Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Brug phage display til at udvikle Ubiquitin Variant Modulatorer til E3 Ligases

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

Allestedsnærværende er et kritisk protein efter translationel modifikation, hvis dysregulering har været impliceret i mange menneskelige sygdomme. Denne protokol beskriver, hvordan phage display kan bruges til at isolere nye allestedsnærværende varianter, der kan binde og modulere aktiviteten af E3 ligaser, der styrer specificitet, effektivitet og mønstre af allestedsnærværende.

Abstract

Ubiquitin er et lille 8,6 kDa protein, der er en kernekomponent i ubiquitin-proteasome-systemet. Derfor kan det binde sig til en bred vifte af proteiner med høj specificitet, men lav affinitet. Gennem phage display, kan allestedsnærværende varianter (UbVs) manipuleres sådan, at de udviser forbedret affinitet over wildtype ubiquitin og opretholde bindende specificitet til at målrette proteiner. Phage display bruger en phagemid bibliotek, hvorved pIII pels protein af en filamentous M13 bakteriofage (valgt fordi det vises eksternt på phage overfladen) er smeltet sammen med UbVs. Specifikke rester af human wildtype ubiquitin er bløde og randomiserede (dvs. der er en bias i retning af indfødte wildtype sekvens) til at generere UbVs således, at skadelige ændringer i protein kropsbygning undgås samtidig indføre den mangfoldighed, der er nødvendig for at fremme nye interaktioner med målet protein. Under phage display proces, er disse UbVs udtrykkes og vises på phage coat proteiner og panoreret mod et protein af interesse. UbVs, der udviser gunstige bindende interaktioner med målet protein bevares, mens dårlige bindemidler vaskes væk og fjernes fra biblioteket pool. De bevarede UbVs, som er fastgjort til phage partikel, der indeholder UbV's tilsvarende phagemid, er eluted, forstærket, og koncentreret, så de kan panoreres mod det samme mål protein i en anden runde af phage display. Typisk udføres op til fem runder phage display, hvor der pålægges et stærkt udvælgelsespres mod UbVs, der binder svagt og / eller promiskuitet, så dem med højere tilhørsforhold er koncentreret og beriget. I sidste ende er UbVs, der demonstrerer højere specificitet og / eller affinitet for målproteinet end deres wildtype kolleger, isolerede og kan karakteriseres gennem yderligere eksperimenter.

Introduction

Forståelse af de molekylære detaljer i protein-protein interaktioner er afgørende for afgrænsning af signaltransduktionsmekanismerne i biologiske processer, især dem, der bidrager til klinisk vigtige sygdomme. I de senere år er phage display blevet brugt som en praktisk og tilgængelig metode til at isolere proteiner / peptider med meget forbedret binding til et ønsket målprotein1,2,3,4, som igen kan bruges som intracellulære sonder af protein-protein interaktioner.

Allestedsnærværende er en kaskade af enzymatiske aktiviteter (E1 aktiverende enzym → E2 konjugaterende enzym → E3 ligaser), der kovalent konjugat ubiquitin (Ub) til protein substrater til at målrette dem til nedbrydning eller at mægle celle signalering ændringer. Derudover katalyserer deubiquitinaser fjernelsen af allestedsnærværende fra proteiner. Derfor er der i celler tusindvis af Ub-afhængige protein-protein interaktioner, hvoraf langt de fleste genkender en fælles overflade med lav affinitet, men høj specificitet for at tillade svage interaktioner gennem store og forskelligartede overflader.

Ernst et al. introducerede mutationer i kendte bindende områder af Ub for at se, om de kunne øge bindende affinitet for et protein af interesse, samtidig med at høj selektivitet5 opretholdes. Et kombinatorisk bibliotek på over 10 milliarder (7,5 x 1010) Ub-varianter (UbVs) med mutationer på positioner på tværs af Ub-overfladen, der formidler de kendte Ub-protein interaktioner, blev udviklet. Dette bibliotek bestod af phagemids, der udtrykker M13 bakteriofage pIII pels protein smeltet til diversificerede UbVs. Derfor kan individuelle UbVs vises på phage overfladen via pelsproteinet ved udtryk. Under udvælgelsesprocessen vil phage, der viser UbVs med betydelige bindende interaktioner med målproteinet, blive bevaret og beriget i efterfølgende phage-display, mens phage, der viser UbVs, der binder sig dårligt til målproteinet, vaskes væk og fjernes fra phage-puljen. De bevarede phage partikler indeholder phagemid svarende til deres viste UbV, så de kan sekvenseres og yderligere karakteriseres, når de er isoleret.

Ved hjælp af denne protein engineering strategi, UbV hæmmere blev udviklet til menneskelige deubiquitinases5 og viral proteaser6. Vigtigere, vi har genereret hæmmende UbVs for menneskelige HECT-familie E3 ligaser gennem kapring af E2-bindende site og aktivering af UbVs, der indtager en Ub-bindende exosite på HECT domæne7. Vi kan også hæmme monomeriske RING-familie E3'ere ved at målrette E2-bindingsstedet og fremkalde UbV-dimerisering for at aktivere homodimerisk RING E3s8. For ring E3'er med flere underenheder kan UbVs opnå hæmning ved at målrette ring-underenheden (f.eks. for APC/C-kompleks9) eller forstyrre kompleks dannelse (f.eks. for SCF E3s10). Samlet set kan UbVs udnyttes til systematisk at afhøre protein-protein interaktioner i Ub-proteasome system (UPS), så vi bedre kan dechifrere biokemiske mekanismer af UPS enzymer og til at identificere og validere funktionelle steder for terapeutisk intervention.

Følgende protokol beskriver, hvordan man anvender en tidligere genereret phage vises UbV bibliotek til at målrette et protein af interesse, og hvordan man beriger UbV bindemidler, der interagerer med målet protein gennem successive runder af phage display.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reagens forberedelse

  1. PBS (fosfatbufferet saltvand): Bland 50 mL 10x PBS-opløsning med 450 mL ultrapur H2O. Steriliser ved filtrering og opbevares ved 4 °C eller stuetemperatur (~20-25 °C).
  2. 10% BSA (kvæg serum albumin): Tilsæt langsomt 1 g BSA til 7 mL ultrapure H2O og bland indtil de er helt opløst (ingen klumper). Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 10 mL. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 °C.
  3. PB buffer (PBS suppleret med 1% BSA): Tilsæt langsomt 5 g BSA til 400 mL ultrapur H2O og 50 mL PBS og blandes, indtil de er helt opløst (ingen klumper). Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 500 mL. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 °C.
  4. PBT-buffer (PBS suppleret med 1% BSA og 0,05% Mellem 20): Tilsæt langsomt 5 g BSA til 400 mL ultrapurE H2O og 50 mL PBS og bland indtil de er helt opløst (ingen klumper). Der tilsættes 250 μL af Mellem 20. Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 500 mL. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 °C.
  5. PT buffer (PBS suppleret med 0,05% Mellem 20): Bland 1 mL af Mellem 20 med 400 mL PBS. Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 2 L. Steriliser ved filtrering og opbevares ved 4 °C eller stuetemperatur (~20-25 °C).
  6. 2YT bouillon: Tilsæt 16 g tryptone, 10 g gærekstrakt og 5 g NaCl til 800 mL ultrapur H2O og bland indtil de er helt opløst (ingen klumper). Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 1 L. Steriliser ved autoklavering og opbevares ved stuetemperatur (~ 20-25 °C).
  7. LB/carb plader: Tilsæt 12,5 g præ-made LB blanding og 7,5 g agar til 400 mL H2O. Top op med ultrapure H2O indtil det endelige volumen er 500 mL og steriliseres ved autoklavering. Sørg for, at agaren er helt opløst, og vent på, at den afkøles til under 60 °C. Tilsæt 500 μL på 100 mg mL carbenicillin, bland godt, og hæld i plade. Opbevares ved 4 °C.
  8. LB/tet plader: Tilsættes 12,5 g forfremstillet LB-blanding og 7,5 g agar til 400 mL ultrapur H2O. Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 500 mL og steriliseres ved autoklavering. Sørg for, at agaren er helt opløst, og vent på, at den afkøles til under 60 °C. Tilsæt 500 μL på 10 mg mL tetracyklin, bland godt, og hæld i plade. Opbevares ved 4 °C.
  9. 20% PEG (polyethylenglycol)/2,5 M NaCl: Tilsæt 50 g PEG-8000 og 36,5 g NaCl til 200 mL ultrapur H2O. Mix indtil den er helt opløst.
    BEMÆRK: Dette kan tage et stykke tid; opvarmning kan hjælpe. Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 250 mL. Steriliseres ved filtrering eller autoklavering.
  10. 0,1 M HCl: Bland 20 mL 1 M HCl med 180 mL ultrapur H2O. Steriliser ved filtrering og opbevares ved stuetemperatur (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11.0): Tilsæt 6,1 g Tris base til 40 mL ultrapurE H2O. Juster pH til 11,0 med HCl og bland indtil Tris er helt opløst. Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 50 mL. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved stuetemperatur (~20-25 °C).
  12. 100 mg/mL (1000x) carbenicillin: Tilsæt 2 g carbenicillin disodium salt til 20 mL ultrapure H2O. Mix indtil fuldt opløst. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved -20 °C.
  13. 50 mg/mL (1000x) kanamycin: Tilsæt 1 g kanamycin sulfat til 20 mL ultrapur H2O. Mix indtil det er helt opløst. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved -20 °C.
  14. 10 mg/ml (1000x) tetracyklin: Tilsæt 0,2 g tetracyklinhydrochlorid til 20 ml ethanol. Bland indtil fuldt opløst. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved -20 °C.

2. Proteinpræparat

  1. Bestem koncentrationen af målproteinbestanden i μM. Den mest bekvemme måde at vurdere proteinkoncentrationen på er at måle absorbansen af proteinlageret ved 280 nm. Hvis koncentrationen kendes i mg/mL, konverteres den til μM ved hjælp af målproteinets molekylvægt. En række metoder kan anvendes afhængigt af det protein af interesse; Yderligere oplysninger finder du i afsnittet Diskussion.
    BEMÆRK: Hvis proteinet afkortes (specifikt proteindomæne/motiv) eller mærkes, skal du huske at tage højde for disse ændringer i molekylvægten ved konvertering fra mg/mL til μM.
  2. Forbered tre mikrocentrifugerør mærket "runde 1", "runde 2/3" og "runde 4/5".
    1. Proteinmængden, der er nødvendig for at fortynde det til 1 μM i 800 μL PBS, beregnes, og dette volumen skal bruges i rørene uden tilsætning af PBS.
      BEMÆRK: Hvis mængden af målprotein er lav, kan koncentrationen sænkes til så lidt som 0,25 μM.

3. Forberedelse til første runde af udvælgelse

  1. Forbered en frøkultur til dyrkning af phage-input til runde to af udvælgelsen.
    1. Pod 5 mL 2YT/tet med en velisoleret Escherichia coli koloni og inkubere natten over ved 37 °C med 200 rpm orbital rysten.
  2. Coat pladen til den første runde af udvælgelsen.
    1. Målproteinet fortyndes i "runde 1"-røret med den passende mængde PBS og aliquot 100 μL i otte brønde af en 96-brønds bindende plade (dvs. målpladen).
      BEMÆRK: Phage display kan gøres for fire forskellige proteiner samtidigt på en enkelt plade ved belægning brønde i hjørnerne af pladen.
    2. Valgfri kontrol: Hvis målproteinet mærkes, f.eks. med GST eller MBP (maltosebindende protein), bekkes otte brønde i en anden 96-brønds bindende plade med 100 μL af en 1 μM-opløsning, der indeholder det relevante epitopmærke. Dette vil blive brugt til at fjerne uønsket phage, der binder sig til tag ikke-specifikt.
    3. Rysteplade(er) natten over ved 4 °C med 200 omdr./min. orbitalrystelser.

4. Runde et af udvælgelse

  1. Forbered de to runde indgange.
    1. Pod 30 mL 2YT/tet med 200 μL af frøkulturen fra trin 3.1.
    2. Inkuber ved 37 °C med 200 omdr./min. orbital rysten, indtil bakterierne er i midten af logfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Det tager cirka tre timer.
  2. Bloker målpladen.
    1. Fjern belægningsopløsningen fra pladen eller begge plader, hvis der er lavet en kontrolplade, ved at invertere og ryste over en vask. Klap tørre på papirhåndklæder.
    2. Der tilsættes 300 μL PB-buffer til hver belagt brønd.
    3. Pbbufferen fjernes som i trin 4.2.1, og der tilføjes yderligere 200 μL PB-buffer.
    4. Inkuber ved stuetemperatur (~ 20-25 °C) i 1 time med 300 omdr./min. orbital rysten.
  3. Forbered phage bibliotek.
    1. Optø phage biblioteket på is og fortynde det til 100x biblioteket mangfoldighed i PBS. For eksempel, hvis biblioteket mangfoldighed er 1 x 1010 og bibliotekets koncentration er 1 x 1013, fortynde biblioteket, således at koncentrationen er 1 x 1012. For de biblioteker, der anvendes her, fortynde dem 10-fold i PBS ved at kombinere 1 mL af biblioteket med 9 mL PBS.
      BEMÆRK: Biblioteksdiversiteten burde have været fastlagt under biblioteksskabelsen og kan ikke let vurderes på anden måde. Bibliotekskoncentrationen kan bestemmes ved at pode E. coli-celler i midten af logfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8) og plating på LB / carb.
    2. Tilføj 1/5 volumen PEG/NaCl. For eksempel tilsættes 2 mL PEG/NaCl for 10 mL af det tidligere fortyndede bibliotek.
    3. Inkuber på is i 30 min.
    4. Centrifuge ved 11.000 x g i 30 min ved 4 °C, kassér supernatant og recentrifuge i 2 min for at trække den resterende supernatant ned.
      BEMÆRK: Sæt røret i rotoren i samme retning anden gang, som det var den første til at holde pellet på samme sted, hvilket gør det lettere at se.
    5. Resuspend forsigtigt phage pellet i 1 mL PBT pr. protein. For fire proteiner skal pellet genbruges i 4 mL PBT.
      BEMÆRK: Prøv ikke at røre ved pellet og ikke indføre luftbobler.
  4. Vis phage til målproteinet(e).
    1. Valgfri kontrol: Tilføj 100 μL phage bibliotek til hver belagt godt i styrepladen. Inkuber ved stuetemperatur (~ 20-25 °C) i 1 time med 300 omdr./min. orbital rysten og overfør biblioteket fra kontrolpladen til målpladen. Spring trin 4.4.2 over.
    2. PB-bufferen fjernes fra målpladen som i trin 4.2.1, og der tilsættes 100 μL af phagebiblioteket til hver belagt brønd.
    3. Inkuber ved stuetemperatur (~ 20-25 °C) i 1 time med 300 omdr./min. orbital rysten.
  5. Elute runde en phage.
    1. Fjern phage bibliotek og vask de coatede brønde fire gange med PT buffer. Vend pladen og tryk på et køkkenrulle for at fjerne de sidste dråber.
      BEMÆRK: Hvis flere målproteiner er belagt på en plade, skal du forsøge at minimere strømmen af alle efterfølgende løsninger mellem brøndene.
    2. Tilsæt 100 μL på 0,1 M HCl til hver belagt brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min med 300 rpm orbital rysten.
    3. Neutralisere pH ved at tilføje 12,5 μL på 1 M Tris-HCl (pH 11) til hver belagt brønd.
    4. Pool den eluted phage fra alle 8 brønde i et enkelt 1,5 mL mikrocentrifugerør. Pipette op og ned under overførslen for at gøre opløsninger homogene og aspirere al væske fra brøndene.
    5. Tilføj 10% BSA til den poolede eluted phage til en endelig koncentration på 1%. For en typisk runde en elution volumen på 950 μL, tilsættes 95 μL af 10% BSA. Opbevares ved 4 °C. Dette er den runde et output.

5. Forberedelse til efterfølgende udvælgelsesrunder

  1. Forbered en frøkultur til dyrkning af phage-inputtet til den næste udvælgelsesrunde som i trin 3.1.
  2. Coat pladen til tredje runde af udvælgelsen som i trin 3.2 med de ændringer, der er anført nedenfor.
    1. Kun pels fire brønde per protein i en 96-godt bindende plade. Halvdelen af indholdet af rørene "runde 2/3" eller "runde 4/5" anvendes til den relevante runde. Fortynd indholdet af disse rør efter behov for at undgå proteiner, der sætter sig ud af opløsningen.
  3. Forbered phage-indgangen til næste udvælgelsesrunde.
    1. Brug halvdelen af det runde output fra trin 4.5.5 til at pode 3 mL midt i logfasen celler fra trin 4.1. For en typisk runde en output, pode med 500 μL af produktionen.
    2. Inkuberes ved 37 °C i 30 min med 200 omdrejninger i kredsløb.
    3. Tilsæt M13K07 hjælper phage til en endelig koncentration på 1 x 1010 PFU/mL.
    4. Inkuberes ved 37 °C i 1 time med 200 omdrejninger i kredsløb.
    5. Overfør hele 3 mL kultur til 30 mL 2YT /carb/kan. Vokse natten over ved 37 °C med 200 rpm orbital rysten.
    6. Den næste dag overføres kulturen til et 50 mL centrifugerør og centrifuge ved 11.000 x g i 10 min ved 4 °C for at udfælde celler.
    7. Dekanter supernatanten i et nyt 50 mL centrifugerør og blandes med 8 mL PEG/NaCl og inkuberes på is i 10 min.
    8. Centrifuge ved 11.000 x g i 10 min ved 4 °C, kassér supernatanten og centrifugen igen i 2 min.
      BEMÆRK: Sæt røret i rotoren i samme retning anden gang, som det var den første til at holde pellet på samme sted, hvilket gør det lettere at se.
    9. Resuspend phage pellet i 800 μL PBT, så det er fuldt homogent, og der ikke er synlige klumper.
    10. Phageopløsningen overføres til et 1,5 mL mikrocentrifugerør og centrifuge ved 16.200 x g i 4 min ved 4 °C til pillerester.
    11. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør. Dette er inputtet til den næste udvælgelsesrunde.
  4. Valgfrit: Titer input- og outputløsningerne.
    1. Brug 500 μL af en E. coli frø kultur til at vaccinere 5 mL af 2YT/tet og inkubere ved 37 °C med 200 rpm orbital ryster indtil bakterier er i midten af log fase (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Dette tager cirka 1 time.
    2. Fortynd phage-/udgangsløsninger til 10-3 - 10-5 i PBS og tilsæt 10 μL af hver fortynding til 90 μL af dyrkede celler.
      BEMÆRK: Brug fortyndede phage-opløsninger med det samme, fordi phage vil adsorbere til røret over tid, og transformationer kan producere falske negativer.
    3. Inkuberes ved 37 °C i 20 min med 200 omdrejninger i kredsløb.
    4. Plade 5 μL på separate LB/carb plader.
      BEMÆRK: Mængden af belagt er variabel afhænger af tidligere resultater / personlige præferencer.

6. Efterfølgende udvælgelsesrunder

  1. Udfør alle efterfølgende runder sammen med forberedelsen som udført i trin 3 og 4, henholdsvis med forskelle nævnt nedenfor.
    1. Brug det input, der blev produceret i forrige runde, som phagekilde i stedet for et bibliotek. Coat 4 brønde pr. målprotein med 100 μL af den phage-indgang, der blev erhvervet fra forrige runde. Opbevar de resterende phage-indgange ved 4 °C.
    2. Gør vasketrinnet i 4.5.1 strengere for hver runde valg. Runde et kræver vask 4 gange, runde to kræver 6 gange, runde tre kræver 8 gange, og runder fire og fem begge kræver vask 10 gange.
    3. Reducer nogle mængder i forhold til dem, der anvendes i runde et, fordi efterfølgende runder kun pels fire brønde i stedet for otte. For eksempel tilsættes der i trin 4.5.5 kun 45 μL på 10% BSA til phage-outputtet, og i trin 5.3.1 anvendes kun 250 μL af phage-outputtet til at pode celler.

7. Behandling efter udvælgelsen og phage Isolation

  1. Titer input og output løsninger til runde fire og fem.
    1. Hvis det ikke allerede er gjort i trin 5.4, skal du følge de samme trin for at titer runder fire og fem phage udgange, ideelt producerer en række 30-300 kolonier på tværs af et par plader.
  2. Kultur og isoler phage.
    1. Aliquot 450 μL 2YT/carb/M13K07 i hvert rør i en 96 mini tube kulturkasse.
    2. Vælg velisolerede kolonier fra nogen af pladerne fra trin 7.1 for at pode hvert rør.
      BEMÆRK: Brug den øverste halvdel af kassen til runde fire udgange og den nederste halvdel til runde fem udgange.
    3. Inkuberes natten over ved 37 °C med 200 omdr./min. orbital rysten.
    4. Centrifuge ved 1.200 x g i 10 min ved 4 °C.
    5. Overfør så meget supernatant som muligt til en ny 96 mini tube kultur boks uden at forstyrre cellepillen og kassere den gamle. Opbevares ved 4 °C.
    6. Fra den nye kasse overføres 100 μL fra hvert rør til en 96 brøndfri plade, der indeholder 100 μL på 50% glycerol i alle brønde. Bland godt og opbevares ved -80 °C som backuplager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bindemidler fremstillet af phage display kan verificeres og analyseres på mange måder. Det anbefales først at fortsætte med at sekventere phage med primere, der flankerer den diversificerede indsats i phagemid biblioteket. Et ideelt phage display eksperiment vil vise en klar bias mod flere sekvenser (Figur 1). Andre sekvenser vil også være til stede, men med et lavere antal, der vises mere som baggrundsstøj. I det medfølgende eksempel, hvor phage display blev udført mellem allestedsnærværende varianter (UbVs) og wildtype UBE4B, er der en særlig bias mod sekvenser # 1-4. Der er givet et eksempel på Python-script til organisering og analyse af sekventeringsfiler ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). For at bekræfte betydningen af bindemidlerne kan enzymrelaterede immunosorbentanalyser (ELISA) bruges som et hurtigt mål for relativ bindende affinitet til wildtypemålproteinet, muteret målprotein samt proteiner uden for målet (figur 1). Forskelle i bindingsaffiniteter mellem de nye bindemidler og wildtypebindingsproteinet, som de nye bindemidler var baseret på, kan bestemmes ved at normalisere ELISA-absorbansen af bindemidlerne til bindemidlets (ikke vist) eller andre proteiner, der ikke viser nogen mærkbar binding med målproteinet (figur 1). Dette eksempel viser tendensen til de berigede sekvenser til at have højere bindende affinitet for målet protein. Der er givet et eksempel på Python-script til organisering og analyse af sekventeringsfiler ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Derudover er der givet et eksempel python-script specielt til analyse af UbV-resultater ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Ideelt set vil bindemiddelsekvenser, der er mere talrige, have højere relativ binding affinitet end mindre talrige sekvenser, som formodentlig er baggrundsstøj. Det er muligt, at ustabile bindemidler vil være lave i antal, men demonstrere mærkbar binding gennem ELISA'er. Disse ringbind bør undersøges yderligere for at afgøre, om ELISA-scorerne er artefakter, eller om de faktisk er ringbind, der er værdige til yderligere karakterisering.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative resultater for en allestedsnærværende variant (UbV) udvælgelse mod UBE4B. (A) UbVs blev bestilt fra højeste til laveste frekvens (tæller). Sekvenser repræsenterer den diversificerede allestedsnærværende region i UbV med alle de randomiserede rester (specifikt rester 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 og 70-78). Alle ELISA absorbanser blev normaliseret mod 96 gennemsnitlige BSA ELISA score og 96 gennemsnitlige GST ELISA score. Mørkere grøn repræsenterer stærkere relativ binding. GST blev inkluderet som en kontrol for ikke-specifik binding på grund af det faktum, at målproteinet er GST-mærket. (B) Grafisk oversigt over ELISA-resultaterne fra panel A. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Foreslået rækkefølge af trin til udførelse af phage-visning. Stiplede linjer angiver processer, der overføres til den næste dag eller fra den foregående dag. Alle efterfølgende runder efter tredje runde fortsætter på samme måde som tredje runde, undtagen runde fem, hvor der ikke er behov for phage-inputforberedelse, medmindre der udføres flere runder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Foreslået labware og etiketter til opsætning af et phage displayeksperiment. Formål og relevante trin i protokollen er angivet. R: rund; I: input; O: output. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Udseende af typiske pellets stødt under phage display procedure. Phage bibliotek pellet præsenterer som en stribe langs siden af røret og kan recentrifuged at koncentrere pellet i bunden af røret. Phage input pellets og vragrester pellets synes mere typisk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Python Scripts. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nævnt i trin 2.1 (proteinpræparat) kan en række metoder bruges til at vurdere proteinkoncentrationen, og hver vil have unikke fordele og ulemper baseret på det specifikke målprotein, der anvendes til phage-display. En kilde til detaljerede beskrivelser og protokoller for populære metoder er blevet leveret tidligere11.

Brug af phage bevaret af en tidligere runde af phage display som input til en efterfølgende runde beriger de gode bindemidler ved gradvist at fjerne bindemidler, der bundet svagt, forbigående, eller ved en tilfældighed. Ved runde fire og fem vil der ideelt set være en klar bias mod et lille og specifikt sæt peptid sekvenser, der viser bindende præferencer målproteinet.

Denne protokol er optimeret til brug med et UbV-bibliotek. Selv om disse trin generelt kan gælde for andre former for biblioteker (f.eks. peptid, antistof osv.), vil de sandsynligvis skulle tilpasses sådanne ikke-UbV-biblioteker. Som nævnt i trin 4.3.1 bør biblioteksdiversitet og -koncentration være kendt, inden der tages hensyn til phage-visning. Yderligere oplysninger om, hvordan disse biblioteksattributter bestemmes, finder du i den protokol, der bruges til at oprette de UbV-biblioteker, der bruges i denne procedure12.

Phage display resultater kan være meget klart skåret og præsentere indlysende kandidat bindemidler til at forfølge yderligere karakterisering. For eksempel er ringbind, der både er meget hyppige og har betydeligt højere binding, målt ved ELISA, klare kandidater til yderligere undersøgelse. Men når hyppigheden af et bestemt bindemiddel ikke positivt korrelerer med ELISA-dataene, kan dette udgøre en vis forvirring om, hvordan man udpeger interessante bindemidler. I det medfølgende eksempel (figur 1) anbefales det at vælge en kombination af de mest almindelige bindemidler, selv om de har en lav bindende affinitet, og dem med højere bindende affinitet, selvom de forekommer sjældne. Sjældne bindemidler med høje ELISA-scorer er muligvis ikke så almindelige på grund af ustabilitet under phage-display, hvilket ville have en negativ indflydelse på deres udbredelse i disse endelige data. Som sådan er disse værd at undersøge så meget som de meget hyppige bindemidler er.

Isolerede phage-opløsninger kan let forurenes. Det anbefales at fortsætte med DNA-sekventering så hurtigt som muligt ved hjælp af primere, der flankerer regionen af den diversificerede peptid. En anden typisk post-display analyse er at udføre ELISA'er af bindemidler med deres mål protein. Derudover kan ELISA'er udføres med bindemidler og muterede / afkortede versioner af deres målproteiner, hvilket kan give en grov idé om deres sandsynlige bindingstilstand. Det er meget vigtigt at bemærke, at phage-løsninger bør blandes godt før brug i ethvert eksperiment, hvis de har siddet i et stykke tid. Phage kan adsorbere til væggene i røret eller bosætte sig ud af opløsningen og kan producere falske negativer.

Den mest tidseffektive måde at gennemføre denne procedure på er illustreret i figur 2. Begynd hver runde med at forberede den bakteriekultur, der er nødvendig for at dyrke phage-inputtet til den efterfølgende runde den næste dag. Mens denne kultur vokser, kan coatede plader blokeres. Mens pladerne blokeres, kan biblioteket forberedes (til runde et), eller phage-indgangen kan forberedes (til efterfølgende runder). På dagen for fjerde runde er der ingen grund til at forberede en frøkultur, og derfor er der på dagen for runde fem ingen grund til at forberede næste rundes phage-input, medmindre man har til hensigt at gøre mere end fem udvælgelsesrunder. For yderligere at spare tid er der også givet en foreslået labwareopsætning (figur 3). Derudover er phage pellets ikke altid forskellige, så billeder af typiske pelletudseender, der er stødt på under denne procedure, er blevet leveret (figur 4).

Hvis der er problemer med pelleting phage under udarbejdelsen af input til en efterfølgende runde, kan eksperimentet skal stoppes i en dag, mens nye phage dyrkes. Disse kan inddrives ved at gå tilbage til phage gemt i rørene for input til denne runde. Hvis den phage, der er nødvendig for tredje visningsrunde, f.eks. af en eller anden grund ikke kan pilles, kan du vende tilbage til "R3I"-røret, der indeholder 400 μL phage-input til runde tre. Dette kan kun gentages én gang, hvis belægning fire brønde med 100 μL.

Titer af output phage for runder fire til fem er typisk i intervallet 106 til 108 PFU/ mL. Hvis titering ikke er af interesse, bør det ikke nødvendigvis være tilstrækkeligt at have nok kolonier til at fylde en 96 tube minikulturboks for at give en nøjagtig repræsentation af phage mangfoldigheden, og titer betyder ikke nødvendigvis noget. Men hvis titeren af output phage er lav og flere kolonier ønskes, kan phage reamplified ved at gentage trin 5.3. Væsentlige, phage kan reamplified ved at tage output for den ønskede udvælgelse runde, podning midten af log fase celler, tilføje hjælper phage og carbenicillin, voksende kultur natten over, og høst phage via PEG nedbør som tidligere beskrevet.

Andre display metoder findes, og hver besidder deres egne fordele og ulemper i forhold til phage display. In vivo-visningsmetoder, såsom celleoverfladedisplay, kan øge sandsynligheden for korrekt proteinfoldning og også tillade, at der opstår postoversættelsesmæssige ændringer. Disse metoder er imidlertid begrænset ved at skulle bruge betydeligt mindre biblioteksstørrelser13 og udtrykke proteiner polyvalent. Polyvalent udtryk introducerer inviditetseffekter, der forstyrrer og maskerer peptidens iboende affinitet, hvilket er af større interesse, når der genereres nye bindemidler. Phage display omgår dette spørgsmål, fordi det er blevet tilpasset til monovalent display, hvilket letter udvælgelsen af bindemidler med virkelig forbedrede tilhørsforhold14,15,16. Andre in vitro-displaymetoder hæmmes heller ikke af begrænsningerne i in vivo-visningsmetoder, men præsenterer deres egne unikke udfordringer. For eksempel kan ribosom display anvendes til at sondere større biblioteker (1013-14)17, men produktionen af valgene er i form af mRNA molekyler, som i sagens natur er mindre stabile end phage-indkapslet DNA-output af phage display18. Andre in vitro-displaymetoder, såsom mRNA/cDNA-display, cisaktivitetsbaseret display (CIS) og kovalent antistofdisplay (CAD), har vist problemer med effektivitet, stabilitet og inkonsekvens19,20,21,22,23.

Phage display selv er begrænset af biblioteket størrelser er begrænset af effektiviteten af bakterielle transformation og ved ikke at tillade biblioteker med sekvenser, der forstyrrer phage / bakterievækst16, men generelt, disse begrænsninger er ubetydelige, og phage display har været en succes med at producere meget specifikke og potente bindemidler af mål proteiner2,5,10,24, 25. Dette kan ikke kun bruges i medicinsk forskning til at udvikle nye terapeutiske, men også til at belyse protein og enzym egenskaber og lære mere om protein interaktioner involveret i vigtige biologiske veje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Den allestedsnærværende variant teknologi blev udtænkt i laboratoriet af Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto). WZ er i øjeblikket en CIFAR Azrieli Global Scholar i mennesker &biom Program. Denne forskning blev finansieret af NSERC Discovery Grants tildelt WZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

Biokemi udgave 174
Brug phage display til at udvikle Ubiquitin Variant Modulatorer til E3 Ligases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter