Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

نقل الطاقة الفلوري جزيء واحد هو الأسلوب الذي يتتبع ديناميات الحمض النووي الريبي أثناء تخليق البروتين ريبوسومات. من خلال تتبع الريبوسومات الفردية ، يتم تحديد السكان غير المتجانسين ، مما يلقي الضوء على الآليات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع التغيرات البيولوجية تشكيلية بشكل عام للكشف عن العلاقات الحيوية وظيفة في العديد من النظم الحيوية المعقدة الأخرى. يمكن لطرق جزيء واحد مراقبة الخطوات المقيدة غير المعدلة والمتوسطات الرئيسية منخفضة السكان ، والتي لا يمكن الوصول إليها عن طريق طرق الفرقة التقليدية بسبب متوسط التأثير.

Abstract

الريبوسوم هو مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يجمع البروتينات بشكل عملي على طول قوالب الحمض النووي الريبي. قطر الريبوسوم هو ما يقرب من 20 نانومتر لاستيعاب ركائز الحمض النووي الريبي كبيرة في A-, P- و E-المواقع. وبالتالي، فإن ديناميات الريبوسوم هي بطبيعة الحال دي التدريجي بسرعة. يمكن لطريقة جزيء واحد الكشف عن كل ريبوسوم بشكل منفصل وتمييز المجموعات السكانية غير الذاتية ، وهو أمر ضروري للكشف عن الآليات المعقدة للأنظمة متعددة المكونات. نحن تقرير تفاصيل طريقة smFRET على أساس المجهر نيكون Ti2 مقلوب للتحقيق في ديناميات ريبوسوم بين البروتين الريبوسوم L27 وTRNAs. وصفت L27 في موقفها الفريد Cys 53 وإعادة تشكيلها في ريبوسوم التي تم تصميمها لعدم وجود L27. وتوصف TRNA في منطقة الكوع. كما ينتقل tRNA إلى مواقع مختلفة داخل ريبوسوم خلال دورة الاستطالة، مثل ما قبل وبعد النقل، والكفاءة FRET وديناميات تظهر الاختلافات، والتي اقترحت عدد السكان الفرعي متعددة. هذه الخلايا الفرعية غير قابلة للكشف عن طريق أساليب الفرقة. تم بناء مجهر SMFRET القائم على TIRF على مجهر مقلوب يدوي أو آلي ، مع إضاءة ليزر منزلية الصنع. يتم تنقية عينات الريبوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ، وتحميلها في خلية عينة متعددة القنوات منزلية الصنع ثم تضيء عبر حقل ليزر مبشر. يمكن استخدام بقعة الليزر انعكاس لتحقيق التحكم في ردود الفعل من التركيز المثالي. يتم فصل إشارات الفلورسينس بواسطة برج فلتر مزود بمحرك ويتم جمعها بواسطة كاميرتين رقميتين من CMOS. يتم استرداد الكثافات عبر برنامج NIS-Elements.

Introduction

الريبوسوم هو ø 20 نانومتر مجمع ريبونوكليوبروتين كبير من وحدة فرعية كبيرة (50S) وصغيرة (30S). فإنه يجمع الببتيدات طويلة على طول قالب مرنا بشكل عملي وتعاوني. يرتبط ريبوسوم 30S إلى fMet-tRNAfMet و mRNA لبدء تخليق البروتين ، ثم ينضم 50S لتشكيل مجمع بدء 70S. الأحماض الأمينية جلب الحمض النووي الريبي إلى ريبوسوم في موقع A (أمينواسيل- TRNA موقع ملزم), في حين يتم عقد سلسلة بيبتيديل ممدود في موقع P (peptidyl- tRNA موقع ملزم). في مجمع ما قبل النقل ، يتم نقل سلسلة بيبتيديل إلى الحمض النووي الريبي في الموقع A مع إضافة حمض أميني واحد. وفي الوقت نفسه، فإن موقع P TRNA هو deacylated. ثم تنتقل ال A-، P-tRNAs إلى مواقع P-، E- لتشكيل مجمع ما بعد النقل، حيث يمثل الموقع الإلكتروني موقع خروج الحمض النووي الريبي. في هذه الحالة، ينتقل peptidyl-tRNA مرة أخرى إلى موقع P. تستمر دورة الاستطالة بين ما قبل وبعد الامتثال في حين أن الريبوسوم translocates على مرنا، codon واحد في وقتواحد 1. ريبوسوم هو تنسيقية للغاية من مواقع وظيفية مختلفة لجعل هذه العملية فعالة ودقيقة، مثل بين وحدة فرعية ratcheting2، tRNA تقلبات التهجين3،GTPase التنشيط4،L1 ساق فتح إغلاق5،الخ. وبالتالي، ريبوسومات بسرعة دي المرحلة لأن كل جزيء يتحرك في وتيرتها الخاصة. يمكن للأساليب التقليدية أن تستنتج فقط متوسط المعلمات الواضحة ، ولكن سيتم إخفاء الأنواع منخفضة السكان أو قصيرة الأجل في متوسط التأثير6. يمكن أن تؤدي طريقة جزيء واحد إلى كسر هذا القيد عن طريق الكشف عن كل ريبوسوم على حدة ، ثم تحديد أنواع مختلفة عن طريق إعادة الإعمارالإحصائية 7. وقد تم تنفيذ مواقع وضع العلامات المختلفة للتحقيق ديناميات ريبوسوم، مثل التفاعلات بين tRNA-tRNA8،EF-G-L119،L1-tRNA10،الخ. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال وضع العلامات على الوحدات الفرعية الكبيرة والصغيرة ، على التوالي ، لوحظت الحركيات التسعيدية بين الوحدات والتنسيق مع العوامل11،12. وفي الوقت نفسه، فإن أسلوب smFRET له تطبيقات واسعة في العمليات البيولوجية المركزية الأخرى، وأساليب FRET متعددة الألوان آخذة في الظهور13.

سابقا تم تطوير زوج فريت ريبوسوم رواية14,15. وقد أعرب عن البروتين الريبوسومي المؤتلف L27، وتنقيته، ووصفت، وأدرجت مرة أخرى في الريبوسوم. تفاعل هذا البروتين مع الحمض النووي الريبي على مسافة قريبة وساعد على استقرار الحمض النووي الريبي P-الموقع في مجمع ما بعد النقل. عندما انتقل TRNA من A- إلى P-الموقع، يتم تقصير المسافة بين هذا البروتين والجيش الملكي النيبالي، والتي يمكن تمييزها من قبل إشارة smFRET. وقد تم تحديد التجمعات السكانية الفرعية الريبوسوم متعددة باستخدام الأساليب الإحصائية و mutagenesis، وتبادل عفوية من هذه المجموعات السكانية في مجمع ما قبل ولكن ليس بعد نقل يوحي ريبوسوم هو أكثر مرونة قبل التحرك على مرنا، وأكثر صلابة خلال فك16،17،18. هذه الاختلافات ضرورية لوظيفة ريبوسوم. هنا ، يصف البروتوكول تفاصيل الريبوسوم / tRNA - وضع العلامات ، ودمجها في إعداد عينة ريبوسوم ، smFRET ، والحصول على البيانات / تحليل19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الريبوسوم المسمى و TRNA للكشف عن FRET

  1. عزل الريبوسوم دون L27 من E. القولونية سلالة IW312 وفقا للبروتوكولات القياسية20،21. استخراج الريبوسوم العادية من سلالة الإشريكية القولونية MRE600.
  2. استنساخ الجين L27 دورة في الدقيقة مع C-المحطة له الوسم في pET-21b (+) البلازميد، والتي يتم تحويلها وأعرب عنها في BL21 (DE3) خلايا pLysS15. تنقية البروتين عن طريق عمود سيفاروز معبأة مسبقا.
  3. وضع العلامات على L27
    1. احتضان 20-100 ميكرومتر من L27 المنقى في 100 ميكرولتر مع 2-10 أضعاف الزائدة من TCEP (تريس-2-كاربوكسيثيل-فوسفين) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة. المخزن المؤقت تبادل الحل في المخزن المؤقت PBS (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 2.7 m M KCl; 0.137 M NaCl), باستخدام عمود nap-5. إضافة 10 أضعاف الزائدة Cy5-maleimide أحادية التفاعلية صبغة في DMSO في الحل واحتضان في RT في الظلام لمدة 2 ساعة.
    2. تحميل محلول البروتين المسمى (500 ميكرولتر) المذكور أعلاه على عمود Nap-5 لإزالة الصبغة الزائدة. تأكد من أن البروتين elutes في الفرقة الملونة الأولى، تليها elute صبغة الحرة في الفرقة الثانية، على التوالي. جمع البروتين eluted في 1 مل من تام10 العازلة (20 mM تريس-HCl (pH 7.5), 10 mM ملغ (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 M M KCl, 0.5 mM EDTA, و 7 M BME (2-mercaptoethanol)).
  4. إعادة تشكيل الريبوسوم مع L27. اخلطي بروتين L27 المسمى مع كمية متساوية من الريبوسوم IW312 في مخزن TAM10 المؤقت واحتضنيه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إزالة البروتين الحر عن طريق وسادة السكروز الطرد الفائق (100،000 × ز، بين عشية وضحاها) للسماح للريبوسوم لتشكيل بيليه زرقاء اللون في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. تسميةTRNA Phe وفقا لتقرير نشر سابقا22. أولا، احتضان tRNA (10 A260 في 1 مل من الماء) مع 100 ميكرولتر من NaBH4 (100 متر مخزون، إضافة دروبوايز) في 0 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تحرير tRNAs من NaBH4 غير منقحة عن طريق هطول الأمطار الإيثانول ثلاث مرات بإضافة حجم 1/10 من 3 M KAc (pH 5.0) وحجم 2.5x من الإيثانول. احتضان انخفاض الحمض النووي الريبي مع 1 ميكرولتر من محلول صبغ Cy3-NHS (1 ملغ في 10 ميكرولتر من DMSO) في الحد الأدنى لحجم (~ 20 ميكرولتر) من 0.1 م الصوديوم formate (درجة الحموضة 3.7). بعد 2 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، افصل الحمض النووي الريبي عن الصبغة غير المتفاعلة عبر عمود G25 Sephadex صغير، ثم قم بإزالة الصبغة الحرة عن طريق هطول الأمطار للإيثانول مرتين.

2. إعداد المجمعات الريبوسومية

  1. التعبير عن وتنقية البروتينات له الموسومة من IF1، IF2، IF3، EF-G، EF-Tu، EF-TS، وsyntases TRNA باستخدام الأساليب القياسية15.
  2. إعداد مزيج بدء بإضافة المكونات التالية في المخزن المؤقت TAM10 في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة: 1 ميكرومتر من ريبوسوم المسمى; 1.5 ميكرومتر لكل من IF1 و IF2 و IF3؛ 2 ميكرومتر من الحمض النووي الريبي البيوتيني (ترميز MF لأول اثنين من الأحماض الأمينية)؛ 4 ميكرومتر من fMet-tRNAfMetالمشحونة؛ و 1 م م جيجابايت.
  3. إعداد مزيج EF-Tu_G عن طريق خلط المكونات التالية في المخزن المؤقت TAM10 في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة: 4 ميكرومتر EF-Tu، 0.4 ميكرومتر EF-Ts، 2 ميكرومتر EF-G، 4 MM GTP، 4 MM PEP، و 0.02 ملغم / مل من بيروفات كيناز.
  4. قم بإعداد مزيج TU_NOG EF مشابه للخطوة 2.3 بدون EF-G.
  5. إعداد مزيج Phe عن طريق خلط المكونات التالية في المياه الخالية من النيوكليز في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة: 100 متر ثلاثي (درجة الحموضة 7.5)، 20 mM MgAc2، 1 MM EDTA, 4 M ATP, 7 M M BME, 2 m M Phenylalanine محددة synthetase, 2 A260/mL من TRNAPheالمسمى , و 50 ميكرومتر فينيلالاناين.
  6. إعداد مجمع ما قبل النقل (PRE) عن طريق خلط بدء، EF-Tu_NoG، ويمزج Phe في نسبة 1:2:2، في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد الحضانة، تنقية PRE من قبل 1.1 M السكروز وسادة الطرد المركزي الفائق بين عشية وضحاها في 100،000 × ز.
  7. إعداد مجمع ما بعد النقل (POST) عن طريق خلط بدء، EF-Tu_WG، ويمزج Phe في نسبة 1:2:2، في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. بعد الحضانة، تنقية POST من قبل 1.1 M السكروز وسادة الطرد المركزي الفائق بين عشية وضحاها في 100،000 × ز.

3. إعداد الشرائح عينة

  1. تنظيف الشرائح الزجاجية المجهر (75 ملم × 25 ملم) التي تحتوي على ستة أزواج من الثقوب (1 ملم في القطر). كل زوج يشكل مدخل منفذ لغرفة العينة. تأكد من أن المسافة بين كل فتحة مدخل منفذ هي 13 ملم والمسافة من مركز إلى مركز بين قناتين هي 6 ملم. ضع ست شرائح في بوتقة زجاجية.
  2. ملء بوتقة مع الأسيتون وسونيكاتي لهم لمدة 5 دقائق. decant الأسيتون وشطف الشرائح ثلاث مرات مع المياه فائقة البور. ملء بوتقة مرة أخرى بالماء و 1 مل من 10 M KOH. سونيكاتي لمدة 20 دقيقة.
  3. شطف الشرائح ثلاث مرات مع المياه فائقة البور. ملء بوتقة مرة أخرى مع الإيثانول وسونيكاتي لمدة 5 دقائق. تماما decant المذيبات. دع الشرائح تجف في غطاء الدخان.
  4. تنظيف الزجاج مجهر يغطي الأغطية (# 1.5 سمك، 24 × 40 ملم). تنفيذ خطوات التنظيف كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.3.
  5. خبز الشرائح وتنظيفها وأغطية في 300 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. الاحتفاظ بها في الفرن بين عشية وضحاها لتبرد.
  6. معطف غطاء مع أمينوسيلين. في بوتقة تحتوي على coverlips، صب في مزيج الميثانول (100 مل من الميثانول، 5 مل من الماء، 0.5 مل من HAc، و 1 مل من أمينوسيلين). تدفئة بوتقة في حمام مائي لمدة 10 دقائق، سونيكاتي لمدة 10 دقيقة، ومن ثم تدفئة بوتقة في حمام الماء لمدة 10 دقائق أخرى. Decant خليط الميثانول، شطف الغطاء جيدا في ثلاث بوتقات من المياه النظيفة. تطهير الأسطح مع تيار النيتروجين الجاف من خلال إبرة.
  7. معطف coverlips مع البيوتين-PEG في غطاء نظيف صفح.
    1. لجعل الحل PEG، استخدم 98 ملغ من PEG و 2-3 ملغ من البيوتين-PEG في 200 ميكرولتر من محلول NaHCO3 100 mM.
    2. وضع واحد coverlip شقة على سطح. إسقاط بعناية 60 ميكرولتر من محلول PEG على الحافة العلوية. ثم، وضع coverslip آخر على أعلى من ذلك، والسماح للتأثير الشعرية نشر الحل بين اثنين من coverlips. تأكد من عدم تشكيل فقاعات.
    3. كرر الخطوة 3.7.2 لزوجين آخرين من الأغطية. معطف ست قطع من الأغطية مع البيوتين. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من coverlips ، وضبط كمية PEG وPE TO PEG Biotin وفقا لذلك لجعل المزيد من حل PEG.
    4. تخزين هذه الأغطية في مربع تلميح فارغة مليئة بالماء واحتضان لمدة 3 ساعة في الظلام.
    5. بعد 3 ساعات، فصل الأغطية، وشطف بالماء في ثلاث بوتقات متتالية وتطهير مع تيار النيتروجين الجاف. ضع الأغطية المغلفة على رف خزفي. وضع علامة على السطح مع طلاء.
  8. تجميع غرف العينة19.
    1. سحب نصائح حادة ماصة من خلال الثقوب على الشرائح الزجاجية حتى تناسب ضيق. كشط ينتهي حاد قبالة حتى انها مسطحة تماما على السطح الزجاجي. قطع الطرف الآخر من طرف ليكون ما يقرب من 5 ملم لتحميل العينة.
    2. قص شريط مزدوج الوجه مع نمط القناة على ذلك (25 × 40 ملم).
    3. ضع الشريط ذو الوجهين على الشرائح الزجاجية على الجانب المسطح.
    4. ضع غطاء الأغطية المغلف على الشريط ذو الوجهين. اضغط عليه لجعل ختم ضيق من غرفة العينة. تأكد من أن الجانب المغلف يواجه الداخل.

4. جزيء واحد FRET التصوير

  1. قم بتشغيل الكمبيوتر.
  2. قم بتشغيل مفتاح المجهر.
  3. بدء تشغيل واجهة التحكم بالليزر، وبدوره على الليزر. اضغط على زر التمكين الموجود في مربع التحكم بالليزر لتسخين الليزر.
  4. تشغيل الكاميرات.
  5. بدء تشغيل برنامج المقترنة بالمجهر. انقر فوق الغالق العلوي إيقاف وانقر فوق المصباح تشغيل.
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت _WT TAM10بإضافة 10 ميكرولتر من 5٪ Tween-20 إلى 1 مل من المخزن المؤقت TAM10.
  7. إعداد محلول deoxy عن طريق وزن 3 ملغ من الجلوكوز أوكسيداز في أنبوب صغير microcentrifuge. أضف 45 ميكرولتر من الكاتالاسي. دوامة بلطف لإذابة الصلبة. تدور في 20،000 × ز في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة. خذ الناسخ الخارق
  8. إعداد محلول الجلوكوز 30٪ في الماء و200 mM Trolox الحل في DMSO.
  9. إعداد 0.5 ملغ / مل من محلول ستريبتافيدين في المياه الخالية من النيوكليز.
  10. أضف قطرة واحدة من زيت التصوير إلى هدف TIRF.
  11. ضع حجرات العينة على الهدف.
  12. ملء الغرفة مع 10 ميكرولتر من الحل ستريبتافيدين. انتظر دقيقة واحدة.
  13. اغسل الغرفة ب 30 مل من TAM10_WT العازلة واجمع محلول التشغيل بورق فلتر مطوي. انتظر دقيقة واحدة.
  14. تمييع المجمعات الريبوسومية (PRE أو POST) إلى تركيز 10-50 nM مع TAM10_WT العازلة.
  15. تحميل 20 ميكرولتر من عينة ريبوسوم في القناة. انتظر لمدة دقيقتين.
  16. جعل العازلة التصوير (50 ميكرولتر من تام10 العازلة بالإضافة إلى 0.5 ميكرولتر لكل من محلول ديوكسي، الجلوكوز، وترولوكس). خلط المخزن المؤقت جيدا.
  17. قم بمسح الغرفة ب 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير.
  18. تعيين الكاميرا للحصول على 100 مللي ثانية / الإطار، 16 بت، 4 × 4 binning.
  19. انقر فوق الغالق العلوي تشغيل والمصباح إيقاف.
  20. بدء اقتناء الكاميرا. نشر الصور في ثلاث نوافذ تمثل اثنين من الكاميرات الفردية وتراكب.
  21. انقر على التركيز التلقائي. ضبط دقيق للعثور على أفضل التركيز.
  22. انقر على طريقة. تعيين نقاط الحقل وتخزين الملفات ورقم الحلقة.
  23. انقر على تشغيل.
    ملاحظة: يظهر إطار جديد مع التصوير في الوقت الحقيقي. يتم عرض تقدم سلسلة الوقت وحقل عرض السلسلة في أعلى الإطار.
  24. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة، أغلق النافذة المنبثقة.
  25. فتح الملف ND (ملف المكتسبة).
  26. انقر على ROI / محرر عائد الاستثمار البسيط. اختر الخيار دائرة.
  27. حدد عائد الاستثمار على الصورة. انقر على إنهاء عند اكتماله.
  28. انقر على القياس / قياس الوقت لإظهار البيانات إما كمؤامرة أو كجداول بيانات.
  29. افتح علامة التبويب تصدير. تعيين معلمات التصدير.
  30. انقر على تصدير لحفظ كثافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان smFRET ريبوسوم المسمى في الموقف الأوسط من حركة المرور TRNA، لتمييز نقل TRNA من A- إلى P-الموقع (الشكل 1)15. المسافة من بقايا وضع العلامات L27 إلى TRNA A- أو P-الموقع هو 52 أو 61 ألف، على التوالي، المقابلة لكفاءة FRET من 0.47 و 0.65. بعد جمع الصور، تم استرجاع وشدات الفلورسينس من قنوات المانح والمقبل ورسمها كهفوات زمنية(الشكل 1). تم حساب كفاءة FRET من خلال الصيغة التي أقبلها/(أنامقبول+أناالمانحة). اكتشف برنامج محلي الصنع التبييض خطوة واحدة من المانح / المقبول وتركيب البيانات قبل نقاط التبييض لتجنب حساب FRET من الضوضاء. بعد تبييض المانحة، اقترب كلا أثر خط الأساس لأنه لا يمكن أن يحدث الإثارة مباشرة على المقبول(الشكل 2A). بعد تبييض المقبول ، زادت كثافة المتبرع لأن مسارات التفاعل الأقل تبدد طاقة الإثارة(الأرقام 2B ، C).

وتبين أن الريبوسومات الفردية تظهر تقلبات مختلفة، كما هو الحال في الأمثلة المبينة في الشكل 2. هذه التقلبات هي بسبب الحركة المتذبذبة من tRNAs، الذي يسبب تقلبات المسافة إلى L2717،18. في الشكل 2، تكون الخطوط المنقطة هي البيانات الأصلية ، والخطوط الصلبة هي البيانات المجهزة من البرنامج. لا تغير الآثار المجهزة قراءة البيانات الأولية ولكنها تقتطع آثار الفاصل الزمني بعد التبييض. الآثار الزرقاء هي الكفاءات FRET المحسوبة. من خلال تتبع نفس الريبوسومات بالضبط بعد 5 دقائق من الحضانة في RT ، وجد أن نوعا واحدا من الديناميكيات يمكن أن يتحول إلى23آخرين. لأن هذه الإشارات تقرير عن الاقتراحات tRNA تمليها ريبوسوم المحيطة بها، تم تجميع كفاءات FRET مماثلة في مختلف التجمعات الفرعية الريبوسوم.

ويبين الشكل 3 تنوع السكان الفرعيين في مجمع PRE. هناك ما يقرب من 70٪ (640/951) من الأنواع المتقلبة و 30٪ (311/951) من الأنواع غير المتقلبة. ويمكن تجميع هاتين الفئتين إلى مجموعات فرعية أدق. من ناحية أخرى، يظهر الشكل 4 توزيع الديناميكيات المعاكس. في POST، 65٪ من السكان الفرعيين غير متقلبين، ومعظمهم أظهر كفاءة عالية FRET. تشير هذه النتائج إلى أن الريبوسوم أكثر مرونة في حالة PRE من حالة POST ، والتي تؤكد دراسة cryo-EM التي خلصت إلى أن سلسلة بيبتيديل في موقع P تغلق ديناميكيات الريبوسوم في حالة POST. ومع ذلك ، في حالة PRE ، يتم نقل سلسلة peptidyl إلى موقع A ، وفتح الريبوسوم وتعزيز5. دعمت النتائج استنتاج دراسة الهيكل في ظل ظروف أكثر فسيولوجية. ترتبط الحالة غير المقفلة بحركة التصعيد بين 30S و 50S ، وترتبط الحالة المقفلة بالتوافق غير المتصاعد.

تكشف طريقة فرز السكان الفرعية عن تشكيل الريبوسوم عند التثبيط بواسطة فيوميسين المضاد الحيوي ، كما هو موضح في الشكل 514. يظهر الرسم البياني العام لكفاءة FRET ذروة كبيرة عند 0.47 ، وهي الحالة الكلاسيكية ، دون فرز. في هذه الحالة، يتم تأمين ريبوسوم وغير متصاعدة. ومع ذلك ، كشف فرز السكان الفرعيين أن 60٪ من السكان يتقلبون كمجمع PRE غير المقفل. لذلك ، حوصر فيوميسن الريبوسوم في الحالة المتصاعدة. تناقضت نتائج هذه الدراسة مع نتيجة بنية الأشعة السينية في وقت النشر (2010) ولكنها دعمت مؤخرا من خلال دراسة هيكل أخرى (2020).

Figure 1
الشكل 1: وضع العلامات من Cy3/Cy5 على ريبوسوم و TRNA. وتظهر المسافات بين بقايا وضع العلامات من L27 إلى الجيش الملكي النيبالي A- و P-الموقع (تظهر النجوم الحمراء والزرقاء مواقع وضع العلامات التقريبية من Cy5 و Cy3، على التوالي). يظهر أثر واحد للفواصل الزمنية التمثيلية لكثافة الفلورسينس من زوج CY3/Cy5 FRET. برنامج بالكشف عن نقاط التبييض على المانحة / المقبول آثار واقتطاع التتبع قبل تلك النقطة. وقد تم تعديل هذا الرقم من ألتونتوب، م. إ.وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تم تصنيف آثار الريبوسوم النموذجية من خلال ديناميكياتها المختلفة. (أ) أثر ريبوسوم غير متقلب. (ب)تتبع الريبوسوم المتقلب الذي عينات فقط قيم FRET أقل من 0.6. (ج)أثر الريبوسوم المتقلب الذي عينات قيمة FRET أعلى من 0.6. تظهر الأساطير في المؤامرة. وكثافة الفلورسينس للمانحين والمتقبلين هي خضراء وأرجوانيتان على التوالي. يتم حساب قيم FRET كما أنامقبول/ (أناacceptor+ Iالمانحة) ورسمت بشكل منفصل باللون الأزرق. يتم عرض البيانات الأصلية في خطوط منقطة، ويتم اقتطاع البيانات قبل عرض نقاط التبييض في خطوط متصلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من ألتونتوب، م. إ.وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسوم بيانية كفاءة FRET من ما قبل المجمع. تظهر المؤامرات من الدرجة الأولى الرسم البياني FRET لإجمالي الريبوسومات. تظهر مؤامرات المستوى الثاني مخططات FRET للريبوسومات المنفصلة إلى مجموعات متقلبة (F) وغير متقلبة (NF). تظهر مؤامرات الطبقة الثالثة مخططات FRET للريبوسومات المنفصلة إلى مجموعات من التقلبات التي كانت أعلى أو أقل من قيمة FRET البالغة 0.6. وطبقت معايير مماثلة على الريبوسومات NF لفصلها إلى دول فريت مستقرة تحت أو فوق 0.6 (NF-low, NF-high). تعرض مخططات الطبقة الرابعة الآثار التمثيلية لكل فئة فرعية. وقد تم تعديل هذا الرقم من ألتونتوب، م. إ.وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الرسم البياني كفاءة FRET من POST-Complex. الترتيب والتجميع مشابهان لل الشكل 3. على عكس الشكل 3، فإن عدد السكان NF-High هو الأغلبية. وقد تم تعديل هذا الرقم من ألتونتوب، م. إ.وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: المدرجات التكرارية لمجمع PRE في وجود 100 ميكرومتر فيوميسين. الترتيب والتجميع مشابهان لل الشكل 3. وقد تم تعديل هذا الرقم من Ly,C. T. وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SmFRET حساسة للإشارات الخلفية. أولا، فمن الضروري لمعطف غرفة عينة مع توين 0.05٪ ومن ثم تضاف بالتزامن مع الحل ريبوسوم لمنع ملزمة غير محددة من ريبوسوم إلى السطح. لرؤية الفلورسينس من انبعاث مقبول Cy5 ، يعد كوكتيل زبال الأكسجين (محلول ديوكسي والجلوكوز وترولوكس) ضروريا. بدون هذا الحل، التبييض سريع جدا في قناة المقبول للحصول على معلومات مفيدة. خطوة حاسمة أخرى لتجارب الريبوسوم ، على وجه التحديد ، هي طلاء PEG على السطح الزجاجي. النشاط الريبوسوم حساس للبيئة السطحية. لذلك ، البوليمرات بالفرشاة طويلة ضرورية لحماية الآثار السطحية غير المواتية.

إذا كانت مرحلة العينة بعيدة جدا عن التركيز ، فلن يعمل نظام التركيز التلقائي. إذا حدث ذلك، قم بإيقاف التركيز التلقائي وضبط موضع الهدف يدويا أثناء مراقبة بقعة الليزر المنعكسة. هذه ميزة واحدة من الإضاءة الداخلية الكلية للانعكاس الداخلي المدمجة في المنزل لأن بقعة الليزر مرئية. عندما يكون الهدف هو بالقرب من التركيز، ينبغي أن يكون الحادث وبقع الليزر المنعكس جنبا إلى جنب، ويتحرك بقعة تعكس مع تعديل الموقف الموضوعي. عندما يكون هذان البقعتان قريبتين، سيعمل التركيز التلقائي مرة أخرى.

أحد قيود smFRET هو نطاق تركيز منخفض جدا. يمكن تحميل ما يصل إلى 50 nM فقط من الركائز المسماة فلوريا دون التسبب في تثبيط الضوضاء الخلفية. على الرغم من أن العينات السطحية ملزمة يمكن أن تتطلب اكتساب لفترة طويلة على نفس الجزيء، يقتصر الوقت القرار إلى نطاق MS، في حين أن انتشار القائم على confocal smFRET يمكن أن تصل إلى ديناميات نطاق μs24. وهناك قيد آخر لطريقة FRET هو الحساب الدقيق للمسافة من كفاءة FRET. بسبب وصلات صبغ مختلفة والبيئات، والمسافة فورستر يختلف من مختبر إلى مختبر. لذلك، مقارنة المسافة المطلقة يمكن أن تكون إشكالية25. على الرغم من أن تغيير الكفاءة FRET يكشف عن آلية النقل، وضعت استراتيجية أكثر مباشرة لقياس التغطية الدقيقة للريبوسوم على مرنا26،27.

ومع ذلك، فإن استخدام قيم FRET كمراجع نسبية لتمييز المجموعات السكانية غير المتجانسة ضمن بيئة تجريبية واحدة هو طريقة قوية للكشف عن الآلية والديناميكيات جزيء واحد في كل مرة، والتي لا يمكن الوصول إليها بالطرق التقليدية. وعلاوة على ذلك، سوف FRET متعددة الألوان والجمع بين FRET مع فخ البصرية تكشف عن ديناميات ريبوسوم أكثر تنسيقا في المستقبل28. هذه التطورات هي توفير حساسية لم يسبق لها مثيل (تشريد مسافة Å) والمعلمات الجديدة (مثل قوى بيكو نيوتن حجم) التي لا يمكن تحقيقها مع الأساليب القائمة28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ي. وانغ يعلن عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452) ومؤسسة ويلش (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 173،
جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. Single Molecule… More

Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter