Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

मैक्रोफेज-फाइब्रोब्लास्ट Cocultures के परिमाणीकरण के लिए क्षेत्र-आधारित छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

Summary

हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जो सेल की गिनती की पहचान करने के लिए एक सामान्यीकृत क्षेत्र-आधारित छवि विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करता है। विभिन्न सेल आबादी के विश्लेषण ने एक अनुकूली एल्गोरिथ्म के भीतर अलग-अलग सेल प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण सेल ऊंचाई और संरचना अंतर का शोषण किया।

Abstract

कोशिकाओं का परिमाणीकरण जैविक और जैव रासायनिक अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है। कोशिकाओं का पारंपरिक छवि विश्लेषण आमतौर पर या तो प्रतिदीप्ति का पता लगाने के दृष्टिकोण को नियोजित करता है, जैसे कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन या किनारे का पता लगाने की तकनीकों के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग या अभिकर्मक, जो अक्सर छवि पृष्ठभूमि में शोर और अन्य गैर-आदर्शों के कारण त्रुटि-प्रवण होते हैं।

हमने एक नया एल्गोरिथ्म डिज़ाइन किया है जो मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट्स, विभिन्न फेनोटाइप्स की कोशिकाओं को सटीक रूप से गिन सकता है और अलग कर सकता है जो अक्सर ऊतक पुनर्जनन के दौरान सह-स्थानीयकरण करते हैं। MATLAB का उपयोग एल्गोरिथ्म को लागू करने के लिए किया गया था, जो पृष्ठभूमि से ऊंचाई में अंतर के आधार पर अलग-अलग सेल प्रकारों को विभेदित करता है। सेल आकार / संरचना और उच्च घनत्व सीडिंग स्थितियों में भिन्नताओं के लिए खाते के लिए एक क्षेत्र-आधारित विधि का उपयोग करके एक प्राथमिक एल्गोरिथ्म विकसित किया गया था।

सेल संरचनाओं में गैर-आदर्शताओं को एक द्वितीयक, पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म के साथ जिम्मेदार ठहराया गया था, जो आंतरिक मापदंडों का उपयोग करता था जैसे कि सेल कवरेज किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए प्रयोगात्मक डेटा का उपयोग करके गणना की जाती है। अंत में, एक अलगाव एल्गोरिथ्म का उपयोग करके कोकल्चर वातावरण का विश्लेषण किया गया था जिसमें छवि के भीतर सापेक्ष ऊंचाई के अंतर के मूल्यांकन के आधार पर विभिन्न सेल प्रकारों को चुनिंदा रूप से बाहर रखा गया था। यह दृष्टिकोण मोनोकल्चर्ड कोशिकाओं के लिए 5% त्रुटि मार्जिन के भीतर और सहसंस्कृत कोशिकाओं के लिए 10% त्रुटि मार्जिन के भीतर कोशिकाओं को सटीक रूप से गिनने के लिए पाया गया था।

Introduction

सॉफ़्टवेयर को नियमित रूप से छवि विश्लेषण तकनीकों के दौरान लागू किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि परिणाम सटीक, कुशल और निष्पक्ष हैं। सेल-आधारित assays के लिए, एक आम समस्या कोशिकाओं की गलत पहचान है। अनुचित फोकल और कंट्रास्ट सेटिंग्स वाली छवियों से सेल धुंधलापन हो सकता है, जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं की सीमा1 की पहचान करना मुश्किल हो जाता है। बाहरी छवि सुविधाओं जैसे कि छिद्रों, बुलबुले, या अन्य अवांछित वस्तुओं की उपस्थिति गिनती प्रक्रिया को धीमा करके और गलत पहचान के लिए अग्रणी करके गिनती प्रक्रियाओं को बाधित कर सकती है। इसके अलावा, सेल की गिनती कठिन हो सकती है, और सैकड़ों प्रतिकृतियों की गिनती बेहद समय लेने वाली हो सकती है। इसके अलावा, मैन्युअल गिनती के दौरान एक अंतर्निहित व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह मौजूद है, और इसलिए सेल पहचान के बारे में निर्णय लेना अक्सर गलतहोता है। स्वचालित सॉफ़्टवेयर बाहरी वस्तुओं से कोशिकाओं को तेजी से और सटीक रूप से अलग करके इन सभी मुद्दों को बाईपास करने की रोमांचक क्षमता प्रदान करता है, जिसमें सटीक पहचान के लिए मानव क्षमता से परे वस्तुएं शामिल हैं, जो अच्छी तरह से परिभाषित पहचान मानदंडों के आधार पर हैं जो अन्वेषक पूर्वाग्रह के प्रभाव को कम करती हैं। स्वचालित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सामान्य तकनीकों में दो मुख्य तरीके शामिल हैं: विभाजन और थ्रेशोल्डिंग3। इसमें, हम एक सामान्यीकृत क्षेत्र-आधारित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं जो व्यापक रूप से सुलभ सॉफ़्टवेयर ढांचे के भीतर तेजी से, सटीक और सस्ती सेल गिनती को सक्षम बनाता है।

विभाजन तकनीक, जैसे कि किनारे का पता लगाना, एक छवि के भीतर तीव्रता अंतर का उपयोग करके अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करना चाहते हैं। तीव्रता परिवर्तन जो एक सेल को बाकी छवि से अलग करते हैं, अक्सर चमक 4 में तेज परिवर्तन होतेहैं। एज डिटेक्शन में एक नियमितीकरण फ़िल्टरिंग चरण शामिल होता है, जिसके बाद एक भेदभाव चरण होता है जिसमें तीव्रता परिवर्तन का पता लगाया जाता है। विभेदन प्रक्रिया उच्च तीव्रता वाले परिवर्तनों की छवि के भीतर किनारों और रूपरेखा की पहचान करती है, और ये किनारे और रूपरेखा सेल की उपस्थिति के साथ सहसंबद्ध हैं। यद्यपि शोर के साथ छवियों को डीनोइज़िंग एल्गोरिदम4 के माध्यम से चलाया जा सकता है, लेकिन एज डिटेक्शन तकनीकों का उपयोग आदर्श रूप से कम पृष्ठभूमि शोर वाली छवियों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। प्रक्रिया बेहतर ढंग से कार्य करती है जब सेल सीमाएं स्पष्ट रूप से और आसानी से अलग-अलग होती हैं और सेल उपस्थिति, सेल धुंधला, बाहरी वस्तुओं, या परिभाषित आंतरिक सेल संरचनाओं 1,2 से असंबंधित चमक की रूपरेखा से बाधित नहीं होती हैं। यदि कोई छवि विशेष रूप से शोर है, तो कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2,5 के साथ फ्लोरोसेंट स्टेनिंग या अभिकर्मक के माध्यम से आगे प्रतिष्ठित किया जा सकता है। यद्यपि यह विभाजन तकनीकों की सटीकता में काफी सुधार करता है, लेकिन इमेजिंग के लिए सेल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए अतिरिक्त लागत और अतिरिक्त समय निवेश की आवश्यकता होती है।

थ्रेशोल्डिंग तकनीकों में एक छवि को दो श्रेणियों में विभाजित किया जाता है: अग्रभूमि और पृष्ठभूमि, अग्रभूमि3 को असाइन की गई कोशिकाओं के साथ। ये तकनीकें किसी वस्तु की स्पष्ट ऊंचाई को परिभाषित करने के लिए रंग / कंट्रास्ट परिवर्तनों का उपयोग करती हैं; जिन वस्तुओं को नियमित रूप से पृष्ठभूमि की तुलना में 'लंबा' किया जाता है, उन्हें आसानी से कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है। वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म इस तरह से प्रकाश पिक्सेल के साथ सतहों को अग्रभूमि के रूप में और अंधेरे पिक्सेल वाले लोगों को पृष्ठभूमि 6,7 के रूप में जोड़कर कार्य करता है। ऊंचाई-आधारित पहचान के माध्यम से, थ्रेशोल्डिंग तकनीक नियमित रूप से वांछित वस्तुओं से शोर को अलग कर सकती है, बशर्ते वे एक ही फोकल प्लेन के भीतर मौजूद हों। जब क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण के साथ जोड़ा जाता है, तो एक वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म वातावरण में वस्तुओं के समूहों की सटीक पहचान कर सकता है जहां किनारे का पता लगाने जैसी विशिष्ट विभाजन तकनीकें गलत होंगी।

वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म को आमतौर पर क्लीनर विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करने के लिए विभाजन तकनीकों के साथ युग्मित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल गिनती की उच्च सटीकता होती है। इस प्रक्रिया के लिए, वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म का उपयोग विभाजन से पहले ब्याज के संभावित क्षेत्रों को उजागर करने के लिए किया जाता है। एक वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म छवियों के अग्रभूमि में कोशिकाओं की पहचान करके अद्वितीय लाभ प्रदान करता है, जो कोशिकाओं के लिए संभावित झूठे सकारात्मक को हटाकर विभाजन विश्लेषण की सटीकता में सुधार कर सकता है, जैसे कि पृष्ठभूमि के असमान पैच। हालांकि, एक वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म के लिए सेल-आधारित छवियों को अनुकूलित करने का प्रयास करते समय कठिनाइयां उत्पन्न हो सकती हैं। उच्च सेल घनत्व वाली छवियों को अंडरसेग्मेंटेशन से ग्रस्त किया जा सकता है, जिसमें कोशिकाओं के समुच्चय को व्यक्तिगत घटकों के बजाय एक विलक्षण समूह के रूप में पहचाना जाता है। शोर या तेज तीव्रता परिवर्तनों की उपस्थिति के परिणामस्वरूप ओवरसेग्मेंटेशन भी हो सकता है, जिसमें एल्गोरिथ्म कोशिकाओं को ओवरआइसोलेट करता है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक और गलत सेल की गिनतीहोती है 8।

इसमें, हम एक क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण एल्गोरिथ्म के भीतर थ्रेशोल्डिंग विश्लेषण के घटकों को शामिल करके वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म की प्राथमिक कमियों को कम करने के लिए एक विधि का विस्तार करते हैं, जैसा कि चित्र 1 में दर्शाया गया है। विशेष रूप से, इस एल्गोरिथ्म को ओपन-सोर्स और / या व्यापक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के साथ लागू किया गया था, और इस सेल-गिनती ढांचे का आवेदन महंगे अभिकर्मकों या जटिल सेल तैयारी तकनीकों के बिना संभव था। RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग संयोजी ऊतक रखरखाव और घाव भरने की प्रक्रियाओं को विनियमित करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण विधि को प्रदर्शित करने के लिए किया गयाथा। इसके अतिरिक्त, ऊतक रखरखाव और मरम्मत में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण एनआईएच / 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट का विश्लेषण किया गया था। फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं अक्सर मैक्रोफेज के साथ सह-अस्तित्व में रहती हैं और उनका समर्थन करती हैं, जिससे कोकल्चर अध्ययनों में इन फेनोटाइपिक रूप से अलग-अलग सेल प्रकारों को अलग करने की आवश्यकता होती है।

उच्च व्यवहार्य सेल घनत्व (वीसीडी) के साथ छवियों से सेल की गिनती को कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए क्षेत्र की गणना करके मज़बूती से और कुशलतासे परिमाणित किया जा सकता है, और एक विलक्षण सेल द्वारा कब्जा किए गए औसत क्षेत्र। सेल पहचान के लिए विभाजन के विपरीत थ्रेशोल्डिंग के उपयोग ने अधिक जटिल विश्लेषणों को भी सक्षम किया, जैसे कि प्रयोग जिसमें सहसंस्कृतियों में विभिन्न सेल प्रकारों का समवर्ती रूप से विश्लेषण किया गया था। एनआईएच / 3टी 3 फाइब्रोब्लास्ट्स, जो अक्सर घाव भरने वाली साइट के भीतर RAW264.7 मैक्रोफेज के साथ सह-स्थानीयकरण करने के लिए पाए जाते हैं, को एक फोकल प्लेन में विकसित होने के लिए पाया गया था जो मैक्रोफेज10 के फोकल प्लेन से अलग था। तदनुसार, विश्लेषण किए जा रहे सेल प्रकार के आधार पर पृष्ठभूमि और अग्रभूमि को परिभाषित करने के लिए कई थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिदम चलाए गए थे, जिससे एक ही छवि के भीतर दो अलग-अलग सेल प्रकारों की सटीक गिनती सक्षम हो गई थी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति और छवि अधिग्रहण

  1. संस्कृति RAW264.7 37 डिग्री सेल्सियस पर मैक्रोफेज और Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में 5% सीओ2 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-streptomycin, 1.5 g / L सोडियम बाइकार्बोनेट, और 5 μM β-mercaptoethanol के साथ पूरक।
    1. Monoculture इमेजिंग के लिए, संस्कृति RAW264.7 कोशिकाओं 25,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर एक 5 एमएल सेल संस्कृति फ्लास्क में माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ एक 5 एमएल सेल संस्कृति फ्लास्क में।
  2. संस्कृति एनआईएच / 3T3 कोशिकाओं पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन11 के साथ पूरक।
  3. Coculture इमेजिंग के लिए, संस्कृति RAW264.7 मैक्रोफेज और NIH / 3T3 fibroblasts एक साथ विभिन्न अनुपातों पर, 25,000 कोशिकाओं / सेमी2 के कुल घनत्व पर। Coculture माध्यम का उपयोग करें जो 1 भाग RAW264.7 मध्यम है (DMEM 10% FBS, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1.5 g / L सोडियम बाइकार्बोनेट, और 5 μM β-mercaptoethanol) और 1 भाग NIH / 3T3 माध्यम (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) है।
  4. सीडिंग के बाद, 80% सेल संगम के व्यवहार्य सेल घनत्व तक पहुंचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. एक 40x उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ छवि कोशिकाओं. ग्रेस्केल में सभी छवियों को प्राप्त करें और उन्हें कच्चे '.czi' फ़ाइल में निर्यात करें।
    1. छवि गुणों की एक श्रृंखला के साथ छवियों का सटीक मूल्यांकन करने के लिए एल्गोरिथ्म की क्षमता निर्धारित करें। अलग-अलग फोकी के साथ छवियों को प्राप्त करें, दोनों 'गैर-बल्बस' छवियों (चित्रा 2) और 'बल्बस' छवियों (चित्रा 3) का उत्पादन करते हैं।
    2. निर्यात और कन्वर्ट सेल छवियों को 8-बिट टिफ (.tiff) छवि प्रारूप में परिवर्तित करें ImageJ का उपयोग कर 'बैच कन्वर्ट' फ़ंक्शन का उपयोग कर कच्चे '.czi' MATLAB विश्लेषण से पहले फ़ाइलों पर। कनवर्ट की गई छवियों को स्थानीय फ़ोल्डर में संग्रहीत करें और मैन्युअल रूप से इन छवि फ़ाइलों को प्रासंगिक MATLAB बिन में स्थानांतरित करें।

2. छवि विश्लेषण-monoculture "monoculture.m" मुख्य रूप से फ़ाइल का उपयोग कर monoculture

नोट:: MATLAB का उपयोग कर निम्न चरणों को निष्पादित किए गए थे। MATLAB प्रोटोकॉल के लिए तीन फ़ाइलों का उपयोग किया गया था: "process.m" (Supplemental coding file 1), एल्गोरिथ्म वाली फ़ाइल, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), monoculture छवियों का विश्लेषण करने के लिए चलाने के लिए फ़ाइल, और "coculture_modified.m" (पूरक कोडिंग फ़ाइल 3), coculture छवियों का विश्लेषण करने के लिए चलाने के लिए फ़ाइल।

  1. सापेक्ष ऊँचाई भिन्नताएँ दिखाने वाले कक्षों की छवियों को प्राप्त करने के लिए क्षेत्र-आधारित विधि का उपयोग करें. प्रत्येक subimage के लिए 'imshow()' फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रत्येक substep के लिए छवि outputs. प्रतिलिपि बनाएँ और बिन में विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइल चिपकाएँ और निम्न आदेश में फ़ाइल का नाम दर्ज करें। प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए चलाएँ दबाएँ.
    imread ('फ़ाइल नाम.tiff')
    1. पृष्ठभूमि से अग्रभूमि को बढ़ाने के लिए स्रोत कार्यों8 का उपयोग करके 'पुनर्निर्माण द्वारा बंद' के बाद 'पुनर्निर्माण द्वारा खोलने' द्वारा छवियों का विश्लेषण करें। पुनर्निर्माण द्वारा खोलने के लिए पहले आदेश का उपयोग करें और पुनर्निर्माण द्वारा बंद करने के लिए दूसरे और तीसरे अनुक्रम का उपयोग करें
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. एक प्रतिशत-आधारित पहचान प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध काले और शुद्ध सफेद पिक्सेल के लिए पुनर्निर्मित छवियों को बायनाराइज़ करें। ध्यान दें कि कोशिकाओं को इस प्रणाली में '255' के शुद्ध सफेद पिक्सेल मान में परिवर्तित किया जाता है, जबकि पृष्ठभूमि और बाहरी (गैर-सेलुलर) वस्तुओं को '0' के शुद्ध काले पिक्सेल मान में परिवर्तित किया जाता है।
    1. 'अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल' से प्रतिशत अंतर का उपयोग करके पृष्ठभूमि से कोशिकाओं को अलग करें, सबसे बड़ा पिक्सेल मान जिसमें किसी दी गई छवि का कम से कम 0.5% शामिल है।
    2. RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए पिक्सेल मानों का विश्लेषण और मूल्यांकन करें। यदि ये मान अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल के 4.5% के भीतर हैं, तो पिक्सेल को सेलुलर के रूप में चिह्नित करें.
      नोट:: यह आदेश एक साधारण यदि कथन का उपयोग कर जारी किया जा सकता है।
    3. बल्बस सेल प्रोफाइल वाली छवियों के लिए, जैसे कि चित्र 2 में देखी गई, कोशिकाओं के केंद्रों पर गलत बीनाराइजेशन के लिए सही करने के लिए एक पुनरावर्ती प्रक्रिया को लागू करें (जिसे 'द्वीप;' नीचे देखें), निम्नानुसार है।
    4. कुल सेल कवरेज के लिए एक प्रारंभिक अनुमान निर्धारित करें; इस अध्ययन के लिए 60% का उपयोग किया गया था। ध्यान दें कि छवि के भीतर मौजूद कक्षों की संख्या सेल कवरेज पर निर्भर होनी चाहिए- इसलिए सेल नंबर और सेल कवरेज के बीच संबंध को प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जा सकता है। इस संबंध का उपयोग करते हुए, चर 'अल्फा' और 'कप्पा' निर्धारित करें।
      नोट: 'अल्फा' एक 3 x 1 वेक्टर का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें निम्नलिखित सापेक्ष ऊंचाई प्रतिशतता होती है: ऊंचाई प्रतिशतता जिस पर कोशिकाओं की पहचान की गई थी, ऊंचाई प्रतिशतता जिस पर पृष्ठभूमि की पहचान की गई थी, और ऊंचाई प्रतिशतता जिस पर द्वीप-क्षेत्र जिसमें तीव्रता मान सेल मूल्यों की तुलना में काफी कम थे- आमतौर पर रहते थे। 'कप्पा' छवि में कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए कुल क्षेत्र को दर्शाता है।
    5. एल्गोरिथ्म चलाएं, जो (i) द्वीपों के एक हिस्से को भरने के लिए अल्फा और कप्पा के प्रारंभिक अनुमानों का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण करेगा, और (ii) कप्पा की पुनर्गणना करने के लिए पोस्टएनालिसिस सेल गिनती और कवरेज का उपयोग करेगा। यदि कप्पा मान प्रारंभिक अनुमान के 10% के भीतर है, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें।
      नोट: RAW264.7 और NIH/3T3 कोशिकाओं वाली छवियों के लिए, अल्फा [4.3, 5.5, 10] पाया गया था। दूसरे शब्दों में, अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल से 4.3% के अंतर ने ऊंचाई प्रतिशतता निर्धारित की जिस पर कोशिकाओं की पहचान की गई थी, अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल से 5.5% का अंतर ऊंचाई प्रतिशतता निर्धारित करता है जिस पर पृष्ठभूमि की पहचान की गई थी। अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल से 10% का अंतर ऊंचाई प्रतिशतता निर्धारित करता है जिस पर द्वीप आमतौर पर रहते थे।
  3. छवि के binarization के बाद, औसत सेल क्षेत्र स्वचालित रूप से ओपन-सोर्स सर्कल खोज एल्गोरिथ्म का उपयोग करके निर्धारित करें, जो binarized छवि12,13,14 पर एक हॉफ ट्रांसफॉर्म करता है। छवि के भीतर पाए जाने वाले सभी केंद्र स्थानों और हलकों की त्रिज्या का वेक्टर प्राप्त करने के लिए निम्न आदेश का उपयोग करें।
    '[केंद्र, त्रिज्या] = imfindcircle (ए, [minradius, maxradius])'
    इस कमांड में 'ए' पसंद की छवि है, और [minradius, maxradius] त्रिज्या की सीमा है जिसे एल्गोरिथ्म का पता लगाने का प्रयास करेगा।
    नोट: औसत सेल क्षेत्र निर्धारित करने के लिए यह प्रक्रिया यह मानती है कि मैक्रोफेज कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दोनों परिपत्र औरकोशिकाओं 10 के बीच सुसंगत था। प्रयोगात्मक आंकड़ों से, मैक्रोफेज की त्रिज्या को आमतौर पर 40x आवर्धन पर 30 और 50 पिक्सेल के बीच देखा जाता है। इस पिक्सेल श्रेणी को वृत्त ढूँढने एल्गोरिथ्म के लिए स्वीकार्य श्रेणी के रूप में परिभाषित किया गया है. त्रिज्या अन्य सेल प्रकारों के लिए काफी अलग हो सकती है और प्रयोगात्मक विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारण की आवश्यकता होगी।
    1. औसत द्वारा औसत सेल क्षेत्र की गणना करने के लिए त्रिज्या आउटपुट का उपयोग करें। सटीक क्षेत्र की पहचान सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
  4. औसत सेल क्षेत्र का उपयोग करके छवि के भीतर कक्षों की कुल संख्या निर्धारित करें.
    1. छवि मैट्रिक्स के माध्यम से लूप करें और सेल पिक्सेल की कुल संख्या की गणना करें। छवि के भीतर पिक्सेल की कुल संख्या से कक्ष पिक्सेल की संख्या को विभाजित करके कुल कक्ष कवरेज निर्धारित करें. कक्ष पिक्सेल की संख्या को किसी कक्ष के औसत क्षेत्र से विभाजित करके छवि के भीतर कक्षों की कुल संख्या निर्धारित करें.

