Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

إن التكوير في كل مكان هو تعديل حاسم للبروتين بعد الترجمه ، وقد تورط خلل التنظيم في العديد من الأمراض البشرية. هذا البروتوكول تفاصيل كيف يمكن استخدام عرض phage لعزل المتغيرات في كل مكان الرواية التي يمكن ربط وتعديل نشاط ليجار E3 التي تتحكم في خصوصية وكفاءة وأنماط في كل مكان.

Abstract

يوبيكيتين هو بروتين صغير 8.6 كدا الذي هو عنصر أساسي في نظام ubiquitin-proteasome. وبالتالي، فإنه يمكن ربط لمجموعة متنوعة من البروتينات مع خصوصية عالية ولكن تقارب منخفض. من خلال عرض phage ، يمكن هندسة متغيرات Ubiquitin (UbVs) بحيث تظهر تقاربا محسنا على النمط البري في كل مكان وتحافظ على خصوصية ملزمة لاستهداف البروتينات. تستخدم شاشة Phage مكتبة phagemid ، حيث يتم دمج بروتين معطف pIII من البكتيريا M13 الخيطية (التي تم اختيارها لأنه يتم عرضها خارجيا على سطح phage) مع UbVs. المخلفات المحددة من النمط البري البشري في كل مكان لينة وعشوائية (أي، هناك تحيز نحو تسلسل النمط البري الأصلي) لتوليد UbVs بحيث يتم تجنب التغييرات الضارة في تشكيل البروتين مع إدخال التنوع اللازم لتعزيز التفاعلات الجديدة مع البروتين المستهدف. خلال عملية عرض phage ، يتم التعبير عن هذه UbVs وعرضها على بروتينات معطف phage ويتم تحريكها مقابل بروتين مهم. يتم الاحتفاظ UbVs التي تظهر التفاعلات ملزمة مواتية مع البروتين المستهدف، في حين يتم غسلها المجلدات الفقراء بعيدا وإزالتها من بركة المكتبة. يتم إعادة تركيب المركبات المحتفظ بها ، والتي ترتبط بجسيمات الفياج التي تحتوي على الفاجم المقابل ل UbV ، وتضخيمها وتركيزها بحيث يمكن تحريكها ضد نفس البروتين المستهدف في جولة أخرى من عرض phage. عادة، يتم تنفيذ ما يصل إلى خمس جولات من عرض phage، خلالها يتم فرض ضغط اختيار قوي ضد UbVs التي تربط ضعيفة و / أو مشوش بحيث يتم تركيز أولئك الذين لديهم تقارب أعلى وإثراء. في نهاية المطاف، يتم عزل UbVs التي تثبت خصوصية أعلى و / أو تقارب للبروتين المستهدف من نظرائهم من النوع البري ويمكن وصفها من خلال مزيد من التجارب.

Introduction

إن فهم التفاصيل الجزيئية للتفاعلات بين البروتين والبروتين أمر بالغ الأهمية لتحديد آليات نقل الإشارات للعمليات البيولوجية، وخاصة تلك التي تساهم في الأمراض المهمة سريريا. في السنوات الأخيرة، تم استخدام عرض phage كطريقة عملية ويمكن الوصول إليها لعزل البروتينات / الببتيدات مع ربط محسنة كثيرا إلى البروتين المستهدف المطلوب1،2،3،4، والتي بدورها يمكن استخدامها كمسبارات داخل الخلايا من التفاعلات البروتين البروتين.

في كل مكان هو سلسلة من الأنشطة الأنزيمية (E1 تنشيط إنزيم → E2 اقتران انزيم → ليغاز E3) التي تترافق بشكل متناقض في كل مكان (Ub) إلى ركائز البروتين لاستهدافهم للتدهور أو للتوسط في التغيرات إشارات الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، deubiquitinases تحفيز إزالة كل مكان من البروتينات. لذلك ، في الخلايا ، هناك الآلاف من التفاعلات البروتينية البروتينية المعتمدة على Ub ، والغالبية العظمى منها تعترف بسطح مشترك مع تقارب منخفض ولكن خصوصية عالية للسماح بالتفاعلات الضعيفة من خلال الأسطح الكبيرة والمتنوعة.

أدخل إرنست وآخرون طفرات في المناطق الملزمة المعروفة في Ub من أجل معرفة ما إذا كان بإمكانهم تعزيز التقارب الملزم لبروتين ذي أهمية مع الحفاظ على الانتقائية العالية5. تم تطوير مكتبة مشتركة تضم أكثر من 10 مليارات (7.5 × 1010) من متغيرات Ub (UbVs) مع طفرات في مواقع عبر سطح Ub تتوسط في التفاعلات المعروفة بين البروتينUb. تألفت هذه المكتبة من phagemids التي تعبر عن بروتين معطف M13 bacteriophage pIII المنصهر في UbVs المتنوعة. لذلك ، يمكن عرض UbVs الفردية على سطح phage عبر بروتين المعطف عند التعبير. خلال عملية الاختيار ، سيتم الاحتفاظ بالphage التي تعرض UbVs مع تفاعلات ملزمة كبيرة مع البروتين المستهدف وإثراؤها في الجولات اللاحقة من عرض phage ، في حين يتم غسل phage عرض UbVs التي ترتبط بشكل سيئ بالبروتين المستهدف وإزالتها من بركة phage. تحتوي جزيئات ال phage المحتفظ بها على الفاغميد المقابل ل UbV المعروض ، مما يسمح بتسلسلها وتميزها مرة أخرى بمجرد عزلها.

باستخدام هذه الاستراتيجية الهندسية البروتين، تم تطوير مثبطات UbV ل deubiquitinases5 الإنسان وبروتيازيس6 الفيروسية. الأهم من ذلك ، لقد قمنا بتوليد UbVs المثبطة لE3 ligases HECT الأسرة البشرية من خلال اختطاف موقع E2 ملزمة وتفعيل UbVs التي تحتل exosite Ub ملزمة على domain7 HECT. يمكننا أيضا أن تمنع monomeric RING-الأسرة E3s من خلال استهداف موقع الربط E2 وحمل UbV dimerization لتنشيط هوموديمريك RING E3s8. بالنسبة إلى وحدات RING E3 متعددة الوحدات، يمكن أن تحقق UbVs تثبيطا من خلال استهداف الوحدة الفرعية RING (على سبيل المثال، بالنسبة إلى APC/C complex9) أو تعطيل التكوين المعقد (على سبيل المثال، ل SCF E3s10). بشكل جماعي ، يمكن الاستفادة من UbVs لاستجواب التفاعلات بين البروتين والبروتين بشكل منهجي في نظام Ub-proteasome (UPS) حتى نتمكن من فك الآليات الكيميائية الحيوية لإنزيمات UPS بشكل أفضل وتحديد المواقع الوظيفية للتدخل العلاجي والتحقق من صحتها.

يصف البروتوكول التالي كيفية استخدام مكتبة UbV المعروضة التي تم إنشاؤها مسبقا لاستهداف بروتين ذي أهمية وكيفية إثراء ملفات UbV التي تتفاعل مع البروتين المستهدف من خلال جولات متتالية من عرض phage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكاشف

  1. PBS (الفوسفات العازلة المالحة): مزيج 50 مل من محلول PBS 10x مع 450 مل من H2O فائقة الشراء. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  2. 10٪ BSA (ألبوم مصل البقر): أضف ببطء 1 غرام من BSA إلى 7 مل من H2O فائقة الشراء واخلطها حتى تذوب بالكامل (بدون كتل). أعلى مع H2O فائقة السعة حتى حجم النهائي هو 10 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 °C.
  3. PB العازلة (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ BSA): إضافة ببطء 5 غرام من BSA إلى 400 مل من H2O فائقة الشراء و 50 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج حتى يذوب تماما (لا كتل). أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 500 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 °C.
  4. PBT العازلة (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ BSA و 0.05٪ توين 20): إضافة ببطء 5 غرام من BSA إلى 400 مل من H2O فائقة السعة و 50 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج حتى يذوب تماما (لا كتل). إضافة 250 ميكرولتر من توين 20. أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 500 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 °C.
  5. PT العازلة (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.05٪ توين 20): مزيج 1 مل من توين 20 مع 400 مل من برنامج تلفزيوني. أعلى مع H2O فائقة النبور حتى حجم النهائي هو 2 L. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  6. مرق 2YT: أضف 16 غرام من التريبتون، 10 غرام من مستخلص الخميرة، و 5 غرام من NaCl إلى 800 مل من H2O فائقة الشراء واخلط حتى يذوب تماما (لا كتل). أعلى مع H2O فائقة النبور حتى حجم النهائي هو 1 L. تعقيم عن طريق الالاستعباد التلقائي وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  7. LB/الكربوهيدرات لوحات: إضافة 12.5 غرام من خليط LB مسبقة الصنع و 7.5 غرام من أجار إلى 400 مل من H2O. أعلى مع H2O فائقة السعة حتى الحجم النهائي هو 500 مل وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي. تأكد من أن أجار يذوب بالكامل وانتظر حتى يبرد إلى أقل من 60 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر من 100 مل كاربينسيلين مل, مزيج جيدا, وتصب في لوحة. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  8. لوحات LB/tet: أضف 12.5 جراما من خليط LB المصنوع مسبقا و7.5 جراما من الأجار إلى 400 مل من H2O فائقة السعة. تأكد من ذوبان أجار بالكامل وانتظر حتى يبرد إلى أقل من 60 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر من 10 مل متر رباعي السيكلين, مزيج جيدا, وتصب في لوحة. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  9. 20٪ PEG (البولي إيثيلين غليكول)/2.5 م NaCl: أضف 50 جراما من PEG-8000 و36.5 جراما من NaCl إلى 200 مل من مزيج H2O فائقة السعة حتى تذوب تماما.
    ملاحظة: قد يستغرق هذا بعض الوقت; التدفئة يمكن أن تساعد. أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 250 مل. تعقيم عن طريق الترشيح أو الالاستعباد التلقائي.
  10. 0.1 م HCl: مزيج 20 مل من 1 م HCl مع 180 مل من H2O فائقة الشراء. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  11. 1 M Tris (درجة الحموضة 11.0): أضف 6.1 غرام من قاعدة تريس إلى 40 مل من H2O فائقة الشراء. ضبط درجة الحموضة إلى 11.0 مع HCl واخلط حتى يذوب تريس تماما. أعلى مع H2O فائقة الشراء حتى حجم النهائي هو 50 مل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).
  12. 100 ملغم/مل (1000x) كاربينسيلين: أضف 2 غرام من ملح الكاربينسيلين ديباديوم إلى 20 مل من H2O فائقة البور حتى تذوب تماما. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  13. 50 ملغم/مل (1000x) كاناميسين: أضف 1 غرام من كبريتات الكاناميسين إلى 20 مل من H2O فائقة السعة حتى تذوب بالكامل. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  14. 10 ملغم/مل (1000x) تتراسيكلين: أضف 0.2 غرام من هيدروكلوريد التتراسيكلين إلى 20 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. تخلط حتى تذوب تماما. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. إعداد البروتين

  1. تحديد تركيز مخزون البروتين المستهدف في ميكرومتر. الطريقة الأكثر ملاءمة لتقييم تركيز البروتين هو لقياس امتصاص مخزون البروتين في 280 نانومتر. إذا كان التركيز معروفا في ملغم / مل، تحويله إلى μM باستخدام الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف. ويمكن استخدام مجموعة من الطرق اعتمادا على البروتين من الفائدة; راجع قسم المناقشة للحصول على التفاصيل.
    ملاحظة: إذا تم اقتطاع البروتين (مجال/عزر بروتين محدد) أو وضع علامة عليه، تذكر أن تحاسب على هذه التغيرات في الوزن الجزيئي عند التحويل من ملغم/مل إلى ميكرومتر.
  2. إعداد ثلاثة أنابيب الطرد المركزي الصغيرة المسمى "الجولة 1"، "جولة 2/3"، و "الجولة 4/5".
    1. حساب حجم البروتين اللازم لتخفيفه إلى 1 ميكرومتر في 800 ميكرولتر PBS وaliquot هذا الحجم في الأنابيب دون إضافة برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: إذا كانت كمية البروتين المستهدفة المتاحة منخفضة، يمكن خفض التركيز إلى أقل من 0.25 ميكرومتر.

3. التحضير للجولة الأولى من الاختيار

  1. إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة الثانية من الاختيار.
    1. تلقيح 5 مل من 2YT/tet مع مستعمرة الإشريكية القولونية المعزولة جيدا واحتضانها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
  2. معطف لوحة للجولة الأولى من الاختيار.
    1. تمييع البروتين المستهدف في أنبوب "الجولة 1" مع الكمية المناسبة من PBS وaliquot 100 ميكرولتر في ثماني آبار من لوحة ملزمة 96 جيدا (أي اللوحة المستهدفة).
      ملاحظة: يمكن إجراء عرض Phage لأربعة بروتينات مختلفة في وقت واحد على لوحة واحدة عن طريق طلاء الآبار في زوايا اللوحة.
    2. التحكم الاختياري: إذا تم وضع علامة على البروتين المستهدف، كما هو الحال مع GST أو MBP (بروتين الربط المالتوس)، اغلف ثمانية آبار في لوحة ربط أخرى ذات 96 بئرا مع 100 ميكرولتر من محلول 1 ميكرومتر يحتوي على علامة epitope المناسبة. سيتم استخدام هذا لإزالة phage غير مرغوب فيه التي تربط إلى العلامة بشكل غير محدد.
    3. يهز لوحة (ق) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.

4. الجولة الأولى من الاختيار

  1. إعداد إدخال الجولة الثانية.
    1. تلقيح 30 مل من 2YT/tet مع 200 ميكرولتر من ثقافة البذور من الخطوة 3.1.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل (OD600Equation 1 0.6 - 0.8). هذا يستغرق ما يقرب من ثلاثة ح.
  2. كتلة لوحة الهدف.
    1. إزالة محلول الطلاء من لوحة, أو كل لوحات إذا تم إجراء لوحة التحكم, عن طريق عكس ويهز على بالوعة. بات الجافة على المناشف الورقية.
    2. إضافة 300 ميكرولتر من PB العازلة إلى كل المغلفة جيدا.
    3. إزالة المخزن المؤقت PB كما في الخطوة 4.2.1 وإضافة آخر 200 μL من المخزن المؤقت PB.
    4. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع 300 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
  3. إعداد مكتبة phage.
    1. إذابة مكتبة phage على الجليد وتمييعه إلى 100x تنوع المكتبة في برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إذا كان تنوع المكتبة 1 × 1010 وكان تركيز المكتبة 1 × 1013، فإنها تضعف المكتبة بحيث يكون التركيز 1 × 1012. للمكتبات المستخدمة هنا ، تمييعها 10 أضعاف في برنامج تلفزيوني من خلال الجمع بين 1 مل من المكتبة مع 9 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: كان يجب تحديد تنوع المكتبات أثناء إنشاء المكتبة ولا يمكن تقييمها بسهولة بخلاف ذلك. يمكن تحديد تركيز المكتبة عن طريق تلقيح خلايا الإشريكية القولونية في مرحلة منتصف السجل (OD600Equation 1 0.6 - 0.8) والطلاء على LB / carb.
    2. إضافة 1/5 حجم PEG/ NaCl. على سبيل المثال، بالنسبة إلى 10 مل من المكتبة المخففة سابقا، أضف 2 مل من PEG/NaCl.
    3. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    4. جهاز الطرد المركزي في 11،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant، والطرد الأخير لمدة 2 دقيقة لسحب أسفل supernatant المتبقية.
      ملاحظة: وضع الأنبوب في الدوار في نفس الاتجاه في المرة الثانية كما كان أول من حافظ على بيليه في نفس المكان، وبالتالي، مما يجعل من الأسهل أن نرى.
    5. إعادة إنفاق بلطف بيليه phage في 1 مل من PBT لكل بروتين. لأربعة بروتينات، إعادة إنفاق بيليه في 4 مل من PBT.
      ملاحظة: حاول عدم لمس بيليه ولا تقدم فقاعات الهواء.
  4. عرض phage إلى البروتين المستهدف (ق).
    1. التحكم الاختياري: أضف 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل بئر مغلفة جيدا في لوحة التحكم. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة ونقل المكتبة من لوحة التحكم إلى لوحة الهدف. تخطي الخطوة 4.4.2.
    2. إزالة المخزن المؤقت PB من لوحة الهدف كما هو الحال في الخطوة 4.2.1 وإضافة 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل المغلفة جيدا.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع 300 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
  5. (إلوت) جولة واحدة
    1. إزالة مكتبة phage وغسل الآبار المغلفة أربع مرات مع المخزن المؤقت PT. عكس لوحة والاستفادة على منشفة ورقية لإزالة قطرات الماضي.
      ملاحظة: إذا كانت البروتينات المستهدفة متعددة مغلفة على طبق واحد، في محاولة لتقليل تدفق جميع الحلول اللاحقة بين الآبار.
    2. أضف 100 ميكرولتر من 0.1 M HCl إلى كل بئر مغلفة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.
    3. تحييد درجة الحموضة بإضافة 12.5 ميكرولتر من 1 M تريس-HCl (درجة الحموضة 11) إلى كل بئر المغلفة.
    4. تجمع فيج eluted من جميع الآبار 8 في أنبوب واحد 1.5 مل الطرد المركزي الدقيق. ماصة صعودا وهبوطا أثناء النقل لجعل الحلول متجانسة و أسبيرات جميع السوائل من الآبار.
    5. إضافة 10٪ BSA إلى phage eluted المجمعة إلى تركيز نهائي قدره 1٪. بالنسبة إلى حجم elution واحد مستدير نموذجي يبلغ 950 ميكرولتر، أضف 95 ميكرولتر من 10٪ BSA. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. هذا هو الناتج الجولة الأولى.

5. التحضير لجولات الاختيار اللاحقة

  1. إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار كما هو الحال في الخطوة 3.1.
  2. معطف لوحة للجولة الثالثة من الاختيار كما هو الحال في الخطوة 3.2 مع التغييرات المذكورة أدناه.
    1. معطف فقط أربعة آبار لكل بروتين في لوحة ملزمة 96 جيدا. استخدم نصف محتويات أنابيب "الجولة 2/3" أو "الجولة 4/5" للجولة المناسبة. تمييع محتويات هذه الأنابيب حسب الحاجة، من أجل تجنب استقرار البروتينات من الحل.
  3. إعداد مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار.
    1. استخدم نصف إخراج الجولة الأولى من الخطوة 4.5.5 لتطعيم 3 مل من خلايا المرحلة المتوسطة من الخطوة 4.1. للحصول على إخراج جولة واحدة نموذجية، تلقيح مع 500 ميكرولتر من الإخراج.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    3. أضف M13K07 المساعد phage إلى تركيز نهائي من 1 × 1010 PFU / مل.
    4. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    5. نقل كامل 3 مل من الثقافة إلى 30 مل من 2YT / الكربوهيدرات / كان. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    6. في اليوم التالي، نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل والطرد المركزي في 11،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لتسريع الخلايا.
    7. decant supernatant في أنبوب طرد مركزي جديد 50 مل ومزيج مع 8 مل من PEG / NaCl واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    8. جهاز الطرد المركزي في 11،000 × غرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية، والتخلص من supernatant، والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: وضع الأنبوب في الدوار في نفس الاتجاه في المرة الثانية كما كان أول من حافظ على بيليه في نفس المكان، وبالتالي، مما يجعل من الأسهل أن نرى.
    9. Resuspend بيليه phage في 800 ميكرولتر من PBT بحيث تكون متجانسة تماما وليس كتل مرئية.
    10. نقل محلول phage إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي والطرد المركزي عند 16200 × غرام لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى حطام بيليه.
    11. نقل supernatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. هذا هو الإدخال للجولة التالية من التحديد.
  4. اختياري: تتر حلول الإدخال والمخرجات.
    1. استخدم 500 ميكرولتر من زراعة بذور الإشريكية القولونية لتطعيم 5 مل من 2YT/tet واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل (OD600Equation 1 0.6 - 0.8). هذا يستغرق حوالي 1 ساعة.
    2. تخفيف المدخلات phage / مخرجات الحلول إلى 10-3 - 10-5 في برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى 90 ميكرولتر من الخلايا المستزرعة.
      ملاحظة: استخدام حلول phage المخفف فورا لأن phage سوف يعبيء إلى الأنبوب مع مرور الوقت، والتحولات قد تنتج السلبيات كاذبة.
    3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع 200 دورة في الدقيقة اهتزاز المداري.
    4. لوحة 5 ميكرولتر على لوحات منفصلة LB / الكربوهيدرات.
      ملاحظة: المبلغ مطلي متغير يعتمد على النتائج السابقة / تفضيل شخصي.

6. جولات الاختيار اللاحقة

  1. قم بإجراء جميع الجولات اللاحقة مع التحضير كما تم في الخطوتين 3 و4 على التوالي، مع ذكر الاختلافات أدناه.
    1. استخدم الإدخال الذي تم إنتاجه في الجولة السابقة كمصدر phage بدلا من مكتبة. معطف 4 آبار لكل بروتين الهدف مع 100 ميكرولتر من مدخلات phage المكتسبة من الجولة السابقة. تخزين مدخلات phage المتبقية عند 4 °C.
    2. جعل خطوة الغسيل في 4.5.1 أكثر صرامة مع كل جولة من الاختيار. الجولة الأولى تتطلب الغسيل 4 مرات، الجولة الثانية تتطلب 6 مرات، الجولة الثالثة تتطلب 8 مرات، والجولات الرابعة والخامسة كلاهما يتطلب الغسيل 10 مرات.
    3. تقليل بعض الأحجام مقارنة بتلك المستخدمة في الجولة الأولى لأن الجولات اللاحقة تغطي أربعة آبار فقط بدلا من ثمانية. على سبيل المثال، في الخطوة 4.5.5 فقط 45 ميكرولتر من 10٪ BSA يضاف إلى إخراج phage، وفي الخطوة 5.3.1 يتم استخدام 250 ميكرولتر فقط من إخراج phage لتطعيم الخلايا.

7. بعد معالجة الاختيار والعزل phage

  1. Titer حلول المدخلات والمخرجات للجولتين الرابعة والخامسة.
    1. إذا لم يكن قد تم بالفعل في الخطوة 5.4 ، اتبع نفس الخطوات لجولات titer أربعة وخمسة مخرجات phage ، مما ينتج بشكل مثالي مجموعة من 30-300 مستعمرة عبر بضع لوحات.
  2. الثقافة وعزل phage.
    1. Aliquot 450 ميكرولتر من 2YT / carb / M13K07 في كل أنبوب من مربع ثقافة أنبوب صغير 96.
    2. اختر مستعمرات معزولة جيدا من أي من الصفائح من الخطوة 7.1 لتطعيم كل أنبوب.
      ملاحظة: استخدم النصف العلوي من المربع للجولة أربعة مخرجات والنصف السفلي للجولة خمسة مخرجات.
    3. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 1200 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. نقل أكبر قدر ممكن من supernatant إلى مربع جديد ثقافة أنبوب صغير 96 دون إزعاج بيليه الخلية والتخلص من القديم. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    6. من المربع الجديد، نقل 100 ميكرولتر من كل أنبوب إلى 96 لوحة غير ملزمة جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في جميع الآبار. تخلط جيدا وتخزينها في -80 درجة مئوية كمخزون احتياطية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن التحقق من الموثقات المنتجة من عرض phage وتحليلها بطرق عديدة. فمن المستحسن أن المضي قدما أولا مع تسلسل phage مع التمهيديات التي تحيط إدراج متنوعة في مكتبة phagemid. سوف تظهر تجربة عرض phage المثالية تحيزا واضحا نحو عدة تسلسلات (الشكل 1). تسلسل أخرى ستكون موجودة أيضا ولكن مع عدد أقل، تظهر أكثر كضوضاء الخلفية. في المثال المقدم، حيث تم تنفيذ عرض phage بين المتغيرات في كل مكان (UbVs) وUBE4B البرية، هناك تحيز خاص نحو تسلسل # 1-4. مثال تم توفير برنامج نصي Python لتنظيم ملفات التسلسل وتحليلها ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). لتأكيد أهمية الموثقات، يمكن استخدام المقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) كمقياس سريع للتقارب النسبي الملزم للبروتين المستهدف من النوع البري، والبروتين المستهدف المتحول، وكذلك البروتينات غير المستهدفة (الشكل 1). يمكن تحديد الاختلافات في التقارب الملزم بين الموثقات الجديدة وبروتين الربط البري ، الذي استندت إليه الموثقات الجديدة ، عن طريق تطبيع امتصاص ELISA للموثقات إلى بروتين النمط البري (غير المعروض) أو البروتينات الأخرى التي لا تثبت أي ربط ملحوظ مع البروتين المستهدف (الشكل 1). يوضح هذا المثال ميل التسلسلات المخصبة إلى أن يكون لها تقارب ربط أعلى للبروتين المستهدف. مثال تم توفير برنامج نصي Python لتنظيم وتحليل ملفات التسلسل ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). بالإضافة إلى ذلك، تم توفير مثال البرنامج النصي بيثون خصيصا لتحليل نتائج UbV ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). من الناحية المثالية ، فإن تسلسل الموثق الذي هو أكثر عددا يمتلك تقاربا ربطا نسبيا أعلى من التسلسلات الأقل عددا ، والتي يفترض أنها ضوضاء خلفية. من الممكن أن تكون الموثقات غير المستقرة منخفضة العدد ولكنها تظهر ربطا ملموسا من خلال ELISAs. وينبغي إجراء مزيد من التحقيق في هذه المجلدات لتحديد ما إذا كانت درجات ELISA هي قطع أثرية أو ما إذا كانت في الواقع ملفات تستحق المزيد من التوصيف.

Figure 1
الشكل 1: تم طلب النتائج التمثيلية لاختيار متغير Ubiquitin (UbV) مقابل UBE4B. (A) UbVs من أعلى إلى أدنى تردد (عدد). تمثل التسلسلات منطقة كل مكان متنوعة في UbV مع جميع المخلفات العشوائية (على وجه التحديد ، المخلفات 2 و 4 و 6 و 8-12 و 14 و 42 و 44 و 46-49 و 62-64 و 66 و 68 و 70-78). تم تطبيع جميع امتصاصات ELISA مقابل 96 متوسط درجات BSA ELISA و 96 متوسط درجات GST ELISA. يمثل اللون الأخضر الداكن ربطا نسبيا أقوى. تم تضمين GST كتحكم في الربط غير المحدد نظرا لحقيقة أن البروتين المستهدف هو الموسومة GST. (ب) ملخص رسومي لنتائج ELISA من لوحة A. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم ترتيب الخطوات المقترحة لتنفيذ عرض phage. تشير الخطوط المتقطعة إلى العمليات التي يتم ترحيلها إلى اليوم التالي أو من اليوم السابق. جميع الجولات اللاحقة بعد الجولة الثالثة تسير على نحو مماثل للجولة الثالثة، باستثناء الجولة الخامسة حيث لا يلزم إعداد مدخلات phage ما لم يتم إجراء المزيد من الجولات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن البرامج المعملية المقترحة والتسميات لإعداد تجربة عرض phage. ويشار إلى الغرض والخطوات ذات الصلة في البروتوكول. R: جولة; 1: المدخلات؛ O: الإخراج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال ظهور الكريات النموذجية التي واجهتها أثناء إجراء عرض phage. بيليه مكتبة phage يقدم كخطوط على طول الجانب من الأنبوب ويمكن أن يكون مؤخراتصدي لتركيز بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. الكريات مدخلات Phage والكريات الحطام تبدو أكثر نموذجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بيثون سكريبت. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما ذكر في الخطوة 2.1 (إعداد البروتين)، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتقييم تركيز البروتين، وسيكون لكل منها فوائد وعيوب فريدة من نوعها على أساس البروتين المستهدف المحدد المستخدم لعرض الفواج. وقد تم توفير مصدر للأوصاف التفصيلية والبروتوكولات للطرق الشعبية سابقا11.

استخدام phage التي تحتفظ بها جولة سابقة من عرض phage كمدخل لجولة لاحقة يثري الموثقات جيدة عن طريق إزالة تدريجيا الموثقات التي لا بد ضعيفة، عابر، أو عن طريق الصدفة. من خلال الجولتين الرابعة والخامسة سيكون هناك تحيز واضح نحو مجموعة صغيرة ومحددة من تسلسل الببتيد ، مما يدل على تفضيلات ملزمة للبروتين المستهدف.

تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع مكتبة UbV. وفي حين أن هذه الخطوات قد تنطبق عموما على أنواع أخرى من المكتبات (مثل الببتيد والأجسام المضادة وما إلى ذلك)، فمن المرجح أن تحتاج إلى تكييفها لاستيعاب هذه المكتبات غير التابعة لمكتبات UbV. وكما ورد في الخطوة 4-3-1، ينبغي معرفة تنوع المكتبات وتركيزها قبل الشروع في عرض ال phage. لمزيد من المعلومات حول كيفية تحديد سمات المكتبة هذه، الرجاء رؤية البروتوكول المستخدم لإنشاء مكتبات UbV المستخدمة في هذا الإجراء12.

يمكن أن تكون نتائج عرض phage واضحة جدا وتقديم ملفات المرشح الواضحة لمتابعة المزيد من التوصيف. على سبيل المثال، المجلدات التي هي على حد سواء متكررة للغاية ولها ربط أعلى بكثير، كما تقاس ELISA، هي مرشحات واضحة لمزيد من الدراسة. ومع ذلك، عندما لا يرتبط تكرار الموثق بشكل إيجابي مع بيانات ELISA، قد يمثل هذا بعض الارتباك حول كيفية تحديد ملفات مثيرة للاهتمام. في المثال المقدم (الشكل 1) ، فإنه من المستحسن لاختيار مزيج من الموثقات الأكثر شيوعا ، حتى لو كان لديهم تقارب ربط منخفضة ، وتلك التي لديها تقارب ربط أعلى ، حتى لو كانت تبدو نادرة. قد لا تكون الموثقات النادرة ذات درجات ELISA العالية شائعة بسبب عدم الاستقرار أثناء عرض phage ، مما سيؤثر سلبا على انتشارها في هذه البيانات النهائية. على هذا النحو ، هذه تستحق التحقيق بقدر ما هي المجلدات المتكررة للغاية.

يمكن أن تكون ملوثة حلول phage معزولة بسهولة. من المستحسن المضي قدما في تسلسل الحمض النووي في أقرب وقت ممكن باستخدام التمهيديات التي تحيط بمنطقة الببتيد المتنوع. تحليل نموذجي آخر بعد العرض هو إجراء ELISAs من الموثقات مع البروتين المستهدف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنفيذ ELISAs مع الموثقات والإصدارات المتحولة / المبتورة من البروتينات المستهدفة ، والتي يمكن أن تعطي فكرة تقريبية عن وضع الربط المحتمل. من المهم جدا ملاحظة أن حلول phage يجب أن تكون مختلطة بشكل جيد قبل استخدامها في أي تجربة إذا كانت جالسة لفترة من الوقت. يمكن للphage امتزاز جدران الأنبوب أو تسوية للخروج من الحل ، ويمكن أن تنتج السلبيات كاذبة.

10- يوضح الشكل 2 الطريقة الأكثر كفاءة في الوقت لتنفيذ هذا الإجراء. تبدأ كل جولة مع إعداد الثقافة البكتيرية اللازمة لنمو مدخلات phage للجولة اللاحقة في اليوم التالي. في حين أن هذه الثقافة تنمو، يمكن حظر لوحات المغلفة. بينما يتم حظر اللوحات ، يمكن إعداد المكتبة (للجولة الأولى) أو يمكن إعداد مدخلات phage (للجولات اللاحقة). في يوم الجولة الرابعة ليست هناك حاجة لإعداد ثقافة البذور وبالتالي في يوم الجولة الخامسة ليست هناك حاجة للقيام بأي استعدادات لمدخلات phage الجولة القادمة ما لم يكن أحد يعتزم القيام بأكثر من خمس جولات من الاختيار. لمزيد من الاقتصاد في الوقت، تم أيضا توفير إعداد labware المقترحة (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، الكريات phage ليست دائما متميزة ، لذلك تم توفير صور المظاهر بيليه نموذجية واجه خلال هذا الإجراء (الشكل 4).

إذا كان هناك أي مشاكل مع بيليه phage أثناء إعداد المدخلات لجولة لاحقة، قد تحتاج إلى وقف التجربة ليوم واحد في حين تزرع phage جديدة. ويمكن استرداد هذه العودة إلى phage المحفوظة في أنابيب لإدخال تلك الجولة. على سبيل المثال، إذا كان لا يمكن أن يكون بيليه phage اللازمة للجولة الثالثة من العرض لسبب ما، يمكنك العودة إلى أنبوب "R3I" الذي يحتوي على 400 ميكرولتر من مدخلات phage للجولة الثالثة. ويمكن تكرار ذلك مرة واحدة فقط إذا طلاء أربعة آبار مع 100 ميكرولتر.

وتيتر من phage الإخراج للجولات 4-5 هو عادة في نطاق 106 إلى 108 PFU / مل. إذا كان التأليه ليس من الفائدة، ببساطة وجود ما يكفي من المستعمرات الحاضر لملء مربع ثقافة أنبوب صغير 96 ينبغي أن تكون كافية لتوفير تمثيل دقيق للتنوع phage وتتر لا يهم بالضرورة. ومع ذلك ، إذا كان titer من phage الإخراج منخفضة وأكثر المستعمرات المطلوبة ، يمكن إعادة صياغة phage بتكرار الخطوة 5.3. أساسا، يمكن إعادة ختم phage عن طريق اتخاذ الإخراج لجولة الاختيار المطلوب، تلقيح خلايا مرحلة منتصف السجل، إضافة phage المساعد وكاربينسيلين، وزراعة الثقافة بين عشية وضحاها، وحصاد phage عن طريق هطول الأمطار PEG كما هو موضح سابقا.

طرق العرض الأخرى موجودة، ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة بالنسبة لعرض phage. في طرق عرض الجسم الحي، مثل عرض سطح الخلية، قد تزيد من احتمال طي البروتين السليم وتسمح أيضا بإجراء تعديلات ما بعد الترجمة؛ ومع ذلك، فإن هذه الطرق مقيدة من خلال الاضطرار إلى استخدام أحجام مكتبة أصغر بكثير13 والتعبير عن البروتينات بشكل متعدد التكافؤ. التعبير متعدد التكافؤ يدخل آثار متعطشا التي تتداخل مع وإخفاء التقارب الجوهري للببتيد، الذي هو من أهمية أكبر عند توليد الموثقات الرواية. تجاوز عرض Phage هذه المشكلة لأنه تم تكييفه للعرض أحادي التكافؤ، وبالتالي تسهيل اختيار الموثقات مع تقارب محسنة حقا14,15,16. وبالمثل، لا تعوق طرق العرض المختبرية الأخرى القيود المفروضة على طرق عرض الجسم الحي ولكنها تمثل تحديات فريدة خاصة بها. على سبيل المثال، يمكن استخدام عرض الريبوسوم للتحقيق في المكتبات الكبيرة (1013-14)17، ومع ذلك، فإن إخراج التحديدات هو في شكل جزيئات مرنا التي هي بطبيعتها أقل استقرارا من إخراج الحمض النووي المغلفة بالفياج من عرض phage18. وقد أظهرت طرق العرض الأخرى في المختبر، مثل عرض mRNA/cDNA، والعرض القائم على نشاط CIS (CIS) وعرض الأجسام المضادة التساهمية (CAD) مشاكل في الكفاءة والاستقرار وعدم الاتساق19,20,21,22,23.

يتم تقييد عرض Phage نفسه بسبب تقييد أحجام المكتبات بسبب كفاءة التحول البكتيري وعدم السماح للمكتبات ذات التسلسلات التي تتداخل مع نمو phage / البكتيري16 ، ولكن بشكل عام ، هذه القيود لا تذكر ، وقد نجح عرض phage في إنتاج ملفات محددة وقوية للغاية من البروتينات المستهدفة2،5،10،24 ، 25- ال 25- الأرباح التي ي لا يمكن استخدام هذا فقط في البحوث الطبية لتطوير علاجات جديدة ولكن أيضا لتوضيح خصائص البروتين والانزيم ومعرفة المزيد عن التفاعلات البروتين المشاركة في المسارات البيولوجية الهامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم ابتكار تقنية متغير ubiquitin في مختبر الدكتور ساشديف سيدهو (جامعة تورنتو). WZ حاليا باحث CIFAR Azrieli العالمية في البشر وبرنامج الميكروبيوم. تم تمويل هذا البحث من قبل NSERC ديسكفري المنح الممنوحة لWZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 174،
استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter