Summary
העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט הממוצע.
Abstract
הריבוזום הוא קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין גדול שמרכיב חלבונים באופן תהליכי לאורך תבניות mRNA. הקוטר של ריבוזום הוא כ 20 ננומטר כדי להכיל מצעים tRNA גדולים באתרי A,P ו- E. כתוצאה מכך, הדינמיקה ריבוזום הם באופן טבעי דה-phased במהירות. שיטת מולקולה אחת יכולה לזהות כל ריבוזום בנפרד ולהבחין באוכלוסיות אינומוגניות, החיוניות כדי לחשוף את המנגנונים המורכבים של מערכות מרובות רכיבים. אנו מדווחים על הפרטים של שיטת smFRET המבוססת על המיקרוסקופ ההפוך של ניקון Ti2 כדי לחקור את הדינמיקה ריבוזום בין חלבון ריבוזומלי L27 ו tRNAs. ה-L27 מסומן בעמדת Cys 53 הייחודית שלו וממוקם מחדש לריבוזום שתוכנן חסר L27. ה- tRNA מסומן באזור המרפק שלו. כאשר ה- tRNA עובר למקומות שונים בתוך הריבוזום במהלך מחזור התארכות, כגון טרום ולאחר טרנסלוקציה, יעילות FRET ודינמיקה מציגות הבדלים, אשר הציעו תת-אוכלוסין מרובים. אוכלוסין משנה אלה אינם ניתנים לזיהוי בשיטות הרכב. מיקרוסקופ smFRET מבוסס TIRF בנוי על מיקרוסקופ הפוך ידני או ממונע, עם תאורת לייזר ביתית. דגימות הריבוזום מטוהרות על ידי אולטרה-צנטריפוגה, נטענות לתא מדגם רב-ערוצי שנבנה בבית ואז מוארות באמצעות שדה לייזר אוונסנטי. נקודת לייזר השתקפות ניתן להשתמש כדי להשיג שליטה משוב של מיקוד מושלם. אותות הפלואורסצנטיות מופרדים על ידי צריח מסנן ממונע ונאספים על ידי שתי מצלמות CMOS דיגיטליות. האינטנסיביות מאוחזרות באמצעות תוכנת NIS-Elements.
Introduction
הריבוזום הוא קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין גדול של 20 ננומטר של מתחם גדול (50S) ותת-unit קטן (30S). הוא מרכיב פפטידים ארוכים לאורך תבנית mRNA בתהליכים ובשיתוף פעולה. ה-30S של ריבוזום נקשר ל-fMet-tRNAfMet ול-mRNA כדי להתחיל בסינתזת חלבונים, וה-50S מצטרף ויוצר את קומפלקס החניכה של 70S. ה- tRNAs מביאים חומצות אמינו לריבוזום באתר A (אתר כריכת אמינואציל- tRNA), בעוד שרשרת הפפטידיל המוארכת מוחזקת באתר P (אתר כריכת פפטידיל- tRNA). בקומפלקס טרום טרנסלוקציה, שרשרת הפפטידיל מועברת ל- tRNA באתר A עם חומצת אמינו אחת נוספת. בינתיים, TRNA אתר P הוא deacylated. לאחר מכן, A-, P-tRNAs לעבור לאתרי P-, E- כדי ליצור את המתחם שלאחר טרנסלוקציה, שבו האתר האלקטרוני מייצג את אתר היציאה tRNA. במצב זה, הפפטידיל-tRNA חוזר לאתר P. מחזור התארכות ממשיך בין טרום ופוסט-קונפורמציות בעוד ריבוזום translocates על mRNA, קודון אחד בכל פעם1. הריבוזום הוא מאוד מתאם של אתרים פונקציונליים שונים כדי להפוך את התהליך הזה יעיל ומדויק, כגון ratcheting בין subunit2, תנודות הכלאה tRNA3, הפעלות GTPase4, L1 גבעול פתיחה-סגירה5,וכו '. כתוצאה מכך, ריבוזומים במהירות דה פאזה כי כל מולקולה נעה בקצב שלה. השיטות הקונבנציונליות יכולות רק להסיק פרמטרים ממוצעים לכאורה, אבל מינים מאוכלסים נמוכים או קצרי מועד יהיו מוסווים באפקט הממוצע6. שיטת מולקולה אחת יכולה לשבור מגבלה זו על ידי זיהוי כל ריבוזום בנפרד, ואז לזהות מינים שונים באמצעות שחזור סטטיסטי7. אתרי תיוג שונים יושמו כדי לחקור דינמיקה ריבוזום, כגון האינטראקציות בין tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10,וכו '. בנוסף, על ידי תיוג תת-units הגדול והקטן, בהתאמה, קינטיקה בין-תת-יונית ותיאום עם גורמים נצפים11,12. בינתיים, שיטת smFRET יש יישומים רחבים בתהליכים ביולוגיים מרכזיים אחרים, ושיטות FRET מרובות צבעים מתעוררים13.
