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Biochemistry

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar pasos no limitantes de velocidad e intermedios clave poco poblados, a los que no son accesibles los métodos de conjunto convencionales debido al efecto promedio.

Abstract

El ribosoma es un gran complejo de ribonucleoproteínas que ensambla proteínas procesivamente a lo largo de plantillas de ARNm. El diámetro del ribosoma es de aproximadamente 20 nm para acomodar grandes sustratos de ARNt en los sitios A, P y E. En consecuencia, la dinámica del ribosoma se desesfálice naturalmente rápidamente. El método de molécula única puede detectar cada ribosoma por separado y distinguir poblaciones no homogéneas, lo cual es esencial para revelar los complicados mecanismos de los sistemas de múltiples componentes. Informamos los detalles de un método smFRET basado en el microscopio invertido Nikon Ti2 para sondear la dinámica de los ribosomas entre la proteína ribosómica L27 y los ARNt. El L27 está etiquetado en su posición única Cys 53 y reconstituido en un ribosoma que está diseñado para carecer de L27. El ARNt está etiquetado en la región del codo. A medida que el ARNt se mueve a diferentes ubicaciones dentro del ribosoma durante el ciclo de elongación, como la pre y post-translocación, las eficiencias y dinámicas de FRET exhiben diferencias, lo que ha sugerido múltiples subpoblaciones. Estas subpoblaciones no son detectables por métodos de conjunto. El microscopio smFRET basado en TIRF está construido sobre un microscopio invertido manual o motorizado, con iluminación láser casera. Las muestras de ribosomas se purifican mediante ultracentrifugación, se cargan en una célula de muestra multicanal construida en casa y luego se iluminan a través de un campo láser evanescente. El punto láser de reflexión se puede utilizar para lograr el control de retroalimentación del enfoque perfecto. Las señales de fluorescencia están separadas por una torreta de filtro motorizada y recogidas por dos cámaras CMOS digitales. Las intensidades se recuperan a través del software NIS-Elements.

Introduction

El ribosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande de ø 20 nm de una subunidad grande (50S) y una pequeña (30S). Ensambla péptidos largos a lo largo de la plantilla de ARNm de manera procesiva y cooperativa. El ribosoma 30S se une al fMet-tRNAfMet y al ARNm para iniciar la síntesis de proteínas, y el 50S luego se une para formar el complejo de iniciación 70S. Los ARNt llevan aminoácidos al ribosoma en el sitio A (sitio de unión aminoacil-ARNt), mientras que la cadena peptidilada alargada se mantiene en el sitio P (sitio de unión peptidil-ARNt). En el complejo de pre-translocación, la cadena de peptidil se transfiere al ARNt en el sitio A con un aminoácido añadido. Mientras tanto, el ARNt del sitio P está desacilado. Luego, los ARNt A-, P- se mueven a los sitios P-, E- para formar el complejo post-translocación, en el que el sitio E representa el sitio de salida del ARNt. En este estado, el PEPTIDIL-ARNt se mueve de vuelta al sitio P. El ciclo de elongación continúa entre las pre y postconformaciones mientras que el ribosoma se transloca en el ARNm, un codón a la vez1. El ribosoma es altamente coordinativo de diferentes sitios funcionales para hacer que este proceso sea eficiente y preciso, como el trinquete intersubunidad2,las fluctuaciones de hibridación de ARNt3,las activaciones de GTPasa4,la apertura-cierre del tallo L15,etc. En consecuencia, los ribosomas se desespaspas rápidamente porque cada molécula se mueve a su propio ritmo. Los métodos convencionales solo pueden deducir parámetros medios aparentes, pero las especies poco pobladas o de corta duración se enmascararán en el efecto medio6. El método de molécula única puede romper esta limitación detectando cada ribosoma individualmente, luego identificar diferentes especies a través de la reconstrucción estadística7. Se han implementado diferentes sitios de etiquetado para sondear la dinámica de los ribosomas, como las interacciones entre tRNA-ARNt8,EF-G-L119,L1-ARNt10,etc. Además, al etiquetar las subunidades grandes y pequeñas, respectivamente, se observa la cinética de trinquete entre subunidades y la coordinación con los factores11,12. Mientras tanto, el método smFRET tiene amplias aplicaciones en otros procesos biológicos centrales, y están surgiendo métodos FRET multicolor13.

Anteriormente se desarrolló un nuevo par de RIBOSOMAS FRET14,15. La proteína ribosómica recombinante L27 ha sido expresada, purificada y etiquetada, e incorporada de nuevo al ribosoma. Esta proteína interactuó con los ARNt a corta distancia y ayudó a estabilizar el ARNt del sitio P en el complejo post-translocación. Cuando el ARNt se mueve del sitio A- al P, la distancia entre esta proteína y el ARNt se acorta, lo que puede distinguirse por la señal smFRET. Se han identificado múltiples subpoblaciones de ribosomas utilizando métodos estadísticos y mutagénesis, y el intercambio espontáneo de estas poblaciones en el complejo pre- pero no post- translocación sugiere que el ribosoma es más flexible antes de moverse sobre el ARNm, y más rígido durante la decodificación16,17,18. Estas variaciones son esenciales para la función del ribosoma. Aquí, el protocolo describe los detalles del etiquetado ribosómico/ARNt, su incorporación en el ribosoma, la preparación de muestras smFRET y la adquisición/análisis de datos19.

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Protocol

1. Preparación de ribosoma y ARNt etiquetados para la detección de FRET

  1. Aislar ribosoma sin L27 de la cepa de E. coli IW312 según protocolos estándar20,21. Extraiga el ribosoma regular de la cepa MRE600 de E. coli.
  2. Clonar el gen rpmA de L27 con C-terminal His-tag en plásmido pET-21b (+), que se transforma y se expresa en células BL21(DE3)pLysS15. Purificar la proteína a través de una columna de sefalrosa preenvasada.
  3. Etiquetado de L27
    1. Incubar 20-100 μM de L27 purificado en 100 μL con un exceso de 2-10 veces de TCEP (Tris-2-carboxietil-fosfina) a temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Intercambio de búfer de la solución en búfer PBS(10mM Na 2 HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), utilizando una columna nap-5. Agregue 10 veces el exceso de colorante monoreactivo Cy5-maleimida en DMSO en la solución e incube a RT en la oscuridad durante 2 h.
    2. Cargue la solución de proteína etiquetada (500 μL) mencionada anteriormente en una columna Nap-5 para eliminar el exceso de colorante. Asegúrese de que la proteína elute en la primera banda de color, seguida por el colorante libre elute en la segunda banda, respectivamente. Recoger la proteína eluida en 1 mL de tampón TAM10 (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA y 7 mM BME (2-mercaptoetanol)).
  4. Reconstituir el ribosoma con L27. Mezclar la proteína L27 etiquetada con una cantidad igual de ribosoma IW312 en tampón TAM10 e incubar a 37 °C durante 1 h. Retire la proteína libre mediante ultracentrifugación de cojín de sacarosa (100.000 x g,durante la noche) para permitir que el ribosoma forme una bolita de color azul en la parte inferior del tubo.
  5. Etiquetar el ARNtPhe según el informe publicado anteriormente22. Primero, incubar el ARNt (10 A260 en 1 mL de agua) con 100 μL de NaBH4 (100 mM de stock, añadiendo gota a gota) a 0 °C durante 1 h. Libere los ARNs de NaBH4 no reaccionado a través de la precipitación de etanol tres veces agregando 1/10 de volumen de 3 M KAc (pH 5.0) y 2.5x volumen de etanol. Incubar el ARNt reducido con 1 μL de solución de colorante Cy3-NHS (1 mg en 10 μL de DMSO) en un volumen mínimo (~20 μL) de formiato de sodio 0,1 M (pH 3,7). Después de 2 h de incubación a 37 °C, separe el ARNt del colorante no reaccionado a través de una pequeña columna de Sephadex G25 y luego retire el colorante libre mediante precipitación de etanol dos veces.

