Summary
A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.
Abstract
Ubiquitin é uma pequena proteína de 8,6 kDa que é um componente central do sistema ubiquitin-proteasome. Consequentemente, pode se ligar a uma variedade diversificada de proteínas com alta especificidade, mas baixa afinidade. Através do display de phage, as variantes de ubiquitina (UbVs) podem ser projetadas de tal forma que exibem maior afinidade sobre a ubiquitina wildtype e mantêm a especificidade de ligação às proteínas-alvo. O display phage utiliza uma biblioteca phagemid, pela qual a proteína pIII coat de um bacteriophage m13 filamentoso (escolhido porque é exibido externamente na superfície da praga) é fundido com UbVs. Resíduos específicos do tipo selvagem humano ubiquitin são macios e randomizados (ou seja, há um viés em relação à sequência de tipo silvestre nativo) para gerar UbVs para que mudanças deletérias na conformação proteica sejam evitadas ao introduzir a diversidade necessária para promover novas interações com a proteína alvo. Durante o processo de exibição de phage, esses UbVs são expressos e exibidos em proteínas de revestimento de phage e garimpados contra uma proteína de interesse. Os UbVs que exibem interações vinculantes favoráveis com a proteína alvo são retidos, enquanto os aglutinantes pobres são lavados e removidos da piscina da biblioteca. Os UbVs retidos, que são anexados à partícula de phage contendo o phagemid correspondente da UbV, são elucidos, amplificados e concentrados para que possam ser garimpados contra a mesma proteína alvo em outra rodada de exibição de phage. Normalmente, são realizadas até cinco rodadas de exibição de phage, durante as quais uma forte pressão de seleção é imposta contra UbVs que se ligam fracamente e/ou promiscuamente para que aqueles com maiores afinidades sejam concentrados e enriquecidos. Em última análise, os UbVs que demonstram maior especificidade e/ou afinidade com a proteína alvo do que suas contrapartes do tipo selvagem são isolados e podem ser caracterizados através de outros experimentos.
Introduction
Compreender os detalhes moleculares das interações proteína-proteína é fundamental para delinear os mecanismos de transdução de sinais dos processos biológicos, particularmente aqueles que contribuem para doenças clinicamente importantes. Nos últimos anos, a exposição phage tem sido utilizada como um método prático e acessível para isolar proteínas/peptídeos com uma ligação muito melhor a uma proteína alvo desejada1,2,3,4, que por sua vez pode ser usada como sondas intracelulares de interações proteína-proteína.
A ubiquização é uma cascata de atividades enzimáticas (E1 ativando enzima → enzima conjugadora E2 → ligases E3) que conjugam covalentemente a ubiquitina (Ub) para substratos proteicos para direcioná-los para degradação ou para mediar as alterações de sinalização celular. Além disso, as deubiquitinas catalisam a remoção da ubiquitina das proteínas. Portanto, nas células, há milhares de interações proteína-proteína dependentes de Ub, a grande maioria das quais reconhecem uma superfície comum com baixa afinidade, mas alta especificidade para permitir interações fracas através de grandes e diversas superfícies.
Ernst et al. introduziram mutações em regiões de ligação conhecidas da Ub, a fim de ver se eles poderiam aumentar a afinidade vinculante para uma proteína de interesse, mantendo ainda alta seletividade5. Uma biblioteca combinatória de mais de 10 bilhões (7,5 x 1010) variantes ub (UbVs) com mutações em posições em toda a superfície Ub que mediam as conhecidas interações ub-proteína foi desenvolvida. Esta biblioteca consistia de phagemides que expressam a proteína m13 bacteriophage pIII coat fundida a UbVs diversificadas. Portanto, UbVs individuais podem ser exibidos na superfície da praga através da proteína do casaco após a expressão. Durante o processo de seleção, phage que exibe UbVs com considerável interações vinculantes com a proteína alvo será retido e enriquecido em rodadas subsequentes de exibição de phage, enquanto phage exibindo UbVs que se ligam mal à proteína alvo são lavados e removidos da piscina de phage. As partículas de phage retidas contêm o phagemid correspondente ao seu UbV exibido, permitindo que sejam sequenciados e ainda mais caracterizados uma vez isolados.