בעבר פותח זוג FRET ריבוזום רומן14,15. החלבון הריבוסומלי L27 התבטא, טוהר ותויג, ושולב בחזרה לריבוזום. חלבון זה קיים אינטראקציה עם tRNAs במרחק קרוב ועזר לייצב את ה- TRNA של אתר P בקומפלקס שלאחר הטרנסלוקציה. כאשר tRNA עבר מאתר A לאתר P, המרחק בין חלבון זה לבין tRNA מתקצר, אשר ניתן להבחין על ידי אות smFRET. מספר אוכלוסיות ריבוזום זוהו בשיטות סטטיסטיות ומוטאגנזה, וחילופין ספונטני של אוכלוסיות אלה במתחם הטרנסלוקציה שלפני אך לא לאחר הטרנסלוקציה מרמז על כך שהריבוזום גמיש יותר לפני שהוא עובר על ה- mRNA, ונוקשה יותר במהלךפענוח 16,17,18. וריאציות אלה חיוניות לתפקוד ריבוזום. כאן, הפרוטוקול מתאר את הפרטים של תיוג ריבוזום / tRNA, שילובם ריבוזום, הכנת מדגם smFRET, ורכישת נתונים / ניתוח19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריבוזום ו- tRNA מסומנים לגילוי FRET
- לבודד ריבוזום ללא L27 מ זן E. coli IW312 על פי פרוטוקולים סטנדרטיים20,21. לחלץ את ריבוזום רגיל מזן E. coli MRE600.
- שכפל את הגן סל"מ של L27 עם C-terminal שלו-תג לתוך pET-21b (+) plasmid, אשר השתנה ובא לידי ביטוי בתאי BL21(DE3)pLysS15. לטהר את החלבון באמצעות עמודת ספרוז ארוז מראש.
- תיוג של L27
- דגירה 20-100 מיקרומטר של L27 מטוהר ב 100 μL עם עודף 2-10-פי 2 של TCEP (טריס-2-קרבוקסיתיל-פוספין) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות. חוצץ להחליף את הפתרון לתוך מאגר PBS (10m Na2HPO4,1.8m KH2PO4,2.7 mM KCl; 0.137 M NaCl), באמצעות עמודת תנומה-5. הוסיפו לתמיסה צבע עודף של Cy5-maleimide ב-DMSO פי 10 ודגרו ב-RT בחושך למשך 2 שעות.
- טען את תמיסת החלבון המסומנת (500 μL) שהוזכרה לעיל בעמודת Nap-5 כדי להסיר את הצבע העודף. ודא כי החלבון חומק בפס הצבעוני הראשון, ואחריו צבע חופשי elute ברצועה השנייה, בהתאמה. לאסוף את החלבון האלוט ב 1 מ"ל של חיץ TAM10 (20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ מ"ג (OAc)2, 30 מ"מ NH4Cl, 70 mM KCl, 0.5 mM EDTA, ו 7 mM BME (2-mercaptoethanol)).
- תרכיבו מחדש את הריבוזום עם L27. מערבבים את חלבון L27 המסומן עם כמות שווה של ריבוזום IW312 במאגר TAM10 ודגרה ב 37 °C (7 °F) למשך שעה אחד. הסר את החלבון החופשי על ידי כרית סוכרוז ultracentrifugation (100,000 x גרם, לילה) כדי לאפשר ריבוזום ליצור גלולה בצבע כחול בתחתית הצינור.
- תייג את tRNAPhe על פי הדו"ח שפורסם בעבר22. ראשית, לדגור על tRNA (10 A260 ב 1 מ"ל של מים) עם 100 μL של NaBH4 (מלאי 100 mM, הוספת dropwise) ב 0 °C (1 שעה). שחררו את ה-tRNAs מ-NaBH4 שלא נמשכו באמצעות משקעים של אתנול שלוש-פעמיים על-ידי הוספת נפח של 1/10 של 3 M KAc (pH 5.0) ונפח של 2.5x אתנול. לדגור על tRNA מופחת עם 1 μL של פתרון צבע Cy3-NHS (1 מ"ג ב 10 μL של DMSO) בנפח מינימלי (~ 20 μL) של 0.1 M נתרן formate (pH 3.7). לאחר 2 שעות של דגירה ב 37 °C (50 °F), להפריד את tRNA מן הצבע לא נטען באמצעות עמוד G25 Sephadex קטן, ולאחר מכן להסיר את הצבע החופשי באמצעות משקעים אתנול פעמיים.
2. הכנת מתחמי ריבוזום
- לבטא ולטהר את החלבונים שלו מתויגים של IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts, ו tRNA סינתזות בשיטות סטנדרטיות15.
- הכן את תערובת החניכה על ידי הוספת המרכיבים הבאים במאגר TAM10 ב 37 °C במשך 15 דקות: 1 מיקרומטר של ריבוזום שכותרתו; 1.5 מיקרומטר כל אחד מ- IF1, IF2 ו- IF3; 2 mRNA ביוטינילאט של מיקרומטר (MRNA קידוד לשתי חומצות האמינו הראשונות); 4 מיקרומטר של fMet-tRNA טעוןfMet; ו-1 מ"מ ג'י-פי.אם.
- הכן את תערובת EF-Tu_G על ידי ערבוב המרכיבים הבאים במאגר TAM10 ב 37 °C למשך 15 דקות: 4 ef-Tu EF-Tu ef,0.4 EF-Ts 0.4 מיקרומטר, 2 מיקרומטר EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, ו 0.02 מ"ג / מ"ל של Pyruvate Kinase.
- הכן את תערובת Tu_NoG EF דומה לשלב 2.3 ללא EF-G.
- הכן את תערובת Phe על ידי ערבוב המרכיבים הבאים במים ללא נוקלאז ב 37 °C (15 דקות): 100 mM טריס (pH 7.5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM פנילאלנין ספציפי סינתטאז, 2 A260/mL של tRNAPheשכותרתו , ו 50 μM פנילאלנין.
- הכן את קומפלקס הטרנסלוקיציה (PRE) על ידי ערבוב החניכה, EF-Tu_NoG ו Phe מתערבב ביחס של 1:2:2, ב 37 °C (50 °F) במשך 2 דקות. לאחר הדגירה, לטהר את PRE על ידי 1.1 M כרית סוכרוז אולטרה צנטריפוגה לילה ב 100,000 x גרם.
- הכן את מתחם שלאחר טרנסלוקציה (POST) על ידי ערבוב החניכה, EF-Tu_WG ו Phe מתערבב ביחס של 1:2:2, ב 37 °C (10 דקות). לאחר הדגירה, לטהר את הפוסט על ידי 1.1 M כרית סוכרוז אולטרה צנטריפוגה לילה ב 100,000 x גרם.
3. הכנת שקופיות לדוגמה
- נקה את שקופיות זכוכית המיקרוסקופ (75 מ"מ x 25 מ"מ) המכילות שישה זוגות חורים (קוטר 1 מ"מ). כל זוג יוצר שקע נכנסה של תא המדגם. ודא שהמרחק בין כל חור שקע נכנס הוא 13 מ"מ והמרחק ממרכז למרכז בין שני ערוצים הוא 6 מ"מ. מניחים שש שקופיות בכור היתוך מזכוכית.
- ממלאים את כור ההיתוך באצטון וסוניקאט אותם במשך 5 דקות. דק את האצטון ולשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם מים אולטרה pure. מלא את כור ההיתוך שוב במים ו 1 מ"ל של 10 M KOH. סוניקאט במשך 20 דקות.
- לשטוף את המגלשות שלוש פעמים עם מים אולטרה-תפותיים. ממלאים את כור ההיתוך שוב באתנול וסוניקאט במשך 5 דקות. לחלוטין decant הממס. תן לשקופיות להתייבש במכסה המנוע של האדים.
- נקה את כיסויי זכוכית המיקרוסקופ (עובי מס '1.5, 24 x 40 מ"מ). בצע את שלבי הניקוי כמתואר בשלבים 3.1-3.3.
- אופים את השקופיות המנוקות והכיסויים ב-300 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. שמור אותם בכבשן לילה כדי להתקרר.
- מצפים את כיסוי עם אמינוסילן. בכיסוי כור ההיתוך המכיל כיסויים, יוצקים בתערובת מתנול (100 מ"ל של מתנול, 5 מ"ל מים, 0.5 מ"ל של HAc ו-1 מ"ל של אמינוסילן). לחמם את כור ההיתוך באמבט מים במשך 10 דקות, sonicate אותו במשך 10 דקות, ולאחר מכן לחמם את כור ההיתוך באמבט המים במשך 10 דקות נוספות. דקת תערובת מתנול, לשטוף את כיסוי היטב בשלושה כור היתוך של מים נקיים. לטהר את המשטחים עם זרם חנקן יבש דרך מחט.
- מצפים את כיסויי המכסים ביוטין-PEG במכסה המנוע הנקי למינאר.
- כדי להפוך את פתרון PEG, להשתמש 98 מ"ג של PEG ו 2-3 מ"ג של ביוטין-PEG ב 200 μL של 100 mM NaHCO3 פתרון.
- הנח כיסוי אחד שטוח על משטח. שחרר בזהירות 60 μL של פתרון PEG בקצה העליון. לאחר מכן, להניח כיסוי נוסף על גבי זה, לתת את האפקט נימי להפיץ את הפתרון בין שני כיסויים. ודא שלא נוצרו בועות.
- חזור על שלב 3.7.2 עבור שני זוגות כיסוי נוספים. מעיל שש חתיכות של כיסויים עם ביוטין. אם יש צורך בכיסויים נוספים, התאימו את כמות PEG וביוטין PEG בהתאם כדי ליצור פתרון PEG נוסף.
- אחסנו את כיסויים אלה בקופסת קצה ריקה מלאה במים ודגרה במשך 3 שעות בחושך.
- לאחר 3 שעות, להפריד את כיסויים, לשטוף עם מים בשלושה כור היתוך רצופים לטהר עם זרם חנקן יבש. מניחים את כיסויי הכיסוי מצופים על מתלה קרמיקה. סמן את פני השטח עם ציפוי.
- להרכיב את תאי המדגם19.
- משכו קצות פיפטה חדות דרך החורים על מגלשות הזכוכית עד שהם מתאימים חזק. לגרד את הקצוות החדים עד שהוא שטוח לחלוטין על משטח הזכוכית. חותכים את הקצה השני של הקצה להיות כ 5 מ"מ עבור טעינת מדגם.
- חותכים סרט דו-פרצופי עם תבנית הערוץ עליה (25 x 40 מ"מ).
- תקע את הסרט הדו-פרצופי על מגלשות הזכוכית בצד השטוח.
- תקעו את הכיסויים המצופה על גבי הסרט הדו-פרצופי. לחץ עליו כדי ליצור חותם הדוק של תא הדגימה. ודאו שהצד המצוה פונה פנימה.
4. הדמיית FRET מולקולה בודדת
- הפעל את המחשב.
- הפעל את מתג המיקרוסקופ.
- התחל את ממשק בקרת הלייזר והפעל את הלייזר. לחץ על לחצן ההפעלה בתיבת בקרת הלייזר כדי לחמם את הלייזר.
- תדליק את המצלמות.
- הפעל את התוכנה המשויכת למיקרוסקופ. לחץ על התריס העליון כבוי ולחץ על המנורה ב-.
- הכן את מאגר _WT TAM10על-ידי הוספת 10 μL של 5% Tween-20 לתוך 1 מ"ל של מאגר TAM10.
- הכן את פתרון deoxy על ידי שקילה 3 מ"ג של גלוקוז אוקסידאז בצינור microcentrifuge קטן. הוסף 45 μL של קטליזה. מערבולת בעדינות כדי להמיס את המוצק. ספין ב 20,000 x g ב microcentrifuge במשך 1 דקות. קח את הסופר-טבעי.
- הכן 30% תמיסת גלוקוז במים ופתרון 200 mM Trolox ב- DMSO.
- הכן 0.5 מ"ג / מ"ל של פתרון סטרפטווידין במים ללא נוקלאז.
- הוסף טיפה אחת של שמן הדמיה למטרה TIRF.
- שים את תאי המדגם על המטרה.
- מלא את התא עם 10 μL של פתרון סטרפטבידין. חכה דקה אחת.
- לשטוף את התא עם 30 מ"ל של TAM10_WT חוצץ ולאסוף את הפתרון לרוץ דרך עם נייר מסנן מקופל. חכה דקה אחת.
- לדלל את מתחמי ריבוזום (PRE או POST) לריכוז של 10-50 ננומטר עם מאגר _WT TAM10.
- טען 20 μL של דגימת ריבוזום לתוך הערוץ. המתן 2 דקות.
- הפוך את מאגר ההדמיה (50 μL של חיץ TAM10 בתוספת 0.5 μL כל אחד של פתרונות deoxy, גלוקוז, ו Trolox). מערבבים היטב את המאגר.
- לשטוף את התא עם 30 μL של מאגר ההדמיה.
- הגדר את המצלמה כדי לרכוש 100 ms / frame, 16 סיביות, 4 x 4 binning.
- לחץ על התריס העליון ב ועל המנורה כבויה.
- התחל רכישת מצלמה. פזר את התמונות לשלושה חלונות המייצגים שתי מצלמות בודדות ואת שכבת העל.
- לחץ על מוקד אוטומטי. כוונון עדין כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר.
- לחץ על שיטה. הגדר את נקודות השדה, אחסון הקבצים ומספר הלולאה.
- לחץ על הפעל.
הערה: חלון חדש מופיע עם הדמיה בזמן אמת. ההתקדמות של סידרת הזמן ושדה הראייה של סידרות מוצגים בחלק העליון של החלון. - לאחר השלמת רכישת התמונה, סגור את החלון המוקפץ.
- פתח את קובץ ND (קובץ שנרכש).
- לחץ על ROI / עורך ROI פשוט. בחר באפשרות עיגול.
- בחר את ההון ב- ROI בתמונה. לחץ על סיום לאחר השלמתו.
- לחץ על מדידה/ מדידת זמן כדי להציג את הנתונים כהתוויה או כגליונות אלקטרוניים.
- פתח את הכרטיסיה ייצוא. הגדר את פרמטרי הייצוא.
- לחץ על ייצוא כדי לשמור את האינטנסיביות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ה-smFRET היה המסומן במיקום האמצעי של תעבורת tRNA, כדי להבחין בין טרנסלוקציה tRNA לבין אתר P (איור 1)15. המרחק בין שאריות תיוג L27 ל- TRNA של אתר A או P הוא 52 או 61 Å, בהתאמה, בהתאמה, בהתאמה ליעילות FRET של 0.47 ו- 0.65. לאחר איסוף התמונות, אוחזרו ועוצמות הפלואורסצנטיות מערוצי התורם והמקבלים והתו כפגמים בזמן(איור 1). יעילות FRET חושבה על ידי הנוסחה שאנימקבל/(אנימקבל+אניתורם). תוכנית תוצרת בית זיהתה את ההלבנה החד-שלבית של התורם/מקבל והתאימה את הנתונים לפני נקודות ההלבנה כדי להימנע מחישוב FRET מרעשים. לאחר ההלבנה של התורם, שני העקבות התקרבו לקו הבסיס מכיוון שלא ניתן לרגש עירור ישירות על המקבל(איור 2A). לאחר ההלבנה הקבלה, עוצמת התורם גדלה מכיוון שפחות מסלולי תגובה מתפזרים באנרגיית העירור(איורים 2B,C).
נמצא כי הריבוזומים הבודדים מציגים תנודות שונות, למשל בדוגמאות המוצגות באיור 2. תנודות אלה נובעות מתנועה מתנדנדת של tRNAs, מה שגורם תנודות מרחק L2717,18. באיור 2, הקווים המנוקדים הם הנתונים המקוריים, וקווים מלאים הם הנתונים המותאמים מהתוכנית. המעקבים המותאמים אינם משנים את קריאת הנתונים הגולמיים אלא קוטפים את עקבות זמן הלכה לאחר ההלבנה. העקבות הכחולות הן יעילות FRET מחושבת. על ידי מעקב אחר אותם ריבוזומים בדיוק לאחר 5 דקות דגירה ב RT, נמצא כי סוג אחד של דינמיקה יכול לעבור אחר23. מכיוון שאותות אלה מדווחים על תנועות tRNA המוכתבות על ידי הריבוזום שמסביב, יעילות FRET דומה קובצו לתת-אוכלוסין ריבוזום שונים.
איור 3 מראה תת-אוכלוסין מגוון מאוד במתחם PRE. ישנם כ -70% (640/951) של מינים משתנים ו -30% (311/951) של מינים שאינם משתנים. ניתן לקבץ עוד יותר את שתי הקטגוריות הללו לתת-אוכלוסין עדין יותר. מצד שני, איור 4 מציג את התפלגות הדינמיקה ההפוכה. בפוסט, 65% מאוכלוסיית המשנה אינה משתנה, ורובן הציגו יעילות FRET גבוהה. תוצאות אלה מצביעות על כך שהריבוזום גמיש יותר במצב PRE מאשר מצב POST, המאמת מחקר cryo-EM שהגיע למסקנה כי שרשרת הפפטידיל באתר P נועלת את הדינמיקה ריבוזום במצב POST. עם זאת, במצב PRE, שרשרת הפפטידיל מועברת לאתר A, פותחת את הריבוזום ומקדמת5. התוצאות תמכו במסקנה של מחקר המבנה בתנאים פיזיולוגיים יותר. המצב הלא נעול מתואם עם תנועת הפטיש בין ה-30S ל-50S, והמצב הנעול מתואם עם הקונפורמציה הלא מרושלת.
שיטת המיון של תת-אכלוס חושפת את הקונפורמציה של ריבוזום עם עיכוב על ידי וומיצין אנטיביוטי, כפי שמוצג באיור 514. היסטוגרמה היעילה הכוללת FRET מראה שיא גדול ב 0.47, המצב הקלאסי, ללא מיון. במצב הזה, הריבוזום נעול ולא מנוטרל. עם זאת, מיון תת-האוכלוסייה גילה כי 60% מהאוכלוסייה משתנה כמו מתחם PRE נעול. לכן, ויומיצין לכד את הריבוזום במצב המקושקש. תוצאות מחקר זה סתרו את תוצאת מבנה הרנטגן בעת הפרסום (2010) אך נתמכו לאחרונה על ידי מחקר מבנה אחר (2020).
איור 1: מיקום התיוג של Cy3/Cy5 על הריבוזום וה-tRNA. המרחקים בין שאריות התוויות של L27 ל- A- ו- P-site tRNA מוצגים (הכוכבים האדומים והכחולים מציגים את מיקומי התיוג המשוערים של Cy5 ו- Cy3, בהתאמה). מוצג עקבות מייצגים של עוצמות פלואורסצנטיות מהזוג CY3/Cy5 FRET. תוכנית מזהה נקודות להלבנה על עקבות תורם / מקבל וגוררת את העקבות לפני נקודה זו. נתון זה שונה מאלטונוטופ, מ.א. ואח'15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2:עקבות הריבוזום הטיפוסיות סווגו לפי הדינמיקה השונה שלהם. (B)עקבות ריבוזום משתנים שדוגמים רק ערכי FRET הנמוכים מ- 0.6. (C)עקבות ריבוזום משתנים שדוגמים ערך FRET גבוה מ- 0.6. האגדות מוצגות בעלילה. עוצמות הפלואורסצנטיות של התורם והמקבל הן ירוקות ומגנטה, בהתאמה. ערכי FRET מחושבים כפי שאנימקבל/(אנימקבל+תורם) ומתוכננים בנפרד בכחול. הנתונים המקוריים מוצגים בקווים מנוקדים, ונתונים נחתכים לפני שנקודות ההלבנה מוצגות בקווים מלאים. נתון זה שונה מאלטונוטופ, מ.א. ואח'15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: היסטוגרמה של יעילות FRET של טרום המתחם. העלילות מהשורה הראשונה מראות את היסטוגרמה FRET של הריבוזומים הכוללים. העלילות מהשורה השנייה מציגות את היסטוגרמות FRET של הריבוזומים המופרדים לקבוצות משתנות (F) ולא משתנות (NF). העלילות מהשורה השלישית מראות את היסטוגרמות FRET של הריבוזומים מופרדים עוד יותר לקבוצות של תנודות שהיו מעל או מתחת לערך FRET של 0.6. קריטריונים דומים הוחלו על ריבוזומים NF להפריד אותם למצבי FRET יציבים מתחת או מעל 0.6 (NF נמוך, NF גבוה). התוויות ברמה הרביעית מציגות את המעקבים הייצוגיים עבור כל תת-אכלוס. נתון זה שונה מאלטונוטופ, מ.א. ואח'15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היסטוגרמה של יעילות FRET של פוסט-קומפלקס. ההסדר וההקבצה דומים לאיור 3. בניגוד לאיור 3, אוכלוסיית NF-High היא הרוב. נתון זה שונה מאלטונוטופ, מ.א. ואח'15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: היסטוגרמה של מתחם PRE בנוכחות 100 מיקרומטר ויומיצין. ההסדר וההקבצה דומים לאיור 3. נתון זה שונה מ Ly, C. T. ואח'14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SmFRET רגיש לאותות רקע. ראשית, יש צורך לצפות את תא המדגם עם 0.05% tween ולאחר מכן להתווסף במקביל עם פתרון ריבוזום לחסום כריכה לא ספציפית של ריבוזום אל פני השטח. כדי לראות פלואורסצנטיות מפליטת Cy5 המקבלת, קוקטייל נבלות החמצן (פתרונות דאוקסי, גלוקוז ותרולוקס) הוא חיוני. ללא פתרון זה, ההלבנה מהירה מדי בערוץ הקבלה כדי להשיג מידע שימושי. צעד קריטי נוסף לניסויי ריבוזום, במיוחד, הוא ציפוי PEG על משטח הזכוכית. פעילות הריבוזום רגישה לסביבת פני השטח; לכן, פולימרים צחצוח ארוך חיוניים כדי להגן על השפעות פני השטח שליליות.
אם שלב הדגימה רחוק מדי מהמוקד, מערכת המיקוד האוטומטי לא תפעל. במקרה כזה, כבה את המוקד האוטומטי והתאם באופן ידני את המיקום האובייקטיבי תוך התבוננות בנקודת הלייזר המוחזרת. זהו יתרון אחד של תאורת השתקפות פנימית כוללת שנבנתה בבית מכיוון שנקודת הלייזר נראית לעין. כאשר המטרה קרובה למיקוד, האירוע וכתמי הלייזר המוחקפים צריכים להיות זה לצד זה, והנקודה המשקפת נעה עם התאמת המיקום האובייקטיבי. כאשר שני כתמים אלה קרובים, המוקד האוטומטי יעבוד שוב.
מגבלה אחת של smFRET היא טווח הריכוז הנמוך מאוד. ניתן לטעון רק עד 50 ננומטר של מצעים המסומנים פלואורסצנטית מבלי לגרום לרעש רקע מעכב. למרות שדגימות הקשורות לפני השטח יכולות לדרוש רכישה ארוכת טווח על אותה מולקולה, רזולוציית הזמן מוגבלת לטווח ms, בעוד smFRET קונפוקלי מבוסס דיפוזיה יכול להגיע לדינמיקה של טווח μs24. מגבלה נוספת של שיטת FRET היא חישוב מדויק של המרחק מיעילות FRET. בשל מקשרי צבע וסביבות שונות, המרחק של פורסטר משתנה ממעבדה למעבדה. לכן, השוואת מרחק מוחלט יכולה להיות בעייתית25. למרות שינוי יעילות FRET חושף את מנגנון translocation, אסטרטגיה ישירה יותר פותחה כדי למדוד את הכיסוי המדויק של ריבוזום על mRNA26,27.
עם זאת, שימוש בערכי FRET כהתייחסויות יחסיות להבחנה בין אוכלוסיות אינומוגניות בתוך הגדרה ניסיונית אחת היא שיטה רבת עוצמה לחשוף מנגנון ודינמיקה מולקולה אחת בכל פעם, אשר אינו נגיש עם שיטות קונבנציונליות. יתר על כן, FRET מרובה צבעים והשילוב של FRET עם מלכודת אופטית יחשפו דינמיקה מתוזמרת יותר ריבוזום בעתיד28. התפתחויות אלה מספקות רגישות חסרת תקדים (עקירת מרחק Å) ופרמטרים חדשים (כגון כוחות בסדר גודל של פיקו-ניוטון) שאינם ניתנים להשגה בשיטות קיימות28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
י. וואנג לא מצהיר על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01GM111452) וקרן וולש (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
