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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Stratégie pour l’étude des cellules lymphoïdes productrices d’IL-9 dans le modèle d’infection à Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

Les cellules T et ILC2 exprimant l’IL-9 sont induites au cours de l’infection à N. brasiliensis , mais leur caractérisation a été largement négligée dans l’intestin infecté en raison de leur faible fréquence et de leur cinétique différentielle. Ce protocole décrit l’isolement de ces cellules à partir de différents organes cibles et la confirmation de leur identité par cytométrie en flux à différents stades de l’infection.

Abstract

L’IL-9 est une cytokine pléiotropique associée à divers processus, notamment l’immunité antitumorale, l’induction de pathologies allergiques et la réponse immunitaire contre les infections à helminthes, où elle joue un rôle important dans l’expulsion du parasite. Dans un modèle murin d’infection à Nippostrongylus brasiliensis, l’IL-9 est produite principalement par les lymphocytes T CD4+ et les cellules lymphoïdes innées présentes dans les poumons, l’intestin grêle et les ganglions lymphatiques drainants. Compte tenu des difficultés techniques liées à la coloration intracellulaire de l’IL-9, ainsi que de la complexité de l’isolement des cellules hématopoïétiques de l’intestin grêle lors de l’infection, il existe un besoin urgent d’un protocole complet mais simple pour analyser l’expression de l’IL-9 dans différents tissus lymphoïdes et non lymphoïdes dans ce modèle. Le protocole décrit ici décrit la cinétique de l’IL-9 produite par les lymphocytes T CD4+ et les lymphoïdes innés dans les poumons et l’intestin grêle, les principaux organes ciblés par N. brasiliensis, ainsi que dans les ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, tout au long de l’infection. En outre, il détaille le nombre de larves nécessaires à l’infection, en fonction du type de cellule et de l’organe d’intérêt. Ce protocole vise à aider à la normalisation des tests afin d’économiser du temps et des ressources en offrant la possibilité de se concentrer sur les cellules, les organes et les stades spécifiques de la maladie d’intérêt dans le modèle d’infection à N. brasiliensis.

Introduction

Les ankylostomes sont des parasites intestinaux qui infectent environ 700 millions de personnes dans le monde, principalement dans les zones tropicales des pays sous-développés. Les infections de haute intensité à Ancylostoma duodenale et Necator americanus, les parasites de l’ankylostome les plus courants chez l’homme, provoquent une anémie et une carence en protéines pouvant entraîner un retard de croissance et de développement mental1. N. americanus et le parasite rongeur Nippostrongylus brasiliensis induisent une réponse immunitaire prototypique de type 2 chez leur hôte et partagent des similitudes dans leur cycle de vie. Par conséquent, l’infection des souris par N. brasiliensis est le modèle le plus couramment utilisé pour les infections par l’ankylostome humain. Stade 3 (L3) Les larves infectieuses de N. brasiliensis se déplacent de la peau vers les poumons dans les premières heures suivant l’infection. Une fois dans les poumons, ils deviennent L4 et migrent vers le haut de la trachée pour être avalés, traversent l’estomac et atteignent l’intestin pour devenir adultes (L5) dans les 4-5 jours. Dans l’intestin, les vers L5 pondent des œufs qui sont excrétés dans les matières fécales pour relancer le cycle de vie du parasite2.

La réponse immunitaire induite par N. brasiliensis est caractérisée par une augmentation de plusieurs cytokines de type 2, y compris IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 et IL-13, ainsi que par une éosinophilie, une basophilie, une hyperplasie caliciforme et mastocytes et une production accrue d’IgG1 et d’IgE. La plupart des études visant à identifier et à définir les réponses immunitaires provoquées lors de l’infection à N. brasiliensis sont centrées sur le rôle de l’IL-4 ou de l’IL-13 dans ce modèle3. Cependant, l’identification et la caractérisation des cellules exprimant l’IL-9 et la fonction de cette cytokine avaient été largement négligées, jusqu’à ce que Licona-Limón et al. publient la première étude démontrant un rôle critique de l’IL-9 dans la réponse immunitaire contre N. brasiliensis. En utilisant des souris rapporteures, cette étude a décrit les cellules T (principalement T auxiliaires 9) et les cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2) comme les principaux sous-ensembles cellulaires exprimant l’IL-9 lors de l’infection4.

L’isolement et la caractérisation des cellules immunitaires des poumons infectés par des helminthes sont possibles et ont été largement rapportés 3,4. Cependant, en raison du remodelage tissulaire inhérent et de la production de mucus, le faire dans l’intestin infecté s’est avéré être un défi technique, jusqu’à la publication récente de Ferrer-Font et al.5. Le groupe a décrit un protocole pour isoler et analyser les suspensions unicellulaires de sous-ensembles immunitaires provenant d’intestins murins infectés par Heligmosomoides polygyrus. Sur cette base, nous avons maintenant normalisé un protocole d’isolement et d’analyse cytométrique des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 de l’intestin infecté par N. brasiliensis. En outre, nous avons établi la cinétique IL-9 à partir de différentes sources cellulaires et emplacements anatomiques tout au long de l’infection.

La caractérisation des populations cellulaires distinctes impliquées dans cette infection est essentielle pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire au parasite et de son interaction avec l’hôte. Ce protocole complet fournit une voie claire pour isoler et analyser les cellules productrices d’IL-9 des organes souhaités aux stades d’intérêt de la maladie, permettant une nette amélioration des connaissances sur le rôle de ces cellules dans l’infection à N. brasiliensis et les infections parasitaires en général.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le Comité interne pour la manipulation des animaux (CICUAL) de l’Institut de physiologie cellulaire de l’Université nationale autonome du Mexique.

