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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

Las células T e ILC2 que expresan IL-9 se inducen durante la infección por N. brasiliensis , sin embargo, su caracterización se ha pasado por alto en gran medida en el intestino infectado debido a su baja frecuencia y cinética diferencial. Este protocolo describe el aislamiento de estas células de diferentes órganos diana y la confirmación de su identidad mediante citometría de flujo en diferentes etapas de infección.

Abstract

IL-9 es una citocina pleiotrópica asociada con diversos procesos, incluida la inmunidad antitumoral, la inducción de patologías alérgicas y la respuesta inmune contra las infecciones por helmintos, donde desempeña un papel importante en la expulsión del parásito. En un modelo murino de infección por Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 es producida principalmente por linfocitos T CD4 + y células linfoides innatas que se encuentran en el pulmón, el intestino delgado y los ganglios linfáticos drenantes. Dadas las dificultades técnicas involucradas en la tinción intracelular de IL-9, así como la complejidad de aislar células hematopoyéticas del intestino delgado tras la infección, existe una necesidad apremiante de un protocolo completo pero directo para analizar la expresión de IL-9 en diferentes tejidos linfoides y no linfoides en este modelo. El protocolo descrito aquí describe la cinética de IL-9 producida por las células T CD4 + y las células linfoides innatas en el pulmón y el intestino delgado, los principales órganos dirigidos por N. brasiliensis, así como en los ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, a lo largo de la infección. Además, detalla el número de larvas necesarias para la infección, dependiendo del tipo de célula y órgano de interés. Este protocolo tiene como objetivo ayudar en la estandarización de ensayos para ahorrar tiempo y recursos al ofrecer la oportunidad de centrarse en las células, órganos y etapas específicas de la enfermedad de interés en el modelo de infección por N. brasiliensis.

Introduction

Los anquilostomas son parásitos intestinales que infectan a aproximadamente 700 millones de personas en todo el mundo, principalmente en áreas tropicales de países subdesarrollados. Las infecciones de alta intensidad con Ancylostoma duodenale y Necator americanus, los parásitos anquilostomas más comunes en humanos, causan anemia y deficiencia de proteínas que pueden resultar en retraso en el crecimiento y el desarrollo mental1. N. americanus y el parásito roedor Nippostrongylus brasiliensis inducen una respuesta inmune prototípica tipo 2 en su huésped y comparten similitudes en su ciclo de vida. Por lo tanto, la infección de ratones con N. brasiliensis es el modelo más comúnmente utilizado para las infecciones por anquilostomas humanas. Estadio 3 (L3) Las larvas infecciosas de N. brasiliensis se mueven de la piel al pulmón en las primeras horas después de la infección. Una vez en el pulmón, se convierten en L4 y migran por la tráquea para ser tragados, pasan a través del estómago y llegan al intestino para convertirse en adultos (L5) dentro de 4-5 días. En el intestino, los gusanos L5 ponen huevos que se excretan en las heces para reiniciar el ciclo de vida del parásito2.

La respuesta inmune inducida por N. brasiliensis se caracteriza por un aumento en varias citoquinas tipo 2, incluyendo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, junto con eosinofilia, basofilia, cáliz e hiperplasia de mastocitos, y una mayor producción de IgG1 e IgE. La mayoría de los estudios que intentan identificar y definir las respuestas inmunes provocadas por la infección por N. brasiliensis se centran en el papel de IL-4 o IL-13 en este modelo3. Sin embargo, la identificación y caracterización de las células que expresan IL-9 y la función de esta citoquina se habían pasado por alto en gran medida, hasta que Licona-Limón et al. publicaron el primer estudio que demuestra un papel crítico para IL-9 en la respuesta inmune contra N. brasiliensis. Utilizando ratones reporteros, este estudio describió las células T (principalmente T helper 9) y las células linfoides innatas tipo 2 (ILC2) como los principales subconjuntos celulares que expresan IL-9 tras la infección4.

El aislamiento y la caracterización de las células inmunes de los pulmones infectados por helmintos es factible, y ha sido ampliamente reportado 3,4. Sin embargo, debido a la remodelación tisular inherente y la producción de moco, hacerlo en el intestino infectado resultó ser un desafío técnico, hasta la reciente publicación de Ferrer-Font et al.5. El grupo describió un protocolo para aislar y analizar suspensiones unicelulares de subconjuntos inmunes de intestinos murinos infectados con Heligmosomoides polygyrus. Basándonos en él, ahora hemos estandarizado un protocolo para el aislamiento y el análisis citométrico de las células linfoides que expresan IL-9 del intestino infectado por N. brasiliensis. Además, hemos establecido la cinética de IL-9 a partir de diferentes fuentes celulares y ubicaciones anatómicas a lo largo de la infección.

La caracterización de las distintas poblaciones celulares involucradas en esta infección es vital para una comprensión más amplia de la respuesta inmune al parásito y su interacción con el huésped. Este protocolo integral proporciona una ruta clara para aislar y analizar las células productoras de IL-9 de los órganos deseados en las etapas de interés de la enfermedad, lo que permite una mejora aguda del conocimiento sobre el papel de estas células en la infección por N. brasiliensis y las infecciones parasitarias en general.

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Protocol

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Interno de Manejo Animal (CICUAL) del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México.

NOTA: En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo de todo el protocolo.

1. Alojamiento de ratones

  1. Utilizar grupos de ratones hembra o macho de 8-10 semanas de edad, alojados en instalaciones para animales con temperatura y humedad constantes en ciclos de luz/oscuridad de 12 h, con acceso ad libitum a agua y alimentos.
    NOTA: Este protocolo utiliza una cepa de ratón reportero IL-9 en el fondo C57BL/6, como se describió anteriormente4; sin embargo, otras cepas reporteras de IL-9 podrían ser utilizadas 6,7,8, así como tinción intracelular de IL-9, con resultados variables9.

2. Infección de ratones

  1. Afeite la espalda de los ratones desde la mitad del cuerpo hasta cerca de la base de la cola 1 día antes de la infección. El uso de anestésicos no es esencial.
  2. Inocular subcutáneamente a cada ratón con 200 larvas viables de N. brasiliensis (L3) en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)10 en la parte inferior de la espalda, como se describió anteriormente2,11, o inyectar 100 μL de PBS solo como control. Sacrificar a los animales el día 4, el día 7 o el día 10 después de la infección.

3. Aislamiento de pulmón, intestino delgado, mediastínico y ganglios linfáticos mesentéricos

  1. Eutanasia al ratón por luxación cervical. Coloque el ratón en su espalda y rocíelo con etanol al 70%. Haga una incisión en la línea media con tijeras y abra la piel para exponer las áreas abdominal y torácica.
    NOTA: El isoflurano puede ser utilizado como un método alternativo de eutanasia12. No se recomiendan las cámaras de dióxido de carbono, ya que elCO2 provoca daño en el tejido pulmonar y hemorragia13.
  2. Aislamiento de ganglios linfáticos mediastínicos y pulmones
    1. Haga una incisión en el esternón y corte en forma de "V" para extraer las costillas y los músculos torácicos. Una vez que la cavidad torácica esté expuesta, ubique los ganglios linfáticos mediastínicos junto al esófago, debajo del corazón (ver Figura suplementaria 1).
    2. Extraer los ganglios linfáticos mediastínicos y recogerlos en 1 mL de medio R-10 (Tabla 1) en una placa de cultivo de 12 pocillos. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta el procesamiento.
      NOTA: Las muestras deben protegerse de la luz, para evitar disminuir la señal fluorescente de los ratones reporteros utilizados en estos experimentos.
    3. Extraer los pulmones y recogerlos en 1 ml de medio R-10 en una placa de cultivo de 12 pocillos por ratón. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta el procesamiento.
  3. Aislamiento de cadenas de ganglios linfáticos mesentéricos e intestino delgado
    1. Exponga la cavidad peritoneal y mueva con cuidado el intestino delgado hacia la derecha para exponer la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) a lo largo del colon.
    2. Con fórceps, retire el MLN, enróllelo suavemente sobre una toalla de papel y retire la grasa.
    3. Transfiera el MLN a 1 ml de medio R-10 en una placa de cultivo de 12 pocillos. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta el procesamiento.
    4. Corte el intestino delgado justo debajo del esfínter pilórico y por encima del ciego. Tire del intestino lentamente con la ayuda de fórceps, eliminando el mesenterio adjunto y el tejido graso.
    5. Coloque el intestino delgado sobre una toalla de papel y humedezca generosamente con PBS. Retire los parches de Peyer del intestino delgado con tijeras.
      NOTA: Para mantener la viabilidad, retire el tejido graso restante y mantenga el intestino delgado húmedo con PBS durante todo el proceso.
    6. Corte el intestino delgado longitudinalmente con tijeras y deslice suavemente los fórceps sobre el intestino abierto para eliminar el contenido fecal y el moco.
    7. Sostenga el intestino delgado con fórceps y lávelo en 5 ml de PBS en hielo sumergiéndolo cuidadosamente varias veces. Repita dos veces.
    8. Cortar el intestino delgado en trozos cortos (aproximadamente 5 mm) y recogerlos en un tubo cónico de 50 mL con 10 mL de HBSS14 con 2% FBS (Tabla 1). Continúe inmediatamente aislando las células intraepiteliales y de lámina propia.

4. Preparación de suspensiones unicelulares del intestino delgado, pulmón y ganglios linfáticos

NOTA: Es extremadamente importante procesar un máximo de seis ratones por persona cuando se preparan suspensiones unicelulares del intestino delgado, ya que la viabilidad celular disminuye significativamente con períodos de procesamiento más largos. Este método fue adaptado del modelo5 de ratón de infección por Heligmosomoides polygyrus.

  1. Precaliente la incubadora de agitación, medio R-20, HBSS y HBSS-2 mM EDTA (Tabla 1) a 37 °C.
  2. Preparar 10 mL de medio de digestión del intestino delgado (Tabla 1) por muestra.
  3. Agitar vigorosamente con la mano los trozos del intestino del paso 3.3.8.
  4. Filtre cada muestra a través de una malla de nylon (aproximadamente 10 cm x 10 cm) sobre un embudo de vidrio. Lave la muestra agregando 10 ml de HBSS precalentado sobre la malla y deseche el flujo continuo. Repita una vez más.
    NOTA: Utilice una malla nueva para cada muestra y reutilícela durante todo el procedimiento.
  5. Retire la malla del embudo y recoja la muestra de la malla en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de HBSS-2 mM EDTA caliente (paso 4.1). Incubar durante 10 min a 37 °C, con agitación a 200 rpm.
  6. Vórtice durante 10 s a velocidad máxima (3.200 rpm) y filtre la muestra con la malla sobre un embudo de vidrio, recuperando el flujo en un tubo cónico de 50 mL.
  7. Repita los pasos 4.5 y 4.6 dos veces, recuperando el flujo en el mismo tubo cónico de 50 ml. Las células intraepiteliales se encuentran en esta fracción de 30 ml. Guarde el tejido restante.
  8. Preparación de suspensión unicelular a partir de células intraepiteliales
    1. Centrifugar los 30 ml de suspensión celular, recuperados en el paso 4.7, a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante.
    2. Añadir 5 ml de PBS y centrifugar a 450 x g durante 5 min a RT. Desechar el sobrenadante.
    3. Resuspender el pellet celular en 3 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNasa (Tabla 1). Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la mancha celular.
  9. Preparación de suspensión unicelular a partir de células de lámina propia
    1. Lave el tejido restante del intestino delgado del paso 4.7 vertiendo más de 10 ml de HBSS caliente a través de la malla sobre el embudo. Repita el lavado. Recoja el tejido de la malla en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de medio de digestión del intestino delgado.
    2. Incubar durante 30 min a 37 °C, con agitación a 200 rpm. Vórtice a velocidad máxima durante 10 s cada 5 min.
    3. Agregue 10 ml de tampón FACS-EDTA (Tabla 1) para detener la reacción de digestión y colóquelo en hielo.
    4. Filtrar cada muestra a través de un filtro celular de 100 μm utilizando una pipeta serológica, recuperando la suspensión en un tubo cónico de 50 mL colocado sobre hielo.
    5. Centrifugar a 600 x g durante 6 min a 4 °C.
    6. Deseche el sobrenadante. Lavar el pellet celular con 5 ml de PBS y centrifugar a 600 x g durante 6 min a 4 °C.
    7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de RPMI 10% FBS-20 μg / ml DNasa. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la mancha celular.
  10. Preparación de suspensión unicelular del pulmón
    NOTA: Cada pulmón e intestino delgado debe ser procesado en paralelo por dos personas para evitar tiempos de manipulación prolongados, lo que resulta en una baja viabilidad celular.
    1. Preparar 4 mL de medio de digestión pulmonar (Tabla 1) por muestra procesada.
    2. Extraer el medio RPMI del pocillo que contiene los pulmones a partir del paso 3.2.3. Cortar el pulmón en trozos pequeños con tijeras finas.
    3. Transfiera las piezas pulmonares a un tubo cónico de 15 ml con una espátula. Añadir 4 mL de medio de digestión pulmonar (Tabla 1).
    4. Incubar durante 30 min a 37 °C, con agitación a 250 rpm. Cuando termine, mantenga en hielo hasta que se procese cada muestra.
    5. Filtrar cada muestra a través de un filtro celular de 100 μm, colocado en un solo pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos. Disociar el tejido con un émbolo de jeringa.
    6. Recuperar cada muestra en un tubo cónico de 15 mL, y agregar 4 mL de medio R-2 (Tabla 1). Mantener en hielo mientras se procesan las otras muestras.
    7. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio R-5 (Tabla 1).
    8. Durante la centrifugación, preparar 4 mL de solución de gradiente de densidad al 27,5% (Tabla 1) por muestra para enriquecer la fracción de células hematopoyéticas15,16. Esta estrategia para la separación unicelular es más eficiente, rentable y menos tóxica en comparación con otros medios de gradiente de densidad similares17.
    9. Añadir 4 ml de solución de gradiente de densidad al 27,5% al 1 ml de suspensión celular del paso 4.10.7 y agitar vigorosamente.
    10. Agregue lentamente 1 ml de medio R-5 (Tabla 1) sobre la suspensión mixta para crear dos fases.
    11. Centrífuga a 1.500 x g durante 20 min en RT, con baja aceleración y el freno apagado. Observa el anillo formado entre las dos fases.
    12. Recuperar el anillo formado entre las dos fases con una micropipeta de 1 mL, y resuspender en 4 mL de medio R-2.
    13. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 1 mL de tampón ACK (Tabla 1), e incubar durante 1 min a RT.
    14. Añadir 4 ml de medio R-5 y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio R-10. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la tinción para citometría de flujo.
  11. Preparación de suspensión unicelular a partir de ganglios linfáticos
    1. Coloque los ganglios linfáticos de los pasos 3.2.2 o 3.3.3 entre dos piezas de malla en un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos y disocie con un émbolo de jeringