Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Abstract

IL-9, antitümör bağışıklığı, alerjik patolojilerin indüklenmesi ve parazitin atılmasında önemli bir rol oynadığı helmint enfeksiyonlarına karşı bağışıklık tepkisi dahil olmak üzere çeşitli süreçlerle ilişkili pleiotropik bir sitokindir. Nippostrongylus brasiliensis enfeksiyonunun murin modelinde, IL-9 esas olarak CD4 + T lenfositleri ve akciğer, ince bağırsak ve drenaj lenf düğümlerinde bulunan doğuştan gelen lenfoid hücreler tarafından üretilir. IL-9'un hücre içi boyanmasında yer alan teknik zorlukların yanı sıra hematopoetik hücrelerin enfeksiyon üzerine ince bağırsaktan izole edilmesinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu modelde farklı lenfoid ve lenfoid olmayan dokularda IL-9 ekspresyonunu analiz etmek için kapsamlı ama basit bir protokole acil bir ihtiyaç vardır. Burada tarif edilen protokol, CD4 + T hücreleri tarafından üretilen IL-9'un kinetiğini ve enfeksiyon boyunca N. brasiliensis tarafından hedeflenen ana organlar olan akciğer ve ince bağırsaktaki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin, ayrıca mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerinin ana hatlarını çizmektedir. Ek olarak, hücre tipine ve ilgilenilen organa bağlı olarak enfeksiyon için gerekli larva sayısını detaylandırır. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyon modelinde ilgi çekici spesifik hücrelere, organlara ve hastalık aşamalarına odaklanma fırsatı sunarak zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için tahlillerin standardizasyonuna yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Introduction

Kancalı kurtlar, çoğunlukla az gelişmiş ülkelerdeki tropikal bölgelerde, dünya çapında yaklaşık 700 milyon insanı enfekte eden bağırsak parazitleridir. İnsanlarda en sık görülen kancalı kurt parazitleri olan Ancylostoma duodenale ve Necator americanus ile yüksek yoğunluklu enfeksiyonlar, gecikmiş büyüme ve zihinsel gelişime neden olabilecek anemi ve proteineksikliğine neden olur 1. N. americanus ve kemirgen paraziti Nippostrongylus brasiliensis, konakçılarında prototipik bir tip 2 immün yanıtı indükler ve yaşam döngülerinde benzerlikleri paylaşırlar. Bu nedenle, farelerin N. brasiliensis ile enfeksiyonu, insan kancalı kurt enfeksiyonları için en yaygın kullanılan modeldir. Evre 3 (L3) N. brasiliensis enfektif larvaları, enfeksiyondan sonraki ilk birkaç saat içinde deriden akciğere hareket eder. Akciğere girdikten sonra, L4 olurlar ve yutulmak, mideden geçmek ve 4-5 gün içinde yetişkin olmak için bağırsağa ulaşmak için trakeadan yukarı göç ederler (L5). Bağırsakta, L5 solucanları, parazit yaşam döngüsünü2 yeniden başlatmak için dışkıda atılan yumurtaları bırakır.

N. brasiliensis tarafından indüklenen immün yanıt, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ve IL-13 dahil olmak üzere çeşitli tip 2 sitokinlerde bir artışın yanı sıra eozinofili, bazofili, kadeh ve mast hücresi hiperplazisi ve artmış IgG1 ve IgE üretimi ile karakterizedir. N. brasiliensis enfeksiyonu üzerine ortaya çıkan immün yanıtları tanımlamaya ve tanımlamaya çalışan çalışmaların çoğu, IL-4 veya IL-13'ün bu model3'teki rolüne odaklanmıştır. Bununla birlikte, IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ve bu sitokinin işlevi, Licona-Limón ve ark., IL-9'un N. brasiliensis'e karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynadığını gösteren ilk çalışmayı yayınlayana kadar büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Muhabir fareleri kullanan bu çalışma, T hücrelerini (çoğunlukla T yardımcı 9) ve tip 2 doğuştan gelen lenfoid hücreleri (ILC2'ler), enfeksiyon4 üzerine IL-9'u eksprese eden ana hücresel alt kümeler olarak tanımlamıştır.

Helmint ile enfekte akciğerlerden immün hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu mümkündür ve kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir 3,4. Bununla birlikte, doğal doku yeniden şekillenmesi ve mukus üretimi nedeniyle, Ferrer-Font ve ark.5'in yakın zamanda yayınlanmasına kadar, enfekte bağırsakta bunu yapmanın teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır. Grup, Heligmosomoides poligyrus ile enfekte murin bağırsaklarından immün alt kümelerin tek hücreli süspansiyonlarını izole etmek ve analiz etmek için bir protokol özetledi. Buna dayanarak, şimdi N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin izolasyonu ve sitometrik analizi için bir protokol standartlaştırdık. Ek olarak, enfeksiyon boyunca farklı hücresel kaynaklardan ve anatomik konumlardan IL-9 kinetiği oluşturduk.

Bu enfeksiyonda yer alan farklı hücre popülasyonlarını karakterize etmek, parazite karşı bağışıklık tepkisinin ve konakçı ile etkileşiminin daha geniş bir şekilde anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bu kapsamlı protokol, IL-9 üreten hücreleri ilgilenilen hastalık aşamalarında istenen organlardan izole etmek ve analiz etmek için net bir yol sağlar ve bu hücrelerin N. brasiliensis enfeksiyonu ve genel olarak parazit enfeksiyonlarındaki rolü hakkındaki bilgilerin keskin bir şekilde iyileştirilmesini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi, Hücresel Fizyoloji Enstitüsü'nün Hayvan Kullanımı İç Komitesi (CICUAL) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Tüm protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Farelerin muhafazası

  1. 12 saatlik aydınlık / karanlık döngülerde sabit sıcaklık ve neme sahip hayvan tesislerinde barındırılan, suya ve yiyeceğe libitum erişimi olan 8-10 haftalık, dişi veya erkek fare gruplarını kullanın.
    NOT: Bu protokol, daha önce açıklandığı gibi C57BL/6 arka planında IL-9 muhabir fare suşu kullanır4; Bununla birlikte, diğer IL-9 muhabir suşları 6,7,8 ve hücre içi IL-9 boyama ile değişken sonuçlar 9 kullanılabilir.

2. Farelerin enfeksiyonu

  1. Farelerin arkasını vücudun ortasından enfeksiyondan 1 gün önce kuyruğun tabanına yakın bir yere tıraş edin. Anestezik kullanımı gerekli değildir.
  2. Subkutan olarak her fareyi, daha önce tarif edildiği gibi, alt sırtta 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS)10'da 200 canlı üçüncü aşama N. brasiliensis larvası (L3) ile aşılayın veya kontrol olarak tek başına 100 μL PBS enjekte edin. Hayvanları enfeksiyon sonrası 4. gün, 7. gün veya 10. günde kurban edin.

3. Akciğer, ince bağırsak, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarının izolasyonu

  1. Servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin. Fareyi sırtına yerleştirin ve% 70 etanol püskürtün. Makas kullanarak orta hat kesisi yapın ve karın ve torasik bölgeleri ortaya çıkarmak için cildi açın.
    NOT: İzofluran alternatif ötanazi yöntemi12 olarak kullanılabilir. CO2 akciğer dokusu hasarına ve kanamaya yol açtığı için karbondioksit odaları önerilmez13.
  2. Mediastinal lenf nodlarının ve akciğerlerin izolasyonu
    1. Sternumda bir kesi yapın ve kaburgaları ve torasik kasları çıkarmak için "V" şeklinde kesin. Torasik kavite açığa çıktıktan sonra, mediastinal lenf düğümlerini yemek borusunun yanında, kalbin altında bulun (bakınız Ek Şekil 1).
    2. Mediastinal lenf nodlarını çıkarın ve bunları 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında (Tablo 1) toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.
      NOT: Bu deneylerde kullanılan muhabir farelerden gelen floresan sinyalinin azalmasını önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.
    3. Akciğerleri çıkarın ve fare başına 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.
  3. Mezenterik lenf nodu zincirlerinin ve ince bağırsakların izolasyonu
    1. Peritoneal boşluğu açığa çıkarın ve kolon boyunca mezenterik lenf nodu (MLN) zincirini açığa çıkarmak için ince bağırsağı dikkatlice sağa hareket ettirin.
    2. Forseps kullanarak, MLN'yi çıkarın, bir kağıt havlu üzerinde yavaşça yuvarlayın ve yağı çekin.
    3. MLN'yi 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamına aktarın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.
    4. İnce bağırsağı pilor sfinkterin hemen altında ve çekumun üstünde kesin. Forseps yardımıyla bağırsağı yavaşça dışarı çekin, bağlı mezenter ve yağ dokusunu çıkarın.
    5. İnce bağırsağı bir kağıt havluya yerleştirin ve PBS ile cömertçe nemlendirin. Peyer'in yamalarını ince bağırsaktan makasla çıkarın.
      NOT: Canlılığı korumak için, kalan yağ dokusunu çıkarın ve tüm işlem boyunca PBS ile ince bağırsağı nemli tutun.
    6. İnce bağırsağı makas kullanarak uzunlamasına kesin ve dışkı içeriğini ve mukusları çıkarmak için forsepsleri açık bağırsak üzerinde yavaşça kaydırın.
    7. İnce bağırsağı forsepslerle tutun ve birkaç kez dikkatlice batırarak buz üzerinde 5 mL PBS içinde yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    8. İnce bağırsağı kısa parçalara ayırın (yaklaşık 5 mm) ve% 2 FBS ile 10 mL HBSS14 içeren 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın (Tablo 1). Hemen intraepitelyal ve lamina propria hücrelerini izole etmeye devam edin.

4. İnce bağırsak, akciğer ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması

NOT: İnce bağırsaklardan tek hücreli süspansiyonlar hazırlarken kişi başına maksimum altı farenin işlenmesi son derece önemlidir, çünkü hücre canlılığı daha uzun işlem süreleriyle önemli ölçüde azalır. Bu yöntem Heligmosomoides polygyrus enfeksiyon faresi model5'ten uyarlanmıştır.

  1. Sallanan inkübatör, R-20 ortam, HBSS ve HBSS-2 mM EDTA'yı (Tablo 1) 37 ° C'de önceden ısıtın.
  2. Örnek başına 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.
  3. Bağırsak parçalarını 3.3.8 adımından elle kuvvetlice sallayın.
  4. Her numuneyi bir cam huni üzerinde naylon bir ağdan (yaklaşık 10 cm x 10 cm) süzün. Numuneyi, ağın üzerine 10 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyerek yıkayın ve akışı atın. Bir kez daha tekrarlayın.
    NOT: Her numune için yeni bir ağ kullanın ve prosedür boyunca yeniden kullanın.
  5. Ağı huniden çıkarın ve numuneyi ağdan 10 mL sıcak HBSS-2 mM EDTA (adım 4.1) ile 50 mL konik bir tüp içinde toplayın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın.
  6. Maksimum hızda (3.200 rpm) 10 s vorteks yapın ve numuneyi bir cam huni üzerinde ağ ile filtreleyerek akışı 50 mL konik bir tüpte geri kazanın.
  7. 4,5 ve 4,6 numaralı adımları iki kez tekrarlayın ve aynı 50 mL konik tüpteki akışı geri kazanın. İntraepitelyal hücreler bu 30 mL fraksiyonda bulunur. Kalan dokuyu kaydedin.
  8. İntraepitel hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    1. 4.7. adımda geri kazanılan 30 mL'lik hücre süspansiyonunu, oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.
    2. RT'de 5 dakika boyunca 5 mL PBS ekleyin ve 450 x g'de santrifüj yapın.
    3. Hücre peletini 3 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın (Tablo 1). Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.
  9. Lamina propria hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    1. Kalan ince bağırsak dokusunu, huni üzerindeki ağdan 10 mL'nin üzerine ılık HBSS dökerek adım 4.7'den yıkayın. Yıkamayı tekrarlayın. Dokuyu ağdan 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı ile 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın.
    2. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın. Her 5 dakikada bir 10 s maksimum hızda vorteks.
    3. Sindirim reaksiyonunu durdurmak için 10 mL FACS-EDTA tamponu ekleyin (Tablo 1) ve buzun üzerine yerleştirin.
    4. Her numuneyi serolojik bir pipet kullanarak 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve süspansiyonu buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik konik bir tüpte geri kazanın.
    5. 4 °C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj.
    6. Süper natantı atın. Hücre peletini 5 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.
    7. Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın. Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.
  10. Akciğerden tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    NOT: Her akciğer ve ince bağırsak, uzun kullanım sürelerinden kaçınmak için iki kişi tarafından paralel olarak işlenmelidir, bu da düşük hücre canlılığına neden olur.
    1. İşlenen numune başına 4 mL akciğer sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.
    2. RPMI ortamını akciğerleri içeren kuyudan adım 3.2.3'ten çıkarın. Akciğeri ince makasla küçük parçalara ayırın.
    3. Akciğer parçalarını spatula ile 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 mL akciğer sindirim ortamı ekleyin (Tablo 1).
    4. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 250 rpm'de sallayın. İşiniz bittiğinde, her numune işlenene kadar buz üzerinde tutun.
    5. Her numuneyi, 6 delikli bir kültür plakasının tek bir kuyucuğuna yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Dokuyu bir şırınga pistonu ile ayırın.
    6. Her numuneyi 15 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamı ekleyin (Tablo 1). Diğer numuneler işlenirken buz üzerinde tutun.
    7. 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-5 ortamında yeniden askıya alın (Tablo 1).
    8. Santrifüj yaparken, hematopoetik hücre fraksiyonu 15,16'yı zenginleştirmek için numune başına 4 mL% 27.5 yoğunluk-gradyan çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. Tek hücreli ayırma stratejisi, diğer benzer yoğunluk gradyan ortamlarına kıyasla daha verimli, uygun maliyetli ve daha az toksiktir17.
    9. Adım 4.10.7'den itibaren 1 mL'lik hücre süspansiyonuna 4 mL% 27.5 yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.
    10. İki faz oluşturmak için karışık süspansiyonun üzerine yavaşça 1 mL R-5 ortamı (Tablo 1) ekleyin.
    11. RT'de 20 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj, düşük hızlanma ve fren kapalı. İki faz arasında oluşan halkayı gözlemleyin.
    12. İki faz arasında oluşan halkayı 1 mL mikropipet ile geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamında yeniden askıya alın.
    13. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın. Hücre peletini 1 mL ACK tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın ve RT'de 1 dakika inkübe edin.
    14. 4 mL R-5 orta ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun.
  11. Lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyon preparatı
    1. Lenf düğümlerini 3.2.2 veya 3.3.3 adımlarından iki ağ parçası arasına 6 delikli bir kültür plakasından bir kuyucuk içine yerleştirin ve bir şırınga pistonu ile ayrışın.
    2. Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.
    3. Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun.
      NOT: Kümeler görülebiliyorsa, numuneyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.

5. Akım sitometrisi için hücre boyama (Şekil 2 ve Şekil 3)

NOT: Lenf nodu hücre süspansiyonlarını 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de 4.11.3 adımından santrifüj edin ve hücre peletini 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın (Tablo 1).

  1. ILC2'lerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 3 ve Ek Şekil 2)
    NOT: Bu boyama prosedürü, IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerinin tanımlanması için spesifiktir.
    1. Adım 4.10.14'ten akciğer örneği başına plaka 150 μL (yaklaşık 1.8 x 10 6 hücre) ve 4.11.3 adımından itibaren lenf nodu örneği başına 50 μL (sırasıyla mediastinalve mezenterik lenf nodu örnekleri için yaklaşık 0.7 x 10 6 ve 2.2 x 106 hücre) 96 kuyucuklu konik alt kültür plakasında. 100 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.
    2. İnce bağırsak numunesi başına plaka 100 μL (intraepitelyal ve lamina propria örnekleri için sırasıyla yaklaşık 2.7 x 10 6 ve 0.6 x 10 6 hücre)96 kuyucuklu bir konik alt kültür plakasında 4.8.3ve 4.9.7 adımlarından. 150 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.
    3. Süpernatanı atın ve her hücre peletini FACS tamponunda seyreltilmiş biyotinile antikor kokteylinin 50 μL'sinde (Tablo 2) yeniden askıya alın. Işıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: İntraepitelyal ve lamina propria numuneleri için 20 μg/mL DNaz içeren FACS tamponu kullanın.
    4. 150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.
    5. Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın.
    6. Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 2) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    7. 150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.
    8. Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın. Yıkamayı tekrarlayın (adım 5.1.7) ve süpernatanı atın.
    9. Hücre peletini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin.
    10. İnce bağırsak ve akciğer örnekleri için geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 3A, B ve Ek Şekil 2A). Lenf nodu örnekleri için geçit stratejisini kullanın: canlı hücreler, tek hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Ek Şekil 2B, C).
  2. IL-9 üreten lenfositlerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 2 ve Ek Şekil 3)
    1. Akciğer örneği başına 800 μL'yi adım 4.10.14'ten 1.5 mL'lik bir tüpe (yaklaşık 14.6 x 106 hücre) aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın.
    2. Lenf nodu örnekleri için, 4.11.3 adımından itibaren hücre süspansiyonunun 400 μL'lik plakası (mediastinal ve mezenterik lenf nodu örnekleri için sırasıyla yaklaşık 5.6 x 10 6ve 17.5 x 106 hücre) iki adımda 96 kuyucuklu konik bir alt plakada.
      1. Önce 200 μL aktarın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
      2. İlgili kuyuya 200 μL daha aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
    3. Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50-400 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 3) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Akciğer örnekleri 400 μL'de, mediastinal lenf nodu örnekleri 50 μL'de ve mezenterik lenf nodu örnekleri boyama kokteylinin 100 μL'sinde yeniden askıya alınmalıdır.
    4. Mediastinal lenf nodu örneklerine 150 μL FACS tamponu ve mezenterik lenf nodu örneklerine 100 μL ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
    5. Akciğer ve lenf nodu örneklerini, peletleri sırasıyla 1 mL ve 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alarak yıkayın. 4 °C'de 5dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve yıkamayı tekrarlayın.
    6. Akciğer örneklerini 600 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve bunları akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2A).
    7. Lenf nodu örneklerini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2B ve Ek Şekil 3A).

6. Tek hücreli süspansiyonlarda mutlak hücre sayısının belirlenmesi

  1. 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 ve 4.11.3 numaralı izolasyon adımlarından alınan numuneleri PBS ile 1:20 oranında (10 μL numune + 190 μL PBS) seyreltin.
  2. Adım 6.1'den itibaren seyreltilmiş her numunenin 10 μL'sini 10 μL Tripan Mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL yükleyin ve her seyreltmeyi göz önünde bulundurarak canlı hücreleri sayın.
  3. Akış sitometrisi (canlılık boyası negatif hücreleri) ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgili popülasyonun yüzdesini, izolasyondan sonra tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısıyla çarparak ve bu sayıyı 100'e bölerek mutlak hücre sayılarını elde edin (Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6).
    Mutlak sayı = (Akış sitometrisi ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgi popülasyonunun yüzdesi x Tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısı)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farelere deri altından 200 L3 evre N. brasiliensis larvası veya sahte kontroller için PBS enjekte edildi. Bu protokolde kullanılan larva sayısı, canlı hücreleri akciğerlerden, lenfoid dokudan ve ince bağırsaktan izole etmek için ayarlandı, lenfoid dokulardaki ve akciğerlerdeki hücreleri tespit etmek için daha yüksek solucan yüklerinin kullanıldığı önceki raporların aksine, sadece4. Akciğerler, mediastinal lenf nodları, mezenterik lenf nodları ve ince bağırsak, lenfosit izolasyonu ve IL-9 üreten popülasyonların karakterizasyonu için enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde hasat edildi. Analiz edilen zaman noktası başına dokuz kontrol ve dört ila altı N. brasiliensis ile enfekte olmuş fare dahil olmak üzere iki veya daha fazla bağımsız deneyde toplam 27 fare kullanılmıştır. Bazal sayıları elde etmek için her deneye sahte enfekte kontroller dahil edildi. Bu protokolü kullanarak, IL-9 üreten CD4 + T hücreleri (bu modelde çoğunlukla Th9 hücreleri), nicelleştirme ve daha ileri analiz için akciğer, mezenterik ve mediastinal lenf düğümlerinden izole edilebilir.

Enfeksiyonun doğal seyrini takiben, ilk olarak akciğerlerde ve mediastinal lenf nodlarında bulunan IL-9 üreten CD4 + T lenfositlerin (Th9) frekanslarını değerlendirdik (Şekil 2A ve Ek Şekil 3A'da gösterilen geçiş stratejisi). Her iki organda da, Th9 frekansları 4. günden başlayarak artmış ve enfeksiyon sonrası 7. günde zirveye ulaşmıştır (Şekil 2C), Th9 mutlak sayılarında da gözlenen bir artış (Ek Şekil 4A, B). Mezenterik lenf nodlarında (Şekil 2B'de gösterilen geçit stratejisi), önceki raporlar 4'e uygun olarak, enfeksiyon sonrası 7. ve 10. günlerde Th9 hücrelerinin hem frekanslarında hem de mutlak sayılarında anlamlı bir artış olmuştur (Şekil 2C ve Ek Şekil 4C). İntraepitelyal ve lamina propria örneklerinde T hücrelerinin ve ILC2'lerin varlığı doğrulandı; Bununla birlikte, enfeksiyon boyunca bu bağırsak bölmelerinde Th9 hücresi gözlenmedi (Ek Şekil 3B, C).

Daha sonra enfekte farelerin lenfoid ve lenfoid olmayan dokularında IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerini değerlendirdik ( Şekil 3A, B ve Ek Şekil 2'de gösterilen geçit stratejisi). Enfeksiyon sonrası 7. günde akciğerlerde ILC2 eksprese eden ST2+ IL-9- ve ST2+ IL-9+ frekanslarında anlamlı bir artış gözlemledik (Şekil 3C). Aynı zamanda, mutlak sayıların analizi, enfeksiyon sonrası 7. günde sadece ST2 + IL-9 + popülasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur (Ek Şekil 5A). Mediastinal lenf nodlarında ( Ek Şekil 2B'de gösterilen geçit stratejisi), IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerinin (ST2 + IL-9+) sayısı enfeksiyon sonrası 10. günde önemli ölçüde artarken, ST2 + hücrelerinin mutlak sayısı 7. günden başlayıp enfeksiyon sonrası 10. güne kadar devam eden bir artış eğilimi göstermiştir (Ek Şekil 6A, C).

IL-9+ ILC2 hücreleri ayrıca ince bağırsağın lamina propriasında ve intraepitelyal kompartmanlarında da bulundu (Şekil 3B ve Ek Şekil 2A'da gösterilen geçit stratejisi). N. brasiliensis enfeksiyonu, lamina propriada 4. günde ST2 + IL-9 + hücrelerinin frekanslarında ve 7. ve 10. günlerde ST2-IL-9 + popülasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olmuştur. İntraepitelyal kompartmanda, ST2+ IL9+ ve ST2-IL-9+ hücrelerinin frekanslarında enfeksiyon sonrası sırasıyla 7. gün ve 10. günde anlamlı bir değişiklik gözlenmiştir (Şekil 3C). Önemli olarak, nispeten düşük sayıda larva yüküyle bile, parazit ile enfeksiyon ince bağırsakta geniş hasara neden oldu; Bu nedenle, IL-9'u ifade eden ILC2'lerin mutlak sayılarının analizi teknik olarak mümkün değildir ve canlı hücrelerin düşük verimi nedeniyle bu popülasyonun doğru bir şekilde ölçülmesini engellemektedir (Ek Şekil 5B, C). Öte yandan, mezenterik lenf nodlarının analizi (Ek Şekil 2C'de gösterilen geçit stratejisi), dahaönce bildirildiği gibi, enfeksiyon sonrası 10. günde ST2 + IL-9-, ST2 + IL-9 + ve ST2- IL-9 + ILC2 hücrelerinin mutlak sayılarında anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur (Ek Şekil 6D). Bu arada, enfeksiyon boyunca bu popülasyonların frekanslarında hiçbir fark gözlenmedi (Ek Şekil 6B). ST2 ve IL-9 eksprese eden hücrelerin bu çeşitli alt kümeleri, in vivo olarak potansiyel olarak farklı rollere sahip ilgi çekici popülasyonlardır ve yakın zamanda tanımlandığı gibi doğal ve enflamatuar ILC2'lere karşılık gelebilir 18,19,20,21. Bununla birlikte, bunun gelecekteki çalışmalarda ele alınması gerekmektedir.

Özetle, bu protokolü IL-9 eksprese eden hücrelerin N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan geri kazanılması için ayarladık, ancak yine de akciğer ve lenfoid dokuda tespit edebildik. Bağışıklık hücrelerini parazitle enfekte olmuş bağırsaklardan almanın teknik olarak zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, enfeksiyon için kullanılan ayarlanmış sayıda larva, IL-9 + popülasyonunun iyileşmesine izin veren bağırsak dokusu bütünlüğünün iyileşmesine neden oldu. Bildiğimiz kadarıyla, bu, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında bağırsaktaki IL-9 eksprese eden hücrelerin analizi için özel olarak geliştirilen ilk protokoldür. Bununla birlikte, diğer bağışıklık hücreleri de bu adımları izleyerek izole edilebilir. Burada sunulan veriler, ince bağırsaktaki dokuda yerleşik IL-9 eksprese eden hücrelerin çoğunun ILC2'ler olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Açıklanan protokolün akış şeması. Farklı organları işlemek için kullanılan ana adımları ve beklenen IL-9-eksprese eden hücre alt kümelerini içeren şematik diyagram. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Th9 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu boyunca akciğerlerde, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarında bulunur. (A) akciğerlerden ve (B) mezenterik lenf nodlarından Th9 hücre tanımlaması için kullanılan temsili akım sitometri analizi ve geçit stratejisi. Her organdan alınan tek hücreli süspansiyonlar, hematopoetik hücrelerin tanımlanması için floresan olarak etiketlenmiş anti-CD45 ve CD4 + T lenfositlerin tanımlanması için anti-T-hücre reseptörü (TCR) β ve anti-CD4 ile sabitlenebilir bir canlılık boyası ile boyandı. GFP + sinyali, mevcut Th9 hücrelerinin yüzdesini gösterir. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile yan saçılma (SSC)-A/ileri saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından CD45+ hücreleri geldi. Bu popülasyonda, GFP + hücrelerinin Th9 hücreleri olarak tanımlandığı TCR-β ve CD4 çift pozitif hücrelere odaklandık. Lenf düğümlerinin boyanması anti-CD45 antikorunu içermiyordu, çünkü tüm popülasyonun pozitif olması bekleniyordu. (C) Enfeksiyon sonrası belirtilen zamanlarda akciğerlerde, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarında bulunan Th9 hücrelerinin frekansları. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; Eşleşmemiş T-testi; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: IL-9 üreten ILC2 hücreleri lenfoid olmayan organlarda bulunur. (A) akciğer ve (B) ince bağırsak lamina propriasından IL-9+ ILC2 hücrelerinin tanımlanmasında kullanılan temsili akım sitometri analizi ve geçit stratejisi. Her organdan tek hücreli süspansiyonlar, soy hücrelerini (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ve anti-Ter119) ve Fc-Block'u tanımlamak için biyotinile antikorlarla işaretlendi. Hücre süspansiyonları daha sonra sabitlenebilir canlılık boyası, florokrom etiketli streptavidin, hematopoetik hücrelerin tanımlanması için anti-CD45 ve ILC2 hücrelerinin tanımlanması için anti-CD90 ile boyandı. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile saçılma (SSC)-A/yan saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından CD45+ hücreleri geldi. Bu popülasyonda, CD90 + lin- hücrelerine odaklandık; Bu gruptan ST2 ve GFP ekspresyonunu değerlendirerek IL-9+ ILC2 hücrelerini tanımladık. (C) Akciğerlerde, lamina propria'da ve intraepitelyal hücre bölmesinde belirtilen zamanlarda bulunan ILC2 hücrelerinin frekansları enfeksiyon sonrası noktalar. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi; *p 0,05 ≤. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kimyasal çözeltilerin ve bileşimlerinin listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: IL-9 üreten ILC2 hücrelerini tanımlamak için antikor kokteyli. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: IL-9 üreten T lenfositleri tanımlamak için antikor kokteyli. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Mediastinal lenf nodu lokalizasyonunun şematik gösterimi. Created in BioRender.com Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: İnce bağırsak ve lenf nodlarından intraepitelyal hücreler içindeki IL-9+ ILC2'leri tanımlamak için kullanılan temsili akım sitometrisi ve geçit stratejisi. (A) İnce bağırsak intraepitel hücrelerinden tek hücreli süspansiyonlar ilk olarak soy hücrelerini (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ve anti-Ter119) ve Fc-Block'u seçmek için biyotin etiketli antikorlarla inkübe edildi. Bunu, sabitlenebilir bir canlılık boyası, florokrom etiketli streptavidin, hematopoetik hücrelerin tanımlanması için anti-CD45 ve ILC2 hücrelerinin tanımlanması için anti-CD90 ile boyama izledi. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile yan saçılma (SSC)-A/ileri saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından CD45+ hücreleri geldi. Bu popülasyonda, CD90 + lin- hücrelerine odaklandık; Bu gruptan GFP+ hücreleri IL-9+ ILC2 hücreleri olarak tanımlandı. (B,C) IL-9+ ILC2 hücrelerini tanımlamak için (B) mediastinal lenf nodları ve (C) mezenterik lenf nodları için temsili akım sitometrisi ve geçit stratejisi. Lenf nodlarının boyanması anti-CD45 antikorunu içermiyordu, çünkü tüm popülasyonun pozitif olması bekleniyordu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Mediastinal lenf nodlarında ve ince bağırsakta Th9 hücrelerini tanımlamak için kullanılan temsili akım sitometri analizi ve geçit stratejisi. (A) mediastinal lenf nodlarından tek hücreli süspansiyonlar, sabitlenebilir bir canlılık boyası ve floresan olarak etiketlenmiş anti-TCR-β ve anti-CD4 antikorları ile boyandı. İlk kapı, lenfoid hücrelerin klasik morfolojisi ile yan saçılma (SSC)-A/ileri saçılma (FSC)-A özelliklerini gösterir. Tek hücreli olaylar seçildi, ardından canlı hücreler ve ardından TCR-β ve CD4 çift pozitif hücreler; Bu gruptan GFP+ hücreleri Th9 hücreleri olarak tanımlandı. İnce bağırsaktan (B) lamina propria ve (C) intraepitelyal hücreler için benzer bir akış sitometri stratejisi kullanıldı, ancak CD45 + hücreleri canlı hücrelerden sonra seçildi, ardından GFP + hücrelerinin Th9 hücreleri olarak tanımlandığı TCR-β ve CD4 çift pozitif hücreler izledi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Th9 hücrelerinin mutlak sayısı enfeksiyon boyunca önemli ölçüde değişir. TCR-β ve CD4 çift pozitif hücrelerden IL-9+ hücrelerinin mutlak sayıları, (A) akciğer, (B) mediastinal lenf nodları ve (C) mezenterik lenf nodlarında enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde belirlendi. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi *p 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001 ≤. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: IL-9 + ILC2 hücrelerinin mutlak sayıları enfeksiyon boyunca farklılık gösterir. Enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde lin-CD90+ popülasyonundan IL-9+ ILC2 hücrelerinin mutlak sayıları (A) akciğer, (B) lamina propria ve (C) ince bağırsaktan intraepitelyal hücrelerde belirlendi. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi *p ≤ 0.05. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 6: Lenf nodlarındaki IL-9+ ILC2 hücrelerinin frekansları ve mutlak sayıları enfeksiyon sırasında önemli ölçüde artar. (A) Mediastinal lenf nodlarından IL-9+ ILC2 hücrelerinin sıklığı ve (C) mutlak sayıları. (B) Mezenterik lenf nodlarından IL-9+ ILC2 hücrelerinin sıklığı ve (D) mutlak sayıları. Değerler, enfeksiyon sonrası 0, 4, 7 ve 10. günlerde lin-CD90+ popülasyonu içinde IL-9+ ILC2 hücreleri olarak belirlendi. Veriler, zaman noktası başına üç bağımsız deneyden, grup başına analiz edilen bir veya iki farenin ortalama ± SEM'ini temsil eder; eşlenmemiş T-testi * p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.0001. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 7: N. brasiliensis ile enfekte bağırsaktan ILC2 hücrelerini eksprese eden IL-9'un akış sitometrisi analizi. Enfeksiyon sonrası 7. günde IL-9-muhabir farelerin bağırsağından izole edilen ILC2 hücrelerinin temsili grafikleri. IL-9 ekspresyonu, enfekte muhabir farelerin (IL-9 REP) intraepitelyal veya lamina propria bölmelerinden yeni izole edilmiş ILC2 hücrelerinde, daha önce tarif edilen IL-9 hücre içi boyama protokolü 9'u (IL-9 AB, bir IL-9 antikor klonu RM9A4, BioLegend kullanılarak) takiben değerlendirildi. IL-9 eksprese eden ILC2'leri tanımlamak için, tek hücreli süspansiyonlar ilk önce soy hücrelerini (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 ve anti-Ter119) ve Fc-Block seçmek için biyotin etiketli antikorlarla inkübe edildi, ardından esnek canlılık boyası, florokrom etiketli streptavidin, anti-CD45 ve anti-CD90 ile boyandı. Grafikler, intraepitelyal (A,B) ve lamina propria (C,D) bölmelerinde bulunan lin-CD45+CD90+ popülasyonu üzerinde geçitli, taze izole edilmiş hücrelerden (A,C) gelen muhabir sinyaliyle veya IL-9'un (B,D) hücre içi boyanmasını takiben tespit edilen IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerini göstermektedir. Kontrol farelerine PBS enjekte edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İntestinal parazit-konakçı etkileşimlerinin ve helmint enfeksiyonuna karşı immün yanıtların tam olarak anlaşılması, doku yeniden şekillenmesi ve solucan kovulmasının indüksiyonu için anahtar olan farklı hücre popülasyonlarının ve efektör moleküllerinin tanımlanmasını ve analiz edilmesini gerektirir. Topraktan bulaşan helmint enfeksiyonları, dünyadaki gelişmekte olan ülkelerde büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, bu enfeksiyondan etkilenen ana organ olan ince bağırsakta bulunan nadir hücre popülasyonlarının analizine izin veren bir protokol mevcut değildi5. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında akciğer, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarındaki IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin akış sitometrik analizine izin veren daha önce tanımlanmış yöntemleri kapsar ve bu popülasyonun ince bağırsakta ilk kez tanımlanmasının ek avantajı vardır.

Bu protokolün başarısı büyük ölçüde doku işleme sürelerine bağlıdır. Kişi başına aynı anda en fazla altı ince bağırsak örneğinin işlenmesi zorunludur. Farklı organlar işlenecekse, başka bir kişi tarafından paralel olarak yapılmasını öneririz. Nispeten düşük bir parazit yükü (200 L3 larva) kullanarak, bu protokol, lenfoid hücrelerin N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan izole edilmesine izin verirken, bu hücreleri diğer organlardan izole etme yeteneğini korur. Daha yüksek parazit yüklerinin kullanılması, ince bağırsaktan izole edilen hücrelerin kalitesini ve miktarını tehlikeye atar (veriler gösterilmemiştir); Bununla birlikte, diğer organlarda IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin önemli bir artışına neden olabilir4. Bağırsak ve mezenterik lenf düğümlerini işlerken, yapışmış yağ dokusunun çıkarılması kritik öneme sahiptir, çünkü bunun yapılmaması hücre ölümünün artmasına neden olur. Veriler, enfeksiyonun doğal seyrinin ince bağırsaktan kurtarılan lenfoid hücrelerin mutlak sayısını olumsuz yönde etkilediği gözlemini desteklemektedir. Burada açıklanan çalışmalarda, IL-9 + ILC2 hücrelerinin frekansları tutarlı kalırken, mutlak sayılar her bağımsız deneyde yüksek değişkenlik göstermektedir. Bu nedenle, mutlak sayılardan çıkarılan sonuçlar yanlış olabilir ve kaçınılmalıdır. Ek olarak, dokularda IL-9 eksprese eden T hücrelerinin düşük sıklığı göz önüne alındığında, mümkün olan en yüksek sayıda hücrenin elde edilmesi ve boyanması önerilir.

Bu ILC2 analizinin bir sınırlaması, bu popülasyonu tanımlamak için ayrı bir belirteç kombinasyonunun kullanılmasıdır. İlgilenilen dokuya ve enfeksiyon evresine bağlı olarak, CD25, Klrg1 ve ST2 gibi ek belirteçler, ILC2 hücrelerinin22 daha ayrıntılı bir fenotipik karakterizasyonu için kullanılabilir. Burada sunulan protokolün INFER muhabiri fare suşu4'e dayandığını ve IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması için bir avantaj oluşturabileceğini kabul ediyoruz. Bununla birlikte, burada bulunan sonuçların, diğer fare muhabiri suşlarının kullanımı ve hücre içi IL-9 boyama 6,7,8,9 dahil olmak üzere alternatif stratejiler kullanılarak elde edilebileceğini umuyoruz. Konvansiyonel farelerin kullanılması ve intraepitelyal ve lamina propria hücrelerinde IL-9'un hücre içi boyanmasının yapılmasının, saptanabilir herhangi bir sinyalin kaybedilmesine ve elde edilen verilerin tehlikeye atılmasına neden olabileceğini belirtmek önemlidir (Ek Şekil 7). Bunun nedeni, ex vivo izole edilmesi ve sürdürülmesi zaten zor olan bir alt kümeyi boyamak için gereken uzun vadeli manipülasyon olabilir. Bu nedenle, işlem sürelerini azaltmak ve IL-9 ekspresyonunun in vivo olarak güvenilir bir analizini sağlamak için muhabir fare suşlarının kullanılmasını öneririz. Ayrıca, Th9 hücrelerinin IL-923'ü eksprese eden tek T hücresi olmadığı gerçeğini de kabul ediyoruz; ancak, bu parazitik modelde, diğer alt kümelerin bunu ifade etmesini beklemeyiz. Bununla birlikte, tarif edilen bağlamda diğer IL-9 eksprese eden alt kümelerin varlığını atmak için, transkripsiyonel belirteçlerin kullanımı ile birlikte tip 2 sitokinlerin tam bir karakterizasyonu mümkündür.

IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin enfeksiyon sonrası 5. günden önce nicelleştirilmesi daha önce bildirilmiştir; ancak, çok düşük hücre frekansları ile sonuçlanır4. Bu çalışmadaki protokol, parazit klirensinin başlangıcına kadar N. brasiliensis enfeksiyonu kinetiğinin büyük bir bölümünü kapsamaktadır2. Bununla birlikte, bu çalışmadaki bazı hücre popülasyonlarının analiz edilen zaman dilimi içinde bazal seviyelere dönmediğini fark ettik, bu da çalışmanın, enfeksiyonun in vivo daha ileri bir aşamasında bu hücrelerin davranışı hakkında tam bir bakış açısına sahip olmak için genişletilmiş zaman noktalarından yararlanabileceğini düşündürmektedir. Ne olursa olsun, burada sunulan çalışmanın, parazit enfeksiyonu modellerinde IL-9 eksprese eden lenfoid hücreleri incelemek isteyen araştırmacılar için bir referans rehberi olarak hizmet edebileceğine ve spesifik hücre tiplerinin ilgili dokulardan tespiti için ideal enfeksiyon aşamasını seçmelerine izin verebileceğine inanıyoruz. Toplamda, burada açıklanan yöntemler, fizyolojik olarak ilgili bir parazit enfeksiyonu modeli sırasında IL-9'u eksprese eden T lenfositlerin ve ILC2 hücrelerinin fenotipini ve işlevini değerlendirmek, bu hücreler hakkındaki bilgimizi genişletmek ve potansiyel olarak diğer patolojik durumlarda onları anlamamızı geliştirmek için yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, José Luis Ramos-Balderas'a teknik desteği için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, CONACYT'den (fordecyt-pronace-303027) PLL'ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir. OM-P ve EO-M, CONACIST'ten (sırasıyla 736162 ve 481437) bir burs aldı. MCM-M, CONACIST'ten burs aldı (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 lenfoid hücreler parazit ince bağırsak N. brasiliensis
<em>Nippostrongylus brasiliensis</em> Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter