Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Abstract

IL-9 is een pleiotroop cytokine geassocieerd met verschillende processen, waaronder antitumorimmuniteit, inductie van allergische pathologieën en de immuunrespons tegen worminfecties, waar het een belangrijke rol speelt bij de uitdrijving van de parasiet. In een muizenmodel van Nippostrongylus brasiliensis-infectie wordt IL-9 voornamelijk geproduceerd door CD4 + T-lymfocyten en aangeboren lymfoïde cellen in de longen, dunne darm en drainerende lymfeklieren. Gezien de technische problemen die gepaard gaan met de intracellulaire kleuring van IL-9, evenals de complexiteit van het isoleren van hematopoëtische cellen uit de dunne darm bij infectie, is er een dringende behoefte aan een uitgebreid maar eenvoudig protocol om de expressie van IL-9 in verschillende lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels in dit model te analyseren. Het hier beschreven protocol schetst de kinetiek van IL-9 geproduceerd door CD4 + T-cellen en aangeboren lymfoïde cellen in de longen en dunne darm, de belangrijkste organen die het doelwit zijn van N. brasiliensis, evenals in de mediastinale en mesenteriale lymfeklieren, gedurende de infectie. Bovendien beschrijft het het aantal larven dat nodig is voor infectie, afhankelijk van het celtype en het orgaan van belang. Dit protocol is bedoeld om te helpen bij de standaardisatie van testen om tijd en middelen te besparen door de mogelijkheid te bieden om zich te concentreren op de specifieke cellen, organen en ziektestadia van belang in het N. brasiliensis-infectiemodel.

Introduction

Haakwormen zijn darmparasieten die wereldwijd ongeveer 700 miljoen mensen infecteren, meestal in tropische gebieden in onderontwikkelde landen. Infecties met hoge intensiteit met Ancylostoma duodenale en Necator americanus, de meest voorkomende haakwormparasieten bij de mens, veroorzaken bloedarmoede en eiwittekort dat kan leiden tot vertraagde groei en mentale ontwikkeling1. N. americanus en de knaagdierparasiet Nippostrongylus brasiliensis induceren een prototypische type 2 immuunrespons in hun gastheer en delen overeenkomsten in hun levenscyclus. Vandaar dat de infectie van muizen met N. brasiliensis het meest gebruikte model is voor menselijke haakworminfecties. Stadium 3 (L3) N. brasiliensis infectieuze larven verplaatsen zich van de huid naar de longen in de eerste paar uur na infectie. Eenmaal in de long worden ze L4 en migreren ze de luchtpijp op om te worden ingeslikt, door de maag te gaan en de darm te bereiken om binnen 4-5 dagen volwassenen (L5) te worden. In de darm leggen L5-wormen eieren die worden uitgescheiden in de ontlasting om de levenscyclus van de parasiet opnieuw op te starten2.

De immuunrespons geïnduceerd door N. brasiliensis wordt gekenmerkt door een toename van verschillende type 2 cytokines, waaronder IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 en IL-13, samen met eosinofilie, basofilie, bokaal- en mestcelhyperplasie en verhoogde IgG1- en IgE-productie. De meeste studies die proberen de immuunresponsen te identificeren en te definiëren die worden opgewekt bij N. brasiliensis-infectie zijn gericht op de rol van IL-4 of IL-13 in dit model3. De identificatie en karakterisering van IL-9-tot expressie brengende cellen en de functie van dit cytokine waren echter grotendeels over het hoofd gezien, totdat Licona-Limón et al. de eerste studie publiceerden die een cruciale rol voor IL-9 in de immuunrespons tegen N. brasiliensis aantoonde. Met behulp van reportermuizen beschreef deze studie T-cellen (meestal T-helper 9) en type 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's) als de belangrijkste cellulaire subsets die IL-9 tot expressie brengen bij infectie4.

Isolatie en karakterisering van immuuncellen uit met worm geïnfecteerde longen is haalbaar en is uitgebreid gerapporteerd 3,4. Vanwege de inherente weefselremodellering en slijmproductie bleek het echter een technische uitdaging om dit in de geïnfecteerde darm te doen, tot de recente publicatie van Ferrer-Font et al.5. De groep schetste een protocol voor het isoleren en analyseren van eencellige suspensies van immuunsubsets van Heligmosomoides polygyrus-geïnfecteerde muizendarmen. Op basis hiervan hebben we nu een protocol gestandaardiseerd voor isolatie en cytometrische analyse van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen uit de met N. brasiliensis geïnfecteerde darm. Daarnaast hebben we IL-9-kinetiek vastgesteld uit verschillende cellulaire bronnen en anatomische locaties gedurende de infectie.

Het karakteriseren van de verschillende celpopulaties die betrokken zijn bij deze infectie is van vitaal belang voor een breder begrip van de immuunrespons op de parasiet en de interactie met de gastheer. Dit uitgebreide protocol biedt een duidelijke route om IL-9-producerende cellen te isoleren en te analyseren van gewenste organen in ziektestadia van belang, waardoor de kennis over de rol van deze cellen bij N. brasiliensis-infectie en parasietinfecties in het algemeen sterk kan worden verbeterd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Intern Comité voor Dierbehandeling (CICUAL) van het Instituut voor Cellulaire Fysiologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico.

OPMERKING: Een stroomdiagram van het gehele protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Huisvesting van muizen

  1. Gebruik 8-10 weken oude, vrouwelijke of mannelijke groepen muizen, gehuisvest in dierenfaciliteiten met constante temperatuur en vochtigheid in 12 uur licht / donker cycli, met ad libitum toegang tot water en voedsel.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een IL-9 reporter muizenstam in C57BL/6 achtergrond, zoals eerder beschreven4; andere IL-9-reporterstammen konden echter 6,7,8 worden gebruikt, evenals intracellulaire IL-9-kleuring, met variabele resultaten9.

2. Infectie van muizen

  1. Scheer de achterkant van de muizen van het midden van het lichaam tot in de buurt van de basis van de staart 1 dag voorafgaand aan infectie. Het gebruik van anesthetica is niet essentieel.
  2. Onderhuids elke muis inenten met 200 levensvatbare N. brasiliensis-larven in het derde stadium (L3) in 100 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)10 in de onderrug, zoals eerder beschreven 2,11, of injecteer 100 μL PBS alleen als controle. Offer de dieren op dag 4, dag 7 of dag 10 na de infectie.

3. Isolatie van long-, dunne darm-, mediastinale en mesenteriale lymfeklieren

  1. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Plaats de muis op zijn rug en spuit hem in met 70% ethanol. Maak een middellijnincisie met een schaar en open de huid om de buik- en thoracale gebieden bloot te leggen.
    OPMERKING: Isofluraan kan worden gebruikt als alternatieve euthanasiemethode12. Kooldioxidekamers worden niet aanbevolen, omdat CO2 leidt tot schade aan longweefsel en bloeding13.
  2. Isolatie van mediastinale lymfeklieren en longen
    1. Maak een incisie in het borstbeen en snijd in een "V" -vorm om de ribben en thoracale spieren te verwijderen. Zodra de thoracale holte is blootgesteld, lokaliseert u de mediastinale lymfeklieren naast de slokdarm, onder het hart (zie aanvullende figuur 1).
    2. Extraheer de mediastinale lymfeklieren en verzamel ze in 1 ml R-10 medium (tabel 1) in een 12-well kweekplaat. Bewaren op ijs, beschermd tegen licht tot verwerking.
      OPMERKING: De monsters moeten worden beschermd tegen licht, om te voorkomen dat het fluorescerende signaal van de reportermuizen die in deze experimenten worden gebruikt, afneemt.
    3. Extraheer de longen en verzamel ze in 1 ml R-10 medium in een 12-well kweekplaat per muis. Bewaren op ijs, beschermd tegen licht tot verwerking.
  3. Isolatie van mesenteriale lymfeklierketens en dunne darm
    1. Stel de peritoneale holte bloot en beweeg de dunne darm voorzichtig naar rechts om de mesenteriale lymfeklierketen (MLN) langs de dikke darm bloot te leggen.
    2. Verwijder met een tang de MLN, rol het voorzichtig op een papieren handdoek en trek het vet eraf.
    3. Breng de MLN over op 1 ml R-10 medium in een 12-well kweekplaat. Bewaren op ijs, beschermd tegen licht tot verwerking.
    4. Snijd de dunne darm net onder de pylorische sluitspier en boven de blindedarm. Trek de darm langzaam naar buiten met behulp van een tang en verwijder het aangehechte mesenterium en vetweefsel.
    5. Leg de dunne darm op een papieren handdoek en bevochtig deze royaal met PBS. Verwijder de Peyer's patches van de dunne darm met een schaar.
      OPMERKING: Om de levensvatbaarheid te behouden, verwijdert u het resterende vetweefsel en houdt u de dunne darm vochtig met PBS tijdens het hele proces.
    6. Knip de dunne darm in de lengterichting af met een schaar en schuif de tang voorzichtig over de open darm om de fecale inhoud en het slijm te verwijderen.
    7. Houd de dunne darm vast met een tang en was deze in 5 ml PBS op ijs door deze een paar keer voorzichtig onder te dompelen. Herhaal dit twee keer.
    8. Snijd de dunne darm in korte stukjes (ongeveer 5 mm) en verzamel ze in een conische buis van 50 ml met 10 ml HBSS14 met 2% FBS (tabel 1). Ga onmiddellijk door met het isoleren van intra-epitheliale en lamina propria-cellen.

4. Bereiding van eencellige suspensies uit de dunne darm, longen en lymfeklieren

OPMERKING: Het is uiterst belangrijk om maximaal zes muizen per persoon te verwerken bij het bereiden van eencellige suspensies uit de dunne darm, omdat de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk afneemt met langere verwerkingsperioden. Deze methode is overgenomen van de Heligmosomoides polygyrus infectie muismodel 5.

  1. Verwarm de schudincubator, R-20 medium, HBSS en HBSS-2 mM EDTA (tabel 1) voor op 37 °C.
  2. Bereid 10 ml dunne darm digestiemedium (tabel 1) per monster.
  3. Schud de darmstukken uit stap 3.3.8 krachtig met de hand.
  4. Filtreer elk monster door een nylon gaas (ongeveer 10 cm x 10 cm) over een glazen trechter. Was het monster door 10 ml voorverwarmd HBSS over het gaas toe te voegen en gooi de doorstroom weg. Herhaal dit nog een keer.
    OPMERKING: Gebruik een nieuw gaas voor elk monster en hergebruik dit gedurende de hele procedure.
  5. Verwijder het gaas uit de trechter en verzamel het monster uit het gaas in een conische buis van 50 ml met 10 ml warme HBSS-2 mM EDTA (stap 4.1). Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C, met schudden bij 200 tpm.
  6. Vortex gedurende 10 s bij maximale snelheid (3.200 tpm) en filter het monster met het gaas over een glazen trechter, waarbij de doorstroming wordt teruggewonnen in een conische buis van 50 ml.
  7. Herhaal stap 4.5 en 4.6 tweemaal en herstel de doorstroming in dezelfde conische buis van 50 ml. De intra-epitheliale cellen bevinden zich in deze fractie van 30 ml. Bewaar het resterende weefsel.
  8. Eencellig suspensiepreparaat uit intra-epitheliale cellen
    1. Centrifugeer de 30 ml celsuspensie, teruggewonnen in stap 4.7, bij 450 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant weg.
    2. Voeg 5 ml PBS toe en centrifugeer op 450 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg.
    3. Resuspendie van de celkorrel in 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase (tabel 1). Op ijs houden, beschermd tegen licht tot celkleuring.
  9. Eencellig suspensiepreparaat uit lamina propria-cellen
    1. Was het resterende dunne darmweefsel uit stap 4.7 door meer dan 10 ml warm HBSS door het gaas over de trechter te gieten. Herhaal de wasbeurt. Verzamel het weefsel uit het gaas in een conische buis van 50 ml met 10 ml spijsverteringsmedium voor de dunne darm.
    2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, met schudden bij 200 tpm. Vortex op maximale snelheid gedurende 10 s om de 5 min.
    3. Voeg 10 ml FACS-EDTA-buffer (tabel 1) toe om de verteringsreactie te stoppen en plaats deze op ijs.
    4. Filtreer elk monster door een celzeef van 100 μm met behulp van een serologische pipet en herstel de suspensie in een conische buis van 50 ml die op ijs is geplaatst.
    5. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
    6. Gooi het supernatant weg. Was de celpellet met 5 ml PBS en centrifugeer gedurende 6 minuten op 600 x g bij 4 °C.
    7. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Op ijs houden, beschermd tegen licht tot celkleuring.
  10. Eencellige suspensievoorbereiding uit de longen
    OPMERKING: Elke long en dunne darm moeten parallel worden verwerkt door twee mensen om langere behandelingstijden te voorkomen, wat resulteert in een lage levensvatbaarheid van de cellen.
    1. Bereid 4 ml longverteringsmedium (tabel 1) per verwerkt monster.
    2. Verwijder het RPMI-medium uit de put met de longen uit stap 3.2.3. Knip de long in kleine stukjes met een fijne schaar.
    3. Breng de longstukken over in een conische buis van 15 ml met een spatel. Voeg 4 ml longverteringsmedium toe (tabel 1).
    4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, met schudden bij 250 tpm. Als u klaar bent, blijft u op ijs totdat elk monster is verwerkt.
    5. Filter elk monster door een celzeef van 100 μm, geplaatst in een enkele put van een kweekplaat met 6 putten. Dissocieer het weefsel met een zuiger van de spuit.
    6. Herstel elk monster terug in een conische buis van 15 ml en voeg 4 ml R-2-medium toe (tabel 1). Blijf op ijs terwijl de andere monsters worden verwerkt.
    7. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml R-5-medium (tabel 1).
    8. Bereid tijdens het centrifugeren 4 ml 27,5% dichtheidsgradiëntoplossing (tabel 1) per monster om de hematopoëtische celfractie15,16 te verrijken. Deze strategie voor eencellige scheiding is efficiënter, kosteneffectiever en minder toxisch in vergelijking met andere media met een vergelijkbare dichtheidsgradiënt17.
    9. Voeg 4 ml 27,5% dichtheidsgradiëntoplossing toe aan de 1 ml celsuspensie uit stap 4.10.7 en schud krachtig.
    10. Voeg langzaam 1 ml R-5 medium (tabel 1) toe aan de gemengde suspensie om twee fasen te creëren.
    11. Centrifugeer op 1.500 x g gedurende 20 minuten bij RT, met lage acceleratie en de rem uit. Observeer de ring gevormd tussen de twee fasen.
    12. Herstel de ring gevormd tussen de twee fasen met een micropipet van 1 ml en resuspensie in 4 ml R-2-medium.
    13. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celkorrel in 1 ml ACK-buffer (tabel 1) en incubeer gedurende 1 minuut bij RT.
    14. Voeg 4 ml R-5 medium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml R-10 medium. Op ijs houden, beschermd tegen licht tot kleuring voor flowcytometrie.
  11. Eencellige suspensievoorbereiding uit lymfeklieren
    1. Plaats de lymfeklieren uit stap 3.2.2 of 3.3.3 tussen twee stukken gaas in een put van een kweekplaat met 6 putten en dissocieer met een zuiger van de spuit.
    2. Recupereer de celsuspensie in een conische buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
    3. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml R-10-medium. Op ijs houden, beschermd tegen licht tot kleuring voor flowcytometrie.
      OPMERKING: Als er klonten zichtbaar zijn, filtert u het monster door een celzeef van 100 μm.

5. Celkleuring voor flowcytometrie (figuur 2 en figuur 3)

OPMERKING: Centrifugeer de lymfekliercelsuspensies van stap 4.11.3 bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspensie van de celpellet in 500 μl FACS-buffer (tabel 1).

  1. Celkleuring voor de identificatie van ILC2's (figuur 3 en aanvullende figuur 2)
    OPMERKING: Deze kleuringsprocedure is specifiek voor de identificatie van IL-9-tot expressie brengende ILC2-cellen.
    1. Plaat 150 μL per longmonster (ongeveer 1,8 x 10 6 cellen) vanaf stap 4.10.14 en 50 μL per lymfekliermonster vanaf stap 4.11.3 (ongeveer 0,7 x 10 6 en 2,2 x 106 cellen voor respectievelijk mediastinale en mesenteriale lymfekliermonsters) in een 96-well conische bodemkweekplaat. Voeg 100 μL FACS-buffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
    2. Plaat 100 μL per dunne darmmonster (ongeveer 2,7 x 10 6 en 0,6 x 106 cellen voor respectievelijk intra-epitheliale en lamina propria-monsters) uit stappen 4.8.3 en 4.9.7 in een 96-well conische bodemkweekplaat. Voeg 150 μL FACS-buffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
    3. Gooi het supernatant weg en resuspensie van elke celkorrel in 50 μl van de gebiotinyleerde antilichaamcocktail (tabel 2) verdund in FACS-buffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Gebruik FACS-buffer met 20 μg/ml DNase voor intra-epitheliale en lamina propria-monsters.
    4. Voeg 150 μL FACS-buffer toe. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celpellet in 200 μL FACS-buffer. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg.
    6. Resuspendeer de celkorrel in 50 μL van de antilichaam/vlekcocktail (tabel 2) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
    7. Voeg 150 μL FACS-buffer toe. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celpellet in 200 μL FACS-buffer. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg. Herhaal de was (stap 5.1.7) en gooi het supernatant weg.
    9. Resuspendie van de celkorrel in 300 μL FACS-buffer en analyseer met flowcytometrie.
    10. Gebruik voor de dunne darm- en longmonsters de gating-strategie: lymfocyten, enkele cellen, levende cellen, hematopoëtische cellen, CD90+Lineage-cellen, ST2+-cellen en IL-9+-cellen (figuur 3A,B en aanvullende figuur 2A). Gebruik voor de lymfekliermonsters de gating-strategie: levende cellen, enkele cellen, CD90+ Lineage-cellen, ST2+-cellen en IL-9+-cellen (aanvullende figuur 2B,C).
  2. Celkleuring voor identificatie van IL-9-producerende lymfocyten (figuur 2 en aanvullende figuur 3)
    1. Breng 800 μL per longmonster over van stap 4.10.14 naar een buis van 1,5 ml (ongeveer 14,6 x 106 cellen). Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
    2. Voor lymfekliermonsters, plaat 400 μL van de celsuspensie uit stap 4.11.3 (ongeveer 5,6 x 10 6 en 17,5 x 106 cellen voor respectievelijk mediastinale en mesenteriale lymfekliermonsters) in een 96-well conische bodemplaat in twee stappen.
      1. Breng eerst 200 μL over, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
      2. Breng nog eens 200 μL over in de overeenkomstige put. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    3. Resuspendeer de celkorrel in 50-400 μl van de antilichaam/vlekcocktail (tabel 3) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Longmonsters moeten worden geresuspendeerd in 400 μL, mediastinale lymfekliermonsters in 50 μL en mesenteriale lymfekliermonsters in 100 μL van de kleuringscocktail.
    4. Voeg 150 μL FACS-buffer toe aan de mediastinale lymfekliermonsters en 100 μL aan de mesenteriale lymfekliermonsters. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    5. Was de long- en lymfekliermonsters door de pellets opnieuw te suspendiëren in respectievelijk 1 ml en 200 μl FACS-buffer. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en herhaal de wasbeurt.
    6. Resuspendeer de longmonsters in 600 μL FACS-buffer en analyseer ze met flowcytometrie. Gebruik de gating-strategie: lymfocyten, enkele cellen, levende cellen, hematopoëtische cellen, CD4+TCRβ+-cellen en IL-9+-cellen (figuur 2A).
    7. Resuspendeer de lymfekliermonsters in 300 μL FACS-buffer en analyseer met flowcytometrie. Gebruik de gating-strategie: lymfocyten, enkele cellen, levende cellen, CD4+ TCRβ+-cellen en IL-9+-cellen (figuur 2B en aanvullende figuur 3A).

6. Bepaling van het absolute aantal cellen in eencellige suspensies

  1. Verdun de monsters uit de isolerende stappen 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 en 4.11.3 met PBS in een verhouding van 1:20 (10 μL monster + 190 μL PBS).
  2. Meng 10 μL van elk verdund monster uit stap 6.1 met 10 μL Trypan Blue. Laad 10 μL in een hemocytometer en tel de levende cellen, rekening houdend met elke verdunning.
  3. Verkrijg het absolute aantal cellen door het percentage van de populatie van belang uit levende cellen bepaald door flowcytometrie (levensvatbaarheidskleurstofnegatieve cellen) te vermenigvuldigen met het totale aantal levende cellen in de eencellige suspensie na isolatie, en dit aantal te delen door 100 (aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5 en aanvullende figuur 6).
    Absoluut aantal = (Percentage van de populatie van belang van levende cellen bepaald door flowcytometrie x Totaal aantal levende cellen in de eencellige suspensie)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 200 L3 stadium N. brasiliensis larven, of met PBS voor schijncontroles. Het aantal larven dat in dit protocol werd gebruikt, werd aangepast om levensvatbare cellen uit de longen, lymfoïde weefsel en de dunne darm te isoleren, in tegenstelling tot eerdere rapporten waar hogere ladingen wormen werden gebruikt om cellen in lymfoïde weefsels en longen slechts4 te detecteren. Longen, mediastinale lymfeklieren, mesenteriale lymfeklieren en de dunne darm werden geoogst op dag 0, 4, 7 en 10 na infectie voor lymfocytenisolatie en karakterisering van IL-9-producerende populaties. Een totaal van 27 muizen werden gebruikt in twee of meer onafhankelijke experimenten, waaronder negen controles en vier tot zes N. brasiliensis-geïnfecteerde muizen per geanalyseerd tijdstip. Schijn-geïnfecteerde controles werden opgenomen in elk experiment om basale getallen te verkrijgen. Met behulp van dit protocol kunnen IL-9-producerende CD4 + T-cellen (meestal Th9-cellen in dit model) worden geïsoleerd uit long-, mesenteriale en mediastinale lymfeklieren voor kwantificering en verdere analyse.

Na het natuurlijke verloop van de infectie beoordeelden we eerst de frequenties van IL-9-producerende CD4+ T-lymfocyten (Th9) in de longen en mediastinale lymfeklieren (gatingstrategie weergegeven in figuur 2A en aanvullende figuur 3A). In beide organen namen de Th9-frequenties toe, beginnend op dag 4, en bereikten een piek op dag 7 na infectie (figuur 2C), een toename die ook werd waargenomen in Th9 absolute aantallen (aanvullende figuur 4A, B). In de mesenteriale lymfeklieren (gatingstrategie weergegeven in figuur 2B) was er een significante toename van zowel de frequenties als de absolute aantallen Th9-cellen op dag 7 en 10 na infectie (figuur 2C en aanvullende figuur 4C), in overeenstemming met eerdere rapporten4. De aanwezigheid van T-cellen en ILC2's werd bevestigd in de intra-epitheliale en lamina propria-monsters; in deze darmcompartimenten werden echter gedurende de infectie geen Th9-cellen waargenomen (aanvullende figuur 3B,C).

Vervolgens evalueerden we IL-9-expressieve ILC2-cellen in lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels van geïnfecteerde muizen (gatingstrategie weergegeven in figuur 3A, B en aanvullende figuur 2). We zagen een significante toename in de frequenties van ST2+ IL-9- en ST2+ IL-9+ die ILC2's in de longen tot expressie brachten op dag 7 na infectie (figuur 3C). Tegelijkertijd toonde analyse van absolute aantallen alleen een statistisch significante toename in de ST2 + IL-9 + -populatie op dag 7 na infectie (aanvullende figuur 5A). In de mediastinale lymfeklieren (gatingstrategie weergegeven in aanvullende figuur 2B) nam het aantal IL-9-tot expressie brengende ILC2-cellen (ST2+ IL-9+) significant toe op dag 10 na infectie, terwijl het absolute aantal ST2+-cellen een trend vertoonde om toe te nemen, beginnend op dag 7 en doorgaand tot dag 10 na infectie (aanvullende figuur 6A,C).

IL-9+ ILC2-cellen werden ook gevonden in de lamina propria en intra-epitheliale compartimenten van de dunne darm (gatingstrategie weergegeven in figuur 3B en aanvullende figuur 2A). N. brasiliensis-infectie resulteerde in een statistisch significante toename van de frequenties van ST2 + IL-9 + -cellen op dag 4 en ST2- IL-9 + -populaties op dag 7 en 10 in de lamina propria. In het intra-epitheliale compartiment werd ook een significante verandering waargenomen in de frequenties van ST2+ IL9+ en ST2- IL-9+ cellen op respectievelijk dag 7 en dag 10 na infectie (figuur 3C). Belangrijk is dat zelfs met een relatief laag aantal larvenbelasting, infectie met de parasiet uitgebreide schade aan de dunne darm veroorzaakte; daarom is de analyse van IL-9-expressing ILC2s absolute getallen technisch onhaalbaar, wat de nauwkeurige kwantificering van deze populatie belemmert vanwege de lage opbrengsten van levende cellen (aanvullende figuur 5B,C). Aan de andere kant onthulde de analyse van mesenteriale lymfeklieren (gatingstrategie weergegeven in aanvullende figuur 2C) een significante toename van absolute aantallen ST2 + IL-9-, ST2 + IL-9 + en ST2- IL-9 + ILC2-cellen op dag 10 na infectie (aanvullende figuur 6D), zoals eerder gemeld4. Ondertussen werd geen verschil waargenomen in de frequenties van deze populaties gedurende de infectie (aanvullende figuur 6B). Deze diverse subsets van ST2- en IL-9-tot expressie brengende cellen zijn intrigerende populaties met potentieel differentiële rollen in vivo, en kunnen overeenkomen met natuurlijke versus inflammatoire ILC2's zoals onlangs beschreven 18,19,20,21. Dit moet echter in toekomstige studies aan de orde komen.

Samenvattend hebben we dit protocol aangepast voor het herstel van IL-9-tot expressie brengende cellen uit de met N. brasiliensis geïnfecteerde darm, terwijl we ze nog steeds in staat zijn om ze in de longen en het lymfoïde weefsel te detecteren. Het ophalen van immuuncellen uit met parasieten geïnfecteerde darmen is technisch moeilijk gebleken. Hier resulteerde een aangepast aantal larven dat werd gebruikt voor infectie in een verbeterde integriteit van het darmweefsel, waardoor het herstel van een IL-9 + -populatie mogelijk werd. Voor zover wij weten, is dit het eerste protocol dat speciaal is ontwikkeld voor de analyse van IL-9-tot expressie brengende cellen in de darm tijdens N. brasiliensis-infectie. Niettemin kunnen ook andere immuuncellen worden geïsoleerd na deze stappen. De hier gepresenteerde gegevens laten zien dat de meeste weefselresidente IL-9-expressiecellen in de dunne darm ILC2's zijn.

Figure 1
Figuur 1: Stroomschema van het beschreven protocol. Schematisch diagram met de belangrijkste stappen die worden gebruikt om verschillende organen te verwerken en de verwachte IL-9-tot expressie brengende celsubsets die zijn verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Th9-cellen worden gevonden in longen, mediastinale en mesenteriale lymfeklieren gedurende N. brasiliensis-infectie. Representatieve flowcytometrie-analyse en gating-strategie gebruikt voor Th9-celidentificatie uit (A) longen en (B) mesenteriale lymfeklieren. Eencellige suspensies van elk orgaan werden gekleurd met een fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof, fluorescerend gelabeld anti-CD45 voor de identificatie van hematopoietische cellen en anti-T-celreceptor (TCR) β en anti-CD4 voor identificatie van CD4 + T-lymfocyten. Het GFP+ signaal geeft het percentage aanwezige Th9-cellen aan. De eerste poort toont side scatter (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A eigenschappen met de klassieke morfologie van lymfoïde cellen. Single-cell events werden geselecteerd, gevolgd door levende cellen en vervolgens CD45+ cellen. Binnen deze populatie richtten we ons op TCR-β en CD4 dubbelpositieve cellen, waaruit GFP+ cellen werden geïdentificeerd als Th9-cellen. De kleuring van lymfeklieren omvatte niet het anti-CD45-antilichaam, omdat de hele populatie naar verwachting positief zal zijn. (C) Frequenties van Th9-cellen gevonden in longen, mediastinale en mesenteriale lymfeklieren op de aangegeven tijden na infectie. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van een of twee muizen geanalyseerd per groep, van drie onafhankelijke experimenten, per tijdstip; Ongepaarde T-test; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: IL-9-producerende ILC2-cellen worden gevonden in niet-lymfoïde organen. Representatieve flowcytometrie-analyse en gatingstrategie gebruikt voor de identificatie van IL-9+ ILC2-cellen uit (A) long- en (B) dunne darm lamina propria. Eencellige suspensies van elk orgaan werden gemarkeerd met gebiotinyleerde antilichamen om afstammingscellen te identificeren (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 en anti-Ter119) en Fc-Block. Celsuspensies werden vervolgens gekleurd met fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof, fluorochroom-gelabeld streptavidin, anti-CD45 voor de identificatie van hematopoietische cellen en anti-CD90 voor de identificatie van ILC2-cellen. De eerste poort toont scatter (SSC)-A/side scatter (FSC)-A eigenschappen met de klassieke morfologie van lymfoïde cellen. Single-cell events werden geselecteerd, gevolgd door levende cellen en vervolgens CD45+ cellen. Binnen deze populatie richtten we ons op CD90+ lin-cellen; uit deze groep evalueerden we ST2- en GFP-expressie om IL-9+ ILC2-cellen te identificeren. (C) Frequenties van ILC2-cellen gevonden in longen, lamina propria en het intra-epitheliale celcompartiment op de aangegeven tijdstippen na infectie. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van een of twee muizen geanalyseerd per groep, van drie onafhankelijke experimenten, per tijdstip; ongepaarde T-test; *p ≤ 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Lijst van chemische oplossingen en hun samenstelling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Antilichaamcocktail om IL-9-producerende ILC2-cellen te identificeren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Antilichaamcocktail om IL-9-producerende T-lymfocyten te identificeren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Schematische weergave van de locatie van de mediastinale lymfeklier. Aangemaakt in BioRender.com Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Representatieve flowcytometrie en gatingstrategie die wordt gebruikt om IL-9+ ILC2's te identificeren in intra-epitheliale cellen uit de dunne darm en lymfeklieren. (A) Eencellige suspensies uit intra-epitheliale cellen in de dunne darm werden eerst geïncubeerd met biotine-gelabelde antilichamen om afstammingscellen te selecteren (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 en anti-Ter119) en Fc-Block. Dit werd gevolgd door kleuring met een fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof, fluorochroom-gelabeld streptavidin, anti-CD45 voor de identificatie van hematopoietische cellen en anti-CD90 voor de identificatie van ILC2-cellen. De eerste poort toont side scatter (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A eigenschappen met de klassieke morfologie van lymfoïde cellen. Single-cell events werden geselecteerd, gevolgd door levende cellen en vervolgens CD45+ cellen. Binnen deze populatie richtten we ons op CD90+ lin-cellen; uit deze groep werden GFP+ cellen geïdentificeerd als IL-9+ ILC2 cellen. (B,C) Representatieve flowcytometrie en gatingstrategie voor (B) mediastinale lymfeklieren en (C) mesenteriale lymfeklieren om IL-9+ ILC2-cellen te identificeren. Kleuring van lymfeklieren omvatte niet het anti-CD45-antilichaam, omdat de hele populatie naar verwachting positief zou zijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Representatieve flowcytometrie-analyse en gatingstrategie gebruikt om Th9-cellen in mediastinale lymfeklieren en de dunne darm te identificeren. Eencellige suspensies van (A) mediastinale lymfeklieren werden gekleurd met een fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof en fluorescerend gelabelde anti-TCR-β- en anti-CD4-antilichamen. De eerste poort toont side scatter (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A eigenschappen met de klassieke morfologie van lymfoïde cellen. Eencellige gebeurtenissen werden geselecteerd, gevolgd door levende cellen en vervolgens TCR-β en CD4 dubbelpositieve cellen; uit deze groep werden GFP+ cellen geïdentificeerd als Th9-cellen. Een vergelijkbare flowcytometriestrategie werd gebruikt voor (B) lamina propria en (C) intra-epitheliale cellen uit de dunne darm, behalve dat CD45+ cellen werden geselecteerd na de levende cellen, gevolgd door TCR-β en CD4 dubbelpositieve cellen, van waaruit GFP+ cellen werden geïdentificeerd als Th9-cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Absolute aantallen Th9-cellen veranderen significant gedurende de infectie. Absolute aantallen IL-9+ cellen van TCR-β en CD4 dubbelpositieve cellen werden bepaald op dag 0, 4, 7 en 10 na infectie in (A) longen, (B) mediastinale lymfeklieren en (C) mesenteriale lymfeklieren. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van een of twee muizen geanalyseerd per groep, van drie onafhankelijke experimenten, per tijdstip; ongepaarde T-test *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Absolute aantallen IL-9+ ILC2-cellen verschillen gedurende de infectie. Absolute aantallen IL-9+ ILC2-cellen uit de lin-CD90+ populatie op dag 0, 4, 7 en 10 na infectie werden bepaald in (A) long-, (B) lamina propria- en (C) intra-epitheliale cellen uit de dunne darm. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van een of twee muizen geanalyseerd per groep, van drie onafhankelijke experimenten, per tijdstip; ongepaarde T-test *p ≤ 0,05. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Frequenties en absolute aantallen IL-9+ ILC2-cellen in lymfeklieren nemen aanzienlijk toe tijdens infectie. (A) Frequentie en (C) absolute aantallen IL-9+ ILC2-cellen uit mediastinale lymfeklieren. (B) Frequentie en (D) absolute aantallen IL-9+ ILC2-cellen uit mesenteriale lymfeklieren. Waarden werden bepaald als IL-9+ ILC2-cellen binnen de lin-CD90+ populatie op dag 0, 4, 7 en 10 na infectie. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van een of twee geanalyseerde muizen per groep, van drie onafhankelijke experimenten, per tijdspunt; ongepaarde T-test * p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Flowcytometrie-analyse van IL-9-expressie van ILC2-cellen uit met N. brasiliensis geïnfecteerde darm. Representatieve plots van ILC2-cellen geïsoleerd uit de darm van IL-9-reportermuizen op dag 7 na infectie. IL-9-expressie werd beoordeeld in ILC2-cellen die vers geïsoleerd waren uit de intra-epitheliale of lamina propria-compartimenten van geïnfecteerde reportermuizen (IL-9 REP) versus volgens het eerder beschreven IL-9 intracellulaire kleuringsprotocol 9 (IL-9 AB, met behulp van een IL-9-antilichaamkloon RM9A4, BioLegend). Om IL-9-expressing ILC2s te identificeren, werden single cell suspensies eerst geïncubeerd met biotine gelabelde antilichamen om afstammingscellen te selecteren (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 en anti-Ter119) en Fc-Block, gevolgd door kleuring met flexibele levensvatbaarheidskleurstof, fluorochroom-gelabeld streptavidin, anti-CD45 en anti-CD90. De plots tonen IL-9-expressing ILC2-cellen die zijn afgesloten op de lin-CD45+CD90+ populatie die aanwezig is in de intra-epitheliale (A,B) en lamina propria (C,D) compartimenten, gedetecteerd via het reportersignaal van vers geïsoleerde cellen (A,C) of na intracellulaire kleuring van IL-9 (B,D). Controlemuizen werden geïnjecteerd met PBS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een volledig begrip van intestinale parasiet-gastheer interacties en immuunresponsen op helminth-infectie vereist de identificatie en analyse van de verschillende celpopulaties en effectormoleculen die essentieel zijn voor de inductie van weefselremodellering en wormuitdrijving. Bodemoverdraagbare worminfecties vormen een groot probleem in ontwikkelingslanden over de hele wereld. Tot voor kort was er echter geenprotocol beschikbaar dat de analyse mogelijk maakte van zeldzame celpopulaties in de dunne darm, het belangrijkste orgaan dat door deze infectie werd aangetast, 5. Dit protocol omvat eerder beschreven methoden die de flowcytometrische analyse van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen in de longen, mediastinale en mesenteriale lymfeklieren tijdens N. brasiliensis-infectie mogelijk maken, met als bijkomend voordeel dat deze populatie voor het eerst in de dunne darm wordt geïdentificeerd.

Het succes van dit protocol is sterk afhankelijk van de weefselverwerkingstijden. Het is noodzakelijk om maximaal zes dunne darmmonsters, per persoon, tegelijk te verwerken. Als verschillende organen moeten worden verwerkt, raden we aan dit parallel door een andere persoon te doen. Door gebruik te maken van een relatief lage parasietbelasting (200 L3-larven), maakt dit protocol de isolatie van lymfoïde cellen uit de met N. brasiliensis geïnfecteerde darm mogelijk, terwijl het vermogen om deze cellen van andere organen te isoleren behouden blijft. Het gebruik van hogere parasietbelastingen brengt de kwaliteit en kwantiteit van cellen geïsoleerd uit de dunne darm in gevaar (gegevens niet getoond); het kan echter resulteren in een significante toename van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen in andere organen4. Bij het verwerken van de darm en mesenteriale lymfeklieren is het van cruciaal belang om het aangehechte vetweefsel te verwijderen, omdat dit niet resulteert in verhoogde celdood. De gegevens ondersteunen de observatie dat het natuurlijke verloop van de infectie een negatieve invloed heeft op het absolute aantal lymfoïde cellen dat uit de dunne darm is hersteld. In de hier beschreven studies blijven de frequenties van IL-9+ ILC2-cellen consistent, terwijl absolute aantallen een hoge variabiliteit vertonen in elk onafhankelijk experiment. Daarom kunnen conclusies uit absolute aantallen onnauwkeurig zijn en moeten ze worden vermeden. Bovendien, gezien de lage frequentie van IL-9-tot expressie brengende T-cellen in weefsels, wordt de verwerving en kleuring van het hoogst mogelijke aantal cellen aanbevolen.

Een beperking van deze ILC2-analyse is het gebruik van een discrete combinatie van markers om deze populatie te definiëren. Afhankelijk van het weefsel van belang en de fase van infectie, kunnen aanvullende markers, zoals CD25, Klrg1 en ST2 onder andere, worden gebruikt voor een meer gedetailleerde fenotypische karakterisering van ILC2-cellen22. We erkennen dat het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de INFER reporter muizenstam4 en een voordeel kan bieden voor de identificatie van IL-9-tot expressie brengende cellen. We verwachten echter dat de hier gevonden resultaten kunnen worden verkregen met behulp van alternatieve strategieën, waaronder het gebruik van andere muisreporterstammen en intracellulaire IL-9-kleuring 6,7,8,9. Het is belangrijk om te vermelden dat het gebruik van conventionele muizen en het uitvoeren van intracellulaire kleuring van IL-9 in intra-epitheliale en lamina propria-cellen kan leiden tot het verliezen van elk detecteerbaar signaal en het compromitteren van de verkregen gegevens (aanvullende figuur 7). Dit kan te wijten zijn aan de langdurige manipulatie die nodig is om een subset te kleuren die al moeilijk ex vivo te isoleren en te onderhouden is. Daarom raden we het gebruik van reportermuizenstammen aan om de verwerkingstijden te verkorten en een betrouwbare analyse van IL-9-expressie in vivo te garanderen. We erkennen ook het feit dat Th9-cellen niet de enige T-cellen zijn die IL-923 tot expressie brengen; In dit parasitaire model zouden we echter niet verwachten dat andere deelverzamelingen het tot uitdrukking zouden brengen. Niettemin, om de aanwezigheid van andere IL-9-uitdrukkende subsets in de beschreven context te verwerpen, is een volledige karakterisering van type 2 cytokines samen met het gebruik van transcriptionele markers haalbaar.

De kwantificering van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen vóór dag 5 na infectie is eerder gemeld; het resulteert echter in zeer lage celfrequenties4. Het protocol in deze studie bestrijkt een groot deel van de infectiekinetiek van N. brasiliensis tot het begin van de parasietklaring2. We merkten echter op dat sommige celpopulaties in deze studie niet terugkeerden naar basale niveaus binnen het geanalyseerde tijdsbestek, wat suggereert dat de studie baat zou kunnen hebben bij langere tijdspunten om een volledig perspectief te hebben op het gedrag van deze cellen in een verder gevorderd stadium van de infectie in vivo. Hoe dan ook, we geloven dat het hier gepresenteerde werk kan dienen als een referentiegids voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen in parasitaire infectiemodellen, waardoor ze de ideale fase van infectie kunnen kiezen voor detectie van de specifieke celtypen uit weefsels van belang. Al met al zullen de hier beschreven methoden nuttig zijn om het fenotype en de functie van T-lymfocyten en ILC2-cellen te beoordelen die IL-9 tot expressie brengen tijdens een fysiologisch relevant model van parasitaire infectie, waardoor onze kennis van deze cellen wordt verbreed en mogelijk ons begrip van hen in andere pathologische omstandigheden wordt verbeterd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen José Luis Ramos-Balderas bedanken voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan PLL van CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P en EO-M ontvingen een fellowship van CONACYT (respectievelijk 736162 en 481437). MCM-M ontving een fellowship van CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

Immunologie en infectie IL-9 Th9 ILC2 IL-9 lymfoïde cellen parasiet dunne darm N. brasiliensis
Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het <em>Nippostrongylus brasiliensis</em> infectiemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter