Summary
我们提出了一种方法,该方法利用可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞计数。对不同细胞群的分析利用了自适应算法中不同细胞类型之间显着的细胞高度和结构差异。
Abstract
细胞定量对于广泛的生物学和生化研究是必要的。传统的细胞图像分析通常采用荧光检测方法,例如免疫荧光染色或使用荧光蛋白或边缘检测技术转染,由于图像背景中的噪声和其他非理想性,这些方法通常容易出错。
我们设计了一种新算法,可以准确地计数和区分巨噬细胞和成纤维细胞,这些巨噬细胞和成纤维细胞是不同表型的细胞,通常在组织再生过程中共定位。MATLAB用于实现该算法,该算法根据背景的高度差异来区分不同的细胞类型。使用基于面积的方法开发了一种主要算法,以考虑细胞大小/结构和高密度接种条件的变化。
利用内部参数(例如使用给定细胞类型的实验数据计算的细胞覆盖率)的二次迭代算法来解释细胞结构中的非理想性。最后,采用分离算法对共生环境进行分析,该算法根据对图像内相对高度差异的评估,选择性地排除了各种细胞类型。发现这种方法可以准确计数单培养细胞的5%误差范围内的细胞,以及共培养细胞的10%误差范围内的细胞。
Introduction
在图像分析技术过程中定期实施软件,以确保结果是准确,高效和无偏的。对于基于细胞的检测,一个常见的问题是细胞的错误识别。具有不正确的焦距和对比度设置的图像可能导致细胞模糊,其中单个细胞的边界变得难以识别1。存在无关的图像特征(如毛孔、气泡或其他不需要的物体)会减慢计数过程并导致错误识别,从而妨碍计数过程。此外,细胞计数可能很繁重,并且计数数百个重复可能非常耗时。此外,在手动计数过程中存在固有的主观偏见,因此有关细胞鉴定的决策通常不准确2。自动化软件提供了令人兴奋的潜力,通过快速准确地将细胞与无关的物体区分开来,包括远远超出人类精确检测能力的物体,基于明确定义的识别标准,减少研究者偏见的影响,从而绕过所有这些问题。使用自动化软件识别细胞的常用技术涉及两种主要方法:分割和阈值3。在本文中,我们展示了一种可推广的基于区域的方案,该协议可在广泛访问的软件框架内实现快速,准确和廉价的细胞计数。
分割技术,如边缘检测,试图通过利用图像中的强度差异来分离单个细胞。将细胞与图像其余部分区分开来的强度变化通常由亮度的急剧变化组成4.边缘检测涉及正则滤波步骤,然后是检测强度变化的微分步骤。分化过程识别高强度变化图像中的边缘和轮廓,这些边缘和轮廓与细胞存在相关。虽然有噪声的图像可以通过去噪算法4运行,但边缘检测技术非常适合用于分析低背景噪声的图像。当细胞边界清晰易辨,并且不受与细胞存在、细胞模糊、无关物体或定义的内部细胞结构1,2无关的亮度轮廓的阻碍时,该过程将发挥最佳功能。如果图像特别嘈杂,则可以通过荧光染色或用荧光蛋白转染2,5进一步区分细胞。虽然这显着提高了分割技术的准确性,但它需要额外的成本和额外的时间投资来制备用于成像的细胞培养物。
阈值技术涉及将图像分为两类:前景和背景,单元格分配给前景3。这些技术利用颜色/对比度变化来定义物体的表观高度;通常比背景“高”的对象可以很容易地识别为单元格。分水岭变换通过关联以浅色像素作为前景的表面和以深色像素作为背景的表面6,7 来以这种方式发挥作用。通过基于高度的识别,阈值技术可以常规地将噪声与所需物体区分开来,前提是它们存在于同一焦平面内。当与基于面积的量化配对时,分水岭变换可以在典型分割技术(如边缘检测)不准确的环境中准确识别对象组。
流域变换通常与分割技术相结合,以准备图像以进行更清晰的分析,从而提高细胞计数的准确性。对于此过程,分水岭变换用于在分割之前突出显示潜在的感兴趣区域。分水岭变换通过识别图像前景中的细胞提供了独特的优势,这可以通过消除细胞的潜在误报(例如背景的不均匀斑块)来提高分割分析的准确性。然而,当试图使基于细胞的图像适应分水岭变换时,可能会出现困难。具有高细胞密度的图像可能会受到下分段的困扰,其中细胞的聚集体被识别为单一组而不是单个组分。噪声或剧烈强度变化的存在也可能导致过度分段,其中算法过度隔离细胞,导致细胞计数过多和不准确8。
在本文中,我们详细介绍了一种方法,通过将阈值分析的组件合并到基于面积的量化算法中来最小化分水岭变换的主要缺点,如图 1所示。值得注意的是,该算法是使用开源和/或广泛使用的软件实现的,并且无需昂贵的试剂或复杂的细胞制备技术即可应用该细胞计数框架。RAW264.7巨噬细胞用于证明该方法,因为它们在调节结缔组织维持和伤口愈合过程中起着关键作用9。此外,由于NIH / 3T3成纤维细胞在组织维护和修复中的关键作用,对其进行了分析。成纤维细胞通常与巨噬细胞共存并支持巨噬细胞,因此需要在共培养研究中区分这些表型不同的细胞类型。
通过计算细胞覆盖的面积和单一细胞占用的平均面积,可以可靠有效地量化具有高活细胞密度(VCD)的图像中的细胞计数。使用阈值而不是分割进行细胞鉴定也使更复杂的分析成为可能,例如同时分析共培养中不同细胞类型的实验。NIH / 3T3成纤维细胞,通常被发现与伤口愈合部位内的RAW264.7巨噬细胞共定位,被发现在与巨噬细胞10的焦平面不同的焦平面上生长。因此,根据所分析的细胞类型,运行多种阈值算法来定义背景和前景,从而能够准确计数同一图像中的两种不同细胞类型。
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Protocol
1. 细胞培养和图像采集
- 在37°C和5%CO2 下在Dulbecco的改良鹰培养基(DMEM)中培养RAW264.7巨噬细胞,并补充10%胎牛血清(FBS),1%青霉素 - 链霉素,1.5g / L碳酸氢钠和5μM β巯基乙醇。
- 对于单培养成像,在装有1 mL培养基的5 mL细胞培养瓶中以25 ,000个细胞/ cm 2的密度培养RAW264.7细胞。
- 在37°C下培养NIH / 3T3细胞,在DMEM中培养5%CO2 ,补充10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素11。
- 对于共培养成像,以不同的比例将RAW264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞一起培养,总密度为25,000个细胞/ cm2。使用 1 份 RAW264.7 培养基(DMEM 补充 10% FBS、1% 青霉素-链霉素、1.5 g/L 碳酸氢钠和 5 μM β-巯基乙醇)和 1 份 NIH/3T3 培养基(DMEM 补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素)的共培养基。
- 接种后,将细胞在37°C和5%CO2 下孵育,以达到80%细胞汇合的活细胞密度。
- 使用配备40x物镜的倒置显微镜对细胞进行成像。获取灰度格式的所有图像,并将其导出到原始“.czi”文件中。
- 确定算法准确评估具有一系列图像质量的图像的能力。获取具有不同病灶的图像,生成“非球状”图像(图2)和“球状”图像(图3)。
- 在 MATLAB 分析之前,使用 ImageJ 在原始“.czi”文件上使用“批量转换”功能,将单元格图像导出并转换为 8 位 tiff (.tiff) 图像格式。将转换后的图像存储在本地文件夹中,并手动将这些图像文件传输到相关的 MATLAB 箱。
2. 图像分析-主要利用“单一栽培.m”文件的单一栽培
注意:以下步骤是使用 MATLAB 执行的。MATLAB协议使用了三个文件:“process.m”(补充编码文件1),包含算法的文件“monoculture.m”(补充编码文件2),用于分析单培养图像的文件,以及“coculture_modified.m”(补充编码文件3),用于分析共培养图像的文件。
- 使用基于面积的方法获取显示相对高度变化的像元的图像。通过对每个子图像使用'imshow()'函数,为每个子步骤输出图像。将要分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中,然后在以下命令中输入文件名。按 run 启动程序。
imread('filename.tiff')- 使用源函数8 通过“通过重建打开”,然后通过“重建关闭”来分析图像,以从背景放大前景。使用第一个命令通过重建打开,使用第二个和第三个序列通过重建关闭
'imopen()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- 使用源函数8 通过“通过重建打开”,然后通过“重建关闭”来分析图像,以从背景放大前景。使用第一个命令通过重建打开,使用第二个和第三个序列通过重建关闭
- 利用基于百分位数的识别系统,将重建的图像二值化为纯黑白像素。请注意,在此系统中,单元格将转换为纯白色像素值“255”,而背景和无关(非蜂窝)对象将转换为纯黑色像素值“0”。
- 通过使用与“最大相关像素”(包含给定图像的至少0.5%的最大像素值)的百分位数差来区分单元格与背景。
- 分析和评估RAW264.7巨噬细胞的像素值。如果这些值在最大相关像素的 4.5% 以内,则将像素标记为蜂窝移动网络。
注意:可以使用简单的 if 语句发出此命令。 - 对于包含球状细胞轮廓的图像,例如 图2所示的图像,请实施迭代过程以纠正细胞中心的错误二值化(称为“岛”;见下文),如下所示。
- 确定总小区覆盖范围的初始猜测;60%用于这项研究。请注意,图像中存在的细胞数量应取决于细胞覆盖率 - 因此可以通过实验确定细胞数量和细胞覆盖率之间的关系。使用此关系,确定变量“Alpha”和“kappa”。
注意:“Alpha”表示包含以下相对高度百分位数的 3 x 1 矢量:识别像元的高度百分位数、识别背景的高度百分位数以及强度值明显低于像元值的岛屿区域的高度百分位数。“Kappa”表示图像中单元格覆盖的总面积。 - 运行该算法,该算法将(i)使用α和kappa的初始估计值来分析图像以填充一部分岛屿,以及(ii)使用分析后的细胞计数和覆盖率来重新计算kappa。如果 kappa 值在初始猜测的 10% 以内,请继续执行下一步。
注意:对于包含RAW264.7和NIH / 3T3细胞的图像,发现α是[4.3,5.5,10]。换句话说,与最大相关像素相差4.3%决定了识别细胞的高度百分位数,与最大相关像素相差5.5%决定了识别背景的高度百分位数。与最大相关像素相差 10% 决定了岛屿通常居住的高度百分位数。
- 在图像的二值化之后,使用开源圆查找算法自动确定平均细胞面积,该算法对二值化图像12,13,14执行霍夫变换。使用以下命令获取图像内所有中心位置和圆半径的矢量。
'[中心,半径] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])”
此命令中的“A”是选择的图像,[minradius,maxradius]是算法将尝试检测的半径范围。
注意:该确定平均细胞面积的程序假设巨噬细胞的形态在细胞10之间是圆形和一致的。从实验数据中观察到巨噬细胞的半径在40倍放大倍率下最常见于30至50像素之间。此像素范围定义为圆查找算法的可接受范围。对于其他细胞类型,半径可能显着不同,需要使用实验分析来确定。- 使用半径输出通过取平均值来计算平均像元面积。分析至少10个细胞以确保准确的区域识别。
- 使用平均像元区域确定图像中像元的总数。
- 遍历图像矩阵并计算单元格像素的总数。通过将细胞像素数除以图像中的总像素数来确定总细胞覆盖率。通过将单元格像素数除以单元格的平均面积来确定图像中的单元格总数。
3. 图像分析-主要利用“coculture_modified.m”文件的共文化
注意:以下步骤是使用 MATLAB 执行的。
- 使用基于面积的方法获取显示相对高度变化的像元的图像。通过对每个子图像使用'imshow()'函数,为每个子步骤输出图像。将要分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中,然后在以下命令中输入文件名。按 run 启动程序。
'imread('filename.tiff')'- 使用源函数10 从背景放大前景,然后通过“重建打开”来分析图像。使用第一个命令通过重建打开,使用第二个和第三个序列通过重建关闭。
'不开放 ()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- 使用源函数10 从背景放大前景,然后通过“重建打开”来分析图像。使用第一个命令通过重建打开,使用第二个和第三个序列通过重建关闭。
- 通过使用两种选择性二值分析,利用两种细胞类型之间的高度差异,对含有RAW264.7和NIH / 3T3细胞的共培养物进行分析。
- 使用RAW264.7和NIH / 3T3细胞的图像实验确定参数“phi”,其中phi表示两种细胞类型之间的成比例高度差。猜测初始 phi 值并进行迭代,直到细胞计数和覆盖率与手动计数紧密匹配,特定于 RAW264.7 和 NIH/3T3 共培养。
注意:这些研究中使用的phi值为3.2。Phi用于选择性地过滤图像,使其看起来仅包含RAW264.7单元格,如图 4C所示。 - 确定 RAW264.7 细胞计数和总细胞覆盖率,方法与单培养图像类似。
- 使用RAW264.7和NIH / 3T3细胞的图像实验确定参数“phi”,其中phi表示两种细胞类型之间的成比例高度差。猜测初始 phi 值并进行迭代,直到细胞计数和覆盖率与手动计数紧密匹配,特定于 RAW264.7 和 NIH/3T3 共培养。
- 在没有phi参数的情况下再次分析流域变换的图像,同时检测巨噬细胞和成纤维细胞。通过使用步骤2中描述的标准阈值和基于面积的定量方法,通过选择性地减去RAW264.7细胞像素来获取NIH / 3T3成纤维细胞数据。
- 分析整个图像后,通过从 RAW264.7 像素数中减去单元格像素的总数来确定 NIH/3T3 像素的总数。通过将每个细胞系的细胞像素数除以图像像素总数来计算NIH / 3T3和RAW264.7细胞的覆盖范围。
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Representative Results
非球茎RAW264.7巨噬细胞的分析在25,000个细胞/ cm 2的单培养环境中进行。在ImageJ中转换为8位tiff后,从细胞培养物中拍摄代表性图像并在MATLAB中处理。在整个过程中的算法输出被记录下来并记录在 图2 中,用于代表性图像。在该图像中,该算法对226个细胞进行了计数,并通过与识别241个细胞(6.2%误差)的手动计数进行比较来验证该图像计数。对于至少10张RAW264.7细胞计数图像的算法输出,平均误差为4.5±1.9%。
使用迭代算法对球状RAW264.7巨噬细胞进行分析。在大多数图像中,观察到的球状效应主要是由于聚焦在焦平面上的结果,该焦平面略高于细胞贴壁的基质的焦平面。因此,大多数图像都是以非球状形式获得的,因此分析要容易得多。分析球状图像所需的算法是为由于半月板效应或其他光学干扰而无法避免次优的情况而开发的。图 3记录了整个过程的典型算法输出。在这个具有代表性的图像分析中,该算法对图像中的221个细胞进行了计数,并通过手动计数252个细胞(12.3%误差)进行了验证。
对含有RAW264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞的共培养物进行分析,以确定在单个图像中区分两种不同细胞类型的能力。由于NIH / 3T3成纤维细胞的细胞形态高度可变,无法准确获得手动/自动细胞计数,而是将成纤维细胞的细胞覆盖率与原始图像进行定性比较。整个过程中的代表性算法输出被记录下来并记录在 图4中。对于此图像,RAW264.7 巨噬细胞计数为 137,并且该计数以 155 的手动计数进行验证(误差为 11.6%)。至少10个RAW264.7巨噬细胞计数的算法输出平均为7.8±3.9%的误差。
使用盲法研究验证了细胞计数算法的稳健性,以比较自动细胞识别与手动用户计数。随机选择五张不同细胞密度的图像,这些图像由三个不同的用户盲目计数。将手动计数彼此进行比较,并与自动细胞计数算法的结果进行比较。手动和自动计数结果的比较示于 表1中。此外,利用常规分割技术推导出的“真实地面”图像,测试了该方法的分割精度。DICE 系数20,21 被用作性能指标,五张图像的平均参数为 0.85。 图 5 中显示了一个覆盖示例。
图 1:基于面积的广义算法。 通过分水岭变换准备影像以进行分割分析以确定区域最大值和最小值10 的过程。该方法通过跳过流域脊线确定和后续步骤来修改过程(黑色的原始过程),采用基于百分位数的系统,并结合基于面积的量化过程(以红色突出显示)。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:RAW 264.7 非球状算法输出。 该图显示了导致非球状RAW264.7巨噬细胞计数定量的中间图像处理步骤。(A)在ImageJ中将图像初始处理为灰度。原始图像在 ImageJ 中转换为 8 位 tiff 和灰度。(B)灰度图像的后处理。 A 的后处理图像在通过重建打开和关闭之后,如步骤2.1.1中所述。(C)处理图像的二进制后化。面板 B 在二值化后,按步骤 2.2 中所述执行。(D)带有代表性单元格的最终图像,用于平均面积计算。带有蓝色圆圈的图像,指示在Hough变换内用于识别细胞平均面积的细胞,如步骤2.3中所述。比例尺 = 20 μm 。请点击此处查看此图的大图。
图 3:RAW264.7 球形算法输出。 该图显示了导致球状RAW264.7巨噬细胞计数定量的中间图像处理步骤。(A)球状RAW264.7巨噬细胞的图像。原始图像在 ImageJ 中转换为 8 位 tiff 和灰度。(B)灰度图像的后处理。 A 的后处理图像在通过重建打开和关闭之后,如步骤2.1.1中所述。(C) 处理后图像的二值化后,具有清晰的岛屿。分析球状图像时没有迭代算法的典型输出,在细胞的中心具有黑色像素的“孤岛”。蓝色圆圈表示 Hough 变换中用于标识像元平均面积的像元,如步骤 2.3 中所述。(四)具有代表性细胞的最终图像,使用术后算法填充岛屿。图像后迭代算法,如步骤2.2.2中所述。比例尺 = 20 μm 。请点击此处查看此图的大图。
图 4:RAW264.7 和 NIH/3T3 共培养算法输出。 该图显示了导致定量含有RAW264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞的共培养图像的中间图像处理步骤。(A)NIH / 3T3和RAW264.7细胞的图像。原始图像在 ImageJ 中转换为 8 位 tiff 和灰度。(B)灰度图像的后处理。 A 的后处理图像通过重建打开和关闭,如步骤3.1.1中所述。(C)基于高度隔离的经过处理的图像的二元化后,具有清晰的巨噬细胞选择。RAW264.7巨噬细胞的选择性分离,如步骤3.2.2所述。(D)鉴定巨噬细胞和成纤维细胞簇的最终图像。包含RAW264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞的整个图像,如步骤3.3中所述。用绿色圆圈勾勒出样品巨噬细胞的轮廓,用红色椭圆形勾勒出成纤维细胞样品。比例尺 = 20 μm 。请点击此处查看此图的大图。
图5:DICE参数分割性能,RAW264.7巨噬细胞。 该图显示了“基本事实”分割方法和此方法之间的叠加。白色区域是由“基本事实”和此方法检测到的单元格,而紫色和绿色区域分别是假阴性和假阳性。“真实”分割是通过常见的分割技术获得的,并使用感兴趣区域工具来纠正错误分割。 请点击此处查看此图的大图。
柜台 1 | 柜台 2 | 柜台 3 | 自动 | 手动计数平均值 (±STDEV) | 误差与自动比较 | |
图像 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
图像 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 1.66 ± 2.0 | 4.05% |
图像 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5.3 | 5.02% |
图像 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2.6 | 7.22% |
图像 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
表1:手动/自动细胞计数和鲁棒性测试。
补充信息:巨噬细胞和成纤维细胞共生图像分析的形态学差异。请点击此处下载此文件。
补充编码文件1:“process.m”,运行算法所需的MATLAB文件。 无需手动操作,但将算法包含在单独的文件中。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件2:“单一栽培.m”,用于分析单一栽培图像的MATLAB文件。请点击此处下载此文件。
补充编码文件3:“coculture_modified.m”,用于分析共文化图像的MATLAB文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
我们设计了一种基于区域的通用程序,可以根据细胞高度准确有效地计数细胞,即使在共培养系统中也能对细胞进行无染色定量。该程序的关键步骤包括实施相对强度系统,通过该系统可以区分细胞。使用相对高度分析有两个目的:不需要外部参数,因为给定的像元类型和参数的相对参数是恒定的,并且不需要为每个图像输入绝对亮度/对比度级别。此外,使用基于百分位数的系统可以分析同一图像中的多种细胞类型,前提是不同的细胞类型位于图像中的独特高度。
基于百分位数的系统被定义为与最大像素值与平均值的差异。这样做是为了防止基于平均强度值的算法偏斜,该值取决于图像中存在的细胞的数量和汇合度。此外,还实施了“最大相关像素”,以防止最大强度异常值显着影响数据 - 最大相关像素需要代表至少0.5%的人口 - 一个实验值。其他步骤包括使用基于面积的量化系统,而不是计算单个实体。这确保了在计数细胞时将细胞碎片化或错误的二值化降至最低,因为与细胞面积相比,总受影响面积最小。
在此算法中实现了各种故障排除方法。量化细胞单一培养图像的最初努力需要准确识别球状细胞和非球状细胞的方法。在球状细胞图像中观察到一种独特的现象,即在分水岭变换之后,细胞的中心被识别为背景,并且这些区域在细胞内显示为岛屿。彻底的分析表明,由于缺乏细胞中心,由于图像中结构过于凸起,导致分水岭变换的反转。专门为球状图像实施了一种解决方案,该过程涉及称为插入的迭代过程,其中岛屿被填充为真实单元格值。这是通过一个程序起作用的,其中使用小区覆盖范围和岛屿形成的范围来确定图像的准确性。通常,小区覆盖率用于确定岛屿形成的程度,因为异常低的小区覆盖率通常是由高水平的岛屿形成引起的。通过实验数据确定了小区覆盖与岛屿形成程度之间的关系。
根据使用“平均像素”阈值(定义为图像中的平均平均像素强度)来区分细胞而不是最大像素的观察结果,需要进行额外的故障排除,从而导致不一致。发现图像的平均强度随着图像中细胞数量的函数而增加,这可能会根据图像中细胞的密度扭曲结果。设计了该算法的替代迭代,采用最大强度基准;然而,这个值也是不一致的,因为高强度异常值会显著扭曲数据并导致不可靠的结果。最终,采用了最大相关像素的使用。发现最大相关像素可以准确解释高强度异常值,从而在区分单一栽培和共聚图像时产生最一致的结果。
当使用基于百分位数的系统分析共培养图像以选择性地识别不同类型的细胞时,确定了该算法的几个局限性。有时,NIH / 3T3细胞会与RAW 264.7细胞一起连续出现在多层聚集体中,这使得图像极难分析。虽然这主要是在共培养图像中观察到的,但具有异常培养条件或高汇合水平的细胞的单培养图像也可能导致多层细胞聚集。虽然该算法可以成功地检测出从背景中唯一的多层聚集体,但使用这种细胞多层图像分析无法获得准确的细胞定量。此外,图像中的细胞碎片可能会妨碍算法的准确性。使用基于区域的分析算法有助于最大限度地减少与错误检测相关的误差,因为使用基于区域的分析而不是分割,小面积的细胞碎片对细胞计数的影响较小。
此外,将czi图像转换为8位TIFF,以确保简单性和均匀性,导致像素类型为 uint8,从0到255的整数集合。因此,差异只能在1/256或0.39%的最大精度下量化。通常,像素散布仅覆盖 210 到 250 像素之间,从而产生 2.5% 的真实精度。虽然这被发现适用于细胞与背景截然不同的单一培养分析,但共培养分析中的选择性减法步骤需要更精确。虽然仍然可以从共培养图像中获得相当准确的数据,但与单一栽培图像分析的准确性相比,共培养分析的总体准确性降低了。此外,使用基于区域的识别系统需要平均细胞面积才能获得细胞计数。当处理噪声图像或具有均匀几何形状的像元时,此参数很有用,但会妨碍面积可变像元的定量。
与现有方法相比,该算法的重要性在于使用开发的方法,例如分水岭变换和形态学图像操作,以分析单培养和共培养的细胞,而无需荧光染色程序。尽管先前的几项研究已经报道了在没有染色的情况下成功区分和计数细胞的方法,但这些替代方法通常需要复杂的培养方法或难以接近的软件16。例如,Yilmaz及其同事使用自动计数分析技术通过微垫15上带有免疫磁珠的生物芯片来量化免疫细胞。
我们还设计了新的和有影响力的方法来解决出现在细胞中心的非随机噪声模式,例如“岛屿”。通过利用细胞的不同“高度”值也可以识别不同的细胞系,这些值可以从强度像素中识别出来。使用相对参数而不是绝对参数提供了几个优点,因为它实现了算法的自动化,并为图像的采集提供了更大的灵活性,因为不需要保留精确的亮度,对比度或颜色设置。即使细胞聚集,基于区域的鉴定也能提供准确的结果,这在许多细胞类型中很常见。相比之下,手动计数和分割是困难的,容易出错,并且可能需要训练有素的用户准确有效地识别细胞。
该算法的未来应用和开发将侧重于细胞计数程序的微调和进一步优化。此外,使用实验参数通过相对强度区分不同的细胞类型可以通过测试进一步的共培养来验证;例如,用于神经毒性分析的神经元/星形胶质细胞的鉴定17。可以在伤口愈合领域进行进一步的应用,其中具有代表性比例的免疫细胞可以在炎症和抗炎过程中发挥突出作用。巨噬细胞和成纤维细胞细胞定量的改进可以为评估异物反应结果相关的旁分泌与并支曲林细胞信号传导效应提供更多的见解18,19。在 补充信息中,我们探索了将形态测量参数纳入算法的可能机制,以帮助在共培养系统中进行细胞鉴定的准确性。
还可以对更复杂的共培养进行扩展,这将专注于图像中的3种或更多种不同的细胞类型,而不仅仅是二进制混合物。由于8位图像的精度有限,可能需要16位图像,这提供了额外的信息,但由于更多的动态强度范围和分布,分析可能会显着复杂化。这项研究的目标是开发一种针对各种细胞培养环境进行优化的自动细胞计数的强大方案。该算法即使在球状细胞图像采集中也能实现准确的细胞计数。其自我校正迭代代码对于免疫相关细胞培养系统的无染色明场显微镜成像非常有用。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作部分由美国国立卫生研究院(R01 AR067247)资助,部分由特拉华州INBRE计划资助,由美国国立卫生研究院和特拉华州的国家普通医学科学研究所-NIGMS(P20 GM103446)资助。稿件的内容不一定反映资助机构的观点。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
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