Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Перенос энергии флуоресценции одной молекулы — это метод, который отслеживает динамику тРНК при синтезе рибосомного белка. Отслеживая отдельные рибосомы, идентифицируются неоднородные популяции, которые проливают свет на механизмы. Этот метод может быть использован для отслеживания биологических конформационных изменений в целом, чтобы выявить динамически-функциональные отношения во многих других сложных биосистемах. Одномолекулярные методы могут наблюдать нескоростные ограничивающие стадии и малонаселенные ключевые промежуточные продукты, которые недоступны обычным ансамблевым методам из-за среднего эффекта.

Abstract

Рибосома представляет собой большой рибонуклеопротеиновый комплекс, который процессно собирает белки вдоль шаблонов мРНК. Диаметр рибосомы составляет приблизительно 20 нм для размещения крупных субстратов тРНК на A-, P- и E-сайтах. Следовательно, динамика рибосом естественным образом быстро размещается. Одномолекулярный метод может обнаружить каждую рибосому отдельно и выделить неоднородные популяции, что необходимо для выявления сложных механизмов многокомпонентных систем. Мы сообщаем подробности метода smFRET на основе инвертированного микроскопа Nikon Ti2 для исследования динамики рибосом между рибосомным белком L27 и тРНК. L27 помечен в своем уникальном положении Cys 53 и восстановлен в рибосому, которая спроектирована так, чтобы не хватать L27. ТРНК мечется в области локтя. Поскольку тРНК перемещается в разные места внутри рибосомы во время цикла удлинения, такие как пре- и пост-транслокация, эффективность и динамика FRET демонстрируют различия, которые предполагают несколько субпопуляций. Эти субпопуляции не обнаруживаются ансамблевыми методами. Микроскоп smFRET на основе TIRF построен на ручном или моторизованного инвертированном микроскопе с самодельным лазерным освещением. Образцы рибосом очищают ультрацентрифугированием, загружают в самодельную многоканальный пробоотборную ячейку, а затем освещают с помощью испаряющегося лазерного поля. Отражательное лазерное пятно может быть использовано для достижения обратной связи управления идеальной фокусировки. Флуоресцентные сигналы разделены моторизованной фильтрующей башней и собраны двумя цифровыми КМОП-камерами. Интенсивности извлекаются с помощью программного обеспечения NIS-Elements.

Introduction

Рибосома представляет собой ø 20 нм большой рибонуклеопротеиновый комплекс большой (50S) и малой (30S) субъединица. Он собирает длинные пептиды вдоль шаблона мРНК процессивно и совместно. Рибосома 30S связывается с fMet-tRNAfMet и мРНК, чтобы начать синтез белка, а затем 50S присоединяется, образуя комплекс инициации 70S. ТРНК приносят аминокислоты в рибосому на А-сайте (сайт связывания аминоацил-тРНК), в то время как удлиненная пептидильная цепь удерживается на Р-сайте (пептидил-тРНК-сайт связывания). В пре-транслокационном комплексе пептидильная цепь переносится в тРНК на А-участке с добавлением одной аминокислоты. Между тем, Р-сайт тРНК деацилируется. Затем A-, P-тРНК перемещаются к P-, E-сайтам с образованием пост-транслокационного комплекса, в котором E-сайт представляет собой сайт выхода тРНК. В этом состоянии пептидил-тРНК перемещается обратно в Р-сайт. Цикл удлинения продолжается между пре- и постконформациями, в то время как рибосома транслоцируется на мРНК, по одному кодону за раз1. Рибосома высоко координирует различные функциональные участки, чтобы сделать этот процесс эффективным и точным, такие как храповая храповаяхраповая храповая 2между субъединицами, флуктуации гибридизации тРНК3,активации GTPase4,открытие-закрытие стебля L15и т. Д. Следовательно, рибосомы быстро раздваиваются, потому что каждая молекула движется в своем собственном темпе. Обычные методы могут выводить только кажущиеся средние параметры, но малонаселенные или короткоживущие виды будут маскироваться в среднемэффекте 6. Метод одной молекулы может нарушить это ограничение, обнаружив каждую рибосому по отдельности, а затем идентифицировать различные виды с помощью статистической реконструкции7. Различные сайты маркировки были реализованы для исследования динамики рибосом, таких как взаимодействия между тРНК-тРНК8,EF-G-L119,L1-тРНК10и т. Д. Кроме того, при маркировке больших и малых субъединиц, соответственно, наблюдается межсуставная храповая кинетика и координация с факторами11,12. Между тем, метод smFRET имеет широкое применение в других центральных биологических процессах, а многоцветные методы FRET появляются13.

Ранее была разработана новая рибосома FRET пары14,15. Рекомбинантный рибосомный белок L27 был экспрессирован, очищен и помечен и включен обратно в рибосому. Этот белок взаимодействовал с тРНК на близком расстоянии и помог стабилизировать рРНК P-сайта в пост-транслокационном комплексе. Когда тРНК перемещается из А- в Р-сайт, расстояние между этим белком и тРНК укорачивается, что можно различить по сигналу smFRET. Множественные рибосомные субпопуляции были идентифицированы с использованием статистических методов и мутагенеза, и спонтанный обмен этими популяциями в до-, но не пост-транслокационном комплексе предполагает, что рибосома более гибкая перед перемещением по мРНК и более жесткая при декодировании16,17,18. Эти вариации необходимы для функции рибосом. Здесь протокол описывает детали маркировки рибосом/тРНК, их включение в рибосому, подготовку образцов smFRET и сбор/анализ данных19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка меченых рибосом и тРНК для обнаружения ЛАД

  1. Выделяют рибосому без L27 из штамма E. coli IW312 согласно стандартным протоколам20,21. Извлеките обычную рибосому из штамма E. coli MRE600.
  2. Клонирование гена rpmA L27 с C-концевым His-tag в плазмиду pET-21b (+), которая трансформируется и экспрессируется в клетках BL21(DE3)pLysS15. Очистите белок через предварительно упакованную колонку сефарозы.
  3. Маркировка L27
    1. Инкубировать 20-100 мкМ очищенного L27 в 100 мкл с 2-10-кратным превышением TCEP (Tris-2-карбоксиэтил-фосфин) при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин. Буфер обмена раствора на буфер PBS (10 мМ Na2HPO4,1,8 мМ KH2PO4,2,7 мМ KCl; 0,137 M NaCl), используя колонку nap-5. Добавляют в раствор 10-кратный избыток монореактивного красителя Cy5-малеимида в ДМСО и инкубируют при РТ в темноте в течение 2 ч.
    2. Загрузите меченый белковый раствор (500 мкл), упомянутый выше, на колонку Nap-5 для удаления избытка красителя. Убедитесь, что белок элюируется в первой цветной полосе, а затем в свободной красяной элют во второй полосе, соответственно. Собирают элюированный белок в 1 мл буфера TAM10 (20 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ Мг (OAc)2, 30мМ NH4Cl, 70 мМ KCl, 0,5 мМ ЭДТА и 7 мМ BME (2-меркаптоэтанол)).
  4. Воссоздайте рибосому с помощью L27. Смешайте меченый белок L27 с равным количеством рибосомы IW312 в буфере TAM10 и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч. Удалите свободный белок ультрацентрифугированием сахарозной подушки (100 000 х г,на ночь), чтобы рибосома образовала гранулу синего цвета на дне трубки.
  5. Маркировка тРНКPhe согласно ранее опубликованному отчету22. Сначала инкубируют тРНК (10 А260 в 1 мл воды) со 100 мкл NaBH4 (запас 100 мМ, добавляя по каплям) при 0 °C в течение 1 ч. Освободите тРНК от непрореактированного NaBH4 посредством трехкратного осаждения этанола путем добавления 1/10 объема 3 М КАц (рН 5,0) и 2,5-кратного объема этанола. Инкубировать восстановленную тРНК с 1 мкл раствора красителя Cy3-NHS (1 мг в 10 мкл ДМСО) в минимальном объеме (~20 мкл) 0,1 М формиата натрия (рН 3,7). После 2 ч инкубации при 37 °C отделите тРНК от непрореактного красителя через небольшую колонку G25 Sephadex, а затем удалите свободный краситель посредством двукратного осаждения этанола.

2. Приготовление рибосомных комплексов

  1. Экспрессируют и очищают помеченные His белки IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts и тРНК-синтетазы с помощью стандартных методов15.
  2. Приготовьте инициируемую смесь, добавив следующие ингредиенты в буфер TAM10 при 37 °C в течение 15 мин: 1 мкМ меченой рибосомы; 1,5 мкМ каждый из IF1, IF2 и IF3; 2 мкМ биотинилированной мРНК (кодирующей МФ для первых двух аминокислот); 4 мкМ заряженной fMet-тРНКfMet; и 1 мМ ГТП.
  3. Приготовьте смесь EF-Tu_G, смешивая следующие ингредиенты в буфере TAM10 при 37 °C в течение 15 мин: 4 мкМ EF-Tu, 0,4 мкМ EF-Ts, 2 мкМ EF-G, 4 мМ ГТФ, 4 мМ PEP и 0,02 мг/мл пируваткиназы.
  4. Приготовьте смесь EF-Tu_NoG аналогично этапу 2.3 без EF-G.
  5. Приготовьте смесь Phe, смешивая следующие ингредиенты в воде без нуклеазы при 37 °C в течение 15 мин: 100 мМ Tris (рН 7,5), 20 мМ MgAc2, 1 мМ ЭДТА, 4 мМ АТФ, 7 мМ BME, 2 мМ Фенилаланин-специфическая синтетаза, 2 A260 /мл меченой тРНКPheи 50 мкМ фенилаланина.
  6. Готовят пре-транслокационный комплекс (PRE), смешивая инициационные смеси, смеси EF-Tu_NoG и Phe в соотношении 1:2:2 при 37 °C в течение 2 мин. После инкубации очистите PRE ультрацентрифугированием ультрацентрифугирования сахарозной подушки в течение ночи при 100 000 х г.
  7. Готовят пост-транслокационный комплекс (POST), смешивая инициационный, EF-Tu_WG и Phe смеси в соотношении 1:2:2 при 37 °C в течение 10 мин. После инкубации очистите POST ультрацентрифугированием ультрацентрифугирования сахарозной подушки в течение ночи при 100 000 х г.

3. Подготовка образцов слайдов

  1. Очистите стеклянные стекла микроскопа (75 мм х 25 мм), содержащие шесть пар отверстий (диаметром 1 мм). Каждая пара образует вход-выход камеры для отбора проб. Убедитесь, что расстояние между каждым входным отверстием составляет 13 мм, а расстояние между двумя каналами от центра до центра составляет 6 мм. Поместите шесть слайдов в стеклянный тигель.
  2. Наполните тигель ацетоном и обмазывать их ультразвуком в течение 5 минут. Декантировать ацетон и трижды промыть горки сверхчистой водой. Снова наполните тигель водой и 1 мл 10 М КОН. Соник в течение 20 мин.
  3. Промойте горки три раза сверхчистой водой. Снова наполните тигель этанолом и ультразвуком в течение 5 минут. Полностью декантация растворителя. Дайте горкам высохнуть в вытяжном капюшоне.
  4. Очистите стеклянные крышки микроскопа (толщина #1,5, 24 x 40 мм). Выполните этапы очистки, как описано в шагах 3.1-3.3.
  5. Выпекайте очищенные горки и крышки при 300 °C в течение 3 ч. Храните их в печи на ночь, чтобы остыть.
  6. Покрыть покров аминосиланом. В тигель, содержащий обшивки, влить смесь метанола (100 мл метанола, 5 мл воды, 0,5 мл HAc и 1 мл аминосилана). Разогрейте тигель на водяной бане в течение 10 минут, обжарите его ультразвуком в течение 10 минут, а затем согрейте тигель на водяной бане еще 10 минут. Декантировать смесь метанола, хорошо промыть крышку в трех тиглях чистой воды. Продуть поверхности сухой струей азота через иглу.
  7. Покрывайте крышки биотин-ПЭГ в ламинарной чистой вытяжке.
    1. Для изготовления раствора ПЭГ используют 98 мг ПЭГ и 2-3 мг биотина-ПЭГ в 200 мкл 100 мМ раствора NaHCO3.
    2. Уложите одну крышку ровно на поверхность. Осторожно опустите 60 мкл раствора ПЭГ на верхний край. Затем положите еще один покров поверх него, позволяя капиллярному эффекту распределить раствор между двумя крышками. Убедитесь, что пузырьки не образуются.
    3. Повторите шаг 3.7.2 для еще двух пар обложек. Посыпь покрывала биотином шесть кусочков обложек. Если требуется больше крышек, отрегулируйте количество ПЭГ и биотина ПЭГ соответственно, чтобы получить больше раствора ПЭГ.
    4. Храните эти крышки в пустом наконечнике, наполненном водой, и высиживаете в течение 3 ч в темноте.
    5. Через 3 ч отделите обтекательные листы, промойте водой в трех последовательных тиглях и продувку сухой струей азота. Поместите покрытые крышками на керамическую стойку. Пометьте поверхность покрытием.
  8. Соберите образцовые камеры19.
    1. Протащите острые кончики пипеток через отверстия на стеклянных слайдах, пока они не плотно прилегают. Соскоблите острые концы до тех пор, пока они не будут полностью плоскими на поверхности стекла. Отрежьте другой конец наконечника примерно на 5 мм для загрузки образца.
    2. Вырежьте двустороннюю ленту с рисунком канала на ней (25 х 40 мм).
    3. Приклейте двустороннюю ленту к стеклянным слайдам на плоской стороне.
    4. Наклейте крышку с покрытием на двустороннюю ленту. Нажмите на него, чтобы сделать плотное уплотнение пробной камеры. Убедитесь, что сторона с покрытием обращена внутрь.

4. Одномолекулярная визуализация FRET

  1. Включите компьютер.
  2. Включите переключатель микроскопа.
  3. Запустите интерфейс управления лазером и включите лазер. Нажмите кнопку включения на блоке управления лазером, чтобы разогреть лазер.
  4. Включите камеры.
  5. Запустите программное обеспечение, связанное с микроскопом. Щелкните верхний затвор Выкл. и нажмите лампу Вкл.
  6. Подготовьте буфер TAM10_WT, добавив 10 мкл 5% Tween-20 в 1 мл буфера TAM10.
  7. Готовят дезокси-раствор, взвешивая 3 мг глюкозооксидазы в небольшой микроцентрифужной пробирке. Добавьте 45 мкл каталазы. Вихрь мягко растворяет твердое вещество. Отжим при 20 000 х г в микроцентрифуге в течение 1 мин. Возьмем супернатант.
  8. Готовят 30% раствор глюкозы в воде и 200 мМ раствор Тролокс в ДМСО.
  9. Готовят 0,5 мг/мл раствора стрептавидина в воде, не содержит нуклеаз.
  10. Добавьте одну каплю масла для визуализации к цели TIRF.
  11. Поместите пробные камеры на объектив.
  12. Заполните камеру 10 мкл раствора стрептавидина. Подождите 1 мин.
  13. Промыть камеру 30 мл TAM10_WT буфера и собрать проенный раствор сложенной фильтровальной бумагой. Подождите 1 мин.
  14. Разбавляют рибосомные комплексы (PRE или POST) до концентрации 10-50 нМ с помощью TAM10_WT буфере.
  15. Загрузите 20 мкл образца рибосомы в канал. Подождите 2 мин.
  16. Сделайте буфер визуализации (50 мкл буфера TAM10 плюс 0,5 мкл растворов дезокси, глюкозы и тролокса). Хорошо перемешайте буфер.
  17. Промывайте камеру 30 мкл буфера визуализации.
  18. Настройте камеру на получение 100 мс/кадр, 16 бит, 4 x 4 биннинга.
  19. Нажмите на верхний затвор Вкл и лампу Выкл.
  20. Начните сбор камеры. Разложите изображения по трем окнам, представляющим две отдельные камеры и наложение.
  21. Нажмите кнопку Автофокус. Тонкая настройка, чтобы найти лучший фокус.
  22. Нажмите на метод. Задайте точки поля, хранилище файлов и номер цикла.
  23. Нажмите кнопку Выполнить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится новое окно с изображением в режиме реального времени. Ход выполнения временных рядов и полей зрения отображается в верхней части окна.
  24. После завершения получения изображения закройте всплывающее окно.
  25. Откройте файл ND (полученный файл).
  26. Нажмите на ROI / простой редактор ROI. Выберите параметр Круг.
  27. Выберите рентабельность инвестиций в изображение. Нажмите кнопку Готово, когда она будет завершена.
  28. Нажмите Измерение / Измерение времени, чтобы отобразить данные либо в виде графика, либо в виде электронной таблицы.
  29. Откройте вкладку Экспорт. Задайте параметры экспорта.
  30. Нажмите «Экспорт», чтобы сохранить интенсивность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

smFRET имел рибосому, помеченную в среднем положении трафика тРНК, чтобы отличить транслокацию тРНК от А- к P-сайту(рисунок 1)15. Расстояние от остатка маркировки L27 до тРНК A- или P-сайта составляет соответственно 52 или 61 Å, что соответствует эффективности FRET 0,47 и 0,65. После сбора изображений интенсивность флуоресценции из донорского и акцепторного каналов была извлечена и нанесена на график в виде временных промежутков(рисунок 1). Эффективность ФРЕТа рассчитывалась по формуле Iакцептор/(Iакцептор+Iдонор). Самодельная программа обнаружила одноступенчатое отбеливание донора/акцептора и установила данные перед точками отбеливания, чтобы избежать расчета FRET от шумов. После донорского отбеливания оба следа приблизились к исходному уровню, поскольку возбуждение не может произойти непосредственно на акцепторе(рисунок 2А). После акцепторного отбеливания интенсивность донора увеличилась, поскольку меньшее количество реакционных путей рассеивает энергию возбуждения(рис. 2B, C).

Было установлено, что отдельные рибосомы проявляют различные флуктуации, как, например, в примерах, показанных на рисунке 2. Эти флуктуации обусловлены колеблющимся движением тРНК, что вызывает флуктуации расстояния до L2717,18. На рисунке 2пунктирные линии являются исходными данными, а сплошные линии - встроенными данными из программы. Установленные трассировки не изменяют чтение необработанных данных, но усекают покадровые следы после отбеливания. Синие следы — это рассчитанная эффективность FRET. Отслеживая точно такие же рибосомы после 5-минутной инкубации на RT, было обнаружено, что один тип динамики может переключаться на другой23. Поскольку эти сигналы сообщают о движениях тРНК, продиктованные окружающей рибосомой, аналогичная эффективность FRET была сгруппирована в различные субпопуляции рибосом.

На рисунке 3 показаны очень разнообразные субпопуляции в комплексе PRE. Существует приблизительно 70% (640/951) колеблющихся видов и 30% (311/951) неколеблющихся видов. Эти две категории могут быть дополнительно сгруппированы в более тонкие субпопуляции. С другой стороны, на рисунке 4 показано противоположное распределение динамики. В POST 65% субпопуляций не колеблются, и большинство из них продемонстрировали высокую эффективность FRET. Эти результаты показывают, что рибосома более гибкая в состоянии PRE, чем в состоянии POST, что подтверждает крио-ЭМ-исследование, которое пришло к выводу, что пептидильная цепь в P-сайте блокирует динамику рибосом в состоянии POST. Однако в состоянии PRE пептидильная цепь переносится на А-сайт, разблокируя рибосому и продвигая5. Результаты подтверждают вывод исследования структуры в более физиологических условиях. Разблокированное состояние коррелирует с храповым движением между 30S и 50S, а заблокированное состояние коррелирует с нетрещоткой конформацией.

Метод сортировки субпопуляций выявляет конформацию рибосом при ингибировании антибиотиком виомицином, как показано на рисунке 514. Общая гистограмма эффективности FRET показывает основной пик на уровне 0,47, классическое состояние, без сортировки. В этом состоянии рибосома заблокирована и разогнута. Тем не менее, сортировка субпопуляций показала, что 60% населения колеблется как разблокированный комплекс PRE. Таким образом, виомицин захватил рибосому в храповом состоянии. Результаты этого исследования противоречили результату рентгеновской структуры на момент публикации (2010), но недавно были подкреплены другим структурным исследованием (2020).

Figure 1
Рисунок 1:Положение маркировки Cy3/Cy5 на рибосоме и тРНК. Показаны расстояния между маркировочным остатком L27 и тРНК A- и P-сайта (красные и синие звезды показывают приблизительные места маркировки Cy5 и Cy3 соответственно). Показан один репрезентативный покадровый след интенсивности флуоресценции от пары CY3/Cy5 FRET. Программа обнаруживает точки отбеливания на следах донора/акцептора и усекает след до этой точки. Эта цифра была изменена с Altuntop, M.E. et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Типичные рибосомные следы были классифицированы по их различной динамике. (A) Нефлектуирующий рибосомный след. (B) Флуктуирующий рибосомный след, который только сэмплирует значения FRET ниже 0,6. (C)Флуктуирующий след рибосомы, который пробы значение FRET выше 0,6. Легенды показаны в сюжете. Интенсивность флуоресценции донора и акцептора зеленая и пурпурная соответственно. Значения FRET рассчитываются как Iакцептор/(Iакцептор+Iдонор)и строятся отдельно синим цветом. Исходные данные отображаются пунктирными линиями, а данные усекаются перед точками отбеливания в виде сплошных линий. Эта цифра была изменена с Altuntop, M.E. et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Гистограммы эффективности FRET Прекомплекса. Графики верхнего уровня показывают гистограмму FRET общих рибосом. Графики второго уровня показывают гистограммы FRET рибосом, разделенных на флуктуирующие (F) и нефтормуцирующие (NF) группы. Графики третьего уровня показывают гистограммы FRET рибосом, дополнительно разделенных на группы флуктуаций, которые были выше или ниже значения FRET 0,6. Аналогичные критерии были применены к рибосомам NF, чтобы разделить их на стабильные состояния FRET ниже или выше 0,6 (NF-низкий, NF-высокий). На участках четвертого уровня отображаются репрезентативные следы для каждой подпопуляции. Эта цифра была изменена с Altuntop, M.E. et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Гистограммы эффективности FRET ПОСТ-Комплекса. Расположение и группировка аналогичны рисунку 3. В отличие от рисунка 3,население NF-High составляет большинство. Эта цифра была изменена с Altuntop, M.E. et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Гистограммы комплекса PRE в присутствии 100 мкМ виомицина. Расположение и группировка аналогичны рисунку 3. Эта цифра была изменена с Ly, C. T. et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SmFRET чувствителен к фоновым сигналам. Сначала необходимо покрыть камеру образца 0,05% анимацией, а затем добавить одновременно с раствором рибосомы, чтобы блокировать неспецифическое связывание рибосомы с поверхностью. Чтобы увидеть флуоресценцию от акцепторного излучения Cy5, необходим коктейль поглотителя кислорода (растворы дезокси, глюкозы и тролокса). Без этого раствора отбеливание происходит слишком быстро в акцепторном канале для получения полезной информации. Другим важным шагом для экспериментов с рибосомами, в частности, является покрытие PEG на поверхности стекла. Активность рибосом чувствительна к поверхностной среде; поэтому полимеры с длительной чисткой необходимы для защиты от неблагоприятных поверхностных эффектов.

Если стадия выборки находится слишком далеко от фокуса, система автофокусировки не будет работать. Если это произойдет, выключите автофокус и вручную отрегулируйте положение цели, наблюдая за отраженным лазерным пятном. Это одно из преимуществ домашнего полного внутреннего отражения, потому что лазерное пятно видно. Когда цель находится вблизи фокуса, падающие и отраженные лазерные пятна должны находиться бок о бок, а отражающее пятно перемещается с корректировкой положения цели. Когда эти два пятна будут близки, автофокус снова заработает.

Одним из ограничений smFRET является очень низкий диапазон концентраций. Только до 50 нМ флуоресцентно меченых подложек могут быть загружены, не вызывая ингибирования фонового шума. Хотя поверхностно-связанные образцы могут требовать длительного сбора на одной и той же молекуле, временное разрешение ограничено диапазоном ms, в то время как диффузионный конфокальный smFRET может достигать динамики диапазона μs24. Другим ограничением метода FRET является точный расчет расстояния от эффективности FRET. Из-за различных линкеров красителей и сред расстояние Форстера варьируется от лаборатории к лаборатории. Поэтому сравнение абсолютного расстояния может быть проблематичным25. Хотя изменение эффективности FRET раскрывает механизм транслокации, была разработана более прямая стратегия для измерения точного покрытия рибосом на мРНК26,27.

Тем не менее, использование значений FRET в качестве относительных ссылок для различения неоднородных популяций в пределах одной экспериментальной установки является мощным методом выявления механизма и динамики одной молекулы за раз, что недоступно обычными методами. Кроме того, многоцветный FRET и комбинация FRET с оптической ловушкой раскроют более организованную динамику рибосом в будущем28. Эти разработки обеспечивают беспрецедентную чувствительность (смещение Å-расстояния) и новые параметры (такие как силы пико-ньютоновской величины), которые недостижимы существующими методами28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ю. Ван заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения США (R01GM111452) и Фондом Уэлча (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Tags

Биохимия выпуск 173
Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. Single Molecule… More

Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter