Summary
We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.
Abstract
Kwantificering van cellen is noodzakelijk voor een breed scala aan biologische en biochemische studies. Conventionele beeldanalyse van cellen maakt meestal gebruik van fluorescentiedetectiebenaderingen, zoals immunofluorescente kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten of randdetectietechnieken, die vaak foutgevoelig zijn vanwege ruis en andere niet-idealiteiten in de beeldachtergrond.
We ontwierpen een nieuw algoritme dat macrofagen en fibroblasten nauwkeurig kon tellen en onderscheiden, cellen van verschillende fenotypen die vaak colocaliseren tijdens weefselregeneratie. MATLAB werd gebruikt om het algoritme te implementeren, dat verschillende celtypen onderscheidde op basis van hoogteverschillen van de achtergrond. Een primair algoritme werd ontwikkeld met behulp van een gebiedsgebaseerde methode om rekening te houden met variaties in celgrootte / structuur en zaaiomstandigheden met hoge dichtheid.
Niet-idealiteiten in celstructuren werden verantwoord met een secundair, iteratief algoritme met behulp van interne parameters zoals celdekking berekend met behulp van experimentele gegevens voor een bepaald celtype. Ten slotte werd een analyse van cocultuuromgevingen uitgevoerd met behulp van een isolatiealgoritme waarbij verschillende celtypen selectief werden uitgesloten op basis van de evaluatie van relatieve hoogteverschillen binnen het beeld. Deze aanpak bleek nauwkeurig cellen te tellen binnen een foutmarge van 5% voor monoculturele cellen en binnen een foutmarge van 10% voor gecocultureerde cellen.
Introduction
Software wordt routinematig geïmplementeerd tijdens beeldanalysetechnieken om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, efficiënt en onbevooroordeeld zijn. Voor celgebaseerde assays is een veel voorkomend probleem de verkeerde identificatie van cellen. Beelden met onjuiste focus- en contrastinstellingen kunnen leiden tot celvervaging, waarbij de grens van individuele cellen moeilijk te identificeren is1. De aanwezigheid van externe beeldkenmerken zoals poriën, bubbels of andere ongewenste objecten kan de telprocedures belemmeren door het telproces te vertragen en tot verkeerde identificatie te leiden. Bovendien kan het tellen van cellen belastend zijn en kan het tellen van honderden replicaties extreem tijdrovend zijn. Bovendien bestaat er een inherente subjectieve bias tijdens handmatig tellen, en daarom is de besluitvorming met betrekking tot celidentificatie vaak onnauwkeurig2. Geautomatiseerde software biedt een opwindend potentieel om al deze problemen te omzeilen door cellen snel en nauwkeurig te onderscheiden van externe objecten, inclusief objecten die ver buiten de menselijke capaciteit liggen voor nauwkeurige detectie, op basis van goed gedefinieerde identificatiecriteria die de invloed van onderzoeksbias verminderen. Veelgebruikte technieken om cellen te identificeren met behulp van geautomatiseerde software omvatten twee hoofdmethoden: segmentatie endrempeling 3. Hierin demonstreren we een generaliseerbaar gebiedsgebaseerd protocol dat snelle, nauwkeurige en goedkope celtelling mogelijk maakt binnen een breed toegankelijk softwareframework.
Segmentatietechnieken, zoals randdetectie, proberen individuele cellen te isoleren door gebruik te maken van intensiteitsverschillen binnen een afbeelding. Intensiteitsveranderingen die een cel onderscheiden van de rest van de afbeelding bestaan meestal uit scherpe veranderingen in helderheid4. Randdetectie omvat een regulariserende filterstap, gevolgd door een differentiatiestap waarin intensiteitsveranderingen worden gedetecteerd. Het differentiatieproces identificeert randen en contouren binnen het beeld van veranderingen met hoge intensiteit, en deze randen en contouren zijn gecorreleerd met celaanwezigheid. Hoewel beelden met ruis kunnen worden uitgevoerd viadenoising-algoritmen 4, worden randdetectietechnieken ideaal gebruikt voor het analyseren van afbeeldingen met weinig achtergrondruis. Het proces functioneert optimaal wanneer celgrenzen duidelijk en gemakkelijk te onderscheiden zijn en niet worden belemmerd door helderheidscontouren die geen verband houden met celaanwezigheid, celonscherpte, vreemde objecten of gedefinieerde interne celstructuren 1,2. Als een beeld bijzonder luidruchtig is, kunnen cellen verder worden onderscheiden door fluorescerende kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten 2,5. Hoewel dit de nauwkeurigheid van segmentatietechnieken aanzienlijk verbetert, vereist het extra kosten en extra tijdsinvesteringen om celculturen voor te bereiden op beeldvorming.
Drempeltechnieken omvatten de verdeling van een afbeelding in twee categorieën: de voorgrond en de achtergrond, met cellen toegewezen aan de voorgrond3. Deze technieken maken gebruik van kleur/contrastveranderingen om de schijnbare hoogte van een object te definiëren; objecten die routinematig 'groter' zijn dan de achtergrond kunnen gemakkelijk als cellen worden geïdentificeerd. De waterscheiding-transformatie functioneert op deze manier door oppervlakken te associëren met lichte pixels als voorgrond en die met donkere pixels als achtergrond 6,7. Door middel van op hoogte gebaseerde identificatie kunnen drempeltechnieken routinematig ruis van gewenste objecten onderscheiden, op voorwaarde dat ze binnen hetzelfde brandpuntsvlak bestaan. In combinatie met een gebiedsgebaseerde kwantificering kan een stroomgebiedtransformatie nauwkeurig groepen objecten identificeren in omgevingen waar typische segmentatietechnieken zoals randdetectie onnauwkeurig zouden zijn.
Stroomgebiedtransformaties worden vaak gekoppeld aan segmentatietechnieken om beelden voor te bereiden voor een schonere analyse, wat resulteert in een hogere nauwkeurigheid van het tellen van cellen. Voor dit proces wordt de waterscheiding-transformatie gebruikt om potentiële interessante regio's te markeren voorafgaand aan segmentatie. Een waterscheidingstransformatie biedt unieke voordelen door cellen op de voorgrond van afbeeldingen te identificeren, wat de nauwkeurigheid van segmentatieanalyse kan verbeteren door potentiële valse positieven voor cellen te verwijderen, zoals ongelijke achtergrondstukken. Er kunnen zich echter problemen voordoen bij het aanpassen van celgebaseerde beelden aan een waterscheidingstransformatie. Beelden met een hoge celdichtheid kunnen worden geplaagd door ondersegmentatie, waarbij aggregaten van cellen worden geïdentificeerd als een enkelvoudige groep in plaats van als individuele componenten. De aanwezigheid van ruis of scherpe intensiteitsveranderingen kan ook leiden tot oversegmentatie, waarbij het algoritme cellen overisoleren, wat resulteert in overmatige en onnauwkeurige celtellingen8.
Hierin beschrijven we een methode om de primaire nadelen van de waterscheidingstransformatie te minimaliseren door componenten van een drempelanalyse op te nemen in een gebiedsgebaseerd kwantificeringsalgoritme, zoals weergegeven in figuur 1. Met name werd dit algoritme geïmplementeerd met open-source en / of algemeen beschikbare software, en toepassing van dit raamwerk voor het tellen van cellen was mogelijk zonder dure reagentia of complexe celvoorbereidingstechnieken. RAW264.7 macrofagen werden gebruikt om de methode te demonstreren vanwege hun cruciale rol bij het reguleren van bindweefselonderhoud en wondgenezingsprocessen9. Bovendien werden NIH / 3T3 fibroblasten geanalyseerd vanwege hun sleutelrol in weefselonderhoud en -reparatie. Fibroblastcellen bestaan vaak naast en ondersteunen macrofagen, waardoor de noodzaak ontstaat om deze fenotypisch verschillende celtypen te onderscheiden in cocultuurstudies.
Celtellingen van afbeeldingen met een hoge levensvatbare celdichtheid (VCD) kunnen betrouwbaar en efficiënt worden gekwantificeerd door het gebied te berekenen dat door de cellen wordt bestreken en het gemiddelde gebied dat door een enkelvoudige cel wordt ingenomen. Het gebruik van thresholding in tegenstelling tot segmentatie voor celidentificatie maakte ook complexere analyses mogelijk, zoals experimenten waarin verschillende celtypen in coculturen tegelijkertijd werden geanalyseerd. NIH / 3T3 fibroblasten, die vaak blijken te colocaliseren met RAW264.7 macrofagen binnen een wondgenezingsplaats, bleken te groeien op een brandpuntsvlak dat zich onderscheidde van het brandpuntsvlak van macrofagen10. Dienovereenkomstig werden meerdere drempelalgoritmen uitgevoerd om de achtergrond en voorgrond te definiëren, afhankelijk van het celtype dat wordt geanalyseerd, waardoor nauwkeurig geteld kan worden van twee verschillende celtypen binnen dezelfde afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek en beeldverwerving
- Kweek RAW264.7 macrofagen bij 37 °C en 5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 1,5 g/l natriumbicarbonaat en 5 μM β-mercaptoethanol.
- Voor monocultuurbeeldvorming kweekt u RAW264.7-cellen met een dichtheid van 25.000 cellen/cm2 in een celkweekkolf van 5 ml met 1 ml medium.
- Kweek NIH/3T3 cellen bij 37 °C en 5% CO2 in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine11.
- Voor beeldvorming van de cocultuur, kweek RAW264.7 macrofagen en NIH /3T3 fibroblasten samen in verschillende verhoudingen, bij een totale dichtheid van 25.000 cellen / cm2. Gebruik een kweekmedium dat bestaat uit 1 deel RAW264,7 medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine, 1,5 g/L natriumbicarbonaat en 5 μM β-mercaptoethanol) en 1 deel NIH/3T3 medium (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine).
- Na het zaaien incuberen van cellen bij 37 °C en 5% CO2 om een levensvatbare celdichtheid van 80% celconfluentie te bereiken.
- Beeldcellen met een omgekeerde microscoop uitgerust met een 40x objectief. Verkrijg alle afbeeldingen in grijswaarden en exporteer ze in het onbewerkte '.czi'-bestand.
- Bepaal de capaciteit van het algoritme om afbeeldingen met een reeks beeldkwaliteiten nauwkeurig te evalueren. Verkrijg afbeeldingen met verschillende foci, waardoor zowel 'niet-bolvormige' afbeeldingen (figuur 2) als 'bolvormige' afbeeldingen (figuur 3) worden geproduceerd.
- Exporteer en converteer celafbeeldingen naar het 8-bits tiff-beeldformaat (.tiff) met ImageJ met behulp van de functie 'Batch Convert' op de onbewerkte '.czi'-bestanden voorafgaand aan MATLAB-analyse. Sla geconverteerde afbeeldingen op in een lokale map en breng deze afbeeldingsbestanden handmatig over naar de relevante MATLAB-bak.
2. Beeldanalyse-monocultuur met behulp van het bestand "monocultuur.m"
OPMERKING: De volgende stappen zijn uitgevoerd met MATLAB. Drie bestanden werden gebruikt voor het MATLAB-protocol: "process.m" (Supplemental coding file 1), het bestand met het algoritme, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), het bestand dat moet worden uitgevoerd voor het analyseren van monocultuurafbeeldingen en "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), het bestand dat moet worden uitgevoerd voor het analyseren van coculture-afbeeldingen.
- Gebruik de gebiedsgebaseerde methode om afbeeldingen te verkrijgen van cellen met relatieve hoogtevariaties. Beelduitvoer voor elke substap door gebruik te maken van de functie 'imshow()' voor elke subafbeelding. Kopieer en plak het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voer de bestandsnaam in de volgende opdracht in. Druk op uitvoeren om het programma te starten.
imread('bestandsnaam.tiff')- Analyseer beelden door 'opening door reconstructie' gevolgd door 'closing by reconstruction' met behulp van bronfuncties8 om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten. Gebruik het eerste commando voor het openen door reconstructie en de tweede en derde reeks om te sluiten door reconstructie
"imopen()"
"imerode()"
"imreconstruct()"
- Analyseer beelden door 'opening door reconstructie' gevolgd door 'closing by reconstruction' met behulp van bronfuncties8 om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten. Gebruik het eerste commando voor het openen door reconstructie en de tweede en derde reeks om te sluiten door reconstructie
- Binarize de gereconstrueerde beelden naar puur zwart en zuiver wit pixels met behulp van een percentiel-gebaseerd identificatiesysteem. Merk op dat cellen in dit systeem worden geconverteerd naar een zuiver witte pixelwaarde van '255', terwijl achtergrond- en externe (niet-cellulaire) objecten worden geconverteerd naar een zuiver zwarte pixelwaarde van '0'.
- Onderscheid cellen van de achtergrond door een percentielverschil te gebruiken met de 'maximale relevante pixel', de grootste pixelwaarde die ten minste 0,5% van een bepaalde afbeelding omvat.
- Analyseer en evalueer de pixelwaarden voor RAW264.7-macrofagen. Als deze waarden zich binnen 4,5% van de maximale relevante pixel bevinden, markeert u de pixel als mobiel.
OPMERKING: Deze opdracht kan worden gegeven met behulp van een eenvoudige if-instructie. - Voor afbeeldingen die bolvormige celprofielen bevatten, zoals die in figuur 2, moet u een iteratieve procedure toepassen om te corrigeren voor onjuiste binarisatie in de centra van de cellen ('eilanden' genoemd; zie hieronder), als volgt.
- Bepaal een eerste schatting voor de totale celdekking; 60% werd gebruikt voor deze studie. Merk op dat het aantal cellen dat in het beeld aanwezig is, afhankelijk moet zijn van de celdekking - de relatie tussen celnummer en celdekking kan daarom experimenteel worden bepaald. Bepaal met behulp van deze relatie de variabelen 'Alpha' en 'kappa'.
OPMERKING: 'Alpha' vertegenwoordigt een 3 x 1 vector met de volgende relatieve hoogte percentielen: het hoogte percentiel waarbij cellen werden geïdentificeerd, het hoogte percentiel waarop de achtergrond werd geïdentificeerd, en het hoogte percentiel op welke eilanden-gebieden waarin intensiteit waarden significant lager waren dan celwaarden - meestal gelegen. 'Kappa' vertegenwoordigt het totale oppervlak dat wordt bedekt door cellen in de afbeelding. - Voer het algoritme uit, dat (i) afbeeldingen analyseert met behulp van initiële schattingen van alfa en kappa om een deel van de eilanden te vullen, en (ii) de postanalyseceltellingen en -dekking gebruikt om kappa opnieuw te berekenen. Als de kappa-waarde binnen 10% van de eerste schatting ligt, gaat u verder met de volgende stap.
OPMERKING: Voor afbeeldingen die RAW264.7- en NIH/3T3-cellen bevatten, bleek alfa [4.3, 5.5, 10] te zijn. Met andere woorden, een verschil van 4,3% ten opzichte van de maximale relevante pixel bepaalde het hoogtepercentiel waarop cellen werden geïdentificeerd, een verschil van 5,5% van de maximale relevante pixel bepaalde het hoogtepercentiel waarop de achtergrond werd geïdentificeerd. Een verschil van 10% ten opzichte van de maximale relevante pixel bepaalde het hoogtepercentiel waarop eilanden zich doorgaans bevonden.
- Bepaal na binarisatie van de afbeelding automatisch het gemiddelde celgebied met behulp van het open-source cirkelzoekalgoritme, dat een Hough-transformatie uitvoert op de binarized afbeelding 12,13,14. Gebruik de volgende opdracht om een vector te verkrijgen van alle centrale locaties en stralen van cirkels in de afbeelding.
"[centra, radii] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])"
'A' in dit commando is de afbeelding van keuze, en [minradius, maxradius] is het bereik van radii dat het algoritme zal proberen te detecteren.
OPMERKING: Deze procedure om het gemiddelde celoppervlak te bepalen gaat ervan uit dat de morfologie van macrofaagcellen zowel circulair als consistent was tussen cellen10. Uit experimentele gegevens blijkt dat de radii van macrofagen meestal tussen 30 en 50 pixels liggen bij 40x vergroting. Dit pixelbereik wordt gedefinieerd als het acceptabele bereik voor het cirkelzoekalgoritme. De radii kunnen aanzienlijk verschillen voor andere celtypen en vereisen bepaling met behulp van experimentele analyse.- Gebruik de radii-uitgangen om het gemiddelde celoppervlak te berekenen door middel van gemiddelden. Analyseer ten minste 10 cellen om nauwkeurige gebiedsidentificatie te garanderen.
- Bepaal het totale aantal cellen in de afbeelding met behulp van het gemiddelde celoppervlak.
- Doorloop de afbeeldingsmatrix en tel het totale aantal celpixels. Bepaal de totale celdekking door het aantal celpixels te delen door het totale aantal pixels in de afbeelding. Bepaal het totale aantal cellen in de afbeelding door het aantal celpixels te delen door het gemiddelde oppervlak van een cel.
3. Beeldanalyse-cocultuur met voornamelijk gebruik van het bestand "coculture_modified.m"
OPMERKING: De volgende stappen zijn uitgevoerd met MATLAB.
- Gebruik de gebiedsgebaseerde methode om afbeeldingen te verkrijgen van cellen met relatieve hoogtevariaties. Beelduitvoer voor elke substap door gebruik te maken van de functie 'imshow()' voor elke subafbeelding. Kopieer en plak het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voer de bestandsnaam in de volgende opdracht in. Druk op uitvoeren om het programma te starten.
'imread('bestandsnaam.tiff')'- Analyseer beelden door 'opening door reconstructie' gevolgd door 'closing by reconstruction' met behulp van bronfuncties10 om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten. Gebruik het eerste commando voor openen door reconstructie en de tweede en derde reeks om te sluiten door reconstructie.
"imopen ()"
"imerode()"
"imreconstruct()"
- Analyseer beelden door 'opening door reconstructie' gevolgd door 'closing by reconstruction' met behulp van bronfuncties10 om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten. Gebruik het eerste commando voor openen door reconstructie en de tweede en derde reeks om te sluiten door reconstructie.
- Voer een analyse uit van coculturen die RAW264.7- en NIH / 3T3-cellen bevatten met behulp van twee selectieve binarisaties, verkregen door gebruik te maken van de hoogteverschillen tussen de twee celtypen.
- Experimenteel een parameter 'phi' bepalen met behulp van afbeeldingen van RAW264.7- en NIH/3T3-cellen, waarbij phi het proportionele hoogteverschil tussen de twee celtypen vertegenwoordigt. Raad een initiële phi-waarde en herhaal totdat het aantal cellen en de dekking nauw overeenkomen met handmatige tellingen, specifiek voor de RAW264.7- en NIH / 3T3-cocultuur.
OPMERKING: De waarde voor phi die in deze studies werd gebruikt, bleek 3,2 te zijn. Phi wordt gebruikt om selectief een afbeelding te filteren zodat deze alleen RAW264.7-cellen lijkt te bevatten, zoals te zien is in figuur 4C. - Bepaal het aantal cellen in RAW264,7 en de totale celdekking op dezelfde manier als voor monocultuurbeelden.
- Experimenteel een parameter 'phi' bepalen met behulp van afbeeldingen van RAW264.7- en NIH/3T3-cellen, waarbij phi het proportionele hoogteverschil tussen de twee celtypen vertegenwoordigt. Raad een initiële phi-waarde en herhaal totdat het aantal cellen en de dekking nauw overeenkomen met handmatige tellingen, specifiek voor de RAW264.7- en NIH / 3T3-cocultuur.
- Analyseer het door stroomgebied getransformeerde beeld opnieuw zonder de phi-parameter en detecteer zowel macrofagen als fibroblasten. Verkrijg NIH/3T3 fibroblastgegevens door selectief RAW264,7 celpixels af te trekken, verkregen met behulp van de standaard drempel- en gebiedsgebaseerde kwantificeringsmethoden die in stap 2 worden beschreven.
- Nadat de hele afbeelding is geanalyseerd, bepaalt u het totale aantal NIH/3T3-pixels door het totale aantal celpixels af te trekken van het aantal RAW264,7 pixels. Bereken de dekking van NIH/3T3- en RAW264.7-cellen door te delen door het aantal celpixels voor elke cellijn door het totale aantal afbeeldingspixels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse van niet-bolvormige RAW264.7 macrofagen werd uitgevoerd in een monocultuur setting bij 25.000 cellen/cm2. Representatieve beelden werden gemaakt van de celcultuur en verwerkt in MATLAB na conversie naar 8-bit tiff in ImageJ. Algoritme-outputs gedurende het hele proces werden geregistreerd en gedocumenteerd in figuur 2 voor het representatieve beeld. In deze afbeelding telde het algoritme 226 cellen en dit aantal afbeeldingen werd geverifieerd door vergelijking met een handmatige telling die 241 cellen identificeerde (6,2% fout). Algoritme-uitvoer voor ten minste 10 afbeeldingen van RAW264,7 celtellingen had een gemiddelde fout van 4,5 ± 1,9%.
Analyse van bulbeuze RAW264.7 macrofagen werd uitgevoerd met behulp van een iteratief algoritme. In de meeste beelden was het waargenomen boleffect voornamelijk het gevolg van scherpstellen op een brandpuntsvlak dat iets boven het brandpuntsvlak van het substraat lag waaraan de cellen kleefden. Dienovereenkomstig werden de meeste beelden verkregen in niet-bolvormige vorm, waarvoor analyse aanzienlijk eenvoudiger was. Het algoritme dat nodig is om bolvormige beelden te analyseren, is ontwikkeld voor scenario's waarin suboptimaal onmogelijk te vermijden was vanwege meniscuseffecten of andere optische interferentie. Typische algoritme-outputs gedurende het hele proces werden geregistreerd en gedocumenteerd in figuur 3. In deze representatieve beeldanalyse telde het algoritme 221 cellen in het beeld, wat werd geverifieerd met een handmatige telling van 252 cellen (12,3% fout).
Analyse van coculturen die zowel RAW264.7 macrofagen als NIH/3T3 fibroblasten bevatten, werd uitgevoerd om het vermogen te bepalen om onderscheid te maken tussen twee verschillende celtypen binnen één beeld. Vanwege de zeer variabele celmorfologieën van NIH/3T3 fibroblasten konden handmatige/automatische celtellingen niet nauwkeurig worden verkregen en werden celdekkingen voor fibroblasten in plaats daarvan kwalitatief vergeleken met het oorspronkelijke beeld. Representatieve algoritme-outputs gedurende het hele proces werden geregistreerd en gedocumenteerd in figuur 4. Voor deze afbeelding was het aantal macrofagen in RAW264,7 137 en dit aantal werd geverifieerd met een handmatige telling van 155 (fout van 11,6%). Algoritme-uitvoer voor ten minste 10 RAW264.7 macrofaagtellingen had een gemiddelde van 7,8 ± 3,9% fout.
De robuustheid van het algoritme voor het tellen van cellen werd ook geverifieerd met behulp van een blinde studie om automatische celidentificatie te vergelijken met handmatige gebruikerstellingen. Vijf afbeeldingen werden willekeurig geselecteerd, met verschillende celdichtheden, en deze afbeeldingen werden blindelings geteld door drie verschillende gebruikers. De handmatige tellingen werden met elkaar vergeleken en met de resultaten van het automatische celtelalgoritme. De vergelijking van handmatige en geautomatiseerde telresultaten is weergegeven in tabel 1. Bovendien werd de segmentatienauwkeurigheid van deze methode getest door gebruik te maken van 'ground truth'-beelden die zijn afgeleid met behulp van conventionele segmentatietechnieken. De DICE-coëfficiënt 20,21 werd gebruikt als prestatiemaatstaf met een gemiddelde parameter van 0,85 over vijf afbeeldingen. Een voorbeeldoverlay is te zien in figuur 5.
Figuur 1: Gegeneraliseerd gebiedsgebaseerd algoritme. Een proces waarbij een beeld wordt voorbereid voor segmentatieanalyse door de waterscheiding-transformaties om regionale maxima en minima10 te bepalen. Deze voorgestelde methode wijzigt het proces (oorspronkelijk proces in zwart) door de bepaling van de stroomgebiedsruglijn en de daaropvolgende stappen over te slaan om een op percentielen gebaseerd systeem in combinatie met een gebiedsgebaseerd kwantificeringsproces (rood gemarkeerd) over te slaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RAW 264.7 niet-bulbeuze algoritme-uitvoer. De figuur toont de tussenliggende beeldverwerkingsstappen die leiden tot de kwantificering van niet-bulbeuze RAW264.7 macrofaagtellingen. (A) Eerste verwerking van afbeelding tot grijswaarden in afbeeldingJ. De oorspronkelijke afbeelding is geconverteerd naar 8-bits tiff en grijswaarden in ImageJ. (B) Nabewerking van grijswaardenafbeelding. De nabewerkingsafbeelding van A na opening en sluiting door reconstructie, zoals beschreven in stap 2.1.1. (C) Postbinarisatie van bewerkte afbeelding. Paneel B na binarisatie, uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.2. (D) Eindbeeld met representatieve cellen voor berekeningen van het gemiddelde oppervlak. De afbeelding met blauwe cirkels die de cellen aangeven die binnen de Hough-transformatie worden gebruikt om het gemiddelde gebied van een cel te identificeren, zoals beschreven in stap 2.3. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: RAW264.7 bulbous algoritme output. De figuur toont de tussenliggende beeldverwerkingsstappen die leiden tot de kwantificering van bulbeuze RAW264.7 macrofaagtellingen. (A) Afbeelding van bolvormige RAW264.7 macrofagen. De oorspronkelijke afbeelding is geconverteerd naar 8-bits tiff en grijswaarden in ImageJ. (B) Nabewerking van grijswaardenafbeelding. De nabewerkingsafbeelding van A na opening en sluiting door reconstructie, zoals beschreven in stap 2.1.1. (C) Post binarisatie van bewerkte afbeelding met duidelijke eilanden. De typische uitvoer zonder het iteratieve algoritme bij het analyseren van bolvormige beelden, met 'eilanden' van zwarte pixels in het midden van de cellen. De blauwe cirkels vertegenwoordigen de cellen die binnen de Hough-transformatie worden gebruikt om het gemiddelde gebied van een cel te identificeren, zoals beschreven in stap 2.3. (D) Eindbeeld met representatieve cellen, eilanden ingevuld met behulp van postoperatief algoritme. Het iteratieve algoritme voor afbeeldingsposts, zoals beschreven in stap 2.2.2. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: RAW264.7 en NIH/3T3 coculture algoritme output. De figuur toont de tussenliggende beeldverwerkingsstappen die leiden tot de kwantificering van cocultuurbeelden met RAW264.7 macrofagen en NIH/3T3 fibroblasten. (A) Afbeelding van NIH/3T3- en RAW264.7-cellen. De oorspronkelijke afbeelding is geconverteerd naar 8-bits tiff en grijswaarden in ImageJ. (B) Nabewerking van grijswaardenafbeelding. De nabewerkingsafbeelding van A na opening en sluiting door reconstructie, zoals beschreven in stap 3.1.1. (C) Postbinarisatie van verwerkt beeld met duidelijke selectie van macrofagen op basis van op hoogte gebaseerde isolatie. De selectieve isolatie van RAW264.7 macrofagen, zoals beschreven in stap 3.2.2. (D) Definitieve afbeelding met clusters van macrofagen en fibroblasten geïdentificeerd. De gehele opname bevat zowel RAW264.7 macrofagen als NIH/3T3 fibroblasten, zoals beschreven in stap 3.3. Een monster macrofaagcel wordt geschetst met een groene cirkel en een monster fibroblast cel wordt geschetst met een rode ovaal. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: DICE parameter-segmentatie prestaties, RAW264.7 macrofagen. De afbeelding toont een overlap tussen de 'ground truth' segmentatiebenadering en deze methode. De witte gebieden zijn cellen die worden gedetecteerd door zowel de 'grondwaarheid' als deze methode, terwijl de paarse en groene gebieden respectievelijk vals-negatieven en vals-positieven zijn. De 'ground truth'-segmentatie werd verkregen door gangbare segmentatietechnieken en maakt gebruik van region-of-interest tools om te corrigeren voor foutieve segmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Teller 1 | Teller 2 | Teller 3 | Automatisch | Gemiddelde handmatige tellingen (±STDEV) | Fout vergeleken met Automatisch | |
| Afbeelding 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3,0 | 4.22% |
| Afbeelding 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2,0 | 4.05% |
| Afbeelding 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5,3 | 5.02% |
| Afbeelding 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2,6 | 7.22% |
| Afbeelding 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3,0 | 7.20% |
Tabel 1: Handmatige/automatische celtellingen en robuustheidstest.
Aanvullende informatie: Morfologische verschillen in beeldanalyse van macrofaag- en fibroblastcoculturen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: "proces.m", het MATLAB-bestand dat nodig is om de algoritmen uit te voeren. Geen handmatige acties vereist, maar bevat het algoritme in een apart bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 2: "monocultuur.m", het MATLAB-bestand dat wordt gebruikt voor het analyseren van monocultuurafbeeldingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 3: "coculture_modified.m", het MATLAB-bestand dat wordt gebruikt voor het analyseren van cocultuurafbeeldingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwierpen een algemene gebiedsgerichte procedure die cellen nauwkeurig en efficiënt telde op basis van celhoogte, waardoor vlekvrije kwantificering van cellen mogelijk is, zelfs in cocultuursystemen. Kritische stappen voor deze procedure omvatten de implementatie van een systeem met relatieve intensiteit waarmee cellen konden worden gedifferentieerd. Het gebruik van een relatieve hoogteanalyse diende twee doelen: de behoefte aan externe parameters werd overbodig gemaakt, omdat relatieve parameters constant waren voor het gegeven celtype en parameter, en absolute helderheids- / contrastniveaus niet voor elk beeld hoefden te worden ingevoerd. Bovendien maakte het gebruik van een percentielgebaseerd systeem de analyse van meerdere celtypen binnen hetzelfde beeld mogelijk, op voorwaarde dat de verschillende celtypen zich op unieke hoogten in het beeld bevonden.
Het op percentielen gebaseerde systeem werd gedefinieerd als een verschil met de maximale pixelwaarde in tegenstelling tot het gemiddelde. Dit werd gedaan om scheeftrekken van het algoritme te voorkomen op basis van de gemiddelde intensiteitswaarde, die afhankelijk was van het aantal en de samenvloeiing van cellen in het beeld. Bovendien werd de 'maximale relevante pixel' geïmplementeerd om te voorkomen dat maximale intensiteitsuitschieters de gegevens significant beïnvloeden - maximale relevante pixels zouden ten minste 0,5% van de populatie moeten vertegenwoordigen - een experimentele waarde. Aanvullende stappen omvatten het gebruik van een gebiedsgebaseerd kwantificeringssysteem in plaats van het tellen van individuele entiteiten. Dit zorgde ervoor dat celfragmentatie of foutieve binarisatie zou worden geminimaliseerd bij het tellen van cellen, omdat het totale getroffen gebied minimaal was in vergelijking met het gebied van een cel.
Binnen dit algoritme zijn verschillende methoden voor probleemoplossing geïmplementeerd. De eerste inspanningen om beelden van celmonoculturen te kwantificeren, vereisten methoden om zowel bolvormige als niet-bolvormige cellen nauwkeurig te identificeren. Een uniek fenomeen werd waargenomen voor de bolvormige celbeelden, in die zin dat de centra van de cellen werden geïdentificeerd als achtergrond na de waterscheiding-transformatie, en deze regio's verschenen als eilanden in de cel. Een grondige analyse onthulde dat het gebrek aan celcentra optrad als gevolg van een te bolle structuur in het beeld, wat resulteerde in een inversie in de waterscheiding-transformatie. Een oplossing werd specifiek geïmplementeerd voor bulbeuze afbeeldingen, wat een iteratief proces omvatte dat bekend staat als plugging, waarbij de eilanden werden ingevuld als echte celwaarden. Dit functioneerde door een procedure waarbij de celdekking en de mate van eilandvorming werden gebruikt om de nauwkeurigheid van het beeld te bepalen. Over het algemeen werd de celdekking gebruikt om de mate van eilandvorming te bepalen, omdat een ongewoon lage celdekking meestal werd veroorzaakt door een hoog niveau van eilandvorming. De relatie tussen celdekking en de mate van eilandvorming werd bepaald door middel van experimentele gegevens.
Aanvullende probleemoplossing was nodig op basis van de observatie dat het gebruik van een 'gemiddelde pixel'-drempel (gedefinieerd als de gemiddelde gemiddelde pixelintensiteit in de afbeelding) om cellen te differentiëren, in plaats van een maximale pixel, tot inconsistenties leidde. De gemiddelde intensiteit van het beeld bleek toe te nemen als functie van het aantal cellen in het beeld, wat de resultaten kon vertekenen op basis van de dichtheid van cellen in het beeld. Een alternatieve iteratie van het algoritme werd ontworpen met behulp van een benchmark met maximale intensiteit; deze waarde was echter ook inconsistent, omdat uitschieters met een hoge intensiteit de gegevens aanzienlijk scheeftrokken en tot onbetrouwbare resultaten leidden. Uiteindelijk is gekozen voor het gebruik van een maximaal relevante pixel. De maximaal relevante pixel bleek nauwkeurig rekening te houden met uitschieters met hoge intensiteit, wat leidde tot de meest consistente resultaten bij het onderscheiden van monocultuur- en cocultuurbeelden.
Verschillende beperkingen van het algoritme werden geïdentificeerd bij het analyseren van cocultuurbeelden met behulp van het op percentiel gebaseerde systeem om selectief verschillende soorten cellen te identificeren. Af en toe verschenen NIH/3T3-cellen continu met RAW 264.7-cellen in een meerlagig aggregaat, waardoor het beeld extreem moeilijk te analyseren was. Hoewel dit meestal werd waargenomen voor cocultuurbeelden, kunnen monocultuurbeelden van cellen met abnormale kweekomstandigheden of hoge samenvloeiingsniveaus ook resulteren in meerlaagse celaggregaten. Hoewel het algoritme met succes meerlaagse aggregaten als uniek van de achtergrond kon detecteren, was het niet mogelijk om nauwkeurige celkwantificering te verkrijgen met behulp van deze 2D-beeldanalyse op celmultilagen. Bovendien kan celresten in het beeld de nauwkeurigheid van het algoritme belemmeren. Het gebruik van een gebiedsgebaseerd analysealgoritme diende om de fout in verband met foutieve detectie te minimaliseren, omdat kleine gebieden van celpuin het celaantal minder zouden beïnvloeden met behulp van een gebiedsgebaseerde analyse dan segmentatie.
Bovendien resulteerde de conversie van czi-afbeeldingen naar 8-bits TIFF, uitgevoerd om eenvoud en uniformiteit te garanderen, in pixeltypen van uint8, een verzameling hele getallen van 0 tot 255. Verschillen konden dus alleen worden gekwantificeerd met een maximale precisie van 1/256 of 0,39%. Over het algemeen beslaat de pixelspreiding slechts tussen de 210 en 250 pixels, wat resulteert in een realistische precisie van 2,5%. Hoewel dit voldoende bleek te zijn voor monocultuuranalyse waarbij cellen extreem verschillend zijn van de achtergrond, vereiste de selectieve aftrekkingsstap binnen de cocultuuranalyse veel meer precisie. Hoewel redelijk nauwkeurige gegevens nog steeds konden worden verkregen uit cocultuurbeelden, was de algehele nauwkeurigheid van de cocultuuranalyse verminderd in vergelijking met de nauwkeurigheid van de analyse van monocultuurbeelden. Bovendien vereiste het gebruik van een gebiedsgebaseerd identificatiesysteem een gemiddelde celoppervlakte om celtellingen te verkrijgen. Deze parameter is nuttig bij het omgaan met luidruchtige beelden of met cellen met uniforme geometrieën, maar zou de kwantificering voor oppervlaktevariabele cellen belemmeren.
De betekenis van dit algoritme in tegenstelling tot bestaande methoden ligt in het gebruik van ontwikkelde methoden zoals de waterscheiding-transformatie en morfologische beeldbewerkingen om mono- en coculturele cellen te analyseren zonder fluorescentiekleuringsprocedures. Hoewel verschillende eerdere studies methoden hebben gerapporteerd om cellen met succes te onderscheiden en te tellen in afwezigheid van kleuring, vereisten deze alternatieve benaderingen vaak complexe kweekbenaderingen of ontoegankelijke software16. Yilmaz en collega's gebruikten bijvoorbeeld geautomatiseerde telanalysetechnieken om immuuncellen te kwantificeren via biochips met immunomagnetische kralen op micropads15.
We hebben ook nieuwe en impactvolle benaderingen ontworpen om niet-willekeurige ruispatronen aan te pakken, zoals 'eilanden', die in de centra van cellen verschenen. Identificatie van verschillende cellijnen was ook mogelijk door gebruik te maken van de verschillende 'hoogte'-waarden van de cellen, die konden worden geïdentificeerd aan de hand van intensiteitspixels. Het gebruik van relatieve parameters in plaats van absolute parameters bood verschillende voordelen door automatisering van het algoritme mogelijk te maken en meer flexibiliteit te bieden voor de verwerving van afbeeldingen, omdat exacte helderheid, contrast of kleurinstellingen niet hoefden te worden behouden. De gebiedsgebaseerde identificatie leverde nauwkeurige resultaten op, zelfs wanneer cellen werden geclusterd, zoals gebruikelijk is bij veel celtypen. Handmatig tellen en segmenteren zijn daarentegen moeilijk, foutgevoelig en vereisen mogelijk dat een getrainde gebruiker cellen nauwkeurig en efficiënt identificeert.
Toekomstige toepassingen en ontwikkeling van het algoritme zullen zich richten op het finetunen en verder optimaliseren van de celtelprocedure. Bovendien kan het gebruik van experimentele parameters om verschillende celtypen te onderscheiden op basis van relatieve intensiteit worden geverifieerd door verdere coculturen te testen; bijvoorbeeld de identificatie van neuronen/astrocyten voor neurotoxiciteitsanalyse17. Verdere toepassingen kunnen worden gemaakt op het gebied van wondgenezing, waar representatieve proporties van immuuncellen een prominente rol kunnen spelen in de ontstekings- en ontstekingsremmende processen. Verbeteringen in celkwantificering van macrofagen en fibroblasten kunnen extra inzicht geven in de paracriene versus juxtracrine celsignaleringseffecten die relevant zijn voor het evalueren van responsresultaten van vreemde lichamen18,19. In Aanvullende informatie onderzoeken we de mogelijke mechanismen van het opnemen van morfometrische parameters in het algoritme om te helpen bij de nauwkeurigheid van celidentificatie binnen cocultuursystemen.
Uitbreidingen kunnen ook worden gemaakt voor complexere coculturen, die zich zouden richten op 3 of meer verschillende celtypen binnen afbeeldingen, in tegenstelling tot alleen binaire mengsels. Vanwege de beperkte precisie die beschikbaar is voor 8-bits afbeeldingen, kunnen 16-bits afbeeldingen nodig zijn, die aanvullende informatie bieden, maar de analyse aanzienlijk kunnen bemoeilijken vanwege meer dynamische intensiteitsbereiken en distributies. Het doel van deze studie was om een robuust protocol te ontwikkelen voor geautomatiseerde celtelling dat is geoptimaliseerd voor diverse celkweekomgevingen. Het algoritme maakt nauwkeurige celtellingen mogelijk, zelfs bij bolvormige celbeeldacquisities. De zelfcorrigerende iteratieve code is nuttig voor vlekvrije brightfield microscopie beeldvorming van immunologisch relevante celkweeksystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 AR067247) en gedeeltelijk door het Delaware INBRE-programma, ondersteund door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) van de National Institutes of Health en de staat Delaware. De inhoud van het manuscript weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de financieringsagentschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