3. छवि विश्लेषण coculture मुख्य रूप से "coculture_modified.m" फ़ाइल का उपयोग

नोट:: MATLAB का उपयोग कर निम्न चरणों को निष्पादित किए गए थे।

  1. सापेक्ष ऊँचाई भिन्नताएँ दिखाने वाले कक्षों की छवियों को प्राप्त करने के लिए क्षेत्र-आधारित विधि का उपयोग करें. प्रत्येक subimage के लिए 'imshow()' फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रत्येक substep के लिए छवि outputs. प्रतिलिपि बनाएँ और बिन में विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइल चिपकाएँ और निम्न आदेश में फ़ाइल का नाम दर्ज करें। प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए चलाएँ दबाएँ.
    'imread('filename.tiff')'
    1. पृष्ठभूमि से अग्रभूमि को बढ़ाने के लिए स्रोत कार्यों10 का उपयोग करके 'पुनर्निर्माण द्वारा समापन' के बाद 'पुनर्निर्माण द्वारा खोलने' द्वारा छवियों का विश्लेषण करें। पुनर्निर्माण द्वारा खोलने के लिए पहले कमांड का उपयोग करें और पुनर्निर्माण द्वारा बंद करने के लिए दूसरे और तीसरे अनुक्रमों का उपयोग करें।
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. RAW264.7 और NIH/3T3 कोशिकाओं वाले cocultures का विश्लेषण दो चयनात्मक binarizations का उपयोग करके, दो सेल प्रकारों के बीच ऊंचाई अंतर का शोषण करके प्राप्त किया जाता है।
    1. प्रयोगात्मक रूप से RAW264.7 और NIH/3T3 कोशिकाओं की छवियों का उपयोग करके एक पैरामीटर 'phi' निर्धारित करें, जिसमें phi दो सेल प्रकारों के बीच आनुपातिक ऊंचाई अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। एक प्रारंभिक phi मान लगता है और जब तक सेल गिनती और कवरेज मैन्युअल गिनती, RAW264.7 और NIH / 3T3 coculture के लिए विशिष्ट के साथ बारीकी से मेल खाने पुनरावृत्ति.
      नोट: इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले phi के लिए मान 3.2 पाया गया था। Phi का उपयोग चुनिंदा रूप से एक छवि को फ़िल्टर करने के लिए किया जाता है ताकि केवल RAW264.7 कोशिकाओं को शामिल किया जा सके, जैसा कि चित्र 4C में देखा गया है।
    2. MONOCULTURE छवियों के लिए के रूप में एक समान फैशन में RAW264.7 सेल गिनती और कुल सेल कवरेज निर्धारित करें।
  3. पीएचआई पैरामीटर के बिना वाटरशेड-रूपांतरित छवि का फिर से विश्लेषण करें, मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट दोनों का पता लगाएं। NIH/3T3 fibroblast डेटा चुनिंदा रूप से RAW264.7 सेल पिक्सेल घटाकर प्राप्त करें, जो चरण 2 में वर्णित मानक थ्रेशोल्डिंग और क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया गया है।
    1. एक बार जब पूरी छवि का विश्लेषण किया जाता है, तो RAW264.7 पिक्सेल की संख्या से सेल पिक्सेल की कुल संख्या घटाकर NIH/3T3 पिक्सेल की कुल संख्या निर्धारित करें। छवि पिक्सेल की कुल संख्या से प्रत्येक कक्ष रेखा के लिए कक्ष पिक्सेल की संख्या से विभाजित करके NIH/3T3 और RAW264.7 कक्षों के कवरेज की गणना करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

गैर-बल्बस RAW264.7 मैक्रोफेज का विश्लेषण 25,000 कोशिकाओं / सेमी2 पर एक मोनोकल्चर सेटिंग में आयोजित किया गया था। प्रतिनिधि छवियों को सेल संस्कृति से लिया गया था और इमेजजे में 8-बिट टिफ में रूपांतरण के बाद MATLAB में संसाधित किया गया था। पूरी प्रक्रिया के दौरान एल्गोरिथ्म आउटपुट रिकॉर्ड किए गए थे और प्रतिनिधि छवि के लिए चित्र 2 में प्रलेखित किए गए थे। इस छवि में, एल्गोरिथ्म ने 226 कोशिकाओं की गणना की, और इस छवि की गणना को एक मैनुअल गणना के साथ तुलना करके सत्यापित किया गया था जिसने 241 कोशिकाओं (6.2% त्रुटि) की पहचान की थी। RAW264.7 सेल गिनती की कम से कम 10 छवियों के लिए एल्गोरिथ्म आउटपुट में 4.5 ± 1.9% की औसत त्रुटि थी।

बल्बस RAW264.7 मैक्रोफेज का विश्लेषण एक पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म का उपयोग करके किया गया था। अधिकांश छवियों में, देखा गया बल्बस प्रभाव मुख्य रूप से एक फोकल प्लेन पर ध्यान केंद्रित करने का एक परिणाम था जो सब्सट्रेट के फोकल प्लेन से थोड़ा ऊपर था, जिसके लिए कोशिकाएं अनुयायी थीं। तदनुसार, अधिकांश छवियों को गैर-बल्बस रूप में अधिग्रहित किया गया था, जिसके लिए विश्लेषण काफी आसान था। बल्बस छवियों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक एल्गोरिथ्म को उन परिदृश्यों के लिए विकसित किया गया था जिनमें मेनिस्कस प्रभाव या अन्य ऑप्टिकल हस्तक्षेप के कारण सबऑप्टिमल से बचना असंभव था। पूरी प्रक्रिया में विशिष्ट एल्गोरिथ्म आउटपुट को रिकॉर्ड किया गया था और चित्र 3 में प्रलेखित किया गया था। इस प्रतिनिधि छवि विश्लेषण में, एल्गोरिथ्म ने छवि के भीतर 221 कोशिकाओं की गणना की, जिसे 252 कोशिकाओं (12.3% त्रुटि) की मैन्युअल गिनती के साथ सत्यापित किया गया था।

RAW264.7 मैक्रोफेज और एनआईएच / 3T3 फाइब्रोब्लास्ट दोनों वाले सहसंस्कृतियों का विश्लेषण एक ही छवि के भीतर दो अलग-अलग सेल प्रकारों के बीच अंतर करने की क्षमता निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया था। एनआईएच / 3टी 3 फाइब्रोब्लास्ट्स के अत्यधिक परिवर्तनीय सेल आकारिकी के कारण, मैनुअल / स्वचालित सेल की गिनती सटीक रूप से प्राप्त नहीं की जा सकी, और फाइब्रोब्लास्ट के लिए सेल कवरेज की तुलना गुणात्मक रूप से मूल छवि से की गई। पूरी प्रक्रिया के दौरान प्रतिनिधि एल्गोरिथ्म आउटपुट को रिकॉर्ड किया गया था और चित्र 4 में प्रलेखित किया गया था। इस छवि के लिए, RAW264.7 मैक्रोफेज गिनती 137 थी, और इस गिनती को 155 (11.6% त्रुटि) की मैन्युअल गिनती के साथ सत्यापित किया गया था। कम से कम 10 RAW264.7 मैक्रोफेज गिनती के लिए एल्गोरिथ्म आउटपुट में 7.8 ± 3.9% त्रुटि का औसत था।