Utilizando esta estratégia de engenharia proteica, os inibidores de UbV foram desenvolvidos para deubiquitinases humanas5 e proteases 6 virais. É importante ressaltar que geramos UbVs inibitórios para ligaduras E3 da família HECT humana através do sequestro do site de ligação E2 e ativação de UbVs que ocupam um exosite ub-vinculante no domínio HECT7. Também podemos inibir e3s monoméricas da família RING mirando o site de ligação E2 e induzir a dimerização ubV para ativar o HOMOdimeric RING E3s8. Para vários E3s ring multi-subunidades, os UbVs podem alcançar a inibição mirando a subunidade RING (por exemplo, para complexo APC/C9) ou interrompendo a formação complexa (por exemplo, para SCF E3s10). Coletivamente, os UbVs podem ser aproveitados para interrogar sistematicamente interações proteína-proteína no sistema Ub-proteasome (UPS) para que possamos decifrar melhor os mecanismos bioquímicos das enzimas UPS e identificar e validar locais funcionais para intervenção terapêutica.
O protocolo a seguir descreve como empregar uma biblioteca ubV exibida anteriormente para atingir uma proteína de interesse e como enriquecer as pastas UbV que interagem com a proteína alvo através de sucessivas rodadas de exibição de phage.
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Protocol
1. Preparação do reagente
- PBS (salina tampão fosfato): Misture 50 mL de solução PBS de 10x com 450 mL de ultrapure H2O. Esterilizar por filtragem e armazenar a 4 °C ou temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 10% BSA (albumina de soro bovino): Adicione lentamente 1 g de BSA a 7 mL de H2O ultrapure e misture até dissolver totalmente (sem aglomerados). Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 10 mL. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.
- Tampão PB (PBS complementado com 1% de BSA): Adicione lentamente 5 g de BSA a 400 mL de H2O ultrapure e 50 mL de PBS e misture até dissolver totalmente (sem aglomerados). Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 500 mL. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.
- Tampão PBT (PBS suplementado com 1% BSA e 0,05% Tween 20): Adicione lentamente 5 g de BSA a 400 mL de H2O ultrauso e 50 mL de PBS e misture até dissolver totalmente (sem aglomerados). Adicione 250 μL de Tween 20. Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 500 mL. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.
- Tampão PT (PBS complementado com 0,05% Tween 20): Mix 1 mL de Tween 20 com 400 mL de PBS. Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 2 L. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C ou temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 2YT caldo: Adicione 16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl a 800 mL de H2O ultrapure e misture até dissolver totalmente (sem aglomerados). Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 1 L. Esterilize autoclaving e armazene à temperatura ambiente (~20-25 °C).
- PLACAS LB/carb: Adicione 12,5 g de mistura LB pré-fabricada e 7,5 g de ágar a 400 mL de H2O. Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 500 mL e esterilize por autoclavagem. Certifique-se de que o ágar está totalmente dissolvido e espere que esfrie abaixo de 60 °C. Adicione 500 μL de 100 mg de carbenicilina mL, misture bem e despeje na placa. Armazenar a 4 °C.
- Placas LB/tet: Adicione 12,5 g de mistura LB pré-fabricada e 7,5 g de ágar a 400 mL de ultrapure H2O. Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 500 mL e esterilize por autoclavagem. Certifique-se de que o ágar está totalmente dissolvido e espere que esfrie abaixo de 60 °C. Adicione 500 μL de 10 mg de tetraciclina mL, misture bem e despeje na placa. Armazenar a 4 °C.
- 20% PEG (polietileno glicol)/2,5 M NaCl: Adicione 50 g de PEG-8000 e 36,5 g de NaCl a 200 mL de ultrapure H2O. Misture até dissolver completamente.
NOTA: Isso pode demorar um pouco; O aquecimento pode ajudar. Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 250 mL. Esterilizar por filtragem ou autoclavação. - 0,1 M HCl: Misture 20 mL de 1 M HCl com 180 mL de ultrapure H2O. Esterilize por filtragem e armazene à temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 1 M Tris (pH 11.0): Adicione 6,1 g de base Tris a 40 mL de ultrapure H2O. Ajuste o pH para 11.0 com HCl e misture até que tris esteja totalmente dissolvido. Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 50 mL. Esterilizar por filtragem e armazenar à temperatura ambiente (~20-25 °C).
- 100 mg/mL (1000x) carbenicilina: Adicione 2 g do sal de disódio carbenicilina a 20 mL de ultrapure H2O. Misture até dissolver totalmente. Esterilize por filtragem e armazene a -20 °C.
- 50 mg/mL (1000x) kanamycin: Adicione 1 g de sulfato de kanamicina a 20 mL de ultrapure H2O. Misture até dissolver completamente. Esterilize por filtragem e armazene a -20 °C.
- Tetraciclina de 10 mg/mL (1000x): Adicione 0,2 g de cloridrato de tetraciclina a 20 mL de 70% de etanol. Misture até dissolver completamente. Esterilize por filtragem e armazene a -20 °C.
2. Preparação de proteínas
- Determine a concentração do estoque de proteína alvo em μM. A maneira mais conveniente de avaliar a concentração proteica é medir a absorção do estoque de proteínas em 280 nm. Se a concentração for conhecida em mg/mL, converta-a em μM usando o peso molecular da proteína alvo. Uma série de métodos podem ser usados dependendo da proteína de interesse; consulte a seção Discussão para obter detalhes.
NOTA: Se a proteína for truncada (domínio/motivo específico da proteína) ou marcada, lembre-se de explicar essas alterações no peso molecular ao converter de mg/mL para μM. - Prepare três tubos de microcentrifuuge rotulados como "round 1", "round 2/3" e "round 4/5".
- Calcule o volume de proteína necessário para diluí-lo a 1 μM em 800 μL PBS e aliquotar esse volume nos tubos sem adicionar PBS.
NOTA: Se a quantidade de proteína alvo disponível for baixa, a concentração pode ser reduzida para apenas 0,25 μM.
- Calcule o volume de proteína necessário para diluí-lo a 1 μM em 800 μL PBS e aliquotar esse volume nos tubos sem adicionar PBS.
3. Preparação para a primeira rodada da seleção
- Prepare uma cultura de sementes para cultivar o insumo phage para a segunda rodada de seleção.
- Inocular 5 mL de 2YT/tet com uma colônia escherichia coli bem isolada e incubar durante a noite a 37 °C com tremor orbital de 200 rpm.
- Cubra a placa para a primeira rodada de seleção.
- Diluir a proteína alvo no tubo "round 1" com a quantidade apropriada de PBS e alíquota de 100 μL em oito poços de uma placa de ligação de 96 poços (ou seja, a placa alvo).
NOTA: O visor de phage pode ser feito para quatro proteínas diferentes simultaneamente em uma única placa, revestindo os poços nos cantos da placa. - Controle opcional: Se a proteína alvo estiver marcada, como com GST ou MBP (proteína de ligação maltosa), cubra oito poços em outra placa de ligação de 96 poços com 100 μL de uma solução de 1 μM contendo a etiqueta de epítope apropriada. Isso será usado para remover phage indesejado que se liga à tag não especificamente.
- Agitar placas durante a noite a 4 °C com 200 rpm orbital tremendo.
- Diluir a proteína alvo no tubo "round 1" com a quantidade apropriada de PBS e alíquota de 100 μL em oito poços de uma placa de ligação de 96 poços (ou seja, a placa alvo).
4. Primeira rodada de seleção
- Prepare a entrada do segundo round.
- Inocular 30 mL de 2YT/tet com 200 μL da cultura de sementes a partir do passo 3.1.
- Incubar a 37 °C com tremor orbital de 200 rpm até que as bactérias estejam em fase de tronco médio (OD600
0,6 - 0,8). Isso leva aproximadamente três h.
- Bloqueie a placa alvo.
- Remova a solução de revestimento da placa, ou ambas as placas se uma placa de controle tiver sido feita, invertendo e tremendo sobre uma pia. Pat secar em toalhas de papel.
- Adicione 300 μL de tampão PB a cada bem revestido.
- Remova o buffer PB como na etapa 4.2.1 e adicione mais 200 μL de tampão PB.
- Incubar à temperatura ambiente (~20-25 °C) por 1h com tremor orbital de 300 rpm.
- Prepare a biblioteca phage.
- Descongele a biblioteca de phage no gelo e dilui-a para 100x a diversidade da biblioteca na PBS. Por exemplo, se a diversidade da biblioteca for 1 x 1010 e a concentração da biblioteca for 1 x 1013, diluir a biblioteca para que a concentração seja 1 x 1012. Para as bibliotecas utilizadas aqui, diluir-as 10 vezes em PBS, combinando 1 mL da biblioteca com 9 mL de PBS.
NOTA: A diversidade da biblioteca deveria ter sido determinada durante a criação da biblioteca e não pode ser facilmente avaliada de outra forma. A concentração da biblioteca pode ser determinada inoculando células E. coli na fase de tronco médio (OD600 0,6 - 0,8) e emplacamento em LB/carb. - Adicione 1/5 de volume de PEG/NaCl. Por exemplo, para 10 mL da biblioteca anteriormente diluída, adicione 2 mL de PEG/NaCl.
- Incubar no gelo por 30 minutos.
- Centrifugar a 11.000 x g por 30 min a 4 °C, descartar supernadant, e recentementerifuge por 2 min para puxar para baixo o restante sobrenante.
NOTA: Coloque o tubo no rotor na mesma orientação da segunda vez que foi o primeiro a manter a pelota no mesmo lugar, facilitando a vista. - Levemente resuspenque a pelota de phage em 1 mL de PBT por proteína. Para quatro proteínas, resuspense a pelota em 4 mL de PBT.
NOTA: Tente não tocar na pelota e não introduza bolhas de ar.
- Descongele a biblioteca de phage no gelo e dilui-a para 100x a diversidade da biblioteca na PBS. Por exemplo, se a diversidade da biblioteca for 1 x 1010 e a concentração da biblioteca for 1 x 1013, diluir a biblioteca para que a concentração seja 1 x 1012. Para as bibliotecas utilizadas aqui, diluir-as 10 vezes em PBS, combinando 1 mL da biblioteca com 9 mL de PBS.
- Exibir phage para as proteínas-alvo( s).
- Controle opcional: Adicione 100 μL de biblioteca de phage a cada bem revestido na placa de controle. Incubar à temperatura ambiente (~20-25 °C) por 1h com tremor orbital de 300 rpm e transferir a biblioteca da placa de controle para a placa alvo. Pule a etapa 4.4.2.
- Remova o tampão PB da placa alvo como na etapa 4.2.1 e adicione 100 μL da biblioteca de phage a cada poço revestido.
- Incubar à temperatura ambiente (~20-25 °C) por 1h com tremor orbital de 300 rpm.
- Elute rodada um phage.
- Remova a biblioteca de phage e lave os poços revestidos quatro vezes com tampão PT. Inverta a placa e bata em uma toalha de papel para remover as últimas gotas.
NOTA: Se várias proteínas-alvo forem revestidas em uma placa, tente minimizar o fluxo de todas as soluções subsequentes entre os poços. - Adicione 100 μL de 0,1 M HCL a cada poço revestido e incubar em temperatura ambiente por 5 min com tremor orbital de 300 rpm.
- Neutralize o pH adicionando 12,5 μL de 1 M Tris-HCl (pH 11) a cada bem revestido.
- Acumule a praga elucidada de todos os 8 poços em um único tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Pipeta para cima e para baixo durante a transferência para tornar as soluções homogêneas e aspirar todo o líquido dos poços.
- Adicione 10% de BSA ao phage elucido agrupado a uma concentração final de 1%. Para um volume típico de eluição redonda de 950 μL, adicione 95 μL de 10% de BSA. Armazenar a 4 °C. Esta é a saída redonda.
- Remova a biblioteca de phage e lave os poços revestidos quatro vezes com tampão PT. Inverta a placa e bata em uma toalha de papel para remover as últimas gotas.
0,6 - 0,8). Isso leva aproximadamente três h.5. Preparação para rodadas subsequentes de seleção
- Prepare uma cultura de sementes para cultivar o insumo phage para a próxima rodada de seleção como na etapa 3.1.
- Cubra a placa para a terceira rodada de seleção como na etapa 3.2 com as mudanças anotadas abaixo.
- Apenas cubra quatro poços por proteína em uma placa de ligação de 96 poços. Use metade do conteúdo dos tubos "round 2/3" ou "round 4/5" para a rodada apropriada. Diluir o conteúdo desses tubos conforme necessário, a fim de evitar que as proteínas se acomodem fora da solução.
- Prepare a entrada de phage para a próxima rodada de seleção.
- Use metade da saída redonda da etapa 4.5.5 para inocular 3 mL de células de fase de tronco médio a partir da etapa 4.1. Para uma saída típica de uma rodada, inocula com 500 μL da saída.
- Incubar a 37 °C por 30 min com tremor orbital de 200 rpm.
- Adicione phage auxiliar M13K07 a uma concentração final de 1 x 1010 PFU/mL.
- Incubar a 37 °C por 1h com tremor orbital de 200 rpm.
- Transfira todo o 3 mL de cultura para 30 mL de 2YT/carb/kan. Cresça durante a noite a 37 °C com tremor orbital de 200 rpm.
- No dia seguinte, transfira a cultura para um tubo de centrífugas de 50 mL e centrífuga a 11.000 x g por 10 min a 4 °C para precipitar células.
- Decante o supernascimento em um novo tubo de centrífuga de 50 mL e misture com 8 mL de PEG/NaCl e incubar no gelo por 10 minutos.
- Centrifugar a 11.000 x g por 10 min a 4 °C, descartar o supernaspe e centrífuga novamente por 2 min.
NOTA: Coloque o tubo no rotor na mesma orientação da segunda vez que foi o primeiro a manter a pelota no mesmo lugar, facilitando a vista. - Resuspenda a pelota de phage em 800 μL de PBT para que seja totalmente homogênea e não sejam visíveis aglomerados.
- Transfira a solução de phage para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga a 16.200 x g por 4 min a 4 °C para detritos de pelotas.
- Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga. Esta é a entrada para a próxima rodada de seleção.
- Opcional: Titer as soluções de entrada e saída.
- Use 500 μL de uma cultura de sementes E. coli para inocular 5 mL de 2YT/tet e incubar a 37 °C com 200 rpm de agitação orbital até que as bactérias esteja em fase de tronco médio (OD600 0,6 - 0,8). Isso leva aproximadamente 1 h.
- Diluir as soluções de entrada/saída de phagem para 10-3 - 10-5 em PBS e adicionar 10 μL de cada diluição a 90 μL de células cultivadas.
NOTA: Use soluções de phage diluídas imediatamente porque phage irá adsorb para o tubo ao longo do tempo, e transformações podem produzir falsos negativos. - Incubar a 37 °C por 20 min com tremor orbital de 200 rpm.
- Placa 5 μL em placas LB/carb separadas.
NOTA: O valor emplacado é variável depende de resultados anteriores/preferência pessoal.
- Use 500 μL de uma cultura de sementes E. coli para inocular 5 mL de 2YT/tet e incubar a 37 °C com 200 rpm de agitação orbital até que as bactérias esteja em fase de tronco médio (OD600
6. Rodadas subsequentes de seleção
- Realize todas as rodadas subsequentes junto com a preparação feita nas etapas 3 e 4, respectivamente, com diferenças observadas abaixo.
- Use a entrada produzida na rodada anterior como fonte de phage em vez de uma biblioteca. Cubra 4 poços por proteína alvo com 100 μL da entrada phage adquirida da rodada anterior. Armazene as entradas restantes de phage a 4 °C.
- Faça a etapa de lavagem em 4.5.1 mais rigorosa a cada rodada de seleção. A primeira rodada requer lavagem 4 vezes, a segunda rodada requer 6 vezes, a terceira rodada requer 8 vezes, e as rodadas quatro e cinco exigem lavagem 10 vezes.
- Reduza alguns volumes em comparação com os usados na primeira rodada, pois as rodadas subsequentes apenas cobrem quatro poços em vez de oito. Por exemplo, na etapa 4.5.5 apenas 45 μL de 10% BSA é adicionado à saída de phage, e na etapa 5.3.1 apenas 250 μL da saída de phage é usado para inocular células.
7. Processamento de pós-seleção e isolamento phage
- Titer as soluções de entrada e saída para as rodadas quatro e cinco.
- Se ainda não for feito na etapa 5.4, siga os mesmos passos para as rodadas de titulação quatro e cinco saídas phage, produzindo idealmente uma gama de 30-300 colônias em algumas placas.
- Cultura e isolar phage.
- Aliquot 450 μL de 2YT/carb/M13K07 em cada tubo de uma caixa de cultura de tubo 96.
- Escolha colônias bem isoladas de qualquer uma das placas do passo 7.1 para inocular cada tubo.
NOTA: Use a metade superior da caixa para as saídas da quarta rodada e a metade inferior para as saídas da quinta rodada. - Incubar durante a noite a 37 °C com tremor orbital de 200 rpm.
- Centrifugar a 1.200 x g por 10 min a 4 °C.
- Transfira o máximo possível de supernasce para uma nova caixa de cultura de mini tubo 96 sem perturbar a pelota celular e descarte a antiga. Armazenar a 4 °C.
- Da nova caixa, transfira 100 μL de cada tubo para uma placa de 96 bem não vinculante contendo 100 μL de 50% de glicerol em todos os poços. Misture bem e armazene a -80 °C como um estoque de backup.
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Representative Results
As pastas produzidas a partir do display phage podem ser verificadas e analisadas de muitas maneiras. Recomenda-se primeiro proceder com o sequenciamento do phage com primers que flanqueiam a inserção diversificada na biblioteca phagemid. Um experimento ideal de exibição de phage mostrará um viés claro em relação a várias sequências (Figura 1). Outras sequências também estarão presentes, mas com uma contagem mais baixa, aparecendo mais como ruído de fundo. No exemplo fornecido, onde o display phage foi realizado entre variantes de ubiquitina (UbVs) e UBE4B wildtype, há um viés particular em relação às sequências #1-4. Um script Python de exemplo para organizar e analisar arquivos de sequenciamento foi fornecido ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). Para confirmar a significância das pastas, os ensaios imunossorbentes ligados à enzima (ELISA) podem ser usados como uma medida rápida de afinidade relativa de ligação à proteína alvo do tipo selvagem, proteína alvo mutada, bem como proteínas fora do alvo (Figura 1). As diferenças nas afinidades vinculantes entre as novas pastas e a proteína de ligação do tipo selvagem, sobre as quais as novas aglutinantes foram baseadas, podem ser determinadas pela normalização da absorção ELISA das pastas à proteína do tipo selvagem (não mostrada) ou outras proteínas que não demonstram nenhuma ligação considerável com a proteína alvo (Figura 1). Este exemplo demonstra a tendência das sequências enriquecidas de ter maior afinidade vinculante para a proteína alvo. Um script Python de exemplo para organizar e analisar arquivos de sequenciamento foi fornecido ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Além disso, um script Python de exemplo especificamente para analisar os resultados da UbV foi fornecido ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Idealmente, sequências de aglutinantes que são mais numerosas terão maior afinidade relativa de ligação do que sequências menos numerosas, que são presumivelmente ruído de fundo. É possível que as pastas instáveis sejam baixas em número, mas demonstrem vinculação considerável através de ELISAs. Essas pastas devem ser investigadas para determinar se as pontuações ELISA são artefatos ou se são de fato aglutinantes dignos de uma caracterização posterior.
Figura 1: Os resultados representativos para uma seleção da variante ubiquitina (UbV) contra UBE4B. (A) UbVs foram ordenados da maior para a menor frequência (contagens). As sequências representam a região diversificada da ubiquitina na UbV com todos os resíduos randomizados (especificamente, resíduos 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 e 70-78). Todas as absorvâncias ELISA foram normalizadas contra 96 pontuações médias de BSA ELISA e 96 pontuações médias de GST ELISA. O verde mais escuro representa uma ligação relativa mais forte. O GST foi incluído como um controle para vinculação não específica devido ao fato de que a proteína alvo é marcada pelo GST. (B) Resumo gráfico dos resultados elisa do painel A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ordem sugerida de etapas para a realização de exibição de phage. As linhas tracejadas indicam processos que são transportados até o dia seguinte ou do dia anterior. Todas as rodadas subsequentes após o terceiro round prosseguem da mesma forma que a terceira rodada, excluindo a quinta rodada, onde nenhuma preparação de entrada phage é necessária, a menos que mais rodadas estejam sendo realizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Forneceu labware e etiquetas para configurar um experimento de exibição de phage. São indicados propósitos e etapas relevantes no protocolo. R: rodada; I: entrada; O: saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Aparições de pelotas típicas encontradas durante o procedimento de exibição de phage. A pelota da biblioteca phage apresenta-se como uma raia ao longo da lateral do tubo e pode ser recentementerifuada para concentrar a pelota na parte inferior do tubo. Pelotas de entrada de phage e pelotas de detritos parecem mais típicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Scripts Python. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Como mencionado na etapa 2.1 (preparação de proteínas), uma variedade de métodos pode ser usado para avaliar a concentração de proteínas, e cada um terá benefícios e desvantagens únicas com base na proteína alvo específica usada para exibição de phage. Uma fonte de descrições detalhadas e protocolos para métodos populares foi fornecida anteriormente11.
O uso do phage retido por uma rodada anterior de exibição de phage como a entrada para uma rodada subsequente enriquece as boas pastas, removendo gradualmente pastas que se ligam fraca, transitóriamente ou por acaso. Pelas rodadas quatro e cinco, o ideal será um viés claro em relação a um pequeno e específico conjunto de sequências de peptídeos, demonstrando preferências vinculantes da proteína alvo.
Este protocolo foi otimizado para uso com uma biblioteca UbV. Embora essas etapas geralmente possam se aplicar a outros tipos de bibliotecas (por exemplo, peptídeo, anticorpo, etc.), elas provavelmente precisarão ser adaptadas para acomodar tais bibliotecas não-UbV. Conforme mencionado na etapa 4.3.1, a diversidade e concentração da biblioteca devem ser conhecidas antes de prosseguir com a exibição de phage. Para obter mais informações sobre como esses atributos de biblioteca são determinados, consulte o protocolo usado para criar as bibliotecas UbV usadas neste procedimento12.
Os resultados da exibição de phage podem ser muito claros e apresentar aglutinantes candidatos óbvios para buscar uma caracterização adicional. Por exemplo, as pastas que são altamente frequentes e têm vinculação significativamente maior, medida pela ELISA, são candidatos claros para um estudo mais aprofundado. No entanto, quando a frequência de um determinado fichário não se correlaciona positivamente com os dados ELISA, isso pode apresentar alguma confusão sobre como destacar aglutinantes interessantes. No exemplo fornecido (Figura 1), recomenda-se escolher uma combinação dos aglutinantes mais comuns, mesmo que tenham uma baixa afinidade de ligação, e aqueles com maior afinidade vinculante, mesmo que pareçam pouco frequentes. Aglutinantes pouco freqüentees com escores de ELISA elevados podem não ser tão comuns devido à instabilidade durante a exibição de phage, o que influenciaria negativamente sua prevalência nestes dados finais. Como tal, vale a pena investigar tanto quanto as pastas altamente frequentes.
Soluções isoladas de phage podem ser contaminadas facilmente. Recomenda-se prosseguir com o sequenciamento de DNA o mais rápido possível usando primers que flanqueiam a região do peptídeo diversificado. Outra análise típica pós-exibição é realizar ELISAs das pastas com sua proteína alvo. Além disso, os ELISAs podem ser realizados com as pastas e versões mutadas/truncadas de suas proteínas-alvo, o que pode dar uma ideia aproximada de seu provável modo de ligação. É muito importante notar que as soluções phage devem ser bem misturadas antes de serem aplicadas em qualquer experimento se estiverem sentadas há algum tempo. O phage pode adsorb para as paredes do tubo ou se estabelecer fora da solução e pode produzir falsos negativos.
A maneira mais eficiente de realizar este procedimento é ilustrada na Figura 2. Comece cada rodada com a preparação da cultura bacteriana necessária para o crescimento do insumo phage para a rodada subsequente no dia seguinte. Enquanto essa cultura está crescendo, placas revestidas podem ser bloqueadas. Enquanto as placas estão sendo bloqueadas, a biblioteca pode ser preparada (para a primeira rodada) ou a entrada phage pode ser preparada (para rodadas subsequentes). No dia da quarta rodada não há necessidade de preparar uma cultura de sementes e, portanto, no dia da quinta rodada não há necessidade de fazer quaisquer preparações para a entrada da próxima rodada phage a menos que se pretende fazer mais de cinco rodadas de seleção. Para economizar ainda mais tempo, também foi fornecida uma configuração de labware sugerida (Figura 3). Além disso, as pelotas de phage nem sempre são distintas, por isso foram fornecidas imagens de aparências típicas de pelotas encontradas durante este procedimento (Figura 4).
Se houver algum problema com a pelotização do phage durante a preparação da entrada para uma rodada subsequente, o experimento pode precisar ser interrompido por um dia enquanto novos phage são cultivados. Estes podem ser recuperados voltando ao phage salvo nos tubos para a entrada para essa rodada. Por exemplo, se a phage necessária para a terceira rodada de display não puder ser pelotada por algum motivo, você pode retornar ao tubo "R3I" que contém 400 μL de entrada phage para o terceiro round. Isso só pode ser repetido uma vez se revestir quatro poços com 100 μL.
O titer de phage de saída para as rodadas quatro a cinco é tipicamente na faixa de 106 a 108 PFU/mL. Se titering não é de interesse, simplesmente ter colônias suficientes presentes para encher uma mini caixa de cultura de tubos 96 deve ser suficiente para fornecer uma representação precisa da diversidade phage e titer não necessariamente importa. No entanto, se o título da produção é baixo e mais colônias são desejadas, phage pode ser reamplificado repetindo o passo 5.3. Essencialmente, a praga pode ser reamplificada tomando a saída para a rodada de seleção desejada, inoculando células de fase de tronco médio, adicionando phage auxiliar e carbenicilina, crescendo a cultura durante a noite, e colhendo a praga via precipitação PEG como descrito anteriormente.
Outros métodos de exibição existem, e cada um possui suas próprias vantagens e desvantagens em relação ao visor phage. Métodos de exibição in vivo, como a exibição da superfície celular, podem aumentar a probabilidade de dobramento de proteínas adequada e também permitir que modificações pós-translacionais ocorram; no entanto, esses métodos são limitados por ter que usar tamanhos de biblioteca consideravelmente menores13 e expressar proteínas polivalentemente. A expressão polivalente introduz efeitos de avidez que interferem e mascaram a afinidade intrínseca do peptídeo, que é de maior interesse ao gerar novos aglutinantes. O display phage contorna esta questão porque foi adaptada para display monovalente, facilitando assim a seleção de aglutinantes com afinidades genuinamente melhoradas14,15,16. Outros métodos de exibição in vitro também não são impedidos pelas limitações dos métodos de exibição in vivo, mas apresentam seus próprios desafios únicos. Por exemplo, o display ribossomo pode ser usado para sondar bibliotecas maiores (1013-14)17, no entanto, a saída das seleções é na forma de moléculas de mRNA que são inerentemente menos estáveis do que a saída de DNA encapsulada por phage do display phage18. Outros métodos de exibição in vitro, como display mRNA/cDNA, cis activity-based display (CIS) e covalent antibody display (CAD) demonstraram problemas com eficiência, estabilidade e inconsistência19,20,21,22,23.
A exposição phage em si é limitada pela restrição dos tamanhos da biblioteca pela eficiência da transformação bacteriana e por não permitir bibliotecas com sequências que interferem no crescimento phage/bacteriano16, mas geralmente, essas limitações são insignificantes, e a exibição de phage tem sido bem sucedida na produção de pastas altamente específicas e potentes de proteínas-alvo2,5,10,24, Dia 25. Isso pode ser utilizado não só em pesquisas médicas para desenvolver novas terapêuticas, mas também para elucidar características proteicas e enzimas e aprender mais sobre interações proteicas envolvidas em importantes caminhos biológicos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
A tecnologia variante de ubiquitina foi concebida no laboratório do Dr. Sachdev Sidhu (Universidade de Toronto). WZ é atualmente um CIFAR Azrieli Global Scholar no Programa Humans & The Microbiome. Esta pesquisa foi financiada pela NSERC Discovery Grants concedida à WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
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