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Biochemistry

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Abstract

La ubiquitina es una pequeña proteína de 8,6 kDa que es un componente central del sistema ubiquitina-proteasoma. En consecuencia, puede unirse a una amplia gama de proteínas con alta especificidad pero baja afinidad. A través de la visualización de fagos, las variantes de ubiquitina (UbV) pueden diseñarse de tal manera que exhiban una afinidad mejorada sobre la ubiquitina de tipo salvaje y mantengan la especificidad de unión a las proteínas objetivo. La pantalla de fagos utiliza una biblioteca de fagomides, mediante la cual la proteína de la capa pIII de un bacteriófago filamentoso M13 (elegido porque se muestra externamente en la superficie del fago) se fusiona con UbV. Los residuos específicos de ubiquitina de tipo silvestre humano son blandos y aleatorizados (es decir, existe un sesgo hacia la secuencia de tipo silvestre nativo) para generar UbV de modo que se eviten cambios perjudiciales en la conformación de proteínas al tiempo que se introduce la diversidad necesaria para promover nuevas interacciones con la proteína objetivo. Durante el proceso de visualización de fagos, estos UbV se expresan y muestran en las proteínas de la capa de fagos y se comparan con una proteína de interés. Los UbV que exhiben interacciones de unión favorables con la proteína objetivo se conservan, mientras que los aglutinantes pobres se eliminan y se eliminan del grupo de la biblioteca. Los UbV retenidos, que están unidos a la partícula de fago que contiene la fagomida correspondiente del UbV, se eluyen, amplifican y concentran para que puedan ser analizados contra la misma proteína objetivo en otra ronda de visualización de fagos. Por lo general, se realizan hasta cinco rondas de visualización de fagos, durante las cuales se impone una fuerte presión de selección contra ubV que se unen débilmente y / o promiscuamente para que aquellos con afinidades más altas se concentren y enriquezcan. En última instancia, los UbV que demuestran una mayor especificidad y / o afinidad por la proteína objetivo que sus contrapartes de tipo salvaje se aíslan y se pueden caracterizar a través de experimentos adicionales.

Introduction

Comprender los detalles moleculares de las interacciones proteína-proteína es fundamental para delinear los mecanismos de transducción de señales de los procesos biológicos, particularmente aquellos que contribuyen a enfermedades clínicamente importantes. En los últimos años, la visualización de fagos se ha utilizado como un método práctico y accesible para aislar proteínas / péptidos con una unión mucho mejor a una proteína objetivo deseada1,2,3,4, que a su vez se puede utilizar como sondas intracelulares de interacciones proteína-proteína.

La ubiquitinación es una cascada de actividades enzimáticas (enzima activadora de E1 → enzima conjugante E2 → ligasas E3) que conjugan covalentemente ubiquitina (Ub) con sustratos de proteínas para dirigirse a ellos para su degradación o para mediar cambios en la señalización celular. Además, las deubiquitinasas catalizan la eliminación de la ubiquitina de las proteínas. Por lo tanto, en las células, hay miles de interacciones proteína-proteína dependientes de Ub, la gran mayoría de las cuales reconocen una superficie común con baja afinidad pero alta especificidad para permitir interacciones débiles a través de superficies grandes y diversas.

Ernst et al. introdujeron mutaciones en regiones de unión conocidas de Ub para ver si podían mejorar la afinidad de unión por una proteína de interés sin dejar de mantener una alta selectividad5. Se desarrolló una biblioteca combinatoria de más de 10 mil millones (7,5 x 1010) variantes de Ub (UbV) con mutaciones en posiciones a través de la superficie de Ub que median las interacciones conocidas entre la proteína Ub. Esta biblioteca consistía en fagémidas que expresan la proteína de la capa de bacteriófagos M13 pIII fusionada a UbV diversificados. Por lo tanto, los UbV individuales se pueden mostrar en la superficie del fago a través de la proteína de la capa al momento de la expresión. Durante el proceso de selección, los fagos que muestran UbV con interacciones de unión considerables con la proteína objetivo se conservarán y enriquecerán en rondas posteriores de visualización de fagos, mientras que los fagos que muestran UbV que se unen mal a la proteína objetivo se eliminan y eliminan del grupo de fagos. Las partículas de fagos retenidos contienen el fagamida correspondiente a su UbV mostrado, lo que les permite ser secuenciadas y caracterizadas una vez aisladas.

Utilizando esta estrategia de ingeniería de proteínas, se desarrollaron inhibidores de UbV para deubiquitinasas humanas5 y proteasas virales6. Es importante destacar que hemos generado UbV inhibitorios para ligasas E3 de la familia HECT humanas a través del secuestro del sitio de unión a E2 y la activación de UbVs que ocupan un exosito de unión a Ub en el dominio HECT7. También podemos inhibir los E3 monoméricos de la familia RING dirigiéndonos al sitio de unión E2 e inducir la dimerización de UbV para activar el ANILLO homodimérico E3s8. Para los RING E3 de subunidades múltiples, los UbV pueden lograr la inhibición dirigiéndose a la subunidad RING (por ejemplo, para el complejo APC/C9) o interrumpiendo la formación de complejos (por ejemplo, para SCF E3s10). Colectivamente, los UbV se pueden aprovechar para interrogar sistemáticamente las interacciones proteína-proteína en el sistema Ub-proteasoma (UPS) para que podamos descifrar mejor los mecanismos bioquímicos de las enzimas UPS e identificar y validar sitios funcionales para la intervención terapéutica.

El siguiente protocolo describe cómo emplear una biblioteca de UbV mostrada de fagos previamente generada para apuntar a una proteína de interés y cómo enriquecer los aglutinantes de UbV que interactúan con la proteína objetivo a través de rondas sucesivas de visualización de fagos.

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Protocol

1. Preparación de reactivos

  1. PBS (solución salina tamponada con fosfato): Mezcle 50 ml de 10 x solución de PBS con 450 ml de H2O ultrapuro. Esterilice por filtración y almacene a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
  2. BSA al 10% (albúmina sérica bovina): Agregue lentamente 1 g de BSA a 7 ml de H2O ultrapuro y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recarga con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 10 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
  3. Tampón de PB (PBS suplementado con 1% de BSA): Agregue lentamente 5 g de BSA a 400 ml de H2O ultrapuro y 50 ml de PBS y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recarga con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
  4. Tampón PBT (PBS suplementado con 1% BSA y 0.05% Tween 20): Agregue lentamente 5 g de BSA a 400 ml de H2O ultrapuro y 50 ml de PBS y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Añadir 250 μL de Tween 20. Recarga con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL. Esterilizar por filtración y conservar a 4 °C.
  5. Búfer PT (PBS suplementado con 0.05% Tween 20): Mezcle 1 ml de Tween 20 con 400 ml de PBS. Recargue con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 2 L. Esterilice por filtración y almacene a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
  6. Caldo 2YT: Agregue 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl a 800 ml de H2O ultrapuro y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recargue con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 1 L. Esterilice en autoclave y almacene a temperatura ambiente (~ 20-25 ° C).
  7. Placas LB/carb: Añadir 12,5 g de mezcla LB prefabricada y 7,5 g de agar a 400 mL de H2O. Recargar con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL y esterilizar en autoclave. Asegúrese de que el agar esté completamente disuelto y espere a que se enfríe a menos de 60 ° C. Agregue 500 μL de 100 mg de carbenicilina, mezcle bien y vierta en el plato. Conservar a 4 °C.
  8. Placas LB/tet: Agregue 12.5 g de mezcla LB prefabricada y 7.5 g de agar a 400 mL de H2O ultrapuro. Recargue con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 500 mL y esterilice en autoclave. Asegúrese de que el agar esté completamente disuelto y espere a que se enfríe por debajo de 60 ° C. Agregue 500 μL de 10 mg de tetraciclina, mezcle bien y vierta en la placa. Conservar a 4 °C.
  9. 20% PEG (polietilenglicol)/2.5 M NaCl: Añadir 50 g de PEG-8000 y 36,5 g de NaCl a 200 mL de H2O ultrapuro. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
    NOTA: Esto puede tomar un tiempo; la calefacción puede ayudar. Recarga con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 250 mL. Esterilizar por filtración o autoclave.
  10. 0.1 M HCl: Mezcle 20 mL de 1 M HCl con 180 mL de H2O ultrapuro. Esterilice por filtración y almacene a temperatura ambiente (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11.0): Agregue 6.1 g de base Tris a 40 mL de H2O ultrapuro. Ajuste el pH a 11.0 con HCl y mezcle hasta que Tris esté completamente disuelto. Recarga con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 50 mL. Esterilizar por filtración y almacenar a temperatura ambiente (~20-25 °C).
  12. 100 mg/ml (1000x) de carbenicilina: Añadir 2 g de sal disódica de carbenicilina a 20 ml de H2O ultrapura. Mezclar hasta que se disuelva por completo. Esterilizar por filtración y conservar a -20 °C.
  13. 50 mg/ml (1000x) de kanamicina: Añadir 1 g de sulfato de kanamicina a 20 ml de H2O ultrapura. Mezclar hasta que se disuelva por completo. Esterilizar por filtración y conservar a -20 °C.
  14. 10 mg/ml (1000x) de tetraciclina: Añadir 0,2 g de clorhidrato de tetraciclina a 20 ml de etanol al 70%. Mezclar hasta que se disuelva por completo. Esterilizar por filtración y conservar a -20 °C.

2. Preparación de proteínas

  1. Determinar la concentración de la reserva de proteína objetivo en μM. La forma más conveniente de evaluar la concentración de proteínas es medir la absorbancia del stock de proteínas a 280 nm. Si la concentración se conoce en mg/ml, conviértala a μM utilizando el peso molecular de la proteína diana. Se puede utilizar una variedad de métodos dependiendo de la proteína de interés; consulte la sección Discusión para obtener más información.
    NOTA: Si la proteína está truncada (dominio/motivo proteico específico) o etiquetada, recuerde tener en cuenta estos cambios en el peso molecular al convertir de mg/mL a μM.
  2. Prepare tres tubos de microcentrífuga etiquetados como "redondo 1", "redondo 2/3" y "redondo 4/5".
    1. Calcule el volumen de proteína necesario para diluirlo a 1 μM en 800 μL PBS y alícuota este volumen en los tubos sin agregar PBS.
      NOTA: Si la cantidad de proteína objetivo disponible es baja, la concentración se puede reducir a tan solo 0,25 μM.

3. Preparación para la primera ronda de selección

  1. Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la segunda ronda de selección.
    1. Inocular 5 mL de 2YT/tet con una colonia de Escherichia coli bien aislada e incubar durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.
  2. Cubra el plato para la primera ronda de selección.
    1. Diluya la proteína objetivo en el tubo "redondo 1" con la cantidad adecuada de PBS y alícuota 100 μL en ocho pocillos de una placa de unión de 96 pocillos (es decir, la placa objetivo).
      NOTA: La visualización de fagos se puede hacer para cuatro proteínas diferentes simultáneamente en una sola placa recubriendo los pozos en las esquinas de la placa.
    2. Control opcional: Si la proteína objetivo está marcada, como con GST o MBP (proteína de unión a maltosa), cubra ocho pocillos en otra placa de unión de 96 pocillos con 100 μL de una solución de 1 μM que contenga la etiqueta de epítopo adecuada. Esto se utilizará para eliminar fagos no deseados que se unen a la etiqueta de forma no específica.
    3. Agitar placa(s) durante la noche a 4 °C con agitación orbital a 200 rpm.

4. Primera ronda de selección

  1. Prepare la entrada de la segunda ronda.
    1. Inocular 30 mL de 2YT/tet con 200 μL del cultivo de semillas a partir del paso 3.1.
    2. Incubar a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm hasta que las bacterias estén en fase logarítmica media (OD600Equation 1 0.6 - 0.8). Esto toma aproximadamente tres h.
  2. Bloquee la placa objetivo.
    1. Retire la solución de recubrimiento de la placa, o ambas placas si se ha hecho una placa de control, invirtiendo y agitando sobre un fregadero. Seque con palmaditas en toallas de papel.
    2. Agregue 300 μL de tampón de PB a cada pozo recubierto.
    3. Retire el búfer de PB como en el paso 4.2.1 y agregue otros 200 μL de búfer de PB.
    4. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm.
  3. Preparar la biblioteca de fagos.
    1. Descongele la biblioteca de fagos en hielo y diluya a 100 veces la diversidad de la biblioteca en PBS. Por ejemplo, si la diversidad de la biblioteca es 1 x 1010 y la concentración de la biblioteca es 1 x 1013, diluya la biblioteca para que la concentración sea 1 x 1012. Para las bibliotecas utilizadas aquí, diluirlas 10 veces en PBS combinando 1 ml de la biblioteca con 9 ml de PBS.
      NOTA: La diversidad de la biblioteca debería haberse determinado durante la creación de la biblioteca y no se puede evaluar fácilmente de otra manera. La concentración de la biblioteca se puede determinar inoculando células de E. coli en la fase logarítmica media (OD600Equation 1 0.6 - 0.8) y chapando en LB/carb.
    2. Agregue 1/5 de volumen de PEG/NaCl. Por ejemplo, para 10 mL de la biblioteca previamente diluida, agregue 2 mL de PEG/NaCl.
    3. Incubar en hielo durante 30 min.
    4. Centrifugar a 11.000 x g durante 30 min a 4 °C, desechar sobrenadante y recentrífugo durante 2 min para tirar del sobrenadante restante.
      NOTA: Coloque el tubo en el rotor en la misma orientación la segunda vez que fue el primero en mantener el pellet en el mismo lugar, por lo tanto, facilitando la visión.
    5. Resusped suavemente el pellet de fago en 1 ml de PBT por proteína. Para cuatro proteínas, resuspenda el pellet en 4 ml de PBT.
      NOTA: Trate de no tocar el pellet y no introduzca burbujas de aire.
  4. Muestre el fago a la(s) proteína(s) objetivo(s).
    1. Control opcional: Agregue 100 μL de biblioteca de fagos a cada pozo recubierto en la placa de control. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm y transferir la biblioteca de la placa de control a la placa objetivo. Omita el paso 4.4.2.
    2. Retire el tampón de PB de la placa de destino como en el paso 4.2.1 y agregue 100 μL de la biblioteca de fagos a cada pozo recubierto.
    3. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm.
  5. Elute redondo un fago.
    1. Retire la biblioteca de fagos y lave los pocillos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y toque una toalla de papel para quitar las últimas gotas.
      NOTA: Si se recubren varias proteínas diana en una placa, trate de minimizar el flujo de todas las soluciones posteriores entre los pozos.
    2. Añadir 100 μL de 0,1 M HCl a cada pozo recubierto e incubar a temperatura ambiente durante 5 min con agitación orbital a 300 rpm.
    3. Neutralice el pH añadiendo 12,5 μL de 1 M Tris-HCl (pH 11) a cada pozo recubierto.
    4. Agrupe el fago eluido de los 8 pozos en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para hacer soluciones homogéneas y aspirar todo el líquido de los pozos.
    5. Agregue 10% de BSA al fago eluido agrupado a una concentración final de 1%. Para un volumen de elución redondo típico de 950 μL, agregue 95 μL de BSA al 10%. Conservar a 4 °C. Esta es la salida redonda.

5. Preparación para las siguientes rondas de selección

  1. Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección como en el paso 3.1.
  2. Cubra la placa para la tercera ronda de selección como en el paso 3.2 con los cambios que se indican a continuación.
    1. Solo cubra cuatro pocillos por proteína en una placa de unión de 96 pocillos. Utilice la mitad del contenido de los tubos "redondo 2/3" o "redondo 4/5" para el cartucho apropiado. Diluya el contenido de estos tubos según sea necesario, para evitar que las proteínas se asienten fuera de la solución.
  3. Prepare la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección.
    1. Utilice la mitad de la salida redonda del paso 4.5.5 para inocular 3 ml de celdas de fase logarítmica media del paso 4.1. Para una salida redonda típica, inocule con 500 μL de la salida.
    2. Incubar a 37 °C durante 30 min con agitación orbital de 200 rpm.
    3. Agregue el fago auxiliar M13K07 a una concentración final de 1 x 1010 PFU/ml.
    4. Incubar a 37 °C durante 1 h con agitación orbital a 200 rpm.
    5. Transfiera los 3 ml completos de cultivo a 30 ml de 2YT/carb/kan. Crecer durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.
    6. Al día siguiente, transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrífuga a 11.000 x g durante 10 min a 4 °C para precipitar las células.
    7. Decantar el sobrenadante en un nuevo tubo centrífugo de 50 ml y mezclar con 8 ml de PEG/NaCl e incubar en hielo durante 10 min.
    8. Centrifugar a 11.000 x g durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y centrifugar de nuevo durante 2 min.
      NOTA: Coloque el tubo en el rotor en la misma orientación la segunda vez que fue el primero en mantener el pellet en el mismo lugar, por lo tanto, facilitando la visión.
    9. Resuspend el pellet de fago en 800 μL de PBT para que sea completamente homogéneo y no se vean grumos.
    10. Transfiera la solución de fago a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrífuga a 16.200 x g durante 4 min a 4 °C para verterar los restos de pellets.
    11. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Esta es la entrada para la próxima ronda de selección.
  4. Opcional: Titule las soluciones de entrada y salida.
    1. Utilice 500 μL de un cultivo de semillas de E. coli para inocular 5 ml de 2YT/tet e incubar a 37 °C con agitación orbitaria a 200 rpm hasta que la bacteria esté en fase logarítmica media (OD600Equation 1 0.6 - 0.8). Esto dura aproximadamente 1 h.
    2. Diluya las soluciones de entrada/salida de fagos a 10-3 - 10-5 en PBS y agregue 10 μL de cada dilución a 90 μL de células cultivadas.
      NOTA: Use soluciones de fagos diluidos inmediatamente porque el fago se adsorberá al tubo con el tiempo, y las transformaciones pueden producir falsos negativos.
    3. Incubar a 37 °C durante 20 min con agitación orbital a 200 rpm.
    4. Placa de 5 μL en placas separadas de LB/carb.
      NOTA: La cantidad plateada es variable depende de los resultados previos / preferencia personal.

6. Rondas posteriores de selección

  1. Realice todas las rondas posteriores junto con la preparación como se hace en los pasos 3 y 4, respectivamente, con las diferencias que se indican a continuación.
    1. Utilice la entrada producida en la ronda anterior como fuente de fagos en lugar de una biblioteca. Cubra 4 pocillos por proteína objetivo con 100 μL de la entrada de fagos adquirida de la ronda anterior. Guarde las entradas restantes de fagos a 4 °C.
    2. Haga que el paso de lavado en 4.5.1 sea más estricto con cada ronda de selección. La ronda uno requiere lavarse 4 veces, la ronda dos requiere 6 veces, la ronda tres requiere 8 veces y las rondas cuatro y cinco requieren lavarse 10 veces.
    3. Reduzca algunos volúmenes en comparación con los utilizados en la ronda uno porque las rondas posteriores solo cubren cuatro pozos en lugar de ocho. Por ejemplo, en el paso 4.5.5 solo se agregan 45 μL de BSA al 10% a la salida del fago, y en el paso 5.3.1 solo se usan 250 μL de la salida de fagos para inocular células.

7. Procesamiento posterior a la selección y aislamiento de fagos

  1. Titule las soluciones de entrada y salida para las rondas cuatro y cinco.
    1. Si aún no se ha hecho en el paso 5.4, siga los mismos pasos para clasificar las salidas de cuatro y cinco fagos, idealmente produciendo un rango de 30-300 colonias en unas pocas placas.
  2. Cultivo y aislamiento de fagos.
    1. Alícuota 450 μL de 2YT/carb/M13K07 en cada tubo de una caja de cultivo de 96 mini tubos.
    2. Escoja colonias bien aisladas de cualquiera de las placas del paso 7.1 para inocular cada tubo.
      NOTA: Utilice la mitad superior de la caja para las salidas de la ronda cuatro y la mitad inferior para las salidas de la ronda cinco.
    3. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.
    4. Centrifugadora a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C.
    5. Transfiera la mayor cantidad posible de sobrenadante a una nueva caja de cultivo de minitubo 96 sin molestar el pellet celular y deseche el viejo. Conservar a 4 °C.
    6. Desde la nueva caja, transfiera 100 μL de cada tubo a una placa no aglutinante de 96 pocillos que contenga 100 μL de glicerol al 50% en todos los pozos. Mezclar bien y almacenar a -80 °C como stock de respaldo.

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Representative Results

Los aglutinantes producidos a partir de la pantalla de fagos se pueden verificar y analizar de muchas maneras. Se recomienda proceder primero a la secuenciación del fago con cebadores que flanqueen el inserto diversificado en la biblioteca de fagomides. Un experimento de visualización de fagos ideal mostrará un claro sesgo hacia varias secuencias (Figura 1). Otras secuencias también estarán presentes pero con un recuento más bajo, apareciendo más como ruido de fondo. En el ejemplo proporcionado, donde se realizó la visualización de fagos entre variantes de ubiquitina (UbV) y UBE4B de tipo salvaje, existe un sesgo particular hacia las secuencias # 1-4. Se ha proporcionado un ejemplo de script de Python para organizar y analizar archivos de secuenciación ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). Para confirmar la importancia de los aglutinantes, los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) se pueden utilizar como una medida rápida de la afinidad de unión relativa a la proteína diana de tipo salvaje, la proteína diana mutada, así como las proteínas fuera del objetivo (Figura 1). Las diferencias en las afinidades de unión entre los nuevos aglutinantes y la proteína de unión de tipo salvaje, en la que se basaron los nuevos aglutinantes, pueden determinarse normalizando la absorbancia ELISA de los aglutinantes a la de la proteína de tipo silvestre (no mostrada) u otras proteínas que no demuestren una unión apreciable con la proteína objetivo (Figura 1). Este ejemplo demuestra la tendencia de las secuencias enriquecidas a tener una mayor afinidad de unión por la proteína diana. Se ha proporcionado un ejemplo de script de Python para organizar y analizar archivos de secuenciación ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Además, se ha proporcionado un script de Python de ejemplo específico para analizar los resultados de UbV ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Idealmente, las secuencias de aglutinantes que son más numerosas poseerán una mayor afinidad de unión relativa que las secuencias menos numerosas, que presumiblemente son ruido de fondo. Es posible que los aglutinantes inestables sean bajos en número, pero demuestren una unión apreciable a través de ELISA. Estos aglutinantes deben investigarse más a fondo para determinar si las puntuaciones ELISA son artefactos o si de hecho son aglutinantes dignos de una mayor caracterización.

Figure 1
Figura 1: Resultados representativos para una selección de variante de ubiquitina (UbV) frente a UBE4B. (A) Los UbV se ordenaron de mayor a menor frecuencia (recuentos). Las secuencias representan la región diversificada de ubiquitina en el UbV con todos los residuos aleatorizados (específicamente, residuos 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 y 70-78). Todas las absorbancias de ELISA se normalizaron contra 96 puntajes promedio de BSA ELISA y 96 puntajes promedio de GST ELISA. El verde más oscuro representa una unión relativa más fuerte. GST se incluyó como un control para la unión no específica debido al hecho de que la proteína objetivo está marcada con GST. (B) Resumen gráfico de los resultados de ELISA del panel A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Orden sugerido de pasos para realizar la visualización de fagos. Las líneas discontinuas indican procesos que se transfieren al día siguiente o al día anterior. Todas las rondas posteriores a la tercera ronda proceden de manera similar a la ronda tres, excluyendo la ronda cinco, donde no es necesaria la preparación de la entrada de fagos a menos que se realicen más rondas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Material de laboratorio y etiquetas sugeridos para configurar un experimento de visualización de fagos. Se indican el propósito y los pasos relevantes en el protocolo. R: redondo; I: entrada; O: salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Apariciones de gránulos típicos encontrados durante el procedimiento de visualización de fagos. El pellet de la biblioteca de fagos se presenta como una raya a lo largo del lado del tubo y se puede recentrifugar para concentrar el pellet en la parte inferior del tubo. Los gránulos de entrada de fagos y los gránulos de escombros parecen más típicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Scripts de Python. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Como se mencionó en el paso 2.1 (preparación de proteínas), se puede utilizar una variedad de métodos para evaluar la concentración de proteínas, y cada uno tendrá beneficios e inconvenientes únicos basados en la proteína objetivo específica utilizada para la visualización de fagos. Anteriormente se ha proporcionado una fuente de descripciones y protocolos detallados para métodos populares11.

El uso del fago retenido por una ronda anterior de visualización de fagos como entrada para una ronda posterior enriquece los buenos aglutinantes al eliminar gradualmente los aglutinantes que se unen débilmente, transitoriamente o por casualidad. En las rondas cuatro y cinco, idealmente habrá un claro sesgo hacia un conjunto pequeño y específico de secuencias peptídicas, lo que demuestra las preferencias de unión de la proteína objetivo.

Este protocolo ha sido optimizado para su uso con una biblioteca UbV. Si bien estos pasos generalmente pueden aplicarse a otros tipos de bibliotecas (por ejemplo, péptidos, anticuerpos, etc.), es probable que deban adaptarse para acomodar dichas bibliotecas que no son UbV. Como se mencionó en el paso 4.3.1, la diversidad y la concentración de la biblioteca deben conocerse antes de proceder con la visualización de fagos. Para obtener más información sobre cómo se determinan estos atributos de biblioteca, consulte el protocolo utilizado para crear las bibliotecas UbV utilizadas en este procedimiento12.

Los resultados de la visualización de fagos pueden ser muy claros y presentar aglutinantes candidatos obvios para buscar una mayor caracterización. Por ejemplo, los aglutinantes que son muy frecuentes y tienen una unión significativamente mayor, según lo medido por ELISA, son claros candidatos para estudios adicionales. Sin embargo, cuando la frecuencia de un aglutinante en particular no se correlaciona positivamente con los datos de ELISA, esto puede presentar cierta confusión en cuanto a cómo seleccionar aglutinantes interesantes. En el ejemplo proporcionado (Figura 1), se recomendaría elegir una combinación de los aglutinantes más comunes, incluso si tienen una afinidad de unión baja, y aquellos con mayor afinidad de unión, incluso si parecen poco frecuentes. Los aglutinantes poco frecuentes con puntuaciones ELISA altas pueden no ser tan comunes debido a la inestabilidad durante la visualización de fagos, lo que influiría negativamente en su prevalencia en estos datos finales. Como tal, vale la pena investigarlos tanto como los aglutinantes altamente frecuentes.

Las soluciones aisladas de fagos pueden contaminarse fácilmente. Se recomienda proceder con la secuenciación del ADN lo antes posible utilizando cebadores que flanqueen la región del péptido diversificado. Otro análisis típico posterior a la visualización es realizar ELISA de los aglutinantes con su proteína objetivo. Además, los ELISA se pueden realizar con los aglutinantes y las versiones mutadas / truncadas de sus proteínas objetivo, lo que puede dar una idea aproximada de su probable modo de unión. Es muy importante tener en cuenta que las soluciones de fagos deben mezclarse bien antes de su uso en cualquier experimento si han estado sentados por un tiempo. El fago puede adsorber a las paredes del tubo o asentarse fuera de la solución y puede producir falsos negativos.

La forma más eficiente en el tiempo de llevar a cabo este procedimiento se ilustra en la Figura 2. Comience cada ronda con la preparación del cultivo bacteriano necesario para el crecimiento de la entrada de fagos para la ronda posterior al día siguiente. Mientras este cultivo está creciendo, las placas recubiertas pueden bloquearse. Mientras se bloquean las placas, se puede preparar la biblioteca (para la primera ronda) o se puede preparar la entrada de fagos (para rondas posteriores). El día de la cuarta ronda no hay necesidad de preparar un cultivo de semillas y, por lo tanto, el día de la quinta ronda no hay necesidad de hacer ninguna preparación para la entrada de fagos de la siguiente ronda a menos que uno tenga la intención de hacer más de cinco rondas de selección. Para ahorrar aún más tiempo, también se ha proporcionado una configuración de laboratorio sugerida (Figura 3). Además, los gránulos de fagos no siempre son distintos, por lo que se han proporcionado imágenes de las apariencias típicas de los gránulos encontrados durante este procedimiento (Figura 4).

Si hay algún problema con la peletización del fago durante la preparación de la entrada para una ronda posterior, es posible que el experimento deba detenerse durante un día mientras se cultivan nuevos fagos. Estos se pueden recuperar volviendo al fago guardado en los tubos para la entrada para esa ronda. Por ejemplo, si el fago necesario para la tercera ronda de visualización no se puede peletizar por alguna razón, puede volver al tubo "R3I" que contiene 400 μL de entrada de fago para la tercera ronda. Esto solo se puede repetir una vez si se recubren cuatro pozos con 100 μL.

El título del fago de salida para las rondas cuatro a cinco suele estar en el rango de 106 a 108 PFU / ml. Si la titulación no es de interés, simplemente tener suficientes colonias presentes para llenar una mini caja de cultivo de 96 tubos debería ser suficiente para proporcionar una representación precisa de la diversidad de fagos y el título no necesariamente importa. Sin embargo, si el título del fago de salida es bajo y se desean más colonias, el fago se puede volver a amplificar repitiendo el paso 5.3. Esencialmente, el fago se puede volver a amplificar tomando la salida para la ronda de selección deseada, inoculando células de fase logarítmica media, agregando fagos auxiliares y carbenicilina, cultivando el cultivo durante la noche y cosechando el fago a través de la precipitación PEG como se describió anteriormente.

Existen otros métodos de visualización, y cada uno posee sus propias ventajas e inconvenientes en relación con la visualización de fagos. Los métodos de visualización in vivo, como la visualización de la superficie celular, pueden aumentar la probabilidad de un plegamiento adecuado de proteínas y también permitir que se produzcan modificaciones posteriores a la traducción; sin embargo, estos métodos se ven limitados por tener que utilizar tamaños de biblioteca considerablemente más pequeños13 y expresar proteínas polivalentemente. La expresión polivalente introduce efectos de avidez que interfieren y enmascaran la afinidad intrínseca del péptido, que es de mayor interés a la hora de generar nuevos aglutinantes. La pantalla de fagos evita este problema porque se ha adaptado para la visualización monovalente, facilitando así la selección de aglutinantes con afinidades genuinamente mejoradas14,15,16. Otros métodos de visualización in vitro tampoco se ven obstaculizados por las limitaciones de los métodos de visualización in vivo, sino que presentan sus propios desafíos únicos. Por ejemplo, la visualización de ribosomas se puede utilizar para sondear bibliotecas más grandes (1013-14)17, sin embargo, la salida de las selecciones es en forma de moléculas de ARNm que son inherentemente menos estables que la salida de ADN encapsulado en fagos de la pantalla de fagos18. Otros métodos de visualización in vitro, como la visualización de ARNm/ADNc, la visualización basada en actividad cis (CIS) y la visualización de anticuerpos covalentes (CAD) han demostrado problemas de eficiencia, estabilidad e inconsistencia19,20,21,22,23.

La visualización de fagos en sí está limitada por el tamaño de las bibliotecas restringidos por la eficiencia de la transformación bacteriana y por no permitir bibliotecas con secuencias que interfieran con el crecimiento de fagos/bacterias16, pero en general, estas limitaciones son insignificantes, y la visualización de fagos ha tenido éxito en la producción de aglutinantes altamente específicos y potentes de proteínas diana2,5,10,24, 25. Esto no solo se puede utilizar en la investigación médica para desarrollar nuevas terapias, sino también para dilucidar las características de proteínas y enzimas y aprender más sobre las interacciones de proteínas involucradas en importantes vías biológicas.

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Disclosures

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Acknowledgments

La tecnología de variante de ubiquitina fue ideada en el laboratorio del Dr. Sachdev Sidhu (Universidad de Toronto). WZ es actualmente un CIFAR Azrieli Global Scholar en el Programa de Humanos y Microbioma. Esta investigación fue financiada por NSERC Discovery Grants otorgada a WZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

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References

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Bioquímica Número 174
Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3
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Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

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