Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Summary

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Abstract

La ubiquitina es una pequeña proteína de 8,6 kDa que es un componente central del sistema ubiquitina-proteasoma. En consecuencia, puede unirse a una amplia gama de proteínas con alta especificidad pero baja afinidad. A través de la visualización de fagos, las variantes de ubiquitina (UbV) pueden diseñarse de tal manera que exhiban una afinidad mejorada sobre la ubiquitina de tipo salvaje y mantengan la especificidad de unión a las proteínas objetivo. La pantalla de fagos utiliza una biblioteca de fagomides, mediante la cual la proteína de la capa pIII de un bacteriófago filamentoso M13 (elegido porque se muestra externamente en la superficie del fago) se fusiona con UbV. Los residuos específicos de ubiquitina de tipo silvestre humano son blandos y aleatorizados (es decir, existe un sesgo hacia la secuencia de tipo silvestre nativo) para generar UbV de modo que se eviten cambios perjudiciales en la conformación de proteínas al tiempo que se introduce la diversidad necesaria para promover nuevas interacciones con la proteína objetivo. Durante el proceso de visualización de fagos, estos UbV se expresan y muestran en las proteínas de la capa de fagos y se comparan con una proteína de interés. Los UbV que exhiben interacciones de unión favorables con la proteína objetivo se conservan, mientras que los aglutinantes pobres se eliminan y se eliminan del grupo de la biblioteca. Los UbV retenidos, que están unidos a la partícula de fago que contiene la fagomida correspondiente del UbV, se eluyen, amplifican y concentran para que puedan ser analizados contra la misma proteína objetivo en otra ronda de visualización de fagos. Por lo general, se realizan hasta cinco rondas de visualización de fagos, durante las cuales se impone una fuerte presión de selección contra ubV que se unen débilmente y / o promiscuamente para que aquellos con afinidades más altas se concentren y enriquezcan. En última instancia, los UbV que demuestran una mayor especificidad y / o afinidad por la proteína objetivo que sus contrapartes de tipo salvaje se aíslan y se pueden caracterizar a través de experimentos adicionales.

Introduction

Comprender los detalles moleculares de las interacciones proteína-proteína es fundamental para delinear los mecanismos de transducción de señales de los procesos biológicos, particularmente aquellos que contribuyen a enfermedades clínicamente importantes. En los últimos años, la visualización de fagos se ha utilizado como un método práctico y accesible para aislar proteínas / péptidos con una unión mucho mejor a una proteína objetivo deseada1,2,3,4, que a su vez se puede utilizar como sondas intracelulares de interacciones proteína-proteína.

La ubiquitinación es una cascada de actividades enzimáticas (enzima activadora de E1 → enzima conjugante E2 → ligasas E3) que conjugan covalentemente ubiquitina (Ub) con sustratos de proteínas para dirigirse a ellos para su degradación o para mediar cambios en la señalización celular. Además, las deubiquitinasas catalizan la eliminación de la ubiquitina de las proteínas. Por lo tanto, en las células, hay miles de interacciones proteína-proteína dependientes de Ub, la gran mayoría de las cuales reconocen una superficie común con baja afinidad pero alta especificidad para permitir interacciones débiles a través de superficies grandes y diversas.

Ernst et al. introdujeron mutaciones en regiones de unión conocidas de Ub para ver si podían mejorar la afinidad de unión por una proteína de interés sin dejar de mantener una alta ^{selectividad5}. Se desarrolló una biblioteca combinatoria de más de 10 mil millones (7,5 x ¹⁰¹⁰) variantes de Ub (UbV) con mutaciones en posiciones a través de la superficie de Ub que median las interacciones conocidas entre la proteína Ub. Esta biblioteca consistía en fagémidas que expresan la proteína de la capa de bacteriófagos M13 pIII fusionada a UbV diversificados. Por lo tanto, los UbV individuales se pueden mostrar en la superficie del fago a través de la proteína de la capa al momento de la expresión. Durante el proceso de selección, los fagos que muestran UbV con interacciones de unión considerables con la proteína objetivo se conservarán y enriquecerán en rondas posteriores de visualización de fagos, mientras que los fagos que muestran UbV que se unen mal a la proteína objetivo se eliminan y eliminan del grupo de fagos. Las partículas de fagos retenidos contienen el fagamida correspondiente a su UbV mostrado, lo que les permite ser secuenciadas y caracterizadas una vez aisladas.

Utilizando esta estrategia de ingeniería de proteínas, se desarrollaron inhibidores de UbV para deubiquitinasas ^humanas5 y proteasas ^virales6. Es importante destacar que hemos generado UbV inhibitorios para ligasas E3 de la familia HECT humanas a través del secuestro del sitio de unión a E2 y la activación de UbVs que ocupan un exosito de unión a Ub en el dominio ^HECT7. También podemos inhibir los E3 monoméricos de la familia RING dirigiéndonos al sitio de unión E2 e inducir la dimerización de UbV para activar el ANILLO homodimérico E3s8. Para los RING E3 de subunidades múltiples, los UbV pueden lograr la inhibición dirigiéndose a la subunidad RING (por ejemplo, para el complejo APC/^C9) o interrumpiendo la formación de complejos (por ejemplo, para SCF ^E3s10). Colectivamente, los UbV se pueden aprovechar para interrogar sistemáticamente las interacciones proteína-proteína en el sistema Ub-proteasoma (UPS) para que podamos descifrar mejor los mecanismos bioquímicos de las enzimas UPS e identificar y validar sitios funcionales para la intervención terapéutica.

El siguiente protocolo describe cómo emplear una biblioteca de UbV mostrada de fagos previamente generada para apuntar a una proteína de interés y cómo enriquecer los aglutinantes de UbV que interactúan con la proteína objetivo a través de rondas sucesivas de visualización de fagos.

Protocol

1. Preparación de reactivos

1. PBS (solución salina tamponada con fosfato): Mezcle 50 ml de 10 x solución de PBS con 450 ml de _H2O ultrapuro. Esterilice por filtración y almacene a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
2. BSA al 10% (albúmina sérica bovina): Agregue lentamente 1 g de BSA a 7 ml de _H2O ultrapuro y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recarga con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 10 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
3. Tampón de PB (PBS suplementado con 1% de BSA): Agregue lentamente 5 g de BSA a 400 ml de _H2O ultrapuro y 50 ml de PBS y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recarga con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
4. Tampón PBT (PBS suplementado con 1% BSA y 0.05% Tween 20): Agregue lentamente 5 g de BSA a 400 ml de _H2O ultrapuro y 50 ml de PBS y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Añadir 250 μL de Tween 20. Recarga con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
5. Búfer PT (PBS suplementado con 0.05% Tween 20): Mezcle 1 ml de Tween 20 con 400 ml de PBS. Recargue con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 2 L. Esterilice por filtración y almacene a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
6. Caldo 2YT: Agregue 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl a 800 ml de _H2O ultrapuro y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recargue con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 1 L. Esterilice en autoclave y almacene a temperatura ambiente (~ 20-25 ° C).
7. Placas LB/carb: Añadir 12,5 g de mezcla LB prefabricada y 7,5 g de agar a 400 mL de _H2O. Recargar con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL y esterilizar en autoclave. Asegúrese de que el agar esté completamente disuelto y espere a que se enfríe a menos de 60 ° C. Agregue 500 μL de 100 mg de carbenicilina, mezcle bien y vierta en el plato. Conservar a 4 °C.
8. Placas LB/tet: Agregue 12.5 g de mezcla LB prefabricada y 7.5 g de agar a 400 mL de _H2O ultrapuro. Recargue con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL y esterilice en autoclave. Asegúrese de que el agar esté completamente disuelto y espere a que se enfríe por debajo de 60 ° C. Agregue 500 μL de 10 mg de tetraciclina, mezcle bien y vierta en la placa. Conservar a 4 °C.
9. 20% PEG (polietilenglicol)/2.5 M NaCl: Añadir 50 g de PEG-8000 y 36,5 g de NaCl a 200 mL de _H2O ultrapuro. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
   NOTA: Esto puede tomar un tiempo; la calefacción puede ayudar. Recarga con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 250 mL. Esterilizar por filtración o autoclave.
10. 0.1 M HCl: Mezcle 20 mL de 1 M HCl con 180 mL de _H2O ultrapuro. Esterilice por filtración y almacene a temperatura ambiente (~20-25 °C).
11. 1 M Tris (pH 11.0): Agregue 6.1 g de base Tris a 40 mL de _H2O ultrapuro. Ajuste el pH a 11.0 con HCl y mezcle hasta que Tris esté completamente disuelto. Recarga con _H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 50 mL. Esterilizar por filtración y almacenar a temperatura ambiente (~20-25 °C).
12. 100 mg/ml (1000x) de carbenicilina: Añadir 2 g de sal disódica de carbenicilina a 20 ml de _H2O ultrapura. Mezclar hasta que se disuelva por completo. Esterilizar por filtración y conservar a -20 °C.
13. 50 mg/ml (1000x) de kanamicina: Añadir 1 g de sulfato de kanamicina a 20 ml de _H2O ultrapura. Mezclar hasta que se disuelva por completo. Esterilizar por filtración y conservar a -20 °C.
14. 10 mg/ml (1000x) de tetraciclina: Añadir 0,2 g de clorhidrato de tetraciclina a 20 ml de etanol al 70%. Mezclar hasta que se disuelva por completo. Esterilizar por filtración y conservar a -20 °C.

2. Preparación de proteínas

1. Determinar la concentración de la reserva de proteína objetivo en μM. La forma más conveniente de evaluar la concentración de proteínas es medir la absorbancia del stock de proteínas a 280 nm. Si la concentración se conoce en mg/ml, conviértala a μM utilizando el peso molecular de la proteína diana. Se puede utilizar una variedad de métodos dependiendo de la proteína de interés; consulte la sección Discusión para obtener más información.
   NOTA: Si la proteína está truncada (dominio/motivo proteico específico) o etiquetada, recuerde tener en cuenta estos cambios en el peso molecular al convertir de mg/mL a μM.
2. Prepare tres tubos de microcentrífuga etiquetados como "redondo 1", "redondo 2/3" y "redondo 4/5".
   1. Calcule el volumen de proteína necesario para diluirlo a 1 μM en 800 μL PBS y alícuota este volumen en los tubos sin agregar PBS.
      NOTA: Si la cantidad de proteína objetivo disponible es baja, la concentración se puede reducir a tan solo 0,25 μM.

3. Preparación para la primera ronda de selección

1. Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la segunda ronda de selección.
   1. Inocular 5 mL de 2YT/tet con una colonia de Escherichia coli bien aislada e incubar durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.
2. Cubra el plato para la primera ronda de selección.
   1. Diluya la proteína objetivo en el tubo "redondo 1" con la cantidad adecuada de PBS y alícuota 100 μL en ocho pocillos de una placa de unión de 96 pocillos (es decir, la placa objetivo).
      NOTA: La visualización de fagos se puede hacer para cuatro proteínas diferentes simultáneamente en una sola placa recubriendo los pozos en las esquinas de la placa.
   2. Control opcional: Si la proteína objetivo está marcada, como con GST o MBP (proteína de unión a maltosa), cubra ocho pocillos en otra placa de unión de 96 pocillos con 100 μL de una solución de 1 μM que contenga la etiqueta de epítopo adecuada. Esto se utilizará para eliminar fagos no deseados que se unen a la etiqueta de forma no específica.
   3. Agitar placa(s) durante la noche a 4 °C con agitación orbital a 200 rpm.

4. Primera ronda de selección

1. Prepare la entrada de la segunda ronda.
   1. Inocular 30 mL de 2YT/tet con 200 μL del cultivo de semillas a partir del paso 3.1.
   2. Incubar a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm hasta que las bacterias estén en fase logarítmica media (_OD600 0.6 - 0.8). Esto toma aproximadamente tres h.
2. Bloquee la placa objetivo.
   1. Retire la solución de recubrimiento de la placa, o ambas placas si se ha hecho una placa de control, invirtiendo y agitando sobre un fregadero. Seque con palmaditas en toallas de papel.
   2. Agregue 300 μL de tampón de PB a cada pozo recubierto.
   3. Retire el búfer de PB como en el paso 4.2.1 y agregue otros 200 μL de búfer de PB.
   4. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm.
3. Preparar la biblioteca de fagos.
   1. Descongele la biblioteca de fagos en hielo y diluya a 100 veces la diversidad de la biblioteca en PBS. Por ejemplo, si la diversidad de la biblioteca es 1 x ¹⁰¹⁰ y la concentración de la biblioteca es 1 x ¹⁰¹³, diluya la biblioteca para que la concentración sea 1 x ¹⁰¹². Para las bibliotecas utilizadas aquí, diluirlas 10 veces en PBS combinando 1 ml de la biblioteca con 9 ml de PBS.
      NOTA: La diversidad de la biblioteca debería haberse determinado durante la creación de la biblioteca y no se puede evaluar fácilmente de otra manera. La concentración de la biblioteca se puede determinar inoculando células de E. coli en la fase logarítmica media (_OD600 0.6 - 0.8) y chapando en LB/carb.
   2. Agregue 1/5 de volumen de PEG/NaCl. Por ejemplo, para 10 mL de la biblioteca previamente diluida, agregue 2 mL de PEG/NaCl.
   3. Incubar en hielo durante 30 min.
   4. Centrifugar a 11.000 x g durante 30 min a 4 °C, desechar sobrenadante y recentrífugo durante 2 min para tirar del sobrenadante restante.
      NOTA: Coloque el tubo en el rotor en la misma orientación la segunda vez que fue el primero en mantener el pellet en el mismo lugar, por lo tanto, facilitando la visión.
   5. Resusped suavemente el pellet de fago en 1 ml de PBT por proteína. Para cuatro proteínas, resuspenda el pellet en 4 ml de PBT.
      NOTA: Trate de no tocar el pellet y no introduzca burbujas de aire.
4. Muestre el fago a la(s) proteína(s) objetivo(s).
   1. Control opcional: Agregue 100 μL de biblioteca de fagos a cada pozo recubierto en la placa de control. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm y transferir la biblioteca de la placa de control a la placa objetivo. Omita el paso 4.4.2.
   2. Retire el tampón de PB de la placa de destino como en el paso 4.2.1 y agregue 100 μL de la biblioteca de fagos a cada pozo recubierto.
   3. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm.
5. Elute redondo un fago.
   1. Retire la biblioteca de fagos y lave los pocillos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y toque una toalla de papel para quitar las últimas gotas.
      NOTA: Si se recubren varias proteínas diana en una placa, trate de minimizar el flujo de todas las soluciones posteriores entre los pozos.
   2. Añadir 100 μL de 0,1 M HCl a cada pozo recubierto e incubar a temperatura ambiente durante 5 min con agitación orbital a 300 rpm.
   3. Neutralice el pH añadiendo 12,5 μL de 1 M Tris-HCl (pH 11) a cada pozo recubierto.
   4. Agrupe el fago eluido de los 8 pozos en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para hacer soluciones homogéneas y aspirar todo el líquido de los pozos.
   5. Agregue 10% de BSA al fago eluido agrupado a una concentración final de 1%. Para un volumen de elución redondo típico de 950 μL, agregue 95 μL de BSA al 10%. Conservar a 4 °C. Esta es la salida redonda.

5. Preparación para las siguientes rondas de selección

1. Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección como en el paso 3.1.
2. Cubra la placa para la tercera ronda de selección como en el paso 3.2 con los cambios que se indican a continuación.
   1. Solo cubra cuatro pocillos por proteína en una placa de unión de 96 pocillos. Utilice la mitad del contenido de los tubos "redondo 2/3" o "redondo 4/5" para el cartucho apropiado. Diluya el contenido de estos tubos según sea necesario, para evitar que las proteínas se asienten fuera de la solución.
3. Prepare la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección.
   1. Utilice la mitad de la salida redonda del paso 4.5.5 para inocular 3 ml de celdas de fase logarítmica media del paso 4.1. Para una salida redonda típica, inocule con 500 μL de la salida.
   2. Incubar a 37 °C durante 30 min con agitación orbital de 200 rpm.
   3. Agregue el fago auxiliar M13K07 a una concentración final de 1 x ¹⁰¹⁰ PFU/ml.
   4. Incubar a 37 °C durante 1 h con agitación orbital a 200 rpm.
   5. Transfiera los 3 ml completos de cultivo a 30 ml de 2YT/carb/kan. Crecer durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.
   6. Al día siguiente, transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrífuga a 11.000 x g durante 10 min a 4 °C para precipitar las células.
   7. Decantar el sobrenadante en un nuevo tubo centrífugo de 50 ml y mezclar con 8 ml de PEG/NaCl e incubar en hielo durante 10 min.
   8. Centrifugar a 11.000 x g durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y centrifugar de nuevo durante 2 min.
      NOTA: Coloque el tubo en el rotor en la misma orientación la segunda vez que fue el primero en mantener el pellet en el mismo lugar, por lo tanto, facilitando la visión.
   9. Resuspend el pellet de fago en 800 μL de PBT para que sea completamente homogéneo y no se vean grumos.
   10. Transfiera la solución de fago a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrífuga a 16.200 x g durante 4 min a 4 °C para verterar los restos de pellets.
   11. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta es la entrada para la próxima ronda de selección.
4. Opcional: Titule las soluciones de entrada y salida.
   1. Utilice 500 μL de un cultivo de semillas de E. coli para inocular 5 ml de 2YT/tet e incubar a 37 °C con agitación orbitaria a 200 rpm hasta que la bacteria esté en fase logarítmica media (_OD600 0.6 - 0.8). Esto dura aproximadamente 1 h.
   2. Diluya las soluciones de entrada/salida de fagos a ^10-3 - ^10-5 en PBS y agregue 10 μL de cada dilución a 90 μL de células cultivadas.
      NOTA: Use soluciones de fagos diluidos inmediatamente porque el fago se adsorberá al tubo con el tiempo, y las transformaciones pueden producir falsos negativos.
   3. Incubar a 37 °C durante 20 min con agitación orbital a 200 rpm.
   4. Placa de 5 μL en placas separadas de LB/carb.
      NOTA: La cantidad plateada es variable depende de los resultados previos / preferencia personal.

6. Rondas posteriores de selección

1. Realice todas las rondas posteriores junto con la preparación como se hace en los pasos 3 y 4, respectivamente, con las diferencias que se indican a continuación.
   1. Utilice la entrada producida en la ronda anterior como fuente de fagos en lugar de una biblioteca. Cubra 4 pocillos por proteína objetivo con 100 μL de la entrada de fagos adquirida de la ronda anterior. Guarde las entradas restantes de fagos a 4 °C.
   2. Haga que el paso de lavado en 4.5.1 sea más estricto con cada ronda de selección. La ronda uno requiere lavarse 4 veces, la ronda dos requiere 6 veces, la ronda tres requiere 8 veces y las rondas cuatro y cinco requieren lavarse 10 veces.
   3. Reduzca algunos volúmenes en comparación con los utilizados en la ronda uno porque las rondas posteriores solo cubren cuatro pozos en lugar de ocho. Por ejemplo, en el paso 4.5.5 solo se agregan 45 μL de BSA al 10% a la salida del fago, y en el paso 5.3.1 solo se usan 250 μL de la salida de fagos para inocular células.

7. Procesamiento posterior a la selección y aislamiento de fagos

1. Titule las soluciones de entrada y salida para las rondas cuatro y cinco.
   1. Si aún no se ha hecho en el paso 5.4, siga los mismos pasos para clasificar las salidas de cuatro y cinco fagos, idealmente produciendo un rango de 30-300 colonias en unas pocas placas.
2. Cultivo y aislamiento de fagos.
   1. Alícuota 450 μL de 2YT/carb/M13K07 en cada tubo de una caja de cultivo de 96 mini tubos.
   2. Escoja colonias bien aisladas de cualquiera de las placas del paso 7.1 para inocular cada tubo.
      NOTA: Utilice la mitad superior de la caja para las salidas de la ronda cuatro y la mitad inferior para las salidas de la ronda cinco.
   3. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.
   4. Centrifugadora a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C.
   5. Transfiera la mayor cantidad posible de sobrenadante a una nueva caja de cultivo de minitubo 96 sin molestar el pellet celular y deseche el viejo. Conservar a 4 °C.
   6. Desde la nueva caja, transfiera 100 μL de cada tubo a una placa no aglutinante de 96 pocillos que contenga 100 μL de glicerol al 50% en todos los pozos. Mezclar bien y almacenar a -80 °C como stock de respaldo.

Results

Los aglutinantes producidos a partir de la pantalla de fagos se pueden verificar y analizar de muchas maneras. Se recomienda proceder primero a la secuenciación del fago con cebadores que flanqueen el inserto diversificado en la biblioteca de fagomides. Un experimento de visualización de fagos ideal mostrará un claro sesgo hacia varias secuencias (Figura 1). Otras secuencias también estarán presentes pero con un recuento más bajo, apareciendo más como ruido de fondo. En el ejemplo proporcion...

Discussion

Como se mencionó en el paso 2.1 (preparación de proteínas), se puede utilizar una variedad de métodos para evaluar la concentración de proteínas, y cada uno tendrá beneficios e inconvenientes únicos basados en la proteína objetivo específica utilizada para la visualización de fagos. Anteriormente se ha proporcionado una fuente de descripciones y protocolos detallados para métodos ^populares11.

El uso del fago retenido por una ronda anterior de visualización de fagos como...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de minitubos Axygen (0,65 ml, estéril, 96/rack, 10 racks/paquete)	Fisher Scientific	14-222-198	Cultivo de salidas de fagos después de la visualización de fagos.
BD Difco Medios de cultivo deshidratados: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparación de placas para la titulación.
Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V	BioShop Canada	ALB001	Componente tampón.
Carbenicilina sal disódica 89,0-100,5% anhidra	Millipore-Sigma	C1389-5G	Cultivo de células infectadas por fagos.
Agitador de microplacas digital compacto	Fisher Scientific	11-676-337	Placas de agitación durante la incubación con la biblioteca de fagos.
Cinta de sellado de aluminio con microplaca Corning	Fisher Scientific	07-200-684	Sellado de existencias de glicerol de fagos.
Agar deshidratado	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparación de placas para la titulación.
DS-11 Espectrofotómetro/Fluorómetro	DeNovix	DS-11 FX+	Medición de la concentración de proteínas.
Greiner Bio-One CellStar de 96 pocillos, sin tratar, microplaca con fondo en forma de U	Fisher Scientific	7000133	Almacenamiento de existencias de glicerol de fagos.
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144-500	Elución de fagos.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Químicamente Competente E. coli	Fisher Scientific C854003		Cepa bacteriana para la infección por fagos.
Sulfato de kanamicina,	Fisher Scientific	AAJ1792406	Cultivo: células infectadas con fagos auxiliares M13K07.
M13KO7 Ayudante Phago	Nueva Inglaterra Biolabs	N0315S	Permiso de empaquetamiento y secreción de fagémidos.
MaxQ 4000 Agitador orbital de sobremesa	Fisher Scientific	11-676-076	Cultivo de células bacterianas.
Nunc MaxiSorp Microplaca de 96 pocillos, fondo plano	Life Technologies	44-2404-21	Proteínas inmovilizadoras.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10X	Fisher Scientific	BP3994	Componente tampón/medio de resuspensión de fagos.
Láminas de poliéster para ELISA e incubación	VWR	60941-120	Recubrimiento de las microplacas durante la incubación.
Polietilenglicol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Precipitación de fagos.
Cloruro de sodio	Millipore-Sigma	S3014	Precipitación de fagos.
Tubos de cultivo de plástico estéril: Polipropileno translúcido	Fisher Scientific	14-956-1D Entradas de	fagos de cultivo.
Clorhidrato de tetraciclina	Fisher Scientific	BP912-100	Cultivo E. coli células OmniMax.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Solución neutralizante de fagos eluidos.
Triptona en polvo	Fisher Scientific	BP1421-2 Componente del	medio de crecimiento celular.
Tween 20	Fisher Scientific BP337500		componente Buffer.
Extracto de levadura	Fisher Scientific	BP1422-2 Componente del medio de	crecimiento celular.