2. Preparación de los complejos de ribosomas

  1. Expresar y purificar las proteínas marcadas con His de IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts y SINTETASAS de ARNt utilizando métodos estándar15.
  2. Preparar la mezcla de iniciación añadiendo los siguientes ingredientes en tampón TAM10 a 37 °C durante 15 min: 1 μM del ribosoma etiquetado; 1,5 μM cada uno de IF1, IF2 e IF3; ARNm biotinilado de 2 μM (que codifica MF para los dos primeros aminoácidos); 4 μM de fMet-tRNAfMetcargado; y 1 mM GTP.
  3. Prepare la mezcla EF-Tu_G mezclando los siguientes ingredientes en tampón TAM10 a 37 °C durante 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP y 0,02 mg/mL de piruvato quinasa.
  4. Prepare la mezcla EF-Tu_NoG similar al paso 2.3 sin EF-G.
  5. Prepare la mezcla de Phe mezclando los siguientes ingredientes en agua libre de nucleasa a 37 °C durante 15 min: 100 mM Tris (pH 7.5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM de fenilalanina sintetasa específica, 2 A260/mL de ARNtPheetiquetado y 50 μM de fenilalanina.
  6. Prepare el complejo de pre-translocación (PRE) mezclando las mezclas de iniciación, EF-Tu_NoG y Phe en la proporción de 1:2:2, a 37 °C durante 2 min. Después de la incubación, purificar el PRE por 1,1 M de cojín de sacarosa ultracentrifugación durante la noche a 100.000 x g.
  7. Prepare el complejo post-translocación (POST) mezclando las mezclas de iniciación, EF-Tu_WG y Phe en la proporción de 1:2:2, a 37 °C durante 10 min. Después de la incubación, purificar el POST por 1,1 M de cojín de sacarosa ultracentrifugación durante la noche a 100.000 x g.

3. Preparación de diapositivas de muestra

  1. Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio (75 mm x 25 mm) que contienen seis pares de orificios (1 mm de diámetro). Cada par forma una entrada-salida de la cámara de muestra. Asegúrese de que la distancia entre cada orificio de entrada-salida sea de 13 mm y la distancia de centro a centro entre dos canales sea de 6 mm. Coloque seis diapositivas en un crisol de vidrio.
  2. Llena el crisol con acetona y sonica durante 5 min. Decantar la acetona y enjuagar los portaobjetos tres veces con agua ultrapura. Llene el crisol de nuevo con agua y 1 mL de 10 M KOH. Sonicar durante 20 min.
  3. Enjuague los toboganes tres veces con agua ultrapura. Llene el crisol nuevamente con etanol y sonicato durante 5 min. Decantar completamente el disolvente. Deje que las diapositivas se sequen en la campana de humos.
  4. Limpie las cubiertas de vidrio del microscopio (espesor #1.5, 24 x 40 mm). Realice los pasos de limpieza como se describe en los pasos 3.1-3.3.
  5. Hornea los toboganes y fundas limpias a 300 °C durante 3 h. Manténgalos en el horno durante la noche para que se enfríen.
  6. Cubra el cobierno con aminosilano. En el crisol que contiene fundas, vierta la mezcla de metanol (100 ml de metanol, 5 ml de agua, 0,5 ml de HAc y 1 ml de aminosilano). Caliente el crisol en un baño de agua durante 10 minutos, sonicarlo durante 10 minutos y luego caliente el crisol en el baño de agua durante otros 10 minutos. Decantar la mezcla de metanol, enjuagar bien el coverslip en tres crisoles de agua limpia. Purgue las superficies con una corriente de nitrógeno seco a través de una aguja.
  7. Cubra las fundas con biotina-PEG en una campana laminar limpia.
    1. Para hacer la solución de PEG, use 98 mg de PEG y 2-3 mg de biotina-PEG en 200 μL de 100 mM de solución de NaHCO3.
    2. Coloca una cubierta plana sobre una superficie. Deje caer cuidadosamente 60 μL de solución de PEG en el borde superior. Luego, coloca otro coverslip encima, dejando que el efecto capilar extienda la solución entre los dos coverslips. Asegúrese de que no se formen burbujas.
    3. Repita el paso 3.7.2 para dos pares más de fundas. Cubra seis piezas de fundas con biotina. Si se necesitan más hojas de cubierta, ajuste la cantidad de PEG y Peg de biotina en consecuencia para hacer más solución de PEG.
    4. Guarde estos recuestos en una caja de punta vacía llena de agua e incube durante 3 h en la oscuridad.
    5. Después de 3 h, separe las cubiertas, enjuague con agua en tres crisoles consecutivos y purgue con una corriente de nitrógeno seco. Coloque las fundas recubiertas en un estante de cerámica. Marque la superficie con recubrimiento.
  8. Montar las cámaras de muestra19.
    1. Tire de las puntas de pipeta afiladas a través de los orificios de los portaobjetos de vidrio hasta que quepan bien. Raspe los extremos afilados hasta que estén completamente planos a la superficie del vidrio. Corte el otro extremo de la punta para que sea de aproximadamente 5 mm para la carga de la muestra.
    2. Corta una cinta de doble cara con el patrón de canal (25 x 40 mm).
    3. Pegue la cinta de doble cara en los toboganes de vidrio en el lado plano.
    4. Pegue la funda recubierta en la cinta de doble cara. Presione sobre él para hacer un sello hermético de la cámara de muestra. Asegúrese de que el lado recubierto esté orientado hacia adentro.

4. Imágenes FRET de molécula única

  1. Encienda el equipo.
  2. Encienda el interruptor del microscopio.
  3. Inicie la interfaz de control láser y encienda el láser. Presione el botón de activación en la caja de control del láser para calentar el láser.
  4. Encienda las cámaras.
  5. Inicie el programa de software asociado al microscopio. Haga clic en el obturador superior Desactivado y haga clic en la luz Encendida.
  6. Prepare el búfer TAM10_WT agregando 10 μL de Tween-20 al 5% en 1 ml de tampón TAM10.
  7. Prepare la solución desoxi pesando 3 mg de glucosa oxidasa en un pequeño tubo de microcentrífuga. Añadir 45 μL de catalasa. Vórtice suavemente para disolver el sólido. Girar a 20.000 x g en una microcentrífuga durante 1 min. Toma el sobrenadante.
  8. Preparar solución de glucosa al 30% en agua y solución de Trolox al 200 mM en DMSO.
  9. Preparar 0,5 mg/ml de solución de estreptavidina en agua libre de nucleasas.
  10. Agregue una gota de aceite de imagen al objetivo TIRF.
  11. Coloque las cámaras de muestra en el objetivo.
  12. Llene la cámara con 10 μL de solución de estreptavidina. Espere 1 min.
  13. Lave la cámara con 30 ml de tampón de TAM10_WT y recoja la solución de correntía con un papel de filtro doblado. Espere 1 min.
  14. Diluir los complejos de ribosomas (PRE o POST) a una concentración de 10-50 nM con TAM10_WT tampón.
  15. Cargue 20 μL de la muestra de ribosoma en el canal. Espere 2 min.
  16. Haga el tampón de imágenes (50 μL de tampón TAM10 más 0,5 μL cada una de las soluciones de desoxi, glucosa y Trolox). Mezcle bien el amortiguador.
  17. Enjuague la cámara con 30 μL del tampón de imágenes.
  18. Configure la cámara para que adquiera 100 ms/frame, 16 bits, 4 x 4 binning.
  19. Haga clic en el obturador superior Encendido y la lámpara Apagada.
  20. Inicie la adquisición de la cámara. Distribuya las imágenes en tres ventanas que representan dos cámaras individuales y la superposición.
  21. Haga clic en Enfoque automático. Ajuste fino para encontrar el mejor enfoque.
  22. Haga clic en un método. Establezca los puntos de campo, el almacenamiento de archivos y el número de bucle.
  23. Haga clic en Ejecutar.
    NOTA: Aparece una nueva ventana con imágenes en tiempo real. El progreso de la serie temporal y la serie de campo de visión se muestran en la parte superior de la ventana.
  24. Una vez completada la adquisición de la imagen, cierre la ventana emergente.
  25. Abra el archivo ND (archivo adquirido).
  26. Haga clic en ROI / editor de ROI simple. Elija la opción Círculo.
  27. Seleccione el ROI en la imagen. Haga clic en Finalizar cuando esté completo.
  28. Haga clic en Medición / Medición de tiempo para mostrar los datos como una gráfica o como una hoja de cálculo.
  29. Abra la pestaña Exportar. Establezca los parámetros de exportación.
  30. Haga clic en Exportar para guardar las intensidades.

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Representative Results

El smFRET tenía el ribosoma etiquetado en la posición media del tráfico de ARNt, para distinguir la translocación del ARNt del sitio A- al P (Figura 1)15. La distancia desde el residuo de etiquetado L27 hasta el ARNt del sitio A o P es de 52 o 61 Å, respectivamente, lo que corresponde a una eficiencia FRET de 0,47 y 0,65. Después de la recolección de imágenes, las intensidades de fluorescencia de los canales donante y aceptor se recuperaron y trazaron como lapsos de tiempo(Figura 1). La eficiencia fret se calculó mediante la fórmula Iaceptor/(Iaceptor+Idonante). Un programa casero detectó el blanqueamiento de un solo paso del donante/aceptor y ajustó los datos antes de los puntos de blanqueo para evitar el cálculo de FRET a partir de ruidos. Después del blanqueamiento del donante, ambos rastros se acercaron a la línea de base porque no puede ocurrir excitación directamente en el aceptor(Figura 2A). Después del blanqueamiento del aceptor, la intensidad del donante aumentó porque menos vías de reacción disipan la energía de excitación(Figuras 2B, C).

Se encontró que los ribosomas individuales exhiben diferentes fluctuaciones, como en los ejemplos mostrados en la Figura 2. Estas fluctuaciones se deben al movimiento tambaleante de los ARNs, lo que provoca fluctuaciones de distancia a la L2717,18. En la Figura 2,las líneas punteadas son los datos originales, y las líneas sólidas son los datos ajustados del programa. Los rastros ajustados no cambian la lectura de datos sin procesar, sino que truncan los rastros de lapso de tiempo después del blanqueo. Los rastros azules son las eficiencias FRET calculadas. Al rastrear exactamente los mismos ribosomas después de 5 minutos de incubación en RT, se encontró que un tipo de dinámica puede cambiar a otro23. Debido a que estas señales informan sobre los movimientos de ARNt dictados por el ribosoma circundante, las eficiencias FRET similares se agruparon en varias subpoblaciones de ribosomas.

La Figura 3 muestra subpoblaciones muy diversas en el complejo PRE. Hay aproximadamente el 70% (640/951) de especies fluctuantes y el 30% (311/951) de especies no fluctuantes. Estas dos categorías se pueden agrupar en subpoblaciones más finas. Por otro lado, la Figura 4 muestra la distribución dinámica opuesta. En POST, el 65% de las subpoblaciones no fluctúan, y la mayoría de ellas exhibieron una alta eficiencia FRET. Estos resultados indican que el ribosoma es más flexible en el estado PRE que en el estado POST, lo que corrobora un estudio crio-EM que concluyó que la cadena peptidil en el sitio P bloquea la dinámica del ribosoma en el estado POST. Sin embargo, en el estado PRE, la cadena de peptidil se transfiere al sitio A, desbloqueando el ribosoma y promoviendo5. Los resultados apoyaron la conclusión del estudio de estructura en condiciones más fisiológicas. El estado desbloqueado se correlaciona con el movimiento de trinquete entre los 30S y 50S, y el estado bloqueado se correlaciona con la conformación sin trinquete.

El método de clasificación de la subpoblación revela la conformación del ribosoma tras la inhibición por el antibiótico viomicina, como se muestra en la Figura 514. El histograma de eficiencia GENERAL de FRET muestra un pico importante en 0.47, el estado clásico, sin ordenar. En este estado, el ribosoma está bloqueado y sin trinquete. Sin embargo, la clasificación de las subpoblaciones ha revelado que el 60% de la población está fluctuando como el complejo PRE desbloqueado. Por lo tanto, la viomicina ha atrapado el ribosoma en el estado de trinquete. Los resultados de este estudio contradijeron un resultado de estructura de rayos X en el momento de la publicación (2010), pero fueron respaldados recientemente por otro estudio de estructura (2020).

Figure 1
Figura 1: La posición de etiquetado del Cy3/Cy5 en el ribosoma y el ARNt. Se muestran las distancias entre el residuo de etiquetado de L27 y el ARNt del sitio A y P (las estrellas rojas y azules muestran las ubicaciones aproximadas de etiquetado de Cy5 y Cy3, respectivamente). Se muestra un rastro representativo de lapso de tiempo de las intensidades de fluorescencia del par CY3/Cy5 FRET. Un programa detecta puntos de blanqueamiento en los rastros de donante/aceptor y trunca el rastro antes de ese punto. Esta figura ha sido modificada a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las trazas típicas de ribosomas se clasificaron por sus diferentes dinámicas. (A) Traza de ribosoma no fluctuante. (B) Traza de ribosoma fluctuante que sólo muestra valores FRET inferiores a 0,6. (C) Traza de ribosoma fluctuante que muestra un valor FRET superior a 0,6. Las leyendas se muestran en la trama. Las intensidades de fluorescencia del donante y del aceptor son verde y magenta, respectivamente. Los valores de FRET se calculan comoaceptorI /(aceptor+ Idonante)y se trazan por separado en azul. Los datos originales se muestran en líneas punteadas y los datos truncados antes de que los puntos de blanqueo se muestren en líneas sólidas. Esta figura ha sido modificada a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Histogramas de eficiencia FRET del Pre-complejo. Las gráficas de primer nivel muestran el histograma FRET de los ribosomas totales. Las gráficas de segundo nivel muestran los histogramas FRET de los ribosomas separados en grupos fluctuantes (F) y no fluctuantes (NF). Los gráficos de tercer nivel muestran los histogramas FRET de los ribosomas separados en grupos de fluctuaciones que estaban por encima o por debajo de un valor FRET de 0,6. Se aplicaron criterios similares a los ribosomas NF para separarlos en estados FRET estables por debajo o por encima de 0.6 (NF-bajo, NF-alto). Las gráficas de cuarto nivel muestran las trazas representativas de cada subpoblación. Esta figura ha sido modificada a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Histogramas de eficiencia FRET de POST-Complex. La disposición y la agrupación son similares a la Figura 3. Contrariamente a la Figura 3,la población NF-Alta es la mayoría. Esta figura ha sido modificada a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Histogramas del complejo PRE en presencia de viomicina de 100 μM. La disposición y la agrupación son similares a la Figura 3. Esta cifra ha sido modificada a partir de Ly, C. T. et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

SmFRET es sensible a las señales de fondo. Primero, es necesario recubrir la cámara de muestra con una interpolación al 0,05% y luego agregarse simultáneamente con la solución de ribosoma para bloquear la unión no específica del ribosoma a la superficie. Para ver la fluorescencia de la emisión de Cy5 aceptor, el cóctel eliminador de oxígeno (soluciones deoxy, glucosa y Trolox) es esencial. Sin esta solución, el blanqueo es demasiado rápido en el canal aceptor para obtener información útil. Otro paso crítico para los experimentos de ribosomas, específicamente, es el recubrimiento PEG en la superficie del vidrio. La actividad del ribosoma es sensible al ambiente de la superficie; por lo tanto, los polímeros de cepillado largo son esenciales para proteger los efectos desfavorables de la superficie.

Si la etapa de muestra está demasiado lejos del foco, el sistema de enfoque automático no funcionará. Si esto sucede, apague el enfoque automático y ajuste manualmente la posición del objetivo mientras observa el punto láser reflejado. Esta es una ventaja de una iluminación de reflexión interna total construida en casa porque el punto láser es visible. Cuando el objetivo está cerca del foco, los puntos láser incidentes y reflejados deben estar uno al lado del otro, y el punto reflectante se mueve con el ajuste de la posición del objetivo. Cuando estos dos puntos están cerca, el enfoque automático volverá a funcionar.

Una limitación de smFRET es el rango de concentración muy bajo. Solo se pueden cargar hasta 50 nM de sustratos etiquetados fluorescentemente sin causar inhibición del ruido de fondo. Aunque las muestras unidas a la superficie pueden requerir una adquisición a largo plazo en la misma molécula, la resolución temporal se limita al rango ms, mientras que el smFRET confocal basado en difusión puede alcanzar dinámicas del rango μs24. Otra limitación del método FRET es el cálculo preciso de la distancia desde la eficiencia FRET. Debido a los diferentes enlazadores de tinte y entornos, la distancia de Forster varía de un laboratorio a otro. Por lo tanto, comparar la distancia absoluta puede ser problemático25. Aunque el cambio de eficiencia fret revela el mecanismo de translocación, se desarrolló una estrategia más directa para medir la cobertura exacta del ribosoma en el ARNm26,27.

Sin embargo, el uso de valores FRET como referencias relativas para distinguir poblaciones no homogéneas dentro de un entorno experimental es un método poderoso para revelar el mecanismo y la dinámica de una molécula a la vez, que no es accesible con los métodos convencionales. Además, el FRET multicolor y la combinación de FRET con una trampa óptica revelarán una dinámica de ribosomas más orquestada en el futuro28. Estos desarrollos están proporcionando una sensibilidad sin precedentes (desplazamiento de la distancia Å) y nuevos parámetros (como fuerzas de magnitud pico-Newton) que no son alcanzables con los métodos existentes28.

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Disclosures

Y. Wang declara que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01GM111452) y la Fundación Welch (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

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References

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Bioquímica Número 173
Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas
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Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

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