सेल गिनती एल्गोरिथ्म की मजबूती को मैन्युअल उपयोगकर्ता गणना के साथ स्वचालित सेल पहचान की तुलना करने के लिए एक अंधे अध्ययन का उपयोग करके भी सत्यापित किया गया था। पांच छवियों को यादृच्छिक रूप से चुना गया था, अलग-अलग सेल घनत्व के साथ, और इन छवियों को तीन अलग-अलग उपयोगकर्ताओं द्वारा आंख मूंदकर गिना गया था। मैनुअल गिनती की तुलना एक दूसरे के साथ और स्वचालित सेल गिनती एल्गोरिथ्म के परिणामों के साथ की गई थी। मैन्युअल और स्वचालित गणना परिणामों की तुलना तालिका 1 में दिखाई गई है। इसके अलावा, इस विधि की विभाजन सटीकता का परीक्षण पारंपरिक विभाजन तकनीकों का उपयोग करके व्युत्पन्न 'ग्राउंड ट्रुथ' छवियों का उपयोग करके किया गया था। DICE गुणांक20,21 का उपयोग पांच छवियों में 0.85 के औसत पैरामीटर के साथ एक प्रदर्शन मीट्रिक के रूप में किया गया था। एक उदाहरण ओवरले को चित्र 5 में देखा जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: सामान्यीकृत क्षेत्र-आधारित एल्गोरिथ्म। एक प्रक्रिया जिसमें क्षेत्रीय मैक्सिमा औरमिनीमा 10 को निर्धारित करने के लिए वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म के माध्यम से विभाजन विश्लेषण के लिए एक छवि तैयार की जाती है। यह प्रस्तावित विधि वाटरशेड रिज लाइन निर्धारण को छोड़कर प्रक्रिया (काले रंग में मूल प्रक्रिया) को संशोधित करती है और एक क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण प्रक्रिया (लाल रंग में हाइलाइट की गई) के साथ युग्मित एक प्रतिशत-आधारित प्रणाली को अपनाने के लिए बाद के चरणों को छोड़ती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रॉ 264.7 गैर बल्बस एल्गोरिथ्म आउटपुट. आंकड़ा मध्यवर्ती छवि प्रसंस्करण कदम गैर-bulbous RAW264.7 मैक्रोफेज गिनती के परिमाणीकरण के लिए अग्रणी से पता चलता है. (ए) छविजे में ग्रेस्केल के लिए छवि का प्रारंभिक प्रसंस्करण। मूल छवि ImageJ में 8-बिट टिफ और ग्रेस्केल में कनवर्ट की गई है। (बी) ग्रेस्केल छवि का पोस्टप्रोसेसिंग। चरण 2.1.1 में वर्णित के रूप में पुनर्निर्माण द्वारा खोलने और बंद होने के बाद A की पोस्टप्रोसेसिंग छवि। (c) संसाधित छवि का पोस्टबाइनराइजेशन। पैनल बी पोस्ट binarization, चरण 2.2 में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया। (डी) औसत क्षेत्र गणना के लिए प्रतिनिधि कोशिकाओं के साथ अंतिम छवि। नीले हलकों के साथ छवि एक सेल के औसत क्षेत्र की पहचान करने के लिए हॉफ-ट्रांसफॉर्म के भीतर उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं को इंगित करती है, जैसा कि चरण 2.3 में वर्णित है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: RAW264.7 बल्बस एल्गोरिथ्म आउटपुट. आंकड़ा मध्यवर्ती छवि प्रसंस्करण चरणों को दर्शाता है जो बल्बस RAW264.7 मैक्रोफेज गिनती के परिमाणीकरण के लिए अग्रणी है। (ए) बल्बस RAW264.7 मैक्रोफेज की छवि। मूल छवि ImageJ में 8-बिट टिफ और ग्रेस्केल में कनवर्ट की गई है। (बी) ग्रेस्केल छवि का पोस्टप्रोसेसिंग। चरण 2.1.1 में वर्णित के रूप में पुनर्निर्माण द्वारा खोलने और बंद होने के बाद A की पोस्टप्रोसेसिंग छवि। (सी) स्पष्ट द्वीपों के साथ संसाधित छवि के द्विआधारीकरण के बाद। पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म के बिना विशिष्ट आउटपुट जब बल्बस छवियों का विश्लेषण करते हैं, तो कोशिकाओं के केंद्रों पर काले पिक्सेल के 'द्वीपों' के साथ। नीले वृत्त किसी कक्ष के औसत क्षेत्र की पहचान करने के लिए हॉफ-ट्रांस्फ़ॉर्म के भीतर उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसा कि चरण 2.3 में वर्णित है। (डी) प्रतिनिधि कोशिकाओं के साथ अंतिम छवि, पोस्टऑपरेटिव एल्गोरिथ्म का उपयोग करके भरे गए द्वीप। छवि पोस्ट पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म, जैसा कि चरण 2.2.2 में वर्णित है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: RAW264.7 और NIH/ यह आंकड़ा मध्यवर्ती छवि प्रसंस्करण चरणों को दर्शाता है जो RAW264.7 मैक्रोफेज और NIH/3T3 fibroblasts युक्त coculture छवियों के परिमाणीकरण के लिए अग्रणी है। (ए) एनआईएच / 3 टी 3 और RAW264.7 कोशिकाओं की छवि। मूल छवि ImageJ में 8-बिट टिफ और ग्रेस्केल में कनवर्ट की गई है। (बी) ग्रेस्केल छवि का पोस्टप्रोसेसिंग। पुनर्निर्माण द्वारा खोलने और बंद होने के बाद A की पोस्टप्रोसेसिंग छवि, जैसा कि चरण 3.1.1 में वर्णित है। (ग) ऊंचाई-आधारित अलगाव के आधार पर मैक्रोफेज के स्पष्ट चयन के साथ संसाधित छवि का पोस्टबाइनराइजेशन। RAW264.7 मैक्रोफेज का चयनात्मक अलगाव, जैसा कि चरण 3.2.2 में वर्णित है। (डी) मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट के समूहों के साथ अंतिम छवि की पहचान की गई। RAW264.7 मैक्रोफेज और NIH/3T3 fibroblasts दोनों युक्त पूरी छवि, जैसा कि चरण 3.3 में वर्णित है। एक नमूना मैक्रोफेज सेल को हरे रंग के सर्कल के साथ रेखांकित किया जाता है, और एक नमूना फाइब्रोब्लास्ट सेल को लाल अंडाकार के साथ रेखांकित किया जाता है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: DICE पैरामीटर-विभाजन प्रदर्शन, RAW264.7 मैक्रोफेज. छवि 'जमीनी सच्चाई' विभाजन दृष्टिकोण और इस विधि के बीच एक ओवरले दिखाती है। सफेद क्षेत्र 'जमीनी सच्चाई' और इस विधि दोनों द्वारा पता लगाए गए कोशिकाएं हैं, जबकि बैंगनी और हरे क्षेत्र क्रमशः झूठे नकारात्मक और झूठे सकारात्मक हैं। 'ग्राउंड ट्रुथ' विभाजन सामान्य विभाजन तकनीकों द्वारा प्राप्त किया गया था और गलत विभाजन के लिए सही करने के लिए क्षेत्र-के-ब्याज उपकरणों का उपयोग करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

काउंटर 1 काउंटर 2 काउंटर 3 स्वचालित मैनुअल गिनती औसत (±STDEV) स्वचालित के साथ तुलना में त्रुटि
छवि 1 151 148 145 142 3.0 ± 148 ± 4.22%
छवि 2 164 166 168 173 166 ± 2.0 4.05%
छवि 3 255 253 245 239 251 ± 5.3 5.02%
छवि 4 153 152 157 166 154 ± 2.6 7.22%
छवि 5 103 106 100 111 103 ± 3.0 7.20%

तालिका 1: मैनुअल / स्वचालित सेल गिनती और मजबूती परीक्षण।

पूरक जानकारी: मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट cocultures की छवि विश्लेषण में रूपात्मक अंतर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: "प्रक्रिया.m", एल्गोरिदम को चलाने के लिए आवश्यक MATLAB फ़ाइल। कोई मैन्युअल क्रियाओं की आवश्यकता नहीं है, लेकिन एक अलग फ़ाइल में एल्गोरिथ्म शामिल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: "monoculture.m", MATLAB फ़ाइल monoculture छवियों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: "coculture_modified.m", MATLAB फ़ाइल coculture छवियों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमने एक सामान्य क्षेत्र-आधारित प्रक्रिया तैयार की है जो सेल की ऊंचाई के आधार पर कोशिकाओं को सटीक और कुशलतासे गिनती करती है, जिससे कोकल्चर सिस्टम में भी कोशिकाओं की दाग-मुक्त मात्रा की अनुमति मिलती है। इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण चरणों में एक सापेक्ष तीव्रता प्रणाली का कार्यान्वयन शामिल था जिसके द्वारा कोशिकाओं को विभेदित किया जा सकता था। एक सापेक्ष ऊंचाई विश्लेषण के उपयोग ने दो उद्देश्यों की सेवा की: बाहरी मापदंडों की आवश्यकता अनावश्यक प्रदान की गई थी, क्योंकि दिए गए सेल प्रकार और पैरामीटर के लिए सापेक्ष पैरामीटर स्थिर थे, और प्रत्येक छवि के लिए पूर्ण चमक / विपरीत स्तरों को दर्ज करने की आवश्यकता नहीं थी। इसके अलावा, एक प्रतिशत-आधारित प्रणाली के उपयोग ने एक ही छवि के भीतर कई सेल प्रकारों के विश्लेषण को सक्षम किया, बशर्ते कि विभिन्न सेल प्रकार छवि के भीतर अद्वितीय ऊंचाइयों पर रहते थे।

प्रतिशत-आधारित प्रणाली को औसत के विपरीत अधिकतम पिक्सेल मान से अंतर के रूप में परिभाषित किया गया था। यह औसत तीव्रता मूल्य के आधार पर एल्गोरिथ्म के तिरछेपन को रोकने के लिए किया गया था, जो छवि में मौजूद कोशिकाओं की संख्या और संगम पर निर्भर था। इसके अलावा, 'अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल' को अधिकतम तीव्रता वाले आउटलेटर्स को डेटा-अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल को प्रभावित करने से रोकने के लिए लागू किया गया था, जिसे जनसंख्या के कम से कम 0.5% का प्रतिनिधित्व करने की आवश्यकता होगी- एक प्रयोगात्मक मूल्य। अतिरिक्त चरणों में व्यक्तिगत संस्थाओं की गिनती के बजाय एक क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण प्रणाली का उपयोग शामिल था। इसने यह सुनिश्चित किया कि कोशिकाओं की गिनती करते समय सेल विखंडन या गलत बीनाराइजेशन को कम से कम किया जाएगा, क्योंकि कुल प्रभावित क्षेत्र सेल के क्षेत्र की तुलना में न्यूनतम था।

इस एल्गोरिथ्म के भीतर विभिन्न समस्या निवारण विधियों को लागू किया गया था। सेल मोनोकल्चर की छवियों को मापने के प्रारंभिक प्रयासों के लिए बल्बस और गैर-बल्बस कोशिकाओं दोनों की सटीक पहचान करने के तरीकों की आवश्यकता होती है। बल्बस सेल छवियों के लिए एक अनूठी घटना देखी गई थी, जिसमें कोशिकाओं के केंद्रों को वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म के बाद पृष्ठभूमि के रूप में पहचाना गया था, और ये क्षेत्र सेल के भीतर द्वीपों के रूप में दिखाई दिए। एक गहन विश्लेषण से पता चला कि सेल केंद्रों की कमी छवि के भीतर अत्यधिक उत्तल संरचना के कारण हो रही थी, जिसके परिणामस्वरूप वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म में एक व्युत्क्रम था। बल्बस छवियों के लिए विशेष रूप से एक समाधान लागू किया गया था, जिसमें प्लगिंग के रूप में जानी जाने वाली एक पुनरावर्ती प्रक्रिया शामिल थी, जिसमें द्वीपों को सच्चे सेल मूल्यों के रूप में भरा गया था। यह एक ऐसी प्रक्रिया द्वारा कार्य करता है जिसमें सेल कवरेज और द्वीप गठन की सीमा का उपयोग छवि की सटीकता निर्धारित करने के लिए किया गया था। आम तौर पर, सेल कवरेज का उपयोग द्वीप गठन की सीमा को निर्धारित करने के लिए किया जाता था, क्योंकि असामान्य रूप से कम सेल कवरेज आमतौर पर द्वीप गठन के उच्च स्तर के कारण होता था। सेल कवरेज और द्वीप गठन की सीमा के बीच संबंध प्रयोगात्मक डेटा के माध्यम से निर्धारित किया गया था।

अतिरिक्त समस्या निवारण इस अवलोकन के आधार पर आवश्यक था कि अधिकतम पिक्सेल के बजाय कोशिकाओं को अलग करने के लिए 'औसत पिक्सेल' थ्रेशोल्ड (छवि के भीतर औसत औसत पिक्सेल तीव्रता के रूप में परिभाषित) का उपयोग करके, विसंगतियों का कारण बना। छवि की औसत तीव्रता को छवि में कोशिकाओं की संख्या के एक समारोह के रूप में बढ़ने के लिए पाया गया था, जो छवि के भीतर कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर परिणामों को तिरछा कर सकता था। एल्गोरिथ्म का एक वैकल्पिक पुनरावृत्ति एक अधिकतम तीव्रता बेंचमार्क को नियोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था; हालांकि, यह मान भी असंगत था, क्योंकि उच्च-तीव्रता वाले आउटलेटर्स ने डेटा को काफी तिरछा कर दिया और अविश्वसनीय परिणामों का नेतृत्व किया। आखिरकार, अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल का उपयोग अपनाया गया था। अधिकतम प्रासंगिक पिक्सेल को उच्च तीव्रता वाले आउटलायर्स के लिए सटीक रूप से खाते में पाया गया था, जिससे मोनोकल्चर और कोकल्चर छवियों को अलग करते समय सबसे सुसंगत परिणाम मिलते हैं।

एल्गोरिथ्म की कई सीमाओं की पहचान की गई थी जब विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की चुनिंदा पहचान करने के लिए प्रतिशत-आधारित प्रणाली का उपयोग करके कोकल्चर छवियों का विश्लेषण किया गया था। कभी-कभी, एनआईएच / 3 टी 3 कोशिकाएं एक बहुस्तरीय समुच्चय में रॉ 264.7 कोशिकाओं के साथ लगातार दिखाई देंगी, जिसने छवि को विश्लेषण करना बेहद मुश्किल बना दिया। यद्यपि यह ज्यादातर coculture छवियों के लिए मनाया गया था, असामान्य संस्कृति की स्थिति या उच्च संगम स्तर के साथ कोशिकाओं की monoculture छवियों के परिणामस्वरूप मल्टीलेयर सेल समुच्चय भी हो सकता है। जबकि एल्गोरिथ्म पृष्ठभूमि से अद्वितीय के रूप में बहुस्तरीय समुच्चय का सफलतापूर्वक पता लगा सकता है, सेल मल्टीलेयर्स पर इस 2 डी छवि विश्लेषण का उपयोग करके सटीक सेल परिमाणीकरण प्राप्त करना संभव नहीं था। इसके अलावा, छवि के भीतर सेल मलबे एल्गोरिथ्म सटीकता को बाधित कर सकते हैं। एक क्षेत्र-आधारित विश्लेषण एल्गोरिथ्म का उपयोग गलत पहचान से जुड़ी त्रुटि को कम करने के लिए कार्य करता है, क्योंकि सेल मलबे के छोटे क्षेत्र विभाजन की तुलना में क्षेत्र-आधारित विश्लेषण का उपयोग करके सेल की गिनती को कम प्रभावित करेंगे।

इसके अतिरिक्त, 8-बिट TIFF के लिए czi छवियों का रूपांतरण, सादगी और एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया, जिसके परिणामस्वरूप पिक्सेल प्रकार के uint8, 0 से 255 तक पूरी संख्याओं का एक संग्रह हुआ। इस प्रकार, अंतर को केवल 1/256 या 0.39% की अधिकतम सटीकता पर परिमाणित किया जा सकता है। आम तौर पर, पिक्सेल केवल 210 और 250 पिक्सेल के बीच कवर किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 2.5% की यथार्थवादी परिशुद्धता होती है। यद्यपि यह मोनोकल्चर विश्लेषण के लिए पर्याप्त पाया गया था जिसमें कोशिकाएं पृष्ठभूमि से बेहद अलग हैं, कोकल्चर विश्लेषण के भीतर चयनात्मक घटाव चरण को बहुत अधिक सटीकता की आवश्यकता होती है। हालांकि यथोचित सटीक डेटा अभी भी coculture छवियों से प्राप्त किया जा सकता है, coculture विश्लेषण की समग्र सटीकता monoculture छवियों से विश्लेषण की सटीकता की तुलना में कम हो गया था। इसके अलावा, एक क्षेत्र-आधारित पहचान प्रणाली के उपयोग के लिए सेल गिनती प्राप्त करने के लिए एक औसत सेल क्षेत्र की आवश्यकता होती है। शोर छवियों के साथ या समान ज्यामिति की कोशिकाओं के साथ काम करते समय यह पैरामीटर उपयोगी है, लेकिन क्षेत्र-चर कोशिकाओं के लिए परिमाणीकरण में बाधा डालेगा।

मौजूदा तरीकों के विपरीत इस एल्गोरिथ्म का महत्व विकसित तरीकों के उपयोग के भीतर निहित है जैसे कि वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म और रूपात्मक छवि संचालन प्रतिदीप्ति धुंधला प्रक्रियाओं के बिना मोनो- और सहसंस्कृत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए। हालांकि कई पूर्व अध्ययनों ने धुंधला होने की अनुपस्थिति में कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अलग करने और गिनने के तरीकों की सूचना दी है, इन वैकल्पिक दृष्टिकोणों को अक्सर जटिल संस्कृति दृष्टिकोण या दुर्गम सॉफ़्टवेयर16 की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, Yilmaz और सहकर्मियों ने माइक्रोपैड15 पर इम्यूनोमैग्नेटिक मोतियों के साथ बायोचिप्स के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मापने के लिए स्वचालित गिनती विश्लेषण तकनीकों का उपयोग किया।

हमने गैर-यादृच्छिक शोर पैटर्न को संबोधित करने के लिए नए और प्रभावशाली दृष्टिकोण भी डिज़ाइन किए हैं, जैसे कि 'द्वीप', जो कोशिकाओं के केंद्रों में दिखाई देते हैं। विभिन्न सेल लाइनों की पहचान कोशिकाओं के अलग-अलग 'ऊंचाई' मूल्यों का उपयोग करके भी संभव थी, जिसे तीव्रता पिक्सेल से पहचाना जा सकता था। निरपेक्ष मापदंडों के बजाय सापेक्ष मापदंडों के उपयोग ने एल्गोरिथ्म के स्वचालन को सक्षम करने और छवियों के अधिग्रहण के लिए अधिक लचीलापन प्रदान करके कई फायदे प्रदान किए, क्योंकि सटीक चमक, इसके विपरीत, या रंग सेटिंग्स को संरक्षित करने की आवश्यकता नहीं थी। क्षेत्र-आधारित पहचान ने सटीक परिणाम प्रदान किए, तब भी जब कोशिकाओं को क्लस्टर किया गया था, जैसा कि कई सेल प्रकारों के साथ आम है। इसके विपरीत, मैन्युअल गिनती और विभाजन मुश्किल, त्रुटि-प्रवण हैं, और कोशिकाओं को सटीक और कुशलता से पहचानने के लिए एक प्रशिक्षित उपयोगकर्ता की आवश्यकता हो सकती है।

भविष्य के अनुप्रयोगों और एल्गोरिथ्म के विकास ठीक ट्यूनिंग और सेल-गिनती प्रक्रिया के आगे अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित करेंगे। इसके अलावा, सापेक्ष तीव्रता द्वारा विभिन्न सेल प्रकारों को अलग करने के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों के उपयोग को आगे के सहसंस्कृतियों के परीक्षण द्वारा सत्यापित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, न्यूरोटॉक्सिसिटी विश्लेषण17 के लिए न्यूरॉन्स / एस्ट्रोसाइट्स की पहचान। घाव भरने के क्षेत्र में आगे के अनुप्रयोग किए जा सकते हैं, जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिनिधि अनुपात भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ प्रक्रियाओं में एक प्रमुख भूमिका निभा सकते हैं। मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट्स के सेल परिमाणीकरण में सुधार विदेशी शरीर प्रतिक्रिया परिणामों के मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक पैराक्राइन बनाम जुक्स्ट्राक्राइन सेल सिग्नलिंग प्रभावों में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकताहै 18,19। पूरक जानकारी में, हम कोकल्चर सिस्टम के भीतर सेल पहचान की सटीकता में सहायता करने के लिए एल्गोरिथ्म में मॉर्फोमेट्रिक मापदंडों को शामिल करने के संभावित तंत्र का पता लगाते हैं।

एक्सटेंशन को अधिक जटिल सहसंस्कृतियों के लिए भी बनाया जा सकता है, जो छवियों के भीतर 3 या अधिक अलग-अलग सेल प्रकारों पर ध्यान केंद्रित करेगा, जैसा कि केवल बाइनरी मिश्रण के विपरीत है। 8-बिट छवियों के लिए उपलब्ध सीमित परिशुद्धता के कारण, 16-बिट छवियों की आवश्यकता हो सकती है, जो अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं लेकिन अधिक गतिशील तीव्रता श्रेणियों और वितरण के कारण विश्लेषण को काफी जटिल कर सकते हैं। इस अध्ययन का लक्ष्य स्वचालित सेल-गिनती के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल विकसित करना था जो विविध सेल संस्कृति वातावरण के लिए अनुकूलित है। एल्गोरिथ्म बल्बस सेल छवि अधिग्रहण में भी सटीक सेल गिनती के लिए अनुमति देता है। इसका आत्म-सही पुनरावर्ती कोड इम्यूनोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक सेल कल्चर सिस्टम के दाग-मुक्त ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए उपयोगी है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AR067247) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था और डेलावेयर INBRE कार्यक्रम द्वारा भाग में, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और डेलावेयर राज्य से राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान-NIGMS (P20 GM103446) से अनुदान द्वारा समर्थित था। पांडुलिपि की सामग्री आवश्यक रूप से वित्त पोषण एजेंसियों के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope Zeiss 1028290770
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
Cell Scrapers CellTreat 229310
Dublecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 12430047
Dublecco's PBS Fisher Scientific 14190144
MATLAB Software MathWorks 2021A
NIH/3T3 Cells ATCC ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin Sigma Aldrich P4333-20ML
RAW264.7 Cells ATCC ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S6014-25G
T75 Cell Culture Flask Corning CLS3814-24EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
  2. Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
  3. Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
  4. Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
  5. Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
  6. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
  7. Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
  8. Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
  9. Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
  10. Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
  11. Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
  12. Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
  13. Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
  14. Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
  15. Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
  16. Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
  17. Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
  18. Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
  19. Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
  20. Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
  21. Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).

Tags

Bioengineering अंक 180
मैक्रोफेज-फाइब्रोब्लास्ट Cocultures के परिमाणीकरण के लिए क्षेत्र-आधारित छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borjigin, T., Boddupalli, A.,… More

Borjigin, T., Boddupalli, A., Sullivan, M. O. Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures. J. Vis. Exp. (180), e63058, doi:10.3791/63058 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter