Summary
缺血性心脏病的心肌基因疗法对未来的治疗前景广阔。在这里，我们介绍了一个大型动物模型，用于评估基因治疗在缺血性心脏中的疗效。
Abstract
冠状动脉疾病是全球死亡和发病的重要原因之一。尽管目前的治疗方法取得了进展，但仍有相当一部分冠状动脉疾病患者仍有症状。基因治疗介导的治疗性血管生成为改善心肌灌注和缓解症状提供了一种新的治疗方法。具有不同血管生成因子的基因治疗已在少数临床试验中进行了研究。由于该方法的新颖性，心肌基因治疗的进展是从工作台到床边的连续路径。因此，需要大型动物模型来评价其安全性和有效性。大型动物模型识别原始疾病和临床使用的终点越多，临床试验的结果就越可预测。在这里，我们介绍了一个大型动物模型，用于评估基因治疗在缺血性猪心脏中的疗效。我们使用临床相关的成像方法，例如超声成像和 15H2O-PET。为了靶向基因转移到所需区域，使用电解剖图谱。该方法的目的是：（1）模拟慢性冠状动脉疾病，（2）在心脏缺氧区域诱导治疗性血管生成，以及（3）通过使用相关终点评估基因治疗的安全性和有效性。
Introduction
冠状动脉疾病占全球死亡率和疾病负担的很大一部分1。目前的治疗策略是经皮介入治疗、药物治疗和搭桥手术2。然而，尽管这些目前的治疗方法取得了进展，但许多患者患有所谓的难治性心绞痛，突显了对新治疗方法的未满足需求3。基因治疗介导的治疗性血管生成可以针对这一患者群体。
心肌基因治疗最常使用不同的病毒载体，最常见的是复制缺陷腺病毒4。作为治疗基因，使用各种血管生成生长因子。研究最实质性的血管生成生长因子是血管内皮生长因子（VEGF），它通过血管内皮生长因子受体（VEGFRs）及其辅助受体介导其血管生成信号传导5。一些临床试验已经证明了心脏基因治疗的益处和安全性，并使这种新颖的治疗方法成为治疗缺血性心脏病的现实选择6，7。然而，这一概念仍然需要在进入临床之前在大型动物模型中对治疗基因和病毒载体进行测试。猪经常被用作实验动物，因为它的心脏与人类心脏非常相似。猪心血管系统的大小允许使用与人类类似的导管发明。所有可用于人类的成像方式都可用于猪8。
有几种用于慢性缺血的大型动物模型。最常用的是ameroid 收缩器型号 9，10，11。这种方法的缺点是侵入性，因为需要开胸术才能进入冠状动脉脉管系统。以前在我们小组中，已经开发了用于慢性心肌缺血的微创瓶颈支架模型12。本手稿中也使用这种方法来诱导心肌缺血。
尽管成像方式的年代久远，但超声成像的可用性已经有了很大的发展。例如，心肌菌株由于其新颖性，仍主要用于研究用途。心肌劳损比传统的M型射血分数测量更能反映心脏收缩功能的变化13。因此，在大型动物模型中，使用了心肌应变测量。为了评估心脏的功能，在血管造影期间还通过左心室的电影成像来测量心输出量。在静息时和多巴酚丁胺诱导的应激下测量心输出量，以评估应激下的心肌功能。
除了心脏功能的测量外，心肌灌注的信息在旨在治疗血管生成的基因治疗研究中也是必不可少的。在该动物模型中，用15个O标记的放射性水正电子发射断层扫描（15H2O-PET）对动物进行成像，因为这是测量心肌灌注的黄金标准。15H2O-PET先前已被验证用于测量缺血性猪心脏的灌注14。
因此，上述方法和方式构成了评估缺血性心脏基因治疗疗效的绝佳视角。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这里介绍的实验是使用大约10周大的雌性家猪进行的，并得到了芬兰动物实验委员会的批准。在协议开始时，动物重30-40公斤，允许人类使用相同的程序设备和成像方式。慢性缺血在基因转移前14天诱导，基因转移后的随访时间取决于所使用的病毒载体。研究方案如图 1所示。该方案可用于进行腺病毒或AAV介导的基因治疗注射。样品采集时间必须调整到转基因表达峰，这取决于所使用的病毒载体。例如，在进行腺病毒基因转移时，样本采集时间设置为基因转移后 6 天。
1. 药物
- 给予每日剂量200mg胺碘酮和2.5mg比索洛尔，以预防致命的室性心律失常。药物在缺血手术前1周开始，每天持续到随访。
- 此外，在缺血手术前1天向动物口服剂量的氯吡格雷（300mg）和乙酰水杨酸（300mg），以防止支架放置后的急性支架内血栓形成。
- 在缺血手术开始时静脉给予动物 100 mg 利多卡因和 2.5 mL （246 mg/mL） MgSO4 ，以防止室性心律失常。
- 在每次手术开始时肌内注射头孢呋辛（500mg）以预防感染。
- 在缺血手术开始时静脉注射30mg依诺肝素，并在手术程序后皮下注射以预防血栓形成。
- 对于麻醉和镇痛，以 15 mg/kg/h 的速率给予 1.5 mL 阿托品、6 mL 阿扎哌酮 （40 mg/mL）、20 mg/mL 丙泊酚和 50 μg/mL 的芬太尼。每头猪的药物剂量相同。剂量管理请参考当地动物使用指南。
- 在所有手术中麻醉动物。所有操作都应使用无菌技术在无菌环境中进行。
2.经胸超声心动图
- 在缺血手术、基因转移和安乐死前进行经胸超声心动图检查，以评估任何可检测到的心包液并确定心肌应变。
- 将换能器放置在猪腋下的第三或第四肋间隙，以访问二尖瓣水平、肌和顶端水平的胸骨旁短轴视图（视频 1）。换能器的标记应指向猪的胸骨。若要存储剪辑，请按 “获取”。
3.透视引导下的血管内手术
- 在缺血手术、基因转移和组织采集之前进行冠状动脉造影后进行左心室电影成像。
- 手术准备
- 通过肌肉注射1.5mL阿托品和6mL阿哌隆使猪镇静来准备手术。
- 镇静后，分别以15mg / kg / h和10μg/ kg / h的剂量诱导猪进行血管造影程序的一般丙泊酚和芬太尼麻醉。
注意：猪在整个过程中都经过麻醉。 - 通过插管和呼吸机支持通气，并监测重要的生理参数，如心电图和呼吸参数。
- 介绍人护套放置
- 将引入鞘放入右股动脉进行所有手术，作为心脏病学的标准做法。使用超声波跟踪股动脉并用入口针（18 G）刺穿它。
注意：使用8F引入鞘进行心肌内基因转移，使用6F鞘进行所有其他操作。将鞘的导丝穿过针头以穿动脉，并在取下针头时保持导丝静止。 - 沿导丝插入导丝，放置时取下导丝，向猪施用舌下硝酸盐1.25mg，诱导冠状动脉血管舒张。
- 将引入鞘放入右股动脉进行所有手术，作为心脏病学的标准做法。使用超声波跟踪股动脉并用入口针（18 G）刺穿它。
- 冠状动脉造影
- 在缺血手术、基因转移和组织采集前直接进行冠状动脉造影。血管造影所需的机器如图 2所示。
- 在透视引导下使用6F导管和碘造影剂对右冠状动脉和左升冠状动脉进行成像（视频2）。
- 静息和多巴酚丁胺应激下的左心室电影成像
- 使用自动注射器通过 5F 尾纤导管将 21 mL 碘造影剂推注至左心室。首先，将推注持续时间设置为 3 秒，总体积设置为 21 mL。然后，按“单个”和“是”。
- 通过血管造影工作站的测量软件计算射血分数。要执行计算，请选择相关图像的心室分析。滚动图像以选择一个时间范围，一个在舒张期，一个在收缩期。选择一个工具来绘制每个时间范围的心室轮廓。
注意：软件现在通过辛普森方法计算射血分数和冲程体积。射血分数测量在休息期间和多巴酚丁胺诱导的应力下进行。
- 应力成像
- 静脉注射多巴酚丁胺，剂量从 10 μg/kg/min 递增至 20 μg/kg/min，用于多巴酚丁胺诱导的负荷成像，直到达到 160 次/分的目标心率。然后，执行电影成像。
- 缺血手术
- 在基因转移前 14 天将瓶颈支架放入左冠状动脉 （LAD） 以诱发慢性心肌缺血。瓶颈支架放置后，检查瓶颈支架是否正确放置，限制冠状动脉血流。
注意：瓶颈支架放置在扩张导管上，由裸金属支架组成，该支架由以瓶颈形状形成的聚四氟乙烯管覆盖，以减少冠状动脉血流量9。
- 在基因转移前 14 天将瓶颈支架放入左冠状动脉 （LAD） 以诱发慢性心肌缺血。瓶颈支架放置后，检查瓶颈支架是否正确放置，限制冠状动脉血流。
- 定义支架尺寸
- 使用血管造影工作站中的自动测量软件，根据血管造影中左升冠状动脉的大小选择支架的尺寸，3.0/3.5/4.0 x 8 mm（视频3）12。
- 支架放置
- 将线圈放在左侧冠状动脉上，然后将瓶颈支架滑向 LAD，将其放置在第一对角线的远端。
- 使用支架与管腔比为 1.3 的平减物将支架充气至动脉中的标称压力，将瓶颈固定到位。再过15秒后，放气支架并将设备从动脉中收回。
注意：通过血管造影确认瓶颈支架的正确放置。
4. 宠物成像
注意：在基因转移前一天，进行休息和压力 15O标记的放射性水PET / CT扫描（需要医院环境和放射技术人员）。
- 参考成像
- 在休息和负荷成像之前进行计算机断层扫描 （CT）。使用 CT 信息进行衰减校正。
- 15O标记放射性水成像
- 使用 800 MBq 15H2O 推注进行静息和负荷成像。
- 应力成像
- 在适当的放射性衰变12分钟后，再推注800 MBq 15O-水进行应力成像。
注意：充血是由腺苷（静脉内200μg/ kg / min）诱导的，如前所述12。
- 在适当的放射性衰变12分钟后，再推注800 MBq 15O-水进行应力成像。
5. 基因转移
- 电解剖映射
- 在冠状动脉造影和功能测量（超声心动图，左心室电影成像）后进行电解剖学映射。
- 在透视引导下，通过股骨鞘将导图导管引入左心室。
注意：用映射导管在左心室周围注册约100-150个点，以创建电解剖图。
- 完成电解剖图
- 删除异常值点以确保左心室的电解剖图更可靠。
- 为此，请选择地图的 裁剪平面 并删除与形成心室形状的点不同的点。接下来，为地图视图选择 轨迹 并删除在点注册期间水平行驶的点。
注意：确保剩余的点覆盖左心室，并在需要时记录更多点。
- 基因转移注射
- 在透视引导下通过股骨鞘将心肌内注射导管引入左心室。将注射针长度设置为 3 mm。
- 心肌注射标准
- 通过电解剖图谱系统引导基因转移，并将注射靶向到左心室的可行但运动减退的区域。
注意：为了可行性，请使用超过5 mV的单极性电压作为标准。对于运动功能减退，选择尽可能低的局部线性缩短 （LLS），至少低于 12%，但最好低于 6%13。
- 通过电解剖图谱系统引导基因转移，并将注射靶向到左心室的可行但运动减退的区域。
- 心肌内注射
- 在30秒内，将载体材料注入选择点（步骤5.4），并将注射针在心肌内再保持5秒，然后缩回以防止回流到左心室。
6. 安乐死和样本采集
注意：分别在步骤3.4.1和3.5.2中描述的冠状动脉造影和射血分数测量后，向麻醉猪静脉内施用50mL饱和氯化钾。
- 心脏灌注固定
- 从胸腔中收获心脏。用水冲洗。将 18 G 针放在主动脉瓣上方，并将针头连接到灌注泵上。用 750 mL 的 1% 多聚甲醛 （PFA） 灌注心脏。
- 样品采集
- 用锋利的菜刀将心脏切成1厘米厚的薄片。将基因转移区的样品收集到4%PFA和液氮中。
注意：要收获阴性对照，请从左心室后壁收集对照样本。
- 用锋利的菜刀将心脏切成1厘米厚的薄片。将基因转移区的样品收集到4%PFA和液氮中。
- 安全组织采集
- 从远端组织（如肺、肝、肾、脾脏和卵巢）采集样本。将样品放入 4% PFA 和液氮中。
7. 样品储存
- 将样品在4°C下在4%PFA中染色48小时。
注意：每天用新鲜液体更换PFA。- 48小时后，用去离子水中的15%蔗糖代替PFA。在将样品嵌入石蜡块之前储存至少24小时。快速冷冻样品储存在-70°C。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
缺血手术的成功可以通过该方案通过冠状动脉造影和经胸超声确定运动减退区域（图1）来确认，然后再进行基因递送。冠状动脉闭塞的状态可以通过冠状动脉造影进行评估，电解剖图谱保证缺血和冬眠区域。
基因治疗的疗效可以通过 15H2O-PET测量圆周应变，射血分数和心肌灌注来分析（图3）。通过将心脏与电解剖图进行比较，可以直接从基因转移区域收集组织样本。转基因表达和治疗性血管生成（图4）可以通过分析β-半乳糖苷酶染色后的阳性细胞数量和分析CD31染色后的心肌毛细血管区域来通过免疫组织学分析来评估。此外，可通过诊断性影像学检查（超声心动图评估心包积液）、免疫组织学和分布分析来评估基因治疗的安全性。
图1：研究方案。缺血在基因转移前14天诱导。15H2O-PET成像在基因转移前1天，安乐死和样本采集前进行。样本采集时间取决于所使用的病毒载体和治疗基因。当使用腺病毒载体时，第二个15H2O-PET分别在第5天，样品收集时间在第6天。请点击此处查看此图的大图。
图 2：血管实验室设置。 冠状动脉介入治疗所需的机器：超声机、呼吸机和血管造影站，从左到右。 请点击此处查看此图的大图。
图3：周向应变的代表性图像，以及15H2O-PET和缺血心脏的电解剖图。 15H2O-PET：红色表示最大灌注面积，蓝色表示灌注不足面积。电解剖图：电解剖图中的棕色点代表注射部位。红色表示左心室运动减退区域，而紫色表示正常收缩区域。请点击此处查看此图的大图。
图 4：β-半乳糖苷酶和 PECAM-1 染色的代表性图像。 β-半乳糖苷酶在AdLacZ转导的心脏中表达，可用于显示转基因表达。PECAM-1染色用于检测心肌毛细血管并分析毛细血管区域。下行代表远离基因转移的区域。β-半乳糖苷酶染色的比例尺：200 μm。PECAM-1染色的比例尺：100μm。 请点击此处查看此图的大图。
视频 1：经胸超声心动图短轴视图。请点击此处下载此视频。
视频2：基因转移前LAD的冠状动脉造影。 请点击此处下载此视频。
视频3：左前降动脉直径测量。请点击此处下载此视频。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议的时间点可以根据所使用的病毒载体进行修改。此外，可以根据治疗基因选择免疫组织学分析。如果需要，还可以向协议添加更多时间点和端点。
该协议包括阶段，这些阶段对于成功至关重要，之后无法纠正。首先，如果不能诱发适当的缺血，则必须将动物排除在进一步的程序和分析之外。方法和成像的标准化至关重要，以便时间点和动物之间的结果具有可比性。其次，必须从确切的基因转移区域收集样本并成功处理以进行进一步分析。此外，该协议需要对血管造影程序和不同的成像方式有深刻的熟悉。例如，冠状动脉造影和病毒注射到跳动的心脏需要广泛的培训以及进行正确的经胸超声心动图检查。然而，这些成像方式测量心肌功能和灌注，为进一步的研究提供基本信息。
猪的心血管系统由于其解剖学和生理学上的相似性而类似于人类，因此，猪通常用于模拟心血管疾病力学和程序。然而，由于动物的快速生长，随访时间限制在大约 6 个月。6个月后，动物的处理变得具有挑战性，成像质量下降。
此外，猪对动脉粥样硬化具有相当大的抵抗力，这使得饮食诱导的动脉粥样硬化在猪中建模变得复杂17。然而，已经开发了慢性缺血模型来模拟原始疾病。该方案中使用的瓶颈支架缺血模型的显着优点是支架的逐渐闭塞比突然闭塞更好地代表冠状动脉疾病。与ameroid蟒蛇模型相比，这种方法的侵入性较小。其次，经皮瓶颈支架置入是一种快速执行的程序。利用电解剖学映射系统可以将基因转移到冬眠的心肌，而不是梗死区域，这是使用超声引导靶向注射时可能的结果。然而，电解剖映射的缺点是程序的长度。此外，由于猪心脏对室性心律失常高度敏感，因此映射可以在映射过程中诱发心室颤动。然而，这些心律失常很容易除颤。
这个大型动物模型中使用的终点识别临床试验中使用的终点，增强了向临床的过渡。此外，这些方法适用于评估心肌基因治疗疗效的大型动物研究，除了该模型中描述的那些之外，还有不同的随访时间和其他辅助终点。在大型动物实验的丰富经验之后，该协议已被标准化。将来，该方案适用于在转化为临床之前评估心肌基因治疗的安全性和有效性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢Maria Hedman，Tiina Laitinen，Tomi Laitinen，Pekka Poutiainen，Annika Viren和Severi Sormunen的帮助，并允许Kuopio大学医院进行 15次O-PET成像;以及来自国家实验动物中心的Heikki Karhunen，Minna Törrönen和Riikka Venäläinen，感谢他们在动物工作方面的帮助。
这项研究得到了芬兰学院、ERC和CardioReGenix EU Horizon 2020资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
- Naghavi, M., et al. Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Davies, A., et al. Management of refractory angina: An update. European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Hammond, H. K., et al. Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).
- Hartikainen, J., et al. Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up. European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).
- Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology. Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).
- Roth, D. M., et al. Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium. The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).
- White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion. Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).
- Liu, C. -B., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia. Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).
- Rissanen, T. T., et al. The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).
- Greenberg, N. L., et al. Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility. Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).
- Grönman, M., et al. Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction. Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).
- Tarkia, M., et al. Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs. Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).
- Gyöngyösi, M., Dib, N. Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).
- Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine. Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).
