Summary
Hücre sayımlarını tanımlamak için genelleştirilebilir alan tabanlı görüntü analizi yaklaşımını kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı hücre popülasyonlarının analizi, uyarlanabilir bir algoritma içinde farklı hücre tipleri arasındaki önemli hücre yüksekliği ve yapı farklılıklarından yararlandı.
Abstract
Hücrelerin nicelleştirilmesi, çok çeşitli biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar için gereklidir. Hücrelerin geleneksel görüntü analizi, tipik olarak, immünofloresan boyama veya floresan proteinlerle transfeksiyon gibi floresan algılama yaklaşımlarını veya görüntü arka planındaki gürültü ve diğer ideal olmayan şeyler nedeniyle genellikle hataya eğilimli olan kenar algılama tekniklerini kullanır.
Makrofajları ve fibroblastları, doku rejenerasyonu sırasında sıklıkla kolokalize olan farklı fenotiplerin hücrelerini doğru bir şekilde sayabilen ve ayırt edebilen yeni bir algoritma tasarladık. MATLAB, arka plandan yükseklik farklılıklarına dayanarak farklı hücre tiplerini farklılaştıran algoritmayı uygulamak için kullanıldı. Hücre boyutu/yapısı ve yüksek yoğunluklu tohumlama koşullarındaki değişimleri hesaba katmak için alan tabanlı bir yöntem kullanılarak birincil bir algoritma geliştirilmiştir.
Hücre yapılarındaki ideal olmayanlar, belirli bir hücre tipi için deneysel veriler kullanılarak hesaplanan hücre kapsamı gibi dahili parametreleri kullanan ikincil, yinelemeli bir algoritma ile açıklandı. Son olarak, görüntü içindeki göreceli yükseklik farklılıklarının değerlendirilmesine dayanarak çeşitli hücre tiplerinin seçici olarak dışlandığı bir izolasyon algoritması kullanılarak kokültür ortamlarının bir analizi gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşımın, monokültürlü hücreler için% 5'lik bir hata marjı içindeki hücreleri ve kokültürlü hücreler için% 10'luk bir hata marjı içindeki hücreleri doğru bir şekilde saydığı bulunmuştur.
Introduction
Yazılım, sonuçların doğru, verimli ve tarafsız olmasını sağlamak için görüntü analizi teknikleri sırasında rutin olarak uygulanır. Hücre bazlı tahliller için yaygın bir sorun, hücrelerin yanlış tanımlanmasıdır. Uygun olmayan odak ve kontrast ayarlarına sahip görüntüler, tek tek hücrelerin sınırlarının tanımlanmasının zorlaştığı hücre bulanıklığına neden olabilir1. Gözenekler, kabarcıklar veya diğer istenmeyen nesneler gibi yabancı görüntü özelliklerinin varlığı, sayma işlemini yavaşlatarak ve yanlış tanımlamaya yol açarak sayma prosedürlerini engelleyebilir. Ayrıca, hücre sayımı zahmetli olabilir ve yüzlerce kopyayı saymak son derece zaman alıcı olabilir. Dahası, manuel sayım sırasında doğal bir öznel önyargı vardır ve bu nedenle hücre tanımlaması ile ilgili karar verme genellikle yanlıştır2. Otomatik yazılım, araştırmacı önyargısının etkisini azaltan iyi tanımlanmış tanımlama kriterlerine dayanarak, hücreleri hassas algılama için insan kapasitesinin çok ötesindeki nesneler de dahil olmak üzere yabancı nesnelerden hızlı ve hassas bir şekilde ayırt ederek tüm bu sorunları atlamak için heyecan verici bir potansiyel sunar. Otomatik yazılım kullanarak hücreleri tanımlamak için yaygın teknikler iki ana yöntemi içerir: segmentasyon ve eşik3. Burada, yaygın olarak erişilebilir bir yazılım çerçevesinde hızlı, doğru ve ucuz hücre sayımını sağlayan genelleştirilebilir alan tabanlı bir protokol sunuyoruz.
Kenar algılama gibi segmentasyon teknikleri, bir görüntüdeki yoğunluk farklılıklarını kullanarak tek tek hücreleri izole etmeyi amaçlar. Bir hücreyi görüntünün geri kalanından ayıran yoğunluk değişiklikleri çoğunlukla parlaklıktaki keskin değişikliklerden oluşur4. Kenar algılama, düzenli bir filtreleme adımını ve ardından yoğunluk değişikliklerinin algılandığı bir farklılaştırma adımını içerir. Farklılaşma süreci, yüksek yoğunluklu değişikliklerin görüntüsündeki kenarları ve konturları tanımlar ve bu kenarlar ve konturlar hücre varlığı ile ilişkilidir. Gürültülü görüntüler gürültü giderme algoritmaları4 aracılığıyla çalıştırılabilse de, kenar algılama teknikleri düşük arka plan gürültüsüne sahip görüntüleri analiz etmek için idealdir. İşlem, hücre sınırları açıkça ve kolayca ayırt edilebildiğinde ve hücre varlığı, hücre bulanıklığı, yabancı nesneler veya tanımlanmış iç hücre yapıları ile ilgisi olmayan parlaklık konturları tarafından engellenmediğinde en iyi şekilde çalışır 1,2. Bir görüntü özellikle gürültülüyse, hücreler floresan boyama veya floresan proteinleri ile transfeksiyon yoluyla daha da ayırt edilebilir 2,5. Bu, segmentasyon tekniklerinin doğruluğunu önemli ölçüde artırsa da, hücre kültürlerini görüntülemeye hazırlamak için ek maliyetler ve ek zaman yatırımları gerektirir.
Eşik teknikleri, bir görüntünün iki kategoriye ayrılmasını içerir: ön plan ve arka plan, ön plana atanmış hücreler3. Bu teknikler, bir nesnenin görünür yüksekliğini tanımlamak için renk / kontrast değişikliklerini kullanır; arka plandan rutin olarak 'daha uzun' olan nesneler kolayca hücre olarak tanımlanabilir. Havza-dönüşüm, yüzeyleri ön plan olarak açık piksellerle ve arka plan 6,7 olarak koyu pikselli yüzeyleri ilişkilendirerek bu şekilde çalışır. Yüksekliğe dayalı tanımlama yoluyla, eşik teknikleri, aynı odak düzleminde bulunmaları koşuluyla, gürültüyü istenen nesnelerden rutin olarak ayırt edebilir. Alan tabanlı bir niceleme ile eşleştirildiğinde, bir havza dönüşümü, kenar algılama gibi tipik segmentasyon tekniklerinin yanlış olacağı ortamlardaki nesne gruplarını doğru bir şekilde tanımlayabilir.
Havza dönüşümleri, görüntüleri daha temiz bir analiz için hazırlamak için genellikle segmentasyon teknikleriyle birleştirilir ve hücre sayımının daha yüksek doğruluğu ile sonuçlanır. Bu süreç için, havza dönüşümü, segmentasyondan önce potansiyel ilgi alanlarını vurgulamak için kullanılır. Bir havza dönüşümü, görüntülerin ön planındaki hücreleri tanımlayarak benzersiz faydalar sağlar; bu, düzensiz arka plan yamaları gibi hücreler için potansiyel yanlış pozitifleri kaldırarak segmentasyon analizinin doğruluğunu artırabilir. Bununla birlikte, hücre tabanlı görüntüleri bir havza dönüşümüne uyarlamaya çalışırken zorluklar ortaya çıkabilir. Yüksek hücre yoğunluğuna sahip görüntüler, hücre agregalarının tek tek bileşenler yerine tekil bir grup olarak tanımlandığı alt segmentasyonla boğuşabilir. Gürültü veya keskin yoğunluk değişikliklerinin varlığı, algoritmanın hücreleri aşırı izole ettiği ve aşırı ve yanlış hücre sayımlarına neden olan aşırı segmentasyona da neden olabilir8.
Burada, Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir eşik analizinin bileşenlerini alan tabanlı bir niceleme algoritmasına dahil ederek havza dönüşümünün birincil dezavantajlarını en aza indirgemek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Özellikle, bu algoritma açık kaynaklı ve / veya yaygın olarak bulunan yazılımlarla uygulandı ve bu hücre sayma çerçevesinin uygulanması, pahalı reaktifler veya karmaşık hücre hazırlama teknikleri olmadan mümkün oldu. RAW264.7 makrofajları, bağ dokusu bakımı ve yara iyileşme süreçlerinin düzenlenmesindeki kritik rolleri nedeniyle yöntemi göstermek için kullanıldı9. Ek olarak, NIH / 3T3 fibroblastları doku bakımı ve onarımındaki kilit rolleri nedeniyle analiz edildi. Fibroblast hücreleri sıklıkla makrofajlarla birlikte bulunur ve onları destekler, bu da kokültür çalışmalarında bu fenotipik olarak farklı hücre tiplerini ayırt etme ihtiyacını doğurur.
Yüksek canlı hücre yoğunluğuna (VCD) sahip görüntülerden elde edilen hücre sayımları, hücrelerin kapladığı alanı ve tekil bir hücrenin kapladığı ortalama alanı hesaplayarak güvenilir ve verimli bir şekilde ölçülebilir. Hücre tanımlaması için segmentasyonun aksine eşik değerlemenin kullanılması, kokültürlerdeki farklı hücre tiplerinin eşzamanlı olarak analiz edildiği deneyler gibi daha karmaşık analizlere de olanak sağlamıştır. Genellikle bir yara iyileşme bölgesi içinde RAW264.7 makrofajları ile kolokalize olduğu tespit edilen NIH / 3T3 fibroblastlarının,makrofajların fokal düzleminden farklı bir odak düzleminde büyüdüğü bulunmuştur. Buna göre, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak arka planı ve ön planı tanımlamak için çoklu eşik algoritmaları çalıştırıldı ve aynı görüntü içindeki iki farklı hücre tipinin doğru sayılmasını sağladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü ve görüntü alımı
- Kültür RAW264.7 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) 37 ° C'de makrofajlar ve% 5 CO2 ,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin-streptomisin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat ve 5 μM β-merkaptoetanol ile desteklenir.
- Monokültür görüntüleme için, 1 mL ortama sahip 5 mL'lik bir hücre kültürü şişesinde 25.000 hücre /cm2 yoğunluğunda kültür RAW264.7 hücreleri.
- DMEM'de 37 °C'de kültür NIH / 3T3 hücreleri ve% 5 CO2 ,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin11 ile desteklenir.
- Kokültür görüntüleme için, kültür RAW264.7 makrofajları ve NIH / 3T3 fibroblastları, toplam 25.000 hücre /cm2 yoğunluğunda, çeşitli oranlarda birlikte bulunur. 1 kısım RAW264.7 medium (DMEM% 10 FBS,% 1 penisilin-streptomisin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat ve 5 μM β-merkaptoetanol) ve 1 kısım NIH / 3T3 ortamı (DMEM% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir) olan kokültür ortamı kullanın.
- Tohumlamayı takiben, hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe ederek,% 80 hücre birleşmesinin canlı bir hücre yoğunluğuna ulaşın.
- 40x hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopa sahip görüntü hücreleri. Tüm görüntüleri gri tonlamalı olarak alın ve ham '.czi' dosyasına dışa aktarın.
- Bir dizi görüntü kalitesine sahip görüntüleri doğru bir şekilde değerlendirmek için algoritmanın kapasitesini belirleyin. Hem 'soğanlı olmayan' görüntüler (Şekil 2) hem de 'soğanlı' görüntüler (Şekil 3) üreterek farklı odaklara sahip görüntüler elde edin.
- MATLAB analizinden önce ham '.czi' dosyalarındaki 'Toplu Dönüştürme' işlevini kullanarak ImageJ kullanarak hücre görüntülerini 8 bit tiff (.tiff) görüntü biçimine dışa aktarın ve dönüştürün. Dönüştürülen görüntüleri yerel bir klasörde depolayın ve bu görüntü dosyalarını ilgili MATLAB kutusuna el ile aktarın.
2. Öncelikle "monokültür" dosyasını kullanan görüntü analizi-monokültür .m
NOT: Aşağıdaki adımlar MATLAB kullanılarak gerçekleştirilmiştir. MATLAB protokolü için üç dosya kullanılmıştır: "süreç.m" (Ek kodlama dosyası 1), algoritmayı içeren dosya, "monokültür.m" (Ek kodlama dosyası 2), monokültür görüntülerini analiz etmek için çalıştırılacak dosya ve "coculture_modified.m" (Ek kodlama dosyası 3), ortak kültür görüntülerini analiz etmek için çalıştırılacak dosya.
- Göreceli yükseklik varyasyonları gösteren hücrelerin görüntülerini elde etmek için alan tabanlı yöntemi kullanın. Her alt görüntü için 'imshow()' işlevini kullanarak her alt adım için görüntü çıktıları. Analiz için görüntü dosyasını kopyalayıp çöp kutusuna yapıştırın ve aşağıdaki komutta dosya adını girin. Programı başlatmak için çalıştır'a basın.
imread('dosya adı.tiff')- Ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevleri8'i kullanarak görüntüleri 'yeniden yapılandırmayla açma' ve ardından 'yeniden yapılandırma ile kapatma' ile analiz edin. Yeniden yapılandırma ile açmak için ilk komutu ve yeniden yapılandırma ile kapatmak için ikinci ve üçüncü sıraları kullanın
'imopen()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- Ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevleri8'i kullanarak görüntüleri 'yeniden yapılandırmayla açma' ve ardından 'yeniden yapılandırma ile kapatma' ile analiz edin. Yeniden yapılandırma ile açmak için ilk komutu ve yeniden yapılandırma ile kapatmak için ikinci ve üçüncü sıraları kullanın
- Yüzdelik dilim tabanlı bir tanımlama sistemi kullanarak yeniden yapılandırılmış görüntüleri saf siyah ve saf beyaz piksellere ikiye bölün. Bu sistemde hücrelerin '255' saf beyaz piksel değerine dönüştürüldüğünü, arka plan ve yabancı (hücresel olmayan) nesnelerin ise '0' saf siyah piksel değerine dönüştürüldüğünü unutmayın.
- Belirli bir görüntünün en az %0,5'ini oluşturan en büyük piksel değeri olan "maksimum alakalı piksel"den yüzdelik bir fark kullanarak hücreleri arka plandan ayırt edin.
- RAW264.7 makrofajlar için piksel değerlerini analiz edin ve değerlendirin. Bu değerler maksimum alakalı pikselin %4,5'i içindeyse pikseli hücresel olarak işaretleyin.
NOT: Bu komut, basit bir if deyimi kullanılarak verilebilir. - Şekil 2'de görülenler gibi soğanlı hücre profilleri içeren görüntüler için, hücrelerin merkezlerindeki hatalı ikilileştirmeyi düzeltmek için yinelemeli bir prosedür uygulayın ("adalar" olarak adlandırılır; aşağıya bakınız).
- Toplam hücre kapsamı için bir başlangıç tahmini belirleyin; Bu çalışmada %60'ından yararlanılmıştır. Görüntüde bulunan hücre sayısının hücre kapsamına bağlı olması gerektiğini unutmayın - hücre sayısı ile hücre kapsamı arasındaki ilişki bu nedenle deneysel olarak belirlenebilir. Bu ilişkiyi kullanarak, 'Alfa' ve 'kappa' değişkenlerini belirleyin.
NOT: 'Alfa', aşağıdaki göreceli yükseklik yüzdelik dilimlerini içeren 3 x 1 vektörü temsil eder: hücrelerin tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimi, arka planın tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimi ve yoğunluk değerlerinin tipik olarak hücre değerlerinden önemli ölçüde daha düşük olduğu adaların-bölgelerin bulunduğu yükseklik yüzdelik dilimi. 'Kappa', görüntüdeki hücrelerin kapladığı toplam alanı temsil eder. - (i) adaların bir bölümünü doldurmak için alfa ve kappa'nın ilk tahminlerini kullanarak görüntüleri analiz edecek ve (ii) kappa'yı yeniden hesaplamak için analiz sonrası hücre sayılarını ve kapsamını kullanacak olan algoritmayı çalıştırın. Kappa değeri ilk tahminin %10'u içindeyse, bir sonraki adıma geçin.
NOT: RAW264.7 ve NIH/3T3 hücrelerini içeren görüntülerde alfanın [4.3, 5.5, 10] olduğu bulunmuştur. Başka bir deyişle, ilgili maksimum pikselden% 4,3'lük bir fark, hücrelerin tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimini, maksimum ilgili pikselden% 5,5'lik bir fark, arka planın tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimini belirledi. İlgili maksimum pikselden %10'luk bir fark, adaların tipik olarak bulunduğu yükseklik yüzdelik dilimini belirledi.
- Görüntünün ikilendirilmesini takiben, ikili görüntü12,13,14 üzerinde bir Hough dönüşümü gerçekleştiren açık kaynaklı daire bulma algoritmasını kullanarak ortalama hücre alanını otomatik olarak belirleyin. Görüntüde bulunan tüm merkez konumlarının ve dairelerin yarıçaplarının vektörünü elde etmek için aşağıdaki komutu kullanın.
'[merkezler, yarıçap] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
Bu komuttaki 'A' seçilecek görüntüdür ve [minradius, maxradius], algoritmanın algılamaya çalışacağı yarıçap aralığıdır.
NOT: Ortalama hücre alanını belirlemeye yönelik bu prosedür, makrofaj hücrelerinin morfolojisinin hücreler arasında hem dairesel hem de tutarlı olduğunu varsayar10. Deneysel verilerden, makrofajların yarıçapının en yaygın olarak 40x büyütmede 30 ila 50 piksel arasında olduğu gözlenmiştir. Bu piksel aralığı, daire bulma algoritması için kabul edilebilir aralık olarak tanımlanır. Yarıçap diğer hücre tipleri için önemli ölçüde farklı olabilir ve deneysel analiz kullanılarak belirlenmesini gerektirir.- Ortalama hücre alanının ortalamasını alarak hesaplamak için yarıçap çıkışlarını kullanın. Doğru alan tanımlamasını sağlamak için en az 10 hücreyi analiz edin.
- Ortalama hücre alanını kullanarak görüntüdeki toplam hücre sayısını belirleyin.
- Görüntü matrisinde döngü yapın ve toplam hücre pikseli sayısını sayın. Hücre piksellerinin sayısını görüntüdeki toplam piksel sayısına bölerek toplam hücre kapsamını belirleyin. Hücre piksellerinin sayısını hücrenin ortalama alanına bölerek görüntüdeki toplam hücre sayısını belirleyin.
3. Öncelikle "coculture_modified.m" dosyasını kullanan görüntü analizi-kokültür
NOT: Aşağıdaki adımlar MATLAB kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
- Göreceli yükseklik varyasyonları gösteren hücrelerin görüntülerini elde etmek için alan tabanlı yöntemi kullanın. Her alt görüntü için 'imshow()' işlevini kullanarak her alt adım için görüntü çıktıları. Analiz için görüntü dosyasını kopyalayıp çöp kutusuna yapıştırın ve aşağıdaki komutta dosya adını girin. Programı başlatmak için çalıştır'a basın.
'imread('dosya adı.tiff')'- Ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevleri10'u kullanarak görüntüleri 'yeniden yapılandırmayla açma' ve ardından 'yeniden yapılandırma ile kapatma' ile analiz edin. Yeniden yapılandırma ile açmak için ilk komutu ve yeniden yapılandırma ile kapatmak için ikinci ve üçüncü sıraları kullanın.
'açık olmayan ()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- Ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevleri10'u kullanarak görüntüleri 'yeniden yapılandırmayla açma' ve ardından 'yeniden yapılandırma ile kapatma' ile analiz edin. Yeniden yapılandırma ile açmak için ilk komutu ve yeniden yapılandırma ile kapatmak için ikinci ve üçüncü sıraları kullanın.
- İki hücre tipi arasındaki yükseklik farklılıklarından yararlanarak elde edilen iki seçici ikilendirme kullanarak RAW264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerini içeren kokültürlerin analizini yapın.
- RAW264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerinin görüntülerini kullanarak deneysel olarak bir 'phi' parametresi belirleyin, phi iki hücre tipi arasındaki orantılı yükseklik farkını temsil eder. İlk phi değerini tahmin edin ve hücre sayıları ve kapsama alanı, RAW264.7 ve NIH / 3T3 kokültürüne özgü manuel sayımlarla yakından eşleşene kadar yineleyin.
NOT: Bu çalışmalarda kullanılan phi değeri 3.2 olarak bulunmuştur. Phi, Şekil 4C'de görüldüğü gibi, bir görüntüyü yalnızca RAW264.7 hücreleri içeriyormuş gibi görünecek şekilde seçici olarak filtrelemek için kullanılır. - RAW264.7 hücre sayılarını ve toplam hücre kapsamını monokültür görüntülerinde olduğu gibi belirleyin.
- RAW264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerinin görüntülerini kullanarak deneysel olarak bir 'phi' parametresi belirleyin, phi iki hücre tipi arasındaki orantılı yükseklik farkını temsil eder. İlk phi değerini tahmin edin ve hücre sayıları ve kapsama alanı, RAW264.7 ve NIH / 3T3 kokültürüne özgü manuel sayımlarla yakından eşleşene kadar yineleyin.
- Havza dönüştürülmüş görüntüyü phi parametresi olmadan tekrar analiz edin, hem makrofajları hem de fibroblastları tespit edin. Adım 2'de açıklanan standart eşik ve alan tabanlı niceleme yöntemleri kullanılarak elde edilen RAW264.7 hücre piksellerini seçici olarak çıkararak NIH/3T3 fibroblast verilerini elde edin.
- Görüntünün tamamı analiz edildikten sonra, toplam hücre pikseli sayısını RAW264,7 piksel sayısından çıkararak toplam NIH/3T3 piksel sayısını belirleyin. NIH/3T3 ve RAW264.7 hücrelerinin kapsamını, her hücre satırı için hücre pikseli sayısını toplam görüntü pikseli sayısına bölerek hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Soğanlı olmayan RAW264.7 makrofajların analizi, 25.000 hücre/ cm2'de monokültür ortamında gerçekleştirildi. Hücre kültürünün temsili görüntüleri alındı ve ImageJ'de 8-bit tiff'e dönüştürüldükten sonra MATLAB'da işlendi. Süreç boyunca algoritma çıktıları kaydedildi ve temsili görüntü için Şekil 2'de belgelendi. Bu görüntüde, algoritma 226 hücre saydı ve bu görüntü sayısı, 241 hücreyi tanımlayan manuel bir sayımla karşılaştırılarak doğrulandı (% 6.2 hata). RAW264.7 hücre sayımlarının en az 10 görüntüsü için algoritma çıktılarında ortalama hata 4,5 ± %1,9 idi.
Soğanlı RAW264.7 makrofajlarının analizi yinelemeli bir algoritma kullanılarak gerçekleştirildi. Çoğu görüntüde, gözlemlenen soğanlı etki, esas olarak, hücrelerin yapıştığı substratın odak düzleminin biraz üzerinde olan bir odak düzlemine odaklanmanın bir sonucuydu. Buna göre, çoğu görüntü, analizin önemli ölçüde daha kolay olduğu soğanlı olmayan formda elde edildi. Soğanlı görüntüleri analiz etmek için gerekli algoritma, menisküs etkileri veya diğer optik parazitler nedeniyle suboptimalin önlenmesinin imkansız olduğu senaryolar için geliştirilmiştir. Süreç boyunca tipik algoritma çıktıları Şekil 3'te kaydedilmiş ve belgelenmiştir. Bu temsili görüntü analizinde, algoritma görüntüdeki 221 hücreyi saydı ve bu da 252 hücrelik manuel bir sayımla (% 12.3 hata) doğrulandı.
Hem RAW264.7 makrofajları hem de NIH / 3T3 fibroblastlarını içeren kokültürlerin analizi, tek bir görüntüde iki farklı hücre tipi arasında ayrım yapma kapasitesini belirlemek için yapıldı. NIH / 3T3 fibroblastlarının oldukça değişken hücre morfolojileri nedeniyle, manuel / otomatik hücre sayıları doğru bir şekilde elde edilememiştir ve bunun yerine fibroblastlar için hücre kapsamları orijinal görüntüyle kalitatif olarak karşılaştırılmıştır. Süreç boyunca temsili algoritma çıktıları Şekil 4'te kaydedilmiş ve belgelenmiştir. Bu görüntü için RAW264.7 makrofaj sayısı 137 idi ve bu sayı manuel sayı 155 (%11.6 hata) ile doğrulandı. En az 10 RAW264.7 makrofaj sayımı için algoritma çıktılarında ortalama 7.8 ± %3.9 hatası vardı.
Hücre sayma algoritmasının sağlamlığı, otomatik hücre tanımlamayı manuel kullanıcı sayımlarıyla karşılaştırmak için kör bir çalışma kullanılarak da doğrulandı. Değişen hücre yoğunluklarına sahip rastgele beş görüntü seçildi ve bu görüntüler üç farklı kullanıcı tarafından körü körüne sayıldı. Manuel sayımlar birbirleriyle ve otomatik hücre sayma algoritmasının sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Manuel ve otomatik sayım sonuçlarının karşılaştırılması Tablo 1'de gösterilmiştir. Ayrıca, bu yöntemin segmentasyon doğruluğu, geleneksel segmentasyon teknikleri kullanılarak türetilen 'zemin gerçeği' görüntüleri kullanılarak test edilmiştir. DICE katsayısı20,21, beş görüntüde ortalama 0,85 parametresi olan bir performans metriği olarak kullanılmıştır. Örnek bir bindirme Şekil 5'te görülebilir.
Şekil 1: Genelleştirilmiş alan tabanlı algoritma. Bölgesel maksimumu ve minima10'u belirlemek için havza yoluyla segmentasyon analizi için bir görüntünün hazırlandığı bir süreç-dönüşümler. Bu önerilen yöntem, havza sırt çizgisi belirlemesini atlayarak süreci (siyah renkli orijinal süreç) ve ardından alan tabanlı bir niceleme işlemi (kırmızı ile vurgulanmış) ile birleştirilmiş yüzdelik dilim tabanlı bir sistemi benimsemek için sonraki adımları atlayarak değiştirir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: RAW 264.7 soğansız algoritma çıkışı. Şekil, soğanlı olmayan RAW264.7 makrofaj sayımlarının nicelleştirilmesine yol açan ara görüntü işleme adımlarını göstermektedir. (A) ImageJ'de Görüntünün gri tonlamaya ilk işlenmesi. Orijinal görüntü, ImageJ'de 8 bit tiff ve gri tonlamaya dönüştürülür. (B) Gri tonlamalı görüntünün sonradan işlenmesi. Adım 2.1.1'de açıklandığı gibi, yeniden yapılandırma ile açılıp kapanan A'nın sonraki işlem sonrası görüntüsü. (C) İşlenmiş görüntünün postbinarizasyonu. Panel B sonrası binarizasyon, adım 2.2'de açıklandığı gibi gerçekleştirilir. (D) Ortalama alan hesaplamaları için temsili hücrelere sahip son görüntü. Hough içinde kullanılan hücreleri gösteren mavi dairelere sahip görüntü, adım 2.3'te açıklandığı gibi, bir hücrenin ortalama alanını tanımlamak için dönüşür. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: RAW264.7 soğanlı algoritma çıkışı. Şekil, soğanlı RAW264.7 makrofaj sayımlarının nicelleştirilmesine yol açan ara görüntü işleme adımlarını göstermektedir. (A) Soğanlı RAW264.7 makrofajlarının görüntüsü. Orijinal görüntü, ImageJ'de 8 bit tiff ve gri tonlamaya dönüştürülür. (B) Gri tonlamalı görüntünün sonradan işlenmesi. Adım 2.1.1'de açıklandığı gibi, yeniden yapılandırma ile açılıp kapanan A'nın sonraki işlem sonrası görüntüsü. (C) İşlenmiş görüntünün net adalarla ikilileştirilmesinden sonra. Soğanlı görüntüleri analiz ederken yinelemeli algoritma olmadan tipik çıktı, hücrelerin merkezlerinde siyah piksellerin 'adaları' ile. Mavi daireler, adım 2.3'te açıklandığı gibi, bir hücrenin ortalama alanını tanımlamak için Hough dönüşümü içinde kullanılan hücreleri temsil eder. (D) Temsili hücreler, postoperatif algoritma kullanılarak doldurulmuş adalar içeren son görüntü. Görüntü post yinelemeli algoritma, adım 2.2.2'de açıklandığı gibi. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RAW264.7 ve NIH/3T3 kokültür algoritması çıktısı. Şekil, RAW264.7 makrofajları ve NIH / 3T3 fibroblastları içeren kokültür görüntülerinin nicelleştirilmesine yol açan ara görüntü işleme adımlarını göstermektedir. (A) NIH/3T3 ve RAW264.7 hücrelerinin görüntüsü. Orijinal görüntü, ImageJ'de 8 bit tiff ve gri tonlamaya dönüştürülür. (B) Gri tonlamalı görüntünün sonradan işlenmesi. Adım 3.1.1'de açıklandığı gibi, yeniden yapılandırma ile açılıp kapanan A'nın son işlem görüntüsü. (C) İşlenmiş görüntünün, yüksekliğe dayalı izolasyona dayalı net makrofajların seçimi ile postbinarizasyonu. Adım 3.2.2'de açıklandığı gibi RAW264.7 makrofajlarının seçici izolasyonu. (D) Makrofajların ve fibroblastların kümelerinin tanımlandığı son görüntü. Adım 3.3'te açıklandığı gibi hem RAW264.7 makrofajlarını hem de NIH / 3T3 fibroblastlarını içeren görüntünün tamamı. Örnek bir makrofaj hücresi yeşil bir daire ile özetlenir ve bir örnek fibroblast hücresi kırmızı bir oval ile özetlenir. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: DICE parametre segmentasyon performansı, RAW264.7 makrofajlar. Resim, 'zemin gerçeği' segmentasyon yaklaşımı ile bu yöntem arasında bir bindirme göstermektedir. Beyaz bölgeler hem 'zemin gerçeği' hem de bu yöntemle tespit edilen hücrelerdir, mor ve yeşil bölgeler ise sırasıyla yanlış negatifler ve yanlış pozitiflerdir. 'Temel gerçek' segmentasyonu, ortak segmentasyon teknikleriyle elde edildi ve hatalı segmentasyonu düzeltmek için ilgi alanı araçlarını kullandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sayaç 1 | Sayaç 2 | Sayaç 3 | Otomatik | Manuel Sayım Ortalaması (±STDEV) | Otomatik ile karşılaştırıldığında hata | |
| Resim 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3,0 | 4.22% |
| Resim 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2,0 | 4.05% |
| Resim 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5,3 | 5.02% |
| Resim 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2,6 | 7.22% |
| Resim 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3,0 | 7.20% |
Tablo 1: Manuel/otomatik hücre sayımları ve sağlamlık testi.
Ek Bilgi: Makrofaj ve fibroblast kokültürlerinin görüntü analizinde morfolojik farklılıklar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek kodlama dosyası 1: "process.m", algoritmaları çalıştırmak için gerekli MATLAB dosyası. El ile işlem gerekmez, ancak algoritmayı ayrı bir dosyada içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek kodlama dosyası 2: "monokültür.m", monokültür görüntülerini analiz etmek için kullanılan MATLAB dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek kodlama dosyası 3: "coculture_modified.m", kokültür görüntülerini analiz etmek için kullanılan MATLAB dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücreleri hücre yüksekliğine göre doğru ve verimli bir şekilde sayan ve kokültür sistemlerinde bile hücrelerin lekesiz kantitasyonuna izin veren genel bir alan tabanlı prosedür tasarladık. Bu prosedür için kritik adımlar, hücrelerin farklılaştırılabileceği göreceli bir yoğunluk sisteminin uygulanmasını içeriyordu. Göreceli yükseklik analizinin kullanılması iki amaca hizmet etti: verilen hücre tipi ve parametresi için göreceli parametreler sabit olduğundan ve her görüntü için mutlak parlaklık / kontrast seviyelerinin girilmesi gerekmediğinden, harici parametrelere duyulan ihtiyaç gereksiz hale getirildi. Ayrıca, yüzdelik dilim tabanlı bir sistemin kullanılması, farklı hücre tiplerinin görüntü içinde benzersiz yüksekliklerde bulunması koşuluyla, aynı görüntü içindeki birden fazla hücre tipinin analizini mümkün kılmıştır.
Yüzdelik dilim tabanlı sistem, ortalamanın aksine maksimum piksel değerinden bir fark olarak tanımlandı. Bu, görüntüde bulunan hücrelerin sayısına ve birleşmesine bağlı olan ortalama yoğunluk değerine dayanan algoritmanın çarpıtılmasını önlemek için yapıldı. Ayrıca, maksimum yoğunluktaki aykırı değerlerin verileri önemli ölçüde etkilemesini önlemek için 'maksimum alakalı piksel' uygulanmıştır - maksimum ilgili piksellerin popülasyonun en az% 0,5'ini temsil etmesi gerekir - deneysel bir değer. Ek adımlar, tek tek varlıkları saymak yerine alan tabanlı bir niceleme sisteminin kullanılmasını içeriyordu. Bu, hücreleri sayarken hücre parçalanmasının veya hatalı ikilileştirmenin en aza indirilmesini sağladı, çünkü toplam etkilenen alan bir hücrenin alanına kıyasla minimum düzeydeydi.
Bu algoritma içerisinde çeşitli sorun giderme yöntemleri uygulanmıştır. Hücre monokültürlerinin görüntülerini ölçmeye yönelik ilk çabalar, hem soğanlı hem de soğanlı olmayan hücreleri doğru bir şekilde tanımlamak için yöntemler gerektiriyordu. Soğanlı hücre görüntüleri için benzersiz bir fenomen gözlendi, çünkü hücrelerin merkezleri havza dönüşümünü takiben arka plan olarak tanımlandı ve bu bölgeler hücre içinde adalar olarak ortaya çıktı. Kapsamlı bir analiz, hücre merkezlerinin eksikliğinin, görüntüdeki aşırı dışbükey bir yapı nedeniyle meydana geldiğini ve bunun da havza dönüşümünde bir tersine çevirme ile sonuçlandığını ortaya koydu. Özellikle soğanlı görüntüler için, adaların gerçek hücre değerleri olarak doldurulduğu fişe takma olarak bilinen yinelemeli bir işlemi içeren bir çözüm uygulandı. Bu, görüntünün doğruluğunu belirlemek için hücre kapsamının ve ada oluşumunun kapsamının kullanıldığı bir prosedürle işlev gördü. Genel olarak, hücre kapsamı ada oluşumunun derecesini belirlemek için kullanıldı, çünkü alışılmadık derecede düşük bir hücre kapsamı en tipik olarak yüksek düzeyde ada oluşumundan kaynaklanıyordu. Hücre kapsamı ile ada oluşumunun kapsamı arasındaki ilişki deneysel verilerle belirlenmiştir.
Hücreleri ayırt etmek için maksimum piksel yerine bir 'ortalama piksel' eşiği (görüntü içindeki ortalama ortalama piksel yoğunluğu olarak tanımlanır) kullanmanın tutarsızlıklara yol açtığı gözlemine dayanarak ek sorun giderme gerekliydi. Görüntünün ortalama yoğunluğunun, görüntüdeki hücre sayısının bir fonksiyonu olarak arttığı ve bunun da görüntüdeki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak sonuçları çarpıtabileceği bulunmuştur. Algoritmanın alternatif bir yinelemesi, maksimum yoğunluk kriteri kullanılarak tasarlanmıştır; ancak, bu değer de tutarsızdı, çünkü yüksek yoğunluklu aykırı değerler verileri önemli ölçüde çarpıttı ve güvenilmez sonuçlara yol açtı. Sonuçta, maksimum alakalı pikselin kullanılması benimsendi. İlgili maksimum pikselin, yüksek yoğunluklu aykırı değerleri doğru bir şekilde hesaba kattığı ve monokültür ve kokültür görüntülerini ayırt ederken en tutarlı sonuçlara yol açtığı bulunmuştur.
Farklı hücre tiplerini seçici olarak tanımlamak için yüzdelik sistem kullanarak kokültür görüntülerini analiz ederken algoritmanın çeşitli sınırlamaları tanımlanmıştır. Bazen, NIH / 3T3 hücreleri çok katmanlı bir agregada RAW 264.7 hücreleriyle sürekli olarak görünür ve bu da görüntünün analiz edilmesini son derece zorlaştırırdı. Bu çoğunlukla kokültür görüntüleri için gözlenmesine rağmen, anormal kültür koşullarına veya yüksek birleşim seviyelerine sahip hücrelerin monokültür görüntüleri de çok katmanlı hücre agregalarına neden olabilir. Algoritma, çok katmanlı agregaları arka plandan benzersiz olarak başarılı bir şekilde tespit edebilse de, hücre çok katmanlarında bu 2D görüntü analizini kullanarak doğru hücre niceliği elde etmek mümkün değildi. Ayrıca, görüntüdeki hücre kalıntıları algoritma doğruluğunu engelleyebilir. Alan tabanlı bir analiz algoritmasının kullanılması, hatalı tespitle ilişkili hatayı en aza indirmeye hizmet etti, çünkü küçük hücre enkazı alanları, segmentasyondan ziyade alan tabanlı bir analiz kullanarak hücre sayımlarını daha az etkileyecekti.
Ek olarak, czi görüntülerinin basitlik ve tekdüzelik sağlamak için gerçekleştirilen 8 bit TIFF'e dönüştürülmesi, 0'dan 255'e kadar tam sayılardan oluşan bir koleksiyon olan uint8'in piksel türleriyle sonuçlandı. Bu nedenle, farklılıklar yalnızca maksimum 1/256 veya% 0,39'luk bir hassasiyetle ölçülebilir. Genel olarak, piksel yayılımı yalnızca 210 ila 250 piksel arasında kaplıdır ve bu da %2,5'lik gerçekçi bir hassasiyetle sonuçlanır. Bunun, hücrelerin arka plandan son derece farklı olduğu monokültür analizi için yeterli bulunmasına rağmen, kokültür analizindeki seçici çıkarma adımı çok daha fazla hassasiyet gerektirmiştir. Kokültür görüntülerinden hala makul derecede doğru veriler elde edilebilse de, kokültür analizinin genel doğruluğu, monokültür görüntülerinden elde edilen analizin doğruluğuna kıyasla azaltılmıştır. Ayrıca, alan tabanlı bir tanımlama sisteminin kullanılması, hücre sayımlarını elde etmek için ortalama bir hücre alanı gerektiriyordu. Bu parametre, gürültülü görüntülerle veya tekdüze geometrili hücrelerle uğraşırken kullanışlıdır, ancak alan değişkenli hücreler için nicelleştirmeyi engeller.
Bu algoritmanın mevcut yöntemlerin aksine önemi, floresan boyama prosedürleri olmadan mono ve kokültürlenmiş hücreleri analiz etmek için havza dönüştürme ve morfolojik görüntü işlemleri gibi gelişmiş yöntemlerin kullanılmasında yatmaktadır. Önceki birkaç çalışma, boyama yokluğunda hücreleri başarılı bir şekilde ayırt etmek ve saymak için yöntemler bildirmiş olsa da, bu alternatif yaklaşımlar genellikle karmaşık kültür yaklaşımları veya erişilemeyen yazılımlar gerektirmiştir16. Örneğin, Yılmaz ve meslektaşları, mikropedler15 üzerindeki immünomanyetik boncuklu biyoçipler aracılığıyla bağışıklık hücrelerini ölçmek için otomatik sayım analiz teknikleri kullandılar.
Ayrıca, hücrelerin merkezlerinde ortaya çıkan 'adalar' gibi rastgele olmayan gürültü modellerini ele almak için yeni ve etkili yaklaşımlar tasarladık. Farklı hücre hatlarının tanımlanması, yoğunluk piksellerinden tanımlanabilen hücrelerin değişen 'yükseklik' değerlerini kullanarak da mümkündü. Mutlak parametreler yerine göreli parametrelerin kullanılması, algoritmanın otomasyonunu etkinleştirerek ve tam parlaklık, kontrast veya renk ayarlarının korunması gerekmediğinden, görüntülerin elde edilmesi için daha fazla esneklik sağlayarak çeşitli avantajlar sağlamıştır. Alan tabanlı tanımlama, birçok hücre tipinde yaygın olduğu gibi, hücreler kümelendiğinde bile doğru sonuçlar verdi. Buna karşılık, manuel sayım ve segmentasyon zordur, hataya açıktır ve hücreleri doğru ve verimli bir şekilde tanımlamak için eğitimli bir kullanıcı gerektirebilir.
Gelecekteki uygulamalar ve algoritmanın geliştirilmesi, hücre sayma prosedürünün ince ayarına ve daha da optimize edilmesine odaklanacaktır. Ayrıca, farklı hücre tiplerini göreceli yoğunluğa göre ayırt etmek için deneysel parametrelerin kullanılması, diğer kokültürlerin test edilmesiyle doğrulanabilir; örneğin, nörotoksisite analizi için nöronların/astrositlerin tanımlanması17. Bağışıklık hücrelerinin temsili oranlarının enflamatuar ve antienflamatuar süreçlerde belirgin bir rol oynayabileceği yara iyileşmesi alanında daha fazla uygulama yapılabilir. Makrofajların ve fibroblastların hücre miktarındaki gelişmeler, yabancı cisim yanıt sonuçlarının değerlendirilmesi için parakrin ve jukstrakrin hücre sinyal etkileri hakkında ek bilgi sağlayabilir18,19. Ek Bilgiler'de, kokültür sistemlerinde hücre tanımlamanın doğruluğuna yardımcı olmak için algoritmaya morfometrik parametrelerin dahil edilmesinin olası mekanizmalarını araştırıyoruz.
Uzantılar, sadece ikili karışımların aksine, görüntülerdeki 3 veya daha fazla farklı hücre tipine odaklanacak daha karmaşık kokültürler için de yapılabilir. 8 bit görüntüler için mevcut sınırlı hassasiyet nedeniyle, ek bilgi sağlayan ancak daha dinamik yoğunluk aralıkları ve dağılımları nedeniyle analizi önemli ölçüde karmaşıklaştırabilecek 16 bit görüntüler gerekebilir. Bu çalışmanın amacı, çeşitli hücre kültürü ortamları için optimize edilmiş otomatik hücre sayımı için sağlam bir protokol geliştirmekti. Algoritma, soğanlı hücre görüntüsü alımlarında bile doğru hücre sayımlarına izin verir. Kendi kendini düzelten yinelemeli kodu, immünolojik olarak ilgili hücre kültürü sistemlerinin lekesiz parlak alan mikroskopisi görüntülemesi için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AR067247) ve kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Delaware Eyaleti'nden Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü-NIGMS (P20 GM103446) tarafından desteklenen Delaware INBRE programı tarafından finanse edilmiştir. Makalenin içeriği, finansman kuruluşlarının görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
