Summary
Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), una centrifugación de gradiente de glicerol en presencia de un ticulador, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas.
Abstract
El empalme pre-ARNm es un proceso muy dinámico que implica muchos reordenamientos moleculares de los subcomplejos del espliceosoma durante el ensamblaje, el procesamiento del ARN y la liberación de los componentes complejos. La centrifugación por gradiente de glicerol se ha utilizado para la separación de complejos de proteínas o RNP (RiboNucleoProtein) para estudios funcionales y estructurales. Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), que se desarrolló por primera vez para purificar y estabilizar complejos macromoleculares para microscopía crio-electrónica de partículas individuales, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas. Este método se basa en la centrifugación de muestras en una concentración creciente de un reactivo de fijación para estabilizar complejos. Después de la centrifugación de los extractos totales de levadura cargados en gradientes de glicerol, las fracciones recuperadas se analizan por punto blot para la identificación de los sub-complejos de espliceosomas y la determinación de la presencia de factores de empalme individuales.
Introduction
El empalme es un proceso altamente dinámico que requiere la unión y liberación de una multitud de factores de manera coordinada. Estos factores de empalme incluyen proteínas de unión a ARN, ATPasas, helicasas, proteínas quinasas y fosfatasas, ligasas de ubiquitina, entre otras1,2,3; y para permitir que se produzcan los reordenamientos moleculares, algunos de estos factores se unen muy transitoriamente a los subcomplejos del espliceosoma, lo que hace que el aislamiento y la identificación de estos complejos intermedios de RNP sean muy difíciles.
Aquí, utilizamos el método grafix4,5 para estabilizar la interacción del factor de empalme de levadura Cwc24 con el complejo deacto B6 para permitir la identificación de otros factores unidos concomitantemente a ese subcomplejo y determinar si la ubiquitina ligasa Prp19 juega algún papel en la unión o liberación de Cwc24 al complejo Nineteen (NTC) y al extremo 5' del intrón antes de la activación y la primera reacción de transesterificación toma lugar. La ventaja de exponer las macromoléculas a una concentración creciente del reticulador a lo largo del gradiente de glicerol es que evita los enlaces cruzados inter-complejos4,5y, por lo tanto, la formación de agregados.
Este método se utilizó como complemento a los ensayos de coinmunoprecipitación de proteínas y pull-down, que, a pesar de permitir el aislamiento de grandes complejos, pueden no ser confiables para mantener interacciones transitorias dentro de grandes complejos dinámicos7,8. El uso de reactivos de fijación en el gradiente de glicerol estabiliza la unión de dichos factores, permitiendo la confirmación de interacciones de proteínas específicas con subcomplejos de empalme. Debido a que el reticulador elegido era químicamente irreversible, las proteínas presentes en las fracciones recuperadas se analizaron mediante puntos secantes después de la centrifugación por gradiente.
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Protocol
1. Preparación de extracto total de levadura
- Cultivar las células de levadura expresando uno de los factores de empalme fusionados a la etiqueta TAP9 en medios 1 L YNB-glu (Base de Nitrógeno de Levadura suplementada con 2% m/v de glucosa) con los aminoácidos o bases nucleicas apropiadas, en este caso, adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptófano (30 μg/mL), hasta OD600 = 1.0.
- Recoger las células del cultivo de 1 L centrifugando en tres botellas centrífugas de 500 ml a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C y lavar dos veces con 10 ml de agua fría estéril.
- Resuspend las células de levadura recolectadas en 1/10 del volumen celular del tampón frío A (10 mmol L-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl2, 50 mmol L-1 KCl, 5% v / v glicerol, 0.5 mmol L-1 TDT, Cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA).
- Congelar pequeñas gotas de suspensión celular en nitrógeno líquido. Las pequeñas gotas se pueden obtener pipeteando la solución celular resuspendida y dejando caer 50 μL directamente en nitrógeno líquido.
PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar lesiones en contacto con la piel o los ojos. Manipule utilizando el equipo de seguridad apropiado.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las gotas congeladas de suspensión celular se pueden almacenar a -80 °C. - Prepare los lisados de las células de levadura moliendo en un dispositivo de molino de bolas a través de seis ciclos a 20 Hz / s durante 3 minutos.
NOTA: Después de cada ciclo, sumerja el recipiente que alberga las células congeladas en nitrógeno líquido para evitar que se derritan. El protocolo se puede pausar aquí. Los extractos congelados se pueden almacenar a -80 °C. Los extractos de empalme de levadura también se pueden preparar utilizando homogeneizadores para lisar esferoplastos10,o utilizando mortero y mortero11,12. - Derrita el extracto colocando los tubos que los contienen en agua a temperatura ambiente, agitando ocasionalmente.
- Extractos de centrífuga a 45.000 x g durante 1 h a 4 °C.
- Cuantificar el contenido proteico del sobrenadante despejado mediante el método BCA13.
- Preparar alícuotas de los extractos, congelarlos rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Preparación del gradiente de glicerol
- Prepare dos soluciones de glicerol en Buffer A, una que contenga 10% v/v y la otra que contenga 30% v/v glicerol.
- Añadir el agente glutaraldehído reticulante al 0,1% v/v en la solución de glicerol al 30% v/v y mezclar para homogeneizar.
PRECAUCIÓN: Manipule el glutaraldehído dentro de la campana de humos con el equipo de seguridad adecuado. - Añadir 6 ml de la solución fría de glicerol al 10% v/v en la parte inferior del tubo centrífugo de 12 ml (14 x 89 mm).
- Agregue 6 ml de la solución fría de glicerol al 30% v/ v suplementada con glutaraldehído con una jeringa conectada a una aguja larga provista con el dispositivo Gradient Master en la parte inferior del tubo, justo debajo de la solución de glicerol al 10% v / v.
NOTA: Alternativamente, la solución de glicerol al 10% v/v se puede pipetear cuidadosamente en la parte superior de la solución de glicerol/glutaraldehído al 30% v/v. - Utilice el dispositivo Maestro de degradado para generar un degradado de densidad continuo.
NOTA: En el dispositivo Gradient Master, los tubos se colocan en un bastidor apropiado y se giran brevemente, siguiendo las recomendaciones del fabricante para determinar los parámetros (tiempo/ángulo/velocidad). En este trabajo utilizamos: 2:25 min/81.5°/11 rpm. - Agregue cuidadosamente 200 μL de un cojín de glicerol / tampón al 7% v / v en la parte superior justo antes de la adición de los extractos celulares.
NOTA: La concentración de glicerol del cojín debe ser menor que la solución de glicerol menos concentrada utilizada para crear el gradiente lineal.
3. Extrae centrifugación
- Cargue aproximadamente 2 mg de proteína total en la parte superior de cada gradiente lineal de glicerol de 12 ml 10% a 30% de glutaraldehído con cojín.
- Coloque los tubos en un rotor de cucharón basculante preenfriado.
NOTA: Manipule los tubos suavemente para evitar mezclarlos antes de la ultracentrifugación. - Centrifugadora a 194.000 x g durante 16 h a 4 °C.
- Alícuota cada tubo de 12 ml en veinticuatro fracciones de 500 μL utilizando un EconoSystem adaptado o mediante pipeteo cuidadoso.
NOTA: Un EconoSystem adaptado consiste en una bomba peristáltica, el detector UV y el colector de fracción conectado al dispositivo de perforación del tubo. El perfil de sedimentación puede ser monitoreado mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. - Use una solución de glicerol al 40% v/v a través de la bomba peristáltica para empujar el gradiente de glicerol 10% -30% desde el tubo hasta el colector de fracción.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Conservar las fracciones a -80 °C hasta su uso. - Cargue 50 μL de cada fracción directamente sobre las membranas de nitrocelulosa en un dispositivo de blot de puntos o de ranura. Detectar proteína por inmunoblot usando anticuerpos contra CBP (1:6,000, para detectar la porción CBP de la etiqueta TAP) e IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:15,000) como anticuerpo secundario.
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Representative Results
Para analizar el perfil de sedimentación de Cwc24-TAP y determinar si el método Grafix fue efectivo para estabilizar su unión a subcomplejos de empalme, separamos extractos de levadura total de células que expresan Cwc24-TAP mediante centrifugación en gradientes de glicerol, en presencia o ausencia de glutaraldehído como agente de reticulación. Las muestras de veinticuatro fracciones de 500 μL se analizaron mediante ranura blot con anticuerpos contra la porción CBP de la etiqueta TAP. Los resultados muestran que en ausencia del reticulador, Cwc24 se concentra entre las fracciones 5 y 13(Figura 1B),correspondientes a complejos de aproximadamente 80 a 200 MDa14. En presencia del reticulador, sin embargo, la posición de Cwc24 en el gradiente se desplaza a fracciones en la parte inferior del gradiente, correspondientes a complejos más grandes (Figura 1). Estos resultados indican que el glutaraldehído estabiliza la asociación de Cwc24 con complejos de empalme.
Para establecer si los complejos que retienen Cwc24 corresponden al complejo bact, que está formado por snRNPs U2, U5 y U6 y el complejo NTC, comparamos la sedimentación Cwc24 con las de la subunidad U5 snRNP Prp8 y la subunidad NTC Prp19. Las cepas de levadura que expresan cualquiera de estas proteínas fusionadas con la etiqueta TAP se sometieron a Grafix, seguido de puntos blot para la detección de las proteínas. Estas tres subunidades de espliceosoma mostraron perfiles similares, sedimentándose con complejos más grandes en la parte inferior del gradiente. Cwc24 se concentra en las mismas fracciones, pero debido a que se asocia transitoriamente con el espliceosoma, también está presente en las fracciones más ligeras (Figura 2). La cuantificación de los puntos muestra estos perfiles (Figura 2B).
Curiosamente, las fracciones 11 y 12 son aquellas donde Prp8 y Prp19 comienzan a concentrarse, lo que sugiere que esta es la porción del gradiente donde el complejo de Bact comienza a sedimentarse. Para determinar que estas proteínas están unidas a complejos en estas fracciones, las alícuotas de las fracciones 11 y 12 fueron sometidas a electroforesis en geles nativos y posteriormente a western blot. Las señales de Prp8 y Prp19 aparecen como frotis que apenas entran en un gel de acrilamida al 8%, demostrando que efectivamente forman parte de grandes complejos(Figura 3). Cwc24 también está presente en la fracción 12, pero en una concentración mucho menor, consistente con su unión transitoria al complejo de Bact. Estos resultados muestran que el glutaraldehído se puede utilizar como un ticulador para estabilizar la unión de factores transitorios a los subcomplejos de empalme.
Figura 1: Grafix mantiene Cwc24 asociado a complejos más grandes. El extracto total de levadura de las células que expresan Cwc24-TAP se separó por centrifugación en gradientes de glicerol, ya sea en ausencia o presencia del glutaraldehído glutaraldehído antiinflamatorio. (A) Las fracciones impares del gradiente fueron sometidas a ranuras para la inmunodetección de Cwc24-TAP con anticuerpos contra la porción CBP de la etiqueta TAP. (B) La cuantificación de Cwc24-TAP utilizando la Imagen J muestra la concentración de la proteína a través de las fracciones del gradiente de glicerol. Se indica presencia o ausencia de glutaraldehído. El eje Y muestra las cantidades relativas de Cwc24 a través del gradiente, calculadas como la intensidad de la señal en las fracciones, en relación con la primera fracción (Fn/ F1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sedimentación de factores de empalme a través de gradientes de glicerol/glutaraldehído. Los extractos de células de levadura que expresan Cwc24, Prp8 o Prp19 fusionados a la etiqueta TAP se cargaron en gradientes de glicerol que contenían glutaraldehído y se centrifugaron para la separación de complejos de empalme. (A)Las muestras de las veinticuatro fracciones del gradiente se analizaron mediante blot de puntos e inmunodetección de las proteínas fusionadas con TAP con anticuerpos contra la porción CBP de la etiqueta TAP. (B) La cuantificación de las proteínas utilizando la Imagen J muestra su concentración en las fracciones inferiores del gradiente glicerol/glutaraldehído. El eje Y muestra las cantidades relativas de las proteínas a través del gradiente, calculadas como la intensidad de la señal en las fracciones, en relación con la primera fracción que muestra una señal sobre el fondo (Fn/ F1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Detección de complejos de empalme por PAGE nativo e immunoblot. Las alícuotas de las fracciones 11 y 12 del gradiente mostrado en la Figura 2 fueron separadas por electroforesis en gel nativo de acrilamida al 8% y sometidas a inmunoblot con anticuerpos contra CBP. Las proteínas no se detectan como bandas porque los complejos son demasiado grandes para separarse en geles nativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las interacciones proteína-proteína y ácidos ribonucleicos-proteína se pueden estabilizar utilizando agentes ticuladores. Es importante que el complejo resultante sea estable para soportar la ultracentrifugación en el gradiente de glicerol. Además, las condiciones del búfer deben permitir la interacción, pero ser lo suficientemente estrictas como para evitar la unión no específica. En los experimentos aquí mostrados, utilizamos una solución tampón ya establecida para reacciones de empalme in vitro15.
La velocidad y el tiempo de centrifugación deben optimizarse para los complejos que se analizan. Probamos diferentes condiciones de sedimentación, centrifugando muestras a 94.000 x g y 194.000 x g durante 16 h a 4 °C, con resultados similares. Estos controles son importantes para determinar las condiciones en las que los complejos que se analizan no precipitan.
También probamos diferentes métodos de blot, pipeteando directamente sobre la membrana, utilizando sistemas slot blot o dot blot, que mostraron que dot blot daba resultados más reproducibles.
Una limitación importante del uso de glutaraldehído como glutaldehído como ticulador es que el enlace cruzado no se puede revertir. Por lo tanto, las proteínas no pueden ser analizadas por immunoblot después de SDS-PAGE, sino solo por geles nativos o puntos blot. Sin embargo, los agentes de reticulación reversibles, como el formaldehído, también podrían utilizarse.
Anteriormente hemos utilizado la coinmunoprecipitación de proteínas para identificar complejos de empalme, pero en el caso de interacciones transitorias o débiles7,la reticulación puede ayudar al aislamiento de complejos intermedios para la posterior determinación de sus componentes por espectrometría de masas. Aunque nuestro enfoque aquí fue el espliceosoma, este método ciertamente se puede usar para el aislamiento de otros procesos dinámicos que incluyen complejos intermedios con composiciones variables.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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