REMARQUE : un organigramme de l’ensemble du protocole est illustré à la figure 1.

1. Logement des souris

  1. Utilisez des groupes de souris femelles ou mâles âgées de 8 à 10 semaines, hébergées dans des animaleries avec une température et une humidité constantes dans des cycles lumière/obscurité de 12 h, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
    NOTE: Ce protocole utilise une souche de souris rapporteur IL-9 en arrière-plan C57BL/6, comme décrit précédemment4; cependant, d’autres souches rapporteures d’IL-9 pourraient être utilisées 6,7,8, ainsi que la coloration intracellulaire de l’IL-9, avec des résultats variables 9.

2. Infection des souris

  1. Rasez le dos des souris du milieu du corps jusqu’à la base de la queue 1 jour avant l’infection. L’utilisation d’anesthésiques n’est pas indispensable.
  2. Inoculer par voie sous-cutanée à chaque souris 200 larves viables de N. brasiliensis (L3) au troisième stade dans 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)10 dans le bas du dos, comme décrit précédemment2,11, ou injecter 100 μL de PBS seul comme témoin. Sacrifiez les animaux le jour 4, le jour 7 ou le jour 10 après l’infection.

3. Isolement des ganglions lymphatiques pulmonaires, de l’intestin grêle, des médiastins et des mésentériques

  1. Euthanasier la souris par luxation cervicale. Placez la souris sur son dos et vaporisez-la avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision médiane à l’aide de ciseaux et ouvrez la peau pour exposer les zones abdominales et thoraciques.
    REMARQUE : L’isoflurane peut être utilisé comme méthode d’euthanasiealternative 12. Les chambres de dioxyde de carbone ne sont pas recommandées, car le CO2 entraîne des lésions des tissus pulmonaires et une hémorragie13.
  2. Isolement des ganglions lymphatiques médiastinaux et des poumons
    1. Faites une incision au sternum et coupez en forme de « V » pour enlever les côtes et les muscles thoraciques. Une fois que la cavité thoracique est exposée, localisez les ganglions lymphatiques médiastinaux près de l’œsophage, sous le cœur (voir la figure supplémentaire 1).
    2. Extraire les ganglions lymphatiques médiastinaux et les recueillir dans 1 mL de milieu R-10 (tableau 1) dans une plaque de culture de 12 puits. Conserver sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’au traitement.
      NOTE: Les échantillons doivent être protégés de la lumière pour éviter de diminuer le signal fluorescent des souris rapporteures utilisées dans ces expériences.
    3. Extraire les poumons et les recueillir dans 1 mL de milieu R-10 dans une plaque de culture de 12 puits par souris. Conserver sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’au traitement.
  3. Isolement des chaînes ganglionnaires mésentériques et de l’intestin grêle
    1. Exposez la cavité péritonéale et déplacez délicatement l’intestin grêle vers la droite pour exposer la chaîne du ganglion lymphatique mésentérique (MLN) le long du côlon.
    2. À l’aide d’une pince, retirez le MLN, roulez-le doucement sur une serviette en papier et retirez la graisse.
    3. Transférer le MLN à 1 mL de milieu R-10 dans une plaque de culture de 12 puits. Conserver sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’au traitement.
    4. Coupez l’intestin grêle juste en dessous du sphincter pylorique et au-dessus du caecum. Retirez l’intestin lentement à l’aide d’une pince, en enlevant le mésentère attaché et le tissu adipeux.
    5. Placez l’intestin grêle sur une serviette en papier et humidifiez-le généreusement avec du PBS. Retirez les plaques de Peyer de l’intestin grêle avec des ciseaux.
      REMARQUE: Pour maintenir la viabilité, retirez le tissu adipeux restant et gardez l’intestin grêle humide avec PBS pendant tout le processus.
    6. Coupez l’intestin grêle longitudinalement à l’aide de ciseaux et faites glisser doucement la pince sur l’intestin ouvert pour éliminer le contenu fécal et le mucus.
    7. Tenez l’intestin grêle avec une pince et lavez-le dans 5 ml de PBS sur de la glace en l’immergeant soigneusement plusieurs fois. Répétez deux fois.
    8. Couper l’intestin grêle en petits morceaux (environ 5 mm) et les recueillir dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de HBSS14 avec 2 % de FBS (tableau 1). Continuer immédiatement à isoler les cellules intraépithéliales et lamina propria.

4. Préparation de suspensions unicellulaires de l’intestin grêle, des poumons et des ganglions lymphatiques

REMARQUE: Il est extrêmement important de traiter un maximum de six souris par personne lors de la préparation de suspensions unicellulaires de l’intestin grêle, car la viabilité cellulaire diminue considérablement avec des périodes de traitement plus longues. Cette méthode a été adaptée de la souris Heligmosomoides polygyrus infection modèle5.

  1. Préchauffer l’incubateur agitateur, milieu R-20, HBSS et EDTA HBSS-2 mM (tableau 1) à 37 °C.
  2. Préparer 10 mL de milieu de digestion de l’intestin grêle (tableau 1) par échantillon.
  3. Secouez vigoureusement les morceaux d’intestin de l’étape 3.3.8 à la main.
  4. Filtrer chaque échantillon à travers un treillis de nylon (environ 10 cm x 10 cm) sur un entonnoir en verre. Lavez l’échantillon en ajoutant 10 ml d’HBSS préchauffé sur le filet et jetez l’écoulement continu. Répétez une fois de plus.
    REMARQUE: Utilisez un nouveau maillage pour chaque échantillon et réutilisez-le tout au long de la procédure.
  5. Retirer le treillis de l’entonnoir et prélever l’échantillon du treillis dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL d’EDTA HBSS-2 mM chaud (étape 4.1). Incuber pendant 10 min à 37 °C, en agitant à 200 tr/min.
  6. Vortex pendant 10 s à la vitesse maximale (3 200 tr/min) et filtrer l’échantillon avec le treillis sur un entonnoir en verre, en récupérant le flux continu dans un tube conique de 50 mL.
  7. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 deux fois, en récupérant le débit dans le même tube conique de 50 mL. Les cellules intraépithéliales sont situées dans cette fraction de 30 mL. Conservez le reste du tissu.
  8. Préparation de suspension unicellulaire à partir de cellules intraépithéliales
    1. Centrifuger les 30 mL de suspension cellulaire, récupérés à l’étape 4.7, à 450 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Jetez le surnageant.
    2. Ajouter 5 mL de PBS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à TA. Jeter le surnageant.
    3. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 3 mL de DNase RPMI à 10 % FBS-20 μg/mL (tableau 1). Gardez sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à la coloration des cellules.
  9. Préparation de suspension unicellulaire à partir de cellules de lamina propria
    1. Lavez le reste du tissu de l’intestin grêle de l’étape 4.7 en versant plus de 10 ml de HBSS chaud à travers le filet au-dessus de l’entonnoir. Répétez le lavage. Prélever le tissu du filet dans un tube conique de 50 ml avec 10 mL de milieu de digestion de l’intestin grêle.
    2. Incuber pendant 30 min à 37 °C, en agitant à 200 tr/min. Vortex à vitesse maximale pendant 10 s toutes les 5 minutes.
    3. Ajouter 10 mL de tampon FACS-EDTA (tableau 1) pour arrêter la réaction de digestion et le placer sur de la glace.
    4. Filtrer chaque échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm à l’aide d’une pipette sérologique, en récupérant la suspension dans un tube conique de 50 ml placé sur de la glace.
    5. Centrifuger à 600 x g pendant 6 min à 4 °C.
    6. Jetez le surnageant. Laver la pastille de la cellule avec 5 mL de PBS et centrifuger à 600 x g pendant 6 min à 4 °C.
    7. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNase. Gardez sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à la coloration des cellules.
  10. Préparation de suspension unicellulaire à partir de poumon
    REMARQUE: Chaque poumon et intestin grêle doit être traité en parallèle par deux personnes pour éviter des temps de manipulation prolongés, ce qui entraîne une faible viabilité cellulaire.
    1. Préparer 4 mL de milieu de digestion pulmonaire (tableau 1) par échantillon traité.
    2. Retirer le milieu RPMI du puits contenant les poumons à l’étape 3.2.3. Couper le poumon en petits morceaux avec des ciseaux fins.
    3. Transférer les morceaux de poumon dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une spatule. Ajouter 4 mL de milieu de digestion pulmonaire (tableau 1).
    4. Incuber pendant 30 min à 37 °C, en agitant à 250 tr/min. Lorsque vous avez terminé, gardez sur la glace jusqu’à ce que chaque échantillon soit traité.
    5. Filtrer chaque échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm, positionnée dans un seul puits d’une plaque de culture à 6 puits. Dissocier le tissu avec un piston de seringue.
    6. Récupérer chaque échantillon dans un tube conique de 15 mL et ajouter 4 mL de milieu R-2 (tableau 1). Gardez sur la glace pendant que les autres échantillons sont traités.
    7. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu R-5 (tableau 1).
    8. Pendant la centrifugation, préparer 4 mL de solution à gradient de densité à 27,5 % (tableau 1) par échantillon pour enrichir la fraction cellulaire hématopoïétique15,16. Cette stratégie de séparation unicellulaire est plus efficace, rentable et moins toxique que d’autres milieux à gradient de densitésimilaire 17.
    9. Ajouter 4 mL de solution à gradient de densité à 27,5 % à la suspension cellulaire de 1 mL de l’étape 4.10.7 et agiter vigoureusement.
    10. Ajouter lentement 1 mL de milieu R-5 (tableau 1) sur la suspension mixte pour créer deux phases.
    11. Centrifuger à 1 500 x g pendant 20 min à RT, avec une faible accélération et le frein coupé. Observez l’anneau formé entre les deux phases.
    12. Récupérer l’anneau formé entre les deux phases à l’aide d’une micropipette de 1 mL, et remettre en suspension dans 4 mL de milieu R-2.
    13. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon ACK (tableau 1) et incuber pendant 1 min à TA.
    14. Ajouter 4 mL de milieu R-5 et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu R-10. Garder sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à coloration pour la cytométrie en flux.
  11. Préparation de suspension unicellulaire à partir de ganglions lymphatiques
    1. Placer les ganglions lymphatiques des étapes 3.2.2 ou 3.3.3 entre deux morceaux de maille dans un puits à partir d’une plaque de culture à 6 puits, et dissocier avec un piston de seringue.
    2. Récupérer la suspension cellulaire dans un tube conique de 1,5 mL et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu R-10. Garder sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à coloration pour la cytométrie en flux.
      REMARQUE : Si des amas sont visibles, filtrer l’échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm.

5. Coloration cellulaire pour la cytométrie en flux (Figure 2 et Figure 3)

NOTA : Centrifuger les suspensions de cellules ganglionnaires de l’étape 4.11.3 à 450 x g pendant 5 minutes à 4 °C et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon FACS (tableau 1).

  1. Coloration cellulaire pour l’identification des ILC2 (Figure 3 et Figure supplémentaire 2)
    REMARQUE: Cette procédure de coloration est spécifique pour l’identification des cellules ILC2 exprimant l’IL-9.
    1. Plaque 150 μL par échantillon pulmonaire (environ 1,8 x 10 6 cellules) à l’étape 4.10.14, et 50 μL par échantillon de ganglion lymphatique à l’étape 4.11.3 (environ 0,7 x 10 6 et 2,2 x 10 6 cellules pour les échantillons de ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, respectivement) dans une plaque de culture conique de fond à 96 puits. Ajouter 100 μL de tampon FACS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Plaque de 100 μL par échantillon d’intestin grêle (environ 2,7 x 10 6 et 0,6 x 106 cellules pour les échantillons intraépithéliaux et de lamina propria, respectivement) des étapes 4.8.3 et 4.9.7 dans une plaque de culture conique de fond à 96 puits. Ajouter 150 μL de tampon FACS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans 50 μL du cocktail d’anticorps biotinylés (tableau 2) dilué dans un tampon FACS. Incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Utilisez un tampon FACS contenant 20 μg/mL de DNase pour les échantillons intraépithéliaux et de lamina propria.
    4. Ajouter 150 μL de tampon FACS. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 μL de tampon FACS. Centrifuger à nouveau et jeter le surnageant.
    6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50 μL du cocktail anticorps/coloration (tableau 2) et incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
    7. Ajouter 150 μL de tampon FACS. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    8. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 μL de tampon FACS. Centrifuger à nouveau et jeter le surnageant. Répétez le lavage (étape 5.1.7) et jetez le surnageant.
    9. Resuspendre la pastille cellulaire dans 300 μL de tampon FACS, et analyser par cytométrie en flux.
    10. Pour les échantillons de l’intestin grêle et des poumons, utilisez la stratégie de déclenchement : lymphocytes, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules hématopoïétiques, cellules de la lignée CD90+, cellules ST2+ et cellules IL-9+ (figure 3A, B et figure supplémentaire 2A). Pour les échantillons de ganglions lymphatiques, utilisez la stratégie de déclenchement : cellules vivantes, cellules individuelles, cellules de la lignée CD90+, cellules ST2+ et cellules IL-9+ (figure supplémentaire 2B,C).
  2. Coloration cellulaire pour l’identification des lymphocytes producteurs d’IL-9 (Figure 2 et Figure 3 supplémentaire)
    1. Transfèrent 800 μL par échantillon pulmonaire de l’étape 4.10.14 dans un tube de 1,5 mL (environ 14,6 x 106 cellules). Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    2. Pour les échantillons de ganglions lymphatiques, plaquer 400 μL de la suspension cellulaire de l’étape 4.11.3 (environ 5,6 x 10 6 et 17,5 x 106 cellules pour les échantillons de ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, respectivement) dans une plaque inférieure conique à 96 puits en deux étapes.
      1. Transvaser d’abord 200 μL, centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
      2. Transférer 200 μL supplémentaires dans le puits correspondant. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    3. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50-400 μL du cocktail anticorps/coloration (tableau 3) et incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Les échantillons de poumons doivent être remis en suspension dans 400 μL, les échantillons de ganglions médiastinaux dans 50 μL et les échantillons de ganglions lymphatiques mésentériques dans 100 μL du cocktail de coloration.
    4. Ajouter 150 μL de tampon FACS aux échantillons de ganglions lymphatiques médiastinaux et 100 μL aux échantillons de ganglions lymphatiques mésentériques. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    5. Laver les échantillons de poumon et de ganglions lymphatiques en remettant les granulés en suspension dans 1 mL et 200 μL de tampon FACS, respectivement. Centrifuger à 450 xg pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et répétez le lavage.
    6. Resuspendre les échantillons pulmonaires dans 600 μL de tampon FACS, et les analyser par cytométrie en flux. Utilisez la stratégie de déclenchement : lymphocytes, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules hématopoïétiques, cellules CD4+TCRβ+ et cellules IL-9+ (Figure 2A).
    7. Resuspendre les échantillons de ganglions lymphatiques dans 300 μL de tampon FACS, et analyser par cytométrie de flux. Utilisez la stratégie de déclenchement : lymphocytes, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules CD4+ TCRβ+ et cellules IL-9+ (Figure 2B et Figure supplémentaire 3A).

6. Détermination du nombre absolu de cellules dans les suspensions unicellulaires

  1. Diluer les échantillons des étapes d’isolement 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 et 4.11.3 avec du PBS dans un rapport de 1:20 (10 μL d’échantillon + 190 μL de PBS).
  2. Mélanger 10 μL de chaque échantillon dilué de l’étape 6.1 avec 10 μL de bleu de trypan. Chargez 10 μL dans un hémocytomètre et comptez les cellules vivantes, en tenant compte de chaque dilution.
  3. Obtenir le nombre absolu de cellules en multipliant le pourcentage de la population d’intérêt à partir de cellules vivantes déterminé par cytométrie en flux (cellules à colorant négatif de viabilité) par le nombre total de cellules vivantes dans la suspension unicellulaire après isolement, et en divisant ce nombre par 100 (figure supplémentaire 4, figure supplémentaire 5 et figure supplémentaire 6).
    Nombre absolu = (Pourcentage de la population d’intérêt provenant de cellules vivantes déterminé par cytométrie en flux x Nombre total de cellules vivantes dans la suspension unicellulaire)/100

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Representative Results

Des souris ont reçu une injection sous-cutanée de 200 larves de N. brasiliensis de stade L3 ou de PBS pour des contrôles fictifs. Le nombre de larves utilisées dans ce protocole a été ajusté afin d’isoler les cellules viables des poumons, du tissu lymphoïde et de l’intestin grêle, contrairement aux rapports précédents où des charges plus élevées de vers ont été utilisées pour détecter des cellules dans les tissus lymphoïdes et les poumons seulement4. Les poumons, les ganglions lymphatiques médiastinaux, les ganglions lymphatiques mésentériques et l’intestin grêle ont été récoltés aux jours 0, 4, 7 et 10 après l’infection pour l’isolement des lymphocytes et la caractérisation des populations productrices d’IL-9. Au total, 27 souris ont été utilisées dans deux expériences indépendantes ou plus, dont neuf témoins et quatre à six souris infectées par N. brasiliensis par point temporel analysé. Des témoins infectés par des simulacres ont été inclus dans chaque expérience pour obtenir des nombres basaux. À l’aide de ce protocole, les lymphocytes T CD4+ producteurs d’IL-9 (principalement des lymphocytes Th9 dans ce modèle) peuvent être isolés des ganglions lymphatiques pulmonaires, mésentériques et médiastinaux pour une quantification et une analyse plus approfondie.

Après l’évolution naturelle de l’infection, nous avons d’abord évalué la fréquence des lymphocytes T CD4+ producteurs d’IL-9 (Th9) présents dans les poumons et les ganglions lymphatiques médiastinaux (stratégie de déclenchement illustrée à la figure 2A et à la figure supplémentaire 3A). Dans les deux organes, les fréquences Th9 ont augmenté, à partir du jour 4, et ont atteint un pic au jour 7 après l’infection (Figure 2C), une augmentation qui a également été observée en nombres absolus Th9 (Figure supplémentaire 4A,B). Dans les ganglions lymphatiques mésentériques (stratégie de déclenchement illustrée à la figure 2B), il y a eu une augmentation significative de la fréquence et du nombre absolu de cellules Th9 aux jours 7 et 10 suivant l’infection (figure 2C et figure supplémentaire 4C), conformément aux rapports précédents4. La présence de lymphocytes T et d’ILC2 a été confirmée dans les échantillons intraépithéliaux et de lamina propria; cependant, aucune cellule Th9 n’a été observée dans ces compartiments intestinaux tout au long de l’infection (figure supplémentaire 3B,C).

Nous avons ensuite évalué les cellules ILC2 exprimant l’IL-9 dans les tissus lymphoïdes et non lymphoïdes de souris infectées (stratégie de déclenchement illustrée à la figure 3A, B et à la figure supplémentaire 2). Nous avons observé une augmentation significative des fréquences des IL-9 et des IL-9+ ST2+ exprimant les ILC2 dans les poumons au jour 7 après l’infection (Figure 3C). Dans le même temps, l’analyse des nombres absolus n’a révélé une augmentation statistiquement significative que dans la population d’IL-9+ ST2+ au jour 7 suivant l’infection (figure supplémentaire 5A). Dans les ganglions lymphatiques médiastinaux (stratégie de déclenchement illustrée à la figure supplémentaire 2B), le nombre de cellules ILC2 exprimant l’IL-9 (IL-9+ ST2+) a augmenté de manière significative au jour 10 après l’infection, tandis que le nombre absolu de cellules ST2+ a montré une tendance à la hausse, commençant au jour 7 et se poursuivant jusqu’au jour 10 post-infection (Figure supplémentaire 6A,C).

Des cellules IL-9+ ILC2 ont également été trouvées dans la lamina propria et les compartiments intraépithéliaux de l’intestin grêle (stratégie de déclenchement illustrée à la figure 3B et à la figure supplémentaire 2A). L’infection à N. brasiliensis a entraîné une augmentation statistiquement significative de la fréquence des cellules IL-9+ ST2+ au jour 4 et des populations ST2-IL-9+ aux jours 7 et 10 dans la lamina propria. Dans le compartiment intraépithélial, un changement significatif a également été observé dans les fréquences des cellules ST2+ IL9+ et ST2- IL-9+ au jour 7 et au jour 10 post-infection, respectivement (Figure 3C). Il est important de noter que même avec un nombre relativement faible de charges larvaires, l’infection par le parasite a causé des dommages importants à l’intestin grêle; par conséquent, l’analyse des nombres absolus d’ILC2 exprimant l’IL-9 est techniquement impossible, ce qui entrave la quantification précise de cette population en raison des faibles rendements en cellules vivantes (figure supplémentaire 5B,C). D’autre part, l’analyse des ganglions lymphatiques mésentériques (stratégie de déclenchement illustrée dans la figure supplémentaire 2C) a révélé une augmentation significative du nombre absolu de cellules ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ et ST2- IL-9+ ILC2 au jour 10 post-infection (figure supplémentaire 6D), comme indiqué précédemment4. Entre-temps, aucune différence n’a été observée dans les fréquences de ces populations tout au long de l’infection (figure supplémentaire 6B). Ces divers sous-ensembles de cellules exprimant ST2 et IL-9 sont des populations intrigantes avec des rôles potentiellement différentiels in vivo, et pourraient correspondre à des ILC2 naturelles par rapport à inflammatoires comme décrit récemment 18,19,20,21. Cependant, cela doit être abordé dans les études futures.

En résumé, nous avons ajusté ce protocole pour la récupération des cellules exprimant l’IL-9 de l’intestin infecté par N. brasiliensis, tout en étant capable de les détecter dans les poumons et les tissus lymphoïdes. La récupération des cellules immunitaires des intestins infectés par des parasites s’est avérée techniquement difficile. Ici, un nombre ajusté de larves utilisées pour l’infection a entraîné une amélioration de l’intégrité des tissus intestinaux, ce qui a permis le rétablissement d’une population IL-9+. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole développé spécifiquement pour l’analyse des cellules exprimant l’IL-9 dans l’intestin lors d’une infection à N. brasiliensis. Néanmoins, d’autres cellules immunitaires peuvent également être isolées en suivant ces étapes. Les données présentées ici montrent que la plupart des cellules exprimant l’IL-9 résidant dans les tissus dans l’intestin grêle sont des ILC2.

Figure 1
Figure 1 : Organigramme du protocole décrit. Diagramme schématique avec les principales étapes utilisées pour traiter les différents organes et les sous-ensembles de cellules exprimant l’IL-9 attendus obtenus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les cellules Th9 sont présentes dans les poumons, les ganglions lymphatiques médistinaux et mésentériques tout au long de l’infection à N. brasiliensis. Analyse représentative de la cytométrie en flux et de la stratégie de déclenchement utilisée pour l’identification des cellules Th9 à partir de (A) poumons et (B) ganglions lymphatiques mésentériques. Les suspensions unicellulaires de chaque organe ont été colorées avec un colorant de viabilité fixable, un anti-CD45 marqué par fluorescence pour l’identification des cellules hématopoïétiques, et un β anti-récepteur des lymphocytes T (TCR) et anti-CD4 pour l’identification des lymphocytes T CD4+. Le signal GFP+ indique le pourcentage de cellules Th9 présentes. La première porte montre les propriétés de diffusion latérale (SSC)-A / de diffusion directe (FSC)-A avec la morphologie classique des cellules lymphoïdes. Les événements unicellulaires ont été sélectionnés, suivis des cellules vivantes, puis des cellules CD45+. Au sein de cette population, nous nous sommes concentrés sur les cellules doublement positives TCR-β et CD4, à partir desquelles les cellules GFP+ ont été identifiées comme des cellules Th9. La coloration des ganglions lymphatiques n’incluait pas l’anticorps anti-CD45, puisque toute la population devrait être positive. (C) Fréquences des cellules Th9 trouvées dans les poumons, les ganglions lymphatiques médistinaux et mésentériques aux moments indiqués après l’infection. Les données représentent la moyenne ± MEB d’une ou deux souris analysées par groupe, à partir de trois expériences indépendantes, par point temporel; Test T non apparié; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les cellules ILC2 productrices d’IL-9 se trouvent dans les organes non lymphoïdes. Analyse représentative de la cytométrie en flux et de la stratégie de déclenchement utilisée pour l’identification des cellules IL-9+ ILC2 de (A) poumon et (B) lamina propria de l’intestin grêle. Les suspensions unicellulaires de chaque organe ont été marquées avec des anticorps biotinylés pour identifier les cellules de la lignée (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 et anti-Ter119), et Fc-Block. Les suspensions cellulaires ont ensuite été colorées avec un colorant de viabilité réparable, de la streptavidine marquée au fluorochrome, de l’anti-CD45 pour l’identification des cellules hématopoïétiques et de l’anti-CD90 pour l’identification des cellules ILC2. La première porte montre les propriétés de diffusion (SSC)-A / diffusion latérale (FSC) - A avec la morphologie classique des cellules lymphoïdes. Les événements unicellulaires ont été sélectionnés, suivis des cellules vivantes, puis des cellules CD45+. Au sein de cette population, nous nous sommes concentrés sur les cellules lin- de CD90+; à partir de ce groupe, nous avons évalué l’expression de ST2 et de GFP pour identifier les cellules IL-9+ ILC2. (C) Fréquences des cellules ILC2 trouvées dans les poumons, la lamina propria et le compartiment cellulaire intraépithélial aux moments indiqués après l’infection. Les données représentent la moyenne ± MEB d’une ou deux souris analysées par groupe, à partir de trois expériences indépendantes, par point temporel; test T non apparié; *p ≤ 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des solutions chimiques et de leurs compositions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Cocktail d’anticorps pour identifier les cellules ILC2 productrices d’IL-9. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Cocktail d’anticorps pour identifier les lymphocytes T producteurs d’IL-9. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire 1 : Représentation schématique de l’emplacement du ganglion lymphatique médiastinal. Créé en BioRender.com Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Cytométrie de flux représentative et stratégie de déclenchement utilisée pour identifier les IL-9+ ILC2 dans les cellules intraépithéliales de l’intestin grêle et des ganglions lymphatiques. (A) Des suspensions unicellulaires de cellules intraépithéliales de l’intestin grêle ont d’abord été incubées avec des anticorps marqués à la biotine pour sélectionner des cellules de lignée (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 et anti-Ter119) et Fc-Block. Cela a été suivi d’une coloration avec un colorant de viabilité réparable, de la streptavidine marquée au fluorochrome, de l’anti-CD45 pour l’identification des cellules hématopoïétiques et de l’anti-CD90 pour l’identification des cellules ILC2. La première porte montre les propriétés de diffusion latérale (SSC)-A / de diffusion directe (FSC)-A avec la morphologie classique des cellules lymphoïdes. Les événements unicellulaires ont été sélectionnés, suivis des cellules vivantes, puis des cellules CD45+. Au sein de cette population, nous nous sommes concentrés sur les cellules lin- de CD90+; de ce groupe, les cellules GFP+ ont été identifiées comme des cellules IL-9+ ILC2. (B,C) Cytométrie de flux représentative et stratégie de déclenchement pour (B) les ganglions lymphatiques médiastinaux et (C) les ganglions lymphatiques mésentériques pour identifier les cellules IL-9+ ILC2. La coloration des ganglions lymphatiques n’incluait pas l’anticorps anti-CD45, car on s’attendait à ce que toute la population soit positive. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Analyse représentative de la cytométrie en flux et stratégie de déclenchement utilisée pour identifier les cellules Th9 dans les ganglions lymphatiques médiastinaux et l’intestin grêle. Les suspensions unicellulaires de ganglions lymphatiques médiastinaux (A) ont été colorées avec un colorant de viabilité réparable et des anticorps anti-TCR-β et anti-CD4 marqués par fluorescence. La première porte montre les propriétés de diffusion latérale (SSC)-A / de diffusion directe (FSC)-A avec la morphologie classique des cellules lymphoïdes. Les événements unicellulaires ont été sélectionnés, suivis des cellules vivantes, puis des cellules TCR-β et CD4 doublement positives; de ce groupe, les cellules GFP+ ont été identifiées comme des cellules Th9. Une stratégie similaire de cytométrie en flux a été utilisée pour (B) les cellules lamina propria et (C) intraépithéliales de l’intestin grêle, sauf que les cellules CD45+ ont été sélectionnées après les cellules vivantes, suivies des cellules TCR-β et CD4 doublement positives, d’où les cellules GFP+ ont été identifiées comme des cellules Th9. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Le nombre absolu de cellules Th9 change significativement tout au long de l’infection. Le nombre absolu de cellules IL-9+ provenant de cellules doublement positives TCR-β et CD4 a été déterminé aux jours 0, 4, 7 et 10 post-infection dans (A) les poumons, (B) les ganglions lymphatiques médiastinaux et (C) les ganglions lymphatiques mésentériques. Les données représentent la moyenne ± MEB d’une ou deux souris analysées par groupe, à partir de trois expériences indépendantes, par point temporel; test T non apparié *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Le nombre absolu de cellules IL-9+ ILC2 diffère tout au long de l’infection. Le nombre absolu de cellules IL-9+ ILC2 de la population de CD90+ lin-aux jours 0, 4, 7 et 10 post-infection a été déterminé dans (A) le poumon, (B) la lamina propria et (C) les cellules intraépithéliales de l’intestin grêle. Les données représentent la moyenne ± MEB d’une ou deux souris analysées par groupe, à partir de trois expériences indépendantes, par point temporel; test T non apparié *p ≤ 0,05. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : La fréquence et le nombre absolu de cellules IL-9+ ILC2 dans les ganglions lymphatiques augmentent significativement pendant l’infection. (A) Fréquence et (C) nombre absolu de cellules IL-9+ ILC2 provenant des ganglions lymphatiques médiastinaux. (B) Fréquence et (D) nombre absolu de cellules IL-9+ ILC2 provenant des ganglions lymphatiques mésentériques. Les valeurs ont été déterminées sous forme de cellules IL-9+ ILC2 dans la population Lin-CD90+ aux jours 0, 4, 7 et 10 post-infection. Les données représentent la moyenne ± MEB d’une ou deux souris analysées par groupe, à partir de trois expériences indépendantes, par point temporel ; test T non apparié *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : Analyse par cytométrie en flux de cellules IL-9 exprimant ILC2 provenant de l’intestin infecté par N. brasiliensis. Tracés représentatifs de cellules ILC2 isolées de l’intestin de souris rapporteures IL-9 au jour 7 après l’infection. L’expression de l’IL-9 a été évaluée dans des cellules ILC2 fraîchement isolées des compartiments intraépithéliaux ou lamina propria de souris rapporteures infectées (IL-9 REP) par rapport au protocole de coloration intracellulaireIL-9 9 décrit précédemment (IL-9 AB, utilisant un clone d’anticorps IL-9 RM9A4, BioLegend). Pour identifier les ILC2 exprimant l’IL-9, des suspensions unicellulaires ont d’abord été incubées avec des anticorps marqués à la biotine pour sélectionner les cellules de la lignée (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 et anti-Ter119) et Fc-Block, suivies d’une coloration avec colorant de viabilité flexible, streptavidine marquée au fluorochrome, anti-CD45 et anti-CD90. Les graphiques montrent des cellules ILC2 exprimant l’IL-9 fermées sur la population lin-CD45+CD90+ présente dans les compartiments intraépithélial (A, B) et lamina propria (C, D), détectées via le signal rapporteur à partir de cellules fraîchement isolées (A, C) ou après coloration intracellulaire de l’IL-9 (B, D). Des souris témoins ont reçu une injection de PBS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Une compréhension complète des interactions parasite-hôte intestinal et des réponses immunitaires à l’infection par les helminthes nécessite l’identification et l’analyse des différentes populations cellulaires et molécules effectrices qui sont essentielles pour l’induction du remodelage tissulaire et l’expulsion des vers. Les géohelminthiasies représentent un gros problème dans les pays en développement du monde entier. Cependant, jusqu’à récemment, un protocole permettant d’analyser les populations de cellules rares présentes dans l’intestin grêle, principal organe affecté par cette infection, n’était pas disponible5. Ce protocole couvre les méthodes décrites précédemment qui permettent l’analyse cytométrique en flux des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 dans les ganglions lymphatiques pulmonaires, médiastinaux et mésentériques au cours de l’infection à N. brasiliensis , avec l’avantage supplémentaire d’identifier cette population pour la première fois dans l’intestin grêle.

Le succès de ce protocole dépend fortement des temps de traitement des tissus. Il est impératif de traiter un maximum de six échantillons d’intestin grêle, par personne, à la fois. Si différents organes doivent être traités, nous recommandons que cela soit fait en parallèle par une autre personne. En utilisant une charge parasitaire relativement faible (200 larves L3), ce protocole permet d’isoler les cellules lymphoïdes de l’intestin infecté par N. brasiliensis tout en maintenant la capacité d’isoler ces cellules d’autres organes. L’utilisation de charges parasitaires plus élevées compromet la qualité et la quantité de cellules isolées de l’intestin grêle (données non présentées); cependant, cela pourrait entraîner une augmentation significative des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 dans d’autres organes4. Lors du traitement de l’intestin et des ganglions lymphatiques mésentériques, il est essentiel d’enlever le tissu adipeux adhérent, car le fait de ne pas le faire entraîne une augmentation de la mort cellulaire. Les données appuient l’observation selon laquelle l’évolution naturelle de l’infection a un impact négatif sur le nombre absolu de cellules lymphoïdes récupérées dans l’intestin grêle. Dans les études décrites ici, les fréquences des cellules IL-9+ ILC2 restent constantes, tandis que les nombres absolus montrent une grande variabilité dans chaque expérience indépendante. Par conséquent, les conclusions tirées des chiffres absolus pourraient être inexactes et devraient être évitées. De plus, étant donné la faible fréquence des lymphocytes T exprimant l’IL-9 dans les tissus, l’acquisition et la coloration du plus grand nombre possible de cellules sont recommandées.

Une limite de cette analyse ILC2 est l’utilisation d’une combinaison discrète de marqueurs pour définir cette population. Selon le tissu d’intérêt et la phase de l’infection, des marqueurs supplémentaires, tels que CD25, Klrg1 et ST2, entre autres, pourraient être utilisés pour une caractérisation phénotypique plus détaillée des cellules ILC222. Nous reconnaissons que le protocole présenté ici est basé sur la souche4 de souris rapporteur INFER et pourrait représenter un avantage pour l’identification des cellules exprimant l’IL-9. Cependant, nous nous attendons à ce que les résultats trouvés ici puissent être obtenus en utilisant des stratégies alternatives, y compris l’utilisation d’autres souches rapporteures de souris et la coloration intracellulaire de l’IL-9 6,7,8,9. Il est important de mentionner que l’utilisation de souris conventionnelles et la coloration intracellulaire de l’IL-9 dans les cellules intraépithéliales et lamina propria peuvent entraîner la perte de tout signal détectable et compromettre les données obtenues (Figure supplémentaire 7). Cela pourrait être dû à la manipulation à long terme nécessaire pour colorer un sous-ensemble qui est déjà difficile à isoler et à maintenir ex vivo. Par conséquent, nous recommandons l’utilisation de souches de souris rapporteures pour réduire les temps de traitement et assurer une analyse fiable de l’expression de l’IL-9 in vivo. Nous reconnaissons également le fait que les cellules Th9 ne sont pas les seules cellules T exprimant IL-923; Cependant, dans ce modèle parasitaire, nous ne nous attendrions pas à ce que d’autres sous-ensembles l’expriment. Néanmoins, pour écarter la présence d’autres sous-ensembles exprimant l’IL-9 dans le contexte décrit, une caractérisation complète des cytokines de type 2 ainsi que l’utilisation de marqueurs transcriptionnels sont réalisables.

La quantification des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 avant le jour 5 post-infection a déjà été rapportée; Cependant, il en résulte des fréquences cellulaires très basses4. Le protocole de cette étude couvre une grande partie de la cinétique de l’infection à N. brasiliensis jusqu’au début de l’élimination du parasite2. Cependant, nous avons remarqué que certaines des populations cellulaires de cette étude ne sont pas revenues aux niveaux basaux dans le délai analysé, ce qui suggère que l’étude pourrait bénéficier de points temporels prolongés pour avoir une perspective complète sur le comportement de ces cellules à un stade plus avancé de l’infection in vivo. Quoi qu’il en soit, nous pensons que les travaux présentés ici pourraient servir de guide de référence pour les chercheurs intéressés par l’étude des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 dans des modèles d’infection parasitaire, leur permettant de choisir la phase idéale de l’infection pour la détection des types cellulaires spécifiques à partir de tissus d’intérêt. Dans l’ensemble, les méthodes décrites ici seront utiles pour évaluer le phénotype et la fonction des lymphocytes T et des cellules ILC2 qui expriment l’IL-9 au cours d’un modèle physiologiquement pertinent d’infection parasitaire, élargissant ainsi notre connaissance de ces cellules et améliorant potentiellement notre compréhension de celles-ci dans d’autres conditions pathologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier José Luis Ramos-Balderas pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par la subvention suivante à PLL de CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P et EO-M ont reçu une bourse du CONACYT (736162 et 481437, respectivement). MCM-M a reçu une bourse du CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie et infection numéro 193 IL-9 Th9 ILC2 cellules lymphoïdes IL-9 parasite intestin grêle N. brasiliensis
Stratégie pour l’étude des cellules lymphoïdes productrices d’IL-9 dans le modèle d’infection à <em>Nippostrongylus brasiliensis</em>
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Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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