Summary
İskemik kalp hastalığı için miyokard gen tedavisi, gelecekteki terapötikler için büyük umut vaat etmektedir. Burada, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz.
Abstract
Koroner arter hastalığı tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli nedenlerinden biridir. Mevcut tedavilerin ilerlemesine rağmen, koroner arter hastalığı hastalarının önemli bir kısmı semptomatik kalmaktadır. Gen terapisi aracılı terapötik anjiyogenez, miyokard perfüzyonunu iyileştirmek ve semptomları hafifletmek için yeni bir terapötik yöntem sunmaktadır. Farklı anjiyojenik faktörlerle gen tedavisi az sayıda klinik çalışmada incelenmiştir. Yöntemin yeniliği nedeniyle, miyokard gen tedavisinin ilerlemesi tezgahtan başucuna kadar sürekli bir yoldur. Bu nedenle, güvenlik ve etkinliği değerlendirmek için büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Büyük hayvan modeli orijinal hastalığı ve kliniklerde kullanılan son noktaları ne kadar çok tanımlarsa, klinik çalışmalardan elde edilen sonuçlar o kadar öngörülebilir olur. Burada, iskemik domuz kalbindeki gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz. Ultrason görüntüleme ve 15H2O-PET gibi klinik olarak ilgili görüntüleme yöntemlerini kullanıyoruz. İstenilen bölgeye gen transferlerini hedeflemek için elektroanatomik haritalama kullanılır. Bu yöntemin amacı: (1) kronik koroner arter hastalığını taklit etmek, (2) kalbin hipoksik bölgelerinde terapötik anjiyogenezi indüklemek ve (3) ilgili sonlanım noktalarını kullanarak gen tedavisinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmektir.
Introduction
Koroner arter hastalığı, dünya çapında mortalite ve hastalık yükünün büyük bir kısmından sorumludur1. Güncel tedavi stratejileri perkütan girişimler, farmakolojik tedavi ve bypass cerrahisidir2. Bununla birlikte, bu mevcut terapötiklerin ilerlemesine rağmen, birçok hasta refrakter anjinadan muzdariptir ve bu da yeni tedavi yaklaşımlarına olan karşılanmamış ihtiyacın altını çizmektedir3. Gen tedavisi aracılı terapötik anjiyogenez bu hasta grubunu hedefleyebilir.
Miyokard gen tedavisi çoğunlukla farklı viral vektörler, en yaygın olarak replikasyon eksikliği olan adenovirüs4 kullanılarak verilir. Terapötik genler olarak, çeşitli anjiyojenik büyüme faktörleri kullanılır. En çok çalışılan anjiyojenik büyüme faktörleri, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörleri (VEGFR'ler) ve bunların ko-reseptörleri 5 yoluyla anjiyojenik sinyalleşmelerine aracılık eden vasküler endotelyal büyüme faktörleridir(VEGF'ler). Birkaç klinik çalışma, kardiyak gen tedavisinin yararını ve güvenliğini kanıtlamış ve bu yeni tedavi yöntemini iskemik kalp hastalıklarının tedavisinde gerçekçi bir seçenek haline getirmiştir 6,7. Bununla birlikte, bu kavramın kliniklere girmeden önce büyük hayvan modellerinde test edilen terapötik genlerin ve viral vektörlerin geliştirilmesine hala ihtiyacı vardır. Domuz, kalbi insan kalbine çok benzediği için sıklıkla laboratuvar hayvanı olarak kullanılmıştır. Bir domuzun kardiyovasküler sisteminin büyüklüğü, insanlarda kullanılana benzer kateter icatlarının kullanılmasına izin verir. İnsanlar için mevcut tüm görüntüleme yöntemleri domuzlarda kullanılabilir8.
Kronik iskemi için birkaç büyük hayvan modeli vardır. En sık kullanılanı ameroid konstriktör modeli 9,10,11'dir. Bu yöntemin dezavantajı, koroner vaskülatüre erişmek için torakotomi gerektiğinden invazivliktir. Daha önce grubumuzda kronik miyokard iskemisi için mini invaziv darboğaz stent modeli geliştirilmiştir12. Bu yöntem bu makalede miyokard iskemisini indüklemek için de kullanılmıştır.
Ultrasonografinin kullanılabilirliği, görüntüleme yönteminin yaşına rağmen önemli ölçüde gelişmiştir. Örneğin, miyokard suşu hala yeniliği nedeniyle araştırma kullanımındadır. Miyokard suşu, kalbin kasılma fonksiyonundaki değişiklikleri geleneksel M-modu ejeksiyon fraksiyonu ölçümünden daha iyi yansıtır13. Böylece, burada büyük hayvan modelinde, miyokard suşu ölçümü kullanılır. Kalbin fonksiyonunu değerlendirmek için, anjiyografi sırasında sol ventrikülün sineksi görüntülemesi ile kalp debisi de ölçülür. Kardiyak debi, stres altında miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için hem istirahatte hem de dobutamin kaynaklı stres altında ölçülür.
Kalp fonksiyonunun ölçümlerine ek olarak, miyokard perfüzyonu hakkında bilgi, terapötik anjiyogenezi amaçlayan gen terapisi çalışmalarında esastır. Bu hayvan modelinde, miyokard perfüzyonunu ölçmek için altın standart olduğu için hayvanlar 15 O etiketli radyosu pozitron emisyon tomografisi (15H2O-PET) ile görüntülenmektedir. 15H2O-PET daha önce iskemik domuz kalbi14'ün perfüzyonunu ölçmek için doğrulanmıştır.
Bu nedenle, yukarıda belirtilen yöntem ve modaliteler, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için mükemmel bir bakış açısı oluşturmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada sunulan deneyler yaklaşık 10 haftalık dişi evcil domuzlar kullanılarak gerçekleştirilmekte ve Finlandiya'daki Hayvan Deneyi Kurulu tarafından onaylanmaktadır. Protokolün başında 30-40 kg ağırlığındaki hayvanlar, insanlar için mümkün olduğunca aynı prosedürel ekipman ve görüntüleme yöntemlerine izin verir. Kronik iskemi, gen transferinden 14 gün önce indüklenir ve gen transferinden sonraki takip süresi, kullanılan viral vektöre bağlıdır. Çalışma protokolü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, adenoviral veya AAV aracılı gen terapisi enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örnek toplama zamanı, kullanılan viral vektöre bağlı olarak transgen ekspresyon zirvesine ayarlanmalıdır. Örneğin, adenoviral gen transferleri yapılırken, örnek toplama zamanı gen transferinden 6 gün sonrasına ayarlanır.
1. İlaç tedavisi
- Ölümcül ventriküler aritmileri önlemek için günlük 200 mg amiodaron ve 2.5 mg bisoprolol dozu uygulayın. İlaç iskemi operasyonundan 1 hafta önce başlar ve takibe kadar günlük olarak devam edilir.
- Ek olarak, stent yerleştirildikten sonra akut stent içi trombozu önlemek için iskemi operasyonundan 1 gün önce hayvanlara peroral dozlarda klopidogrel (300 mg) ve asetilsalisilik asit (300 mg) uygulayın.
- Ventriküler aritmileri önlemek için iskemi operasyonunun başlangıcında hayvanlara intravenöz olarak 100 mg lidokain ve 2.5 mL (246 mg / mL) MgSO4 uygulayın.
- Enfeksiyon profilaksisi için her ameliyatın başında kas içi sefuroksim enjeksiyonu (500 mg) uygulayın.
- 30 mg enoksaparin, iskemi operasyonlarının başlangıcında intravenöz olarak ve trombozun önlenmesi için operasyon prosedüründen sonra deri altından uygulanır.
- Anestezi ve analjezi için, 15 mg / kg / s oranında 1.5 mL atropin, 6 mL azaperon (40 mg / mL), propofol 20 mg / mL ve 10 μg / kg / s oranında fentanil 50 μg / mL uygulayın. İlaç dozajları her domuz için aynıydı. Doz uygulaması için yerel hayvan kullanım kılavuzlarına bakın.
- Tüm operasyonlar sırasında hayvanları uyuşturun. Tüm operasyonlar steril bir teknik kullanılarak steril bir ortamda yapılmalıdır.
2. Transtorasik ekokardiyografi
- Saptanabilir herhangi bir perikardiyal sıvıyı değerlendirmek ve miyokard suşunu belirlemek için iskemi operasyonu, gen transferi ve ötenaziden önce transtorasik ekokardiyografi yapın.
- Mitral kapak seviyesinde, papiller kas ve apikal seviyelerde parasternal kısa eksenli görünümlere erişmek için dönüştürücüyü domuzun koltuk altındaki üçüncü veya dördüncü interkostal boşluğa yerleştirin (Video 1). Dönüştürücünün işaretleyicisi, domuzun sternumuna işaret etmelidir. Bir klibi kaydetmek için, Al tuşuna basın.
3. Floroskopik kılavuzluk altında endovasküler operasyonlar
- İskemi operasyonu, gen transferi ve doku toplama işlemlerinden önce koroner anjiyografi sonrası sol ventrikül sinüs görüntülemesi yapılır.
- Operasyonun hazırlanması
- Domuzları 1.5 mL atropin ve 6 mL azaperon intramüsküler enjeksiyonu ile sakinleştirerek operasyonlara hazırlanın.
- Sedasyondan sonra, sırasıyla 15 mg / kg / s ve 10 μg / kg / s dozlarında domuzlara anjiyografik prosedürler için genel propofol ve fentanil anestezisi indükleyin.
NOT: Domuzlar tüm prosedür boyunca uyuşturulur. - Entübasyon ve ventilatör ile ventilasyonu destekleyin ve EKG ve solunum parametreleri gibi hayati fizyolojik parametreleri izleyin.
- Tanıtıcı kılıf yerleşimi
- Kardiyolojide standart uygulama olarak tüm ameliyatlar için sağ femoral artere tanıtıcı kılıf yerleştirin. Femoral arteri izlemek için ultrason kullanın ve bir giriş iğnesi (18 G) ile delin.
NOT: İntramyokardiyal gen transferleri için 8F tanıtıcı kılıf ve diğer tüm işlemler için 6F kılıf kullanın. Arteri iplik haline getirmek için kılıfın kılavuz telini iğneden geçirin ve iğneyi çıkarırken kılavuz teli sabit tutun. - Giriş kılıfını kılavuz tel boyunca yerleştirin ve yerleştirildiğinde, kılavuz teli çıkarın ve koroner vazodilatasyonu indüklemek için domuza 1.25 mg dil altı dinitrat uygulayın.
- Kardiyolojide standart uygulama olarak tüm ameliyatlar için sağ femoral artere tanıtıcı kılıf yerleştirin. Femoral arteri izlemek için ultrason kullanın ve bir giriş iğnesi (18 G) ile delin.
- Koroner anjiyografi
- İskemi operasyonu, gen transferi ve doku toplanmasından hemen önce koroner anjiyografi yapın. Anjiyogramlar için gerekli makineler Şekil 2'de gösterilmiştir.
- Sağ koroner arteri ve sol yükselen koroner arteri görüntülemek için iyot kontrast madde ile floroskopik kılavuzluk altında 6F kateter kullanın (Video 2).
- İstirahat ve dobutamin stres altında sol ventrikül sinüs görüntüleme
- Bir oto-enjektör kullanarak 5F pigtail kateteri aracılığıyla sol ventriküle 21 mL'lik bir iyot kontrast madde bolusu uygulayın. İlk olarak, bolus süresini 3 s ve toplam hacmi 21 mL olarak ayarlayın. Ardından, Tek ve Evet tuşlarına basın.
- Anjiyografik iş istasyonunun ölçüm yazılımı ile ejeksiyon fraksiyonunu hesaplayın. Hesaplamayı gerçekleştirmek için, söz konusu görüntünün Ventriküler Analizi'ni seçin. Biri diyastol, diğeri sistol olmak üzere bir zaman dilimi seçmek için görüntüyü kaydırın. Her zaman diliminin ventriküler ana hatlarını çizmek için bir araç seçin.
NOT: Yazılım şimdi Simpson'ın yöntemiyle ejeksiyon fraksiyonunu ve strok hacmini hesaplamaktadır. Ejeksiyon fraksiyonu ölçümü dinlenme sırasında ve dobutamin kaynaklı stres altında gerçekleştirilir.
- Stres görüntüleme
- Dobutamin kaynaklı stres görüntüleme için 10 μg / kg / dak'dan 20 μg / kg / dak'ya yükselen dozlarda, 160 bpm hedef kalp atış hızına ulaşılana kadar intravenöz olarak doz dobutamin. Ardından, sinema görüntülemeyi gerçekleştirin.
- İskemi operasyonu
- Kronik miyokard iskemisini indüklemek için gen transferinden 14 gün önce sol koroner artere (LAD) bir darboğaz stenti yerleştirin. Darboğaz stenti yerleştirildikten sonra, darboğaz stentinin doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol ederek koroner kan akışını kısıtlayın.
NOT: Darboğaz stent, bir dilatasyon kateteri üzerine yerleştirilir ve koroner kan akışını azaltmak için darboğaz şeklinde oluşturulmuş bir politetrafloroetilen tüp ile kaplanmış çıplak metal bir stentten oluşur9.
- Kronik miyokard iskemisini indüklemek için gen transferinden 14 gün önce sol koroner artere (LAD) bir darboğaz stenti yerleştirin. Darboğaz stenti yerleştirildikten sonra, darboğaz stentinin doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol ederek koroner kan akışını kısıtlayın.
- Stent boyutunun tanımlanması
- Anjiyografik iş istasyonundaki otomatik ölçüm yazılımını kullanarak anjiyogramdaki sol çıkan koroner arterin boyutuna göre stent boyutunu 3.0/3.5/4.0 x 8 mm olarak seçin (Video 3)12.
- Stent yerleştirme
- Sol koroner artere bir bobin yerleştirin ve darboğaz stentini LAD'ye kaydırın ve distal olarak ilk diyagonale yerleştirin.
- Stent-lümen oranı 1.3 olan bir in-deflatör kullanarak stentin arterdeki nominal basınca şişirin ve darboğazı yerine sabitleyin. Ek 15 saniye sonra, stenti söndürün ve ekipmanı arterden geri çekin.
NOT: Darboğaz stentinin anjiyogram ile doğru yerleştirildiğini onaylayın.
4. PET görüntüleme
NOT: Gen transferinden bir gün önce, dinlenme ve stres 15O etiketli radyosu PET / BT taramaları yapın (hastane ortamı ve radyolojik teknisyenler gerektirir).
- Referans görüntüleme
- Dinlenme ve stres görüntülemeden önce bilgisayarlı tomografi (BT) taramaları yapın. Zayıflama düzeltmesi için BT bilgilerini kullanın.
- 15O-etiketli radyosu görüntüleme
- 800 MBq 15H2O bolus kullanarak dinlenme ve stres görüntülemesi gerçekleştirin.
- Stres görüntüleme
- 12 dakikalık uygun bir radyoaktif bozunmadan sonra 800 MBq 15O-su bolusu ile stres görüntülemesi yapın.
NOT: Hiperemi, daha önce tarif edildiği gibi adenozin (200 μg / kg / dak intravenöz) ile indüklenir12.
- 12 dakikalık uygun bir radyoaktif bozunmadan sonra 800 MBq 15O-su bolusu ile stres görüntülemesi yapın.
5. Gen transferi
- Elektroanatomik haritalama
- Koroner anjiyografi ve fonksiyonel ölçümlerden (ekokardiyografi, LV sinesi görüntüleme) sonra elektroanatomik haritalamaya geçilir.
- Floroskopik kılavuzlukta femoral kılıf yoluyla sol ventriküle bir haritalama kateteri verin.
NOT: Elektroanatomik haritayı oluşturmak için haritalama kateteri ile sol ventrikülün etrafında yaklaşık 100-150 nokta kaydedin.
- Elektroanatomik haritanın bitirilmesi
- Sol ventrikülün daha güvenilir bir elektroanatomik haritasını sağlamak için aykırı değerleri silin.
- Bunu, haritanın Klip Düzlemleri'ni seçerek yapın ve ventrikül şeklini oluşturan noktalardan farklı noktaları silin. Ardından, harita görünümü için Yörüngeler'i seçin ve nokta kaydı sırasında yatay olarak hareket eden noktaları silin.
NOT: Kalan noktaların sol ventrikülü kapladığından emin olun ve gerekirse daha fazla nokta kaydedin.
- Gen transferi enjeksiyonları
- Floroskopik kılavuzluk altında femoral kılıf yoluyla sol ventriküle intramiyokardiyal enjeksiyon kateteri sokulmalıdır. Enjeksiyon iğnesi uzunluğunu 3 mm'ye ayarlayın.
- İntramiyokardiyal enjeksiyonlar için kriterler
- Elektroanatomik haritalama sistemi ile gen transferlerini yönlendirin ve enjeksiyonları sol ventrikülün canlı fakat hipokinetik bölgelerine hedefleyin.
NOT: Uygulanabilirlik için, kriter olarak 5 mV'un üzerinde tek kutuplu bir voltaj kullanın. Hipokinezi için, mümkün olduğunca düşük, en az% 12'nin altında ancak tercihen% 6'nın altında13 yerel doğrusal kısaltma (LLS) seçin.
- Elektroanatomik haritalama sistemi ile gen transferlerini yönlendirin ve enjeksiyonları sol ventrikülün canlı fakat hipokinetik bölgelerine hedefleyin.
- İntramyokard enjeksiyonları
- 30 s boyunca, vektör materyalini seçim noktasına enjekte edin (adım 5.4) ve sol ventriküle geri akışı önlemek için geri çekilmeden önce enjeksiyon iğnesini miyokardın içinde 5 saniye daha tutun.
6. Ötenazi ve örnek toplama
NOT: Sırasıyla 3.4.1 ve 3.5.2 adımlarında açıklanan koroner anjiyografi ve ejeksiyon fraksiyonu ölçümlerinden sonra, anestezi uygulanan domuza intravenöz olarak 50 mL doymuş potasyum klorür uygulayın.
- Kalbin perfüzyon fiksasyonu
- Kalbi göğüs boşluğundan toplayın. Su ile durulayın. Aort kapağının üzerine 18 G'lik bir iğne yerleştirin ve iğneyi bir perfüzyon pompasına takın. Kalbi 750 mL% 1 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin.
- Örnek toplama
- Keskin bir mutfak bıçağı kullanarak kalbi 1 cm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Gen transfer alanından alınan örnekleri %4 PFA ve sıvı azot halinde toplayın.
NOT: Negatif kontrolleri toplamak için, sol ventrikülün arka duvarından bir kontrol örneği toplayın.
- Keskin bir mutfak bıçağı kullanarak kalbi 1 cm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Gen transfer alanından alınan örnekleri %4 PFA ve sıvı azot halinde toplayın.
- Güvenli doku toplama
- Akciğer, karaciğer, böbrek, dalak ve yumurtalıklar gibi uzak dokulardan örnekler toplayın. Numuneleri %4 PFA ve sıvı azot içine alın.
7. Örnek depolama
- Numuneleri boyamak üzere 4 °C'de 48 saat boyunca %4 PFA'da saklayın.
NOT: PFA'yı günlük olarak taze bir sıvı ile değiştirin.- 48 saat sonra, PFA'yı deiyonize suda% 15 sakkaroz ile değiştirin. Numuneleri parafin bloklara gömmeden önce en az 24 saat saklayın. Çıtçıtlı dondurulmuş numuneler -70 °C'de saklanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İskemi operasyonunun başarısı bu protokol ile koroner anjiyogram ile ve gen doğumuna geçmeden önce transtorasik ultrason ile hipokinetik alanın belirlenmesi ile doğrulanabilir (Şekil 1). Koroner oklüzyonun durumu koroner anjiyogram ile değerlendirilebilir ve elektroanatomik haritalama iskemik ve kış uykusuna yatan alanları sağlar.
Gen tedavisinin etkinliği, çevresel suş, ejeksiyon fraksiyonu ve miyokard perfüzyonu 15H2O-PET ile ölçülerek analiz edilebilir (Şekil 3). Doku örnekleri, kalbi elektroanatomik haritayla karşılaştırarak doğrudan gen transfer alanından toplanabilir. Transgen ekspresyonu ve terapötik anjiyogenez (Şekil 4), beta-galaktosidaz boyaması sonrası pozitif hücre sayısı ve CD31 boyaması sonrası miyokard kılcal bölgesi analiz edilerek immünohistolojik analiz ile değerlendirilebilir. Ek olarak, gen tedavisinin güvenliği tanısal görüntüleme (ekokardiyografi ile perikard efüzyon değerlendirmesi), immünohistoloji ve dağılım analizi ile değerlendirilebilir.
Şekil 1: Çalışma protokolü. İskemi, gen transferinden 14 gün önce indüklenir. 15H2O-PET görüntüleme, gen transferinden 1 gün önce, ötenazi ve örnek toplamadan önce yapılır. Örnek toplama zamanı, kullanılan viral vektöre ve terapötik gene bağlıdır. Adenoviral vektörleri kullanırken, ikinci 15H2O-PET 5. günde ve örnek toplama zamanı sırasıyla 6. gündedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Anjiyolaboratuvar kurulumu. Koroner girişimler için gerekli makineler: ultrason makinesi, ventilatör ve anjiyografik istasyon, soldan sağa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çevresel suşun temsili görüntüsü ve 15H2O-PET ve iskemik kalpten elektroanatomik bir harita. 15H2O-PET: kırmızı renk maksimal perfüzyon alanını, mavi ise hipoperfüzyon alanını gösterir. Elektroanatomik harita: Elektroanatomik haritadaki kahverengi noktalar enjeksiyon bölgelerini temsil eder. Kırmızı renk sol ventrikülün hipokinetik alanlarını gösterirken, mor normal kasılabilirlik alanını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: β-galaktosidaz ve PECAM-1 boyamalarının temsili görüntüsü. β-galaktosidaz AdLacZ transdüslü kalplerde eksprese edilir ve transgen ekspresyonunu göstermek için kullanılabilir. PECAM-1 boyaması, miyokard kılcal damarlarını tespit etmek ve kılcal bölgeyi analiz etmek için kullanılır. Alt sıra, gen transferinden uzak alanı temsil eder. β-galaktosidaz boyamalarında ölçek çubuğu: 200 μm. PECAM-1 boyamalarında ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Transtorasik ekokardiyografi kısa eksenli görünüm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Gen transferinden önce LAD'nin koroner anjiyografisi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: Sol ön inen arter çapı ölçümü. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün zaman noktaları, kullanılan viral vektöre göre değiştirilebilir. Ayrıca immünohistolojik analizler terapötik gene göre seçilebilir. Gerekirse protokole daha fazla zaman noktası ve uç nokta eklemek de mümkündür.
Bu protokol, başarılı olmak için gerekli olan ve daha sonra düzeltilmesi imkansız olan aşamalardan oluşur. İlk olarak, eğer uygun iskemi indüklenemezse, hayvan diğer prosedürlerden ve analizlerden dışlanmalıdır. Yöntemlerin ve görüntülemenin standardizasyonu, sonuçların zaman noktaları ve hayvanlar arasında karşılaştırılabilir olması için çok önemlidir. İkincisi, örnekler tam gen transfer alanından toplanmalı ve daha ileri analizler yapmak için başarılı bir şekilde işlenmelidir. Ayrıca, bu protokol anjiyografik prosedürlere ve farklı görüntüleme modalitelerine derin bir aşinalık gerektirir. Örneğin, koroner anjiyografi ve atan bir kalbe viral enjeksiyonlar, doğru transtorasik ekokardiyografi yapmanın yanı sıra kapsamlı bir eğitim gerektirir. Bununla birlikte, bu görüntüleme modaliteleri miyokard fonksiyonunu ve perfüzyonu ölçerek daha ileri çalışmalar için gerekli bilgileri sağlar.
Bir domuzun kardiyovasküler sistemi, anatomik ve fizyolojik benzerlikleri nedeniyle insana benzer ve bu nedenle, domuzlar genellikle kardiyovasküler hastalık mekaniğini ve prosedürlerini modellemek için kullanılır. Bununla birlikte, hayvanın hızlı büyümesi nedeniyle takip süresi yaklaşık 6 ay ile sınırlıdır. 6 ay sonra, hayvanın kullanımı zorlaşır ve görüntüleme kalitesi bozulur.
Ayrıca, domuzlar ateroskleroza karşı oldukça dirençlidir, bu da diyete bağlı aterosklerozu domuzlarda modellemek için karmaşık hale getirir17. Bununla birlikte, orijinal hastalığı taklit etmek için kronik iskemi modelleri geliştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan darboğaz stent iskemisi modelinin önemli avantajı, stentin kademeli olarak tıkanmasının koroner arter hastalığını ani oklüzyondan daha iyi temsil etmesidir. Ameroid konstriktör modeline kıyasla, bu yöntem daha az invazivdir. İkincisi, perkütan darboğaz stent yerleştirme işlemi hızlı bir şekilde gerçekleştirilecek bir işlemdir. Elektroanatomik haritalama sisteminin kullanılması, gen transferinin enfarktüs bölgesine değil, kış uykusuna yatmakta olan miyokardın hedeflenmesini sağlar; bu, enjeksiyonları hedeflemek için ultrason rehberliği kullanıldığında olası bir sonuçtur. Bununla birlikte, elektroanatomik haritalamanın dezavantajı, prosedürün uzunluğudur. Ayrıca, domuz kalbi ventriküler aritmilere karşı oldukça hassas olduğundan, haritalama haritalama prosedürü sırasında ventriküler fibrilasyonu indükleyebilir. Bununla birlikte, bu aritmiler kolayca defibrilasyona uğrar.
Bu büyük hayvan modelinde kullanılan uç noktalar, klinik çalışmalarda kullanılanları tanımlayarak kliniklere geçişi arttırır. Ek olarak, bu yöntemler, bu modelde tarif edilenlere ek olarak, farklı takip süreleri ve diğer yardımcı sonlanım noktaları ile miyokard gen tedavisinin etkinliğini değerlendiren büyük hayvan çalışmaları için de geçerlidir. Bu protokol, büyük hayvan deneylerinin geniş bir deneyiminden sonra standartlaştırılmıştır. Gelecekte, bu protokol kliniklere tercüme edilmeden önce miyokard gen tedavisinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Maria Hedman, Tiina Laitinen, Tomi Laitinen, Pekka Poutiainen, Annika Viren ve Severi Sormunen'e Kuopio Üniversitesi Hastanesi'nde 15O-PET görüntülemeye yardım ettikleri ve izin verdikleri için teşekkür eder; ve Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden Heikki Karhunen, Minna Törrönen ve Riikka Venäläinen, hayvan çalışmalarındaki yardımlarından dolayı.
Bu çalışma Finlandiya Akademisi, ERC ve CardioReGenix EU Horizon 2020 hibesinden gelen hibelerle desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
- Naghavi, M., et al. Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Davies, A., et al. Management of refractory angina: An update. European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Hammond, H. K., et al. Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).
- Hartikainen, J., et al. Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up. European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).
- Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology. Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).
- Roth, D. M., et al. Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium. The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).
- White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion. Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).
- Liu, C. -B., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia. Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).
- Rissanen, T. T., et al. The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).
- Greenberg, N. L., et al. Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility. Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).
- Grönman, M., et al. Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction. Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).
- Tarkia, M., et al. Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs. Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).
- Gyöngyösi, M., Dib, N. Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).
- Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine. Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).
