avec coussin.
- Placez les tubes dans un rotor à godet oscillant pré-refroidi.
REMARQUE: Manipulez les tubes doucement pour éviter de mélanger avant l’ultracentrifugation. - Centrifuger à 194 000 x g pendant 16 h à 4 °C.
- Aliquoter chaque tube de 12 mL en vingt-quatre fractions de 500 μL à l’aide d’un EconoSystem adapté ou en pipetant soigneusement.
REMARQUE: Un EconoSystem adapté se compose d’une pompe péristaltique, du détecteur UV et du collecteur de fraction connecté au dispositif de perforation de tubes. Le profil de sédimentation peut être surveillé par la mesure de l’absorbance à 280 nm. - Utilisez une solution de glycérol à 40 % v/v à travers la pompe péristaltique pour pousser le gradient de glycérol de 10 % à 30 % du tube au collecteur de fractions.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les fractions à -80 °C jusqu’à utilisation. - Chargez 50 μL de chaque fraction directement sur des membranes de nitrocellulose sur un dispositif de transfert de points ou de fente. Détecter la protéine par immunoblot en utilisant un anticorps contre le CBP (1:6 000, pour détecter la partie CBP de la balise TAP) et des IgG anti-lapin conjuguées avec la peroxydase de raifort (1:15 000) comme anticorps secondaire.
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Representative Results
Pour analyser le profil de sédimentation de Cwc24-TAP et déterminer si la méthode Grafix était efficace pour stabiliser sa liaison aux sous-complexes d’épissage, nous avons séparé des extraits de levure totaux de cellules exprimant Cwc24-TAP par centrifugation sur des gradients de glycérol, en présence ou en l’absence de glutaraldéhyde comme agent de réticulation. Des échantillons de vingt-quatre fractions de 500 μL ont ensuite été analysés par transfert de fente avec anticorps contre la partie CBP de l’étiquette TAP. Les résultats montrent qu’en l’absence du réticulateur, Cwc24 est concentré entre les fractions 5 et 13(Figure 1B),correspondant à des complexes d’environ 80 à 200 MDa14. En présence du réticulateur, cependant, la position de Cwc24 sur le gradient est décalée en fractions au bas du gradient, correspondant à des complexes plus grands (Figure 1). Ces résultats indiquent que le glutaraldéhyde stabilise l’association de Cwc24 avec des complexes d’épissage.
Afin d’établir si les complexes retenant Cwc24 correspondent au complexe bact, qui est formé par les snRNPs U2, U5 et U6 et le complexe NTC, nous avons comparé la sédimentation de Cwc24 à celles de la sous-unité U5 snRNP Prp8 et de la sous-unité NTC Prp19. Des souches de levure exprimant l’une ou l’autre de ces protéines fusionnées à la balise TAP ont été soumises à Grafix, suivi d’un dot blot pour la détection des protéines. Ces trois sous-unités spliceosomes présentaient des profils similaires, sédimentant avec des complexes plus grands au bas du gradient. Cwc24 est concentré dans les mêmes fractions, mais comme il s’associe transitoirement au spliceosome, il est également présent dans les fractions plus légères (Figure 2). La quantification des points montre ces profils (Figure 2B).
Fait intéressant, les fractions 11 et 12 sont celles où Prp8 et Prp19 commencent à se concentrer, ce qui suggère que c’est la partie du gradient où le complexe de Bact commence à sédimenter. Pour vérifier que ces protéines sont liées à des complexes dans ces fractions, des aliquotes de fractions 11 et 12 ont été soumises à l’électrophorèse sur des gels natifs et par la suite à un transfert western. Les signaux de Prp8 et Prp19 apparaissent sous forme de frottis qui pénètrent à peine dans un gel d’acrylamide à 8%, montrant qu’ils font en effet partie de grands complexes (Figure 3). Cwc24 est également présent dans la fraction 12, mais en concentration beaucoup plus faible, ce qui correspond à sa liaison transitoire au complexe de Bact. Ces résultats montrent que le glutaraldéhyde peut être utilisé comme réticulateur pour stabiliser la liaison des facteurs transitoires aux sous-complexes d’épissage.
Figure 1 : Grafix tient Cwc24 associé à des complexes plus grands. L’extrait total de levure des cellules exprimant Cwc24-TAP a été séparé par centrifugation sur des gradients de glycérol, en l’absence ou en présence du réticulateur glutaraldéhyde. (A) Des fractions impaires du gradient ont été soumises à un transfert de fente pour l’immunodétection de Cwc24-TAP avec anticorps contre la partie CBP de l’étiquette TAP. (B) La quantification de Cwc24-TAP à l’aide de l’image J montre la concentration de la protéine à travers les fractions du gradient glycérol. La présence ou l’absence de glutaraldéhyde est indiquée. L’axe Y montre les quantités relatives de Cwc24 à travers le gradient, calculées comme l’intensité du signal dans les fractions, par rapport à la première fraction (Fn/ F1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sédimentation des facteurs d’épissage par gradients glycérol/glutaraldéhyde. Des extraits de cellules de levure exprimant Cwc24, Prp8 ou Prp19 fusionnés à l’étiquette TAP ont été chargés sur des gradients de glycérol contenant du glutaraldéhyde et centrifugés pour la séparation des complexes d’épissage. (A) Des échantillons des vingt-quatre fractions du gradient ont été analysés par transfert de points et immunodétection des protéines fusionnées TAP avec des anticorps contre la partie CBP de l’étiquette TAP. (B) La quantification des protéines à l’aide de l’image J montre leur concentration aux fractions inférieures du gradient glycérol/glutaraldéhyde. L’axe Y montre les quantités relatives de protéines à travers le gradient, calculées comme l’intensité du signal dans les fractions, par rapport à la première fraction montrant un signal au-dessus de l’arrière-plan (Fn/ F1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détection des complexes d’épissage par PAGE natif et immunoblot. Les aliquotes des fractions 11 et 12 du gradient illustré à la figure 2 ont été séparées par électrophorèse sur gel natif d’acrylamide à 8 % et soumises à un immunoblot avec anticorps contre le CBP. Les protéines ne sont pas détectées sous forme de bandes car les complexes sont trop grands pour être séparés sur des gels natifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les interactions protéine-protéine et acides ribonucléiques-protéines peuvent être stabilisées à l’aide d’agents de réticulation. Il est important que le complexe résultant soit stable pour résister à l’ultracentrifugation sur le gradient de glycérol. De plus, les conditions de tampon doivent permettre l’interaction, mais être suffisamment strictes pour éviter une liaison non spécifique. Dans les expériences présentées ici, nous avons utilisé une solution tampon déjà établie pour les réactions d’épissage in vitro15.
La vitesse et le temps de centrifugation doivent être optimisés pour les complexes analysés. Nous avons testé différentes conditions de sédimentation, des échantillons de centrifugation à 94 000 x g et 194 000 x g pendant 16 h à 4 °C, avec des résultats similaires. Ces contrôles sont importants pour déterminer les conditions dans lesquelles les complexes analysés ne précipitent pas.
Nous avons également testé différentes méthodes de transfert, pipettage directement sur la membrane, en utilisant des systèmes de transfert à fente ou de tache à points, ce qui a montré que le transfert de points donnait des résultats plus reproductibles.
Une limitation majeure de l’utilisation du glutaraldéhyde comme réticulateur est que la réticulation ne peut pas être inversée. Par conséquent, les protéines ne peuvent pas être analysées par immunoblot après SDS-PAGE, mais seulement par gels natifs ou par transfert de points. Cependant, des agents réticuventibles, tels que le formaldéhyde, pourraient également être utilisés.
Nous avons déjà utilisé la co-immunoprécipitation des protéines pour identifier les complexes d’épissage, mais dans le cas d’interactions transitoires ou faibles7,la réticulation peut aider à isoler les complexes intermédiaires pour une détermination ultérieure de leurs composants par spectrométrie de masse. Bien que nous nous concentrions ici sur le spliceosome, cette méthode peut certainement être utilisée pour l’isolement d’autres processus dynamiques qui incluent des complexes intermédiaires de compositions variables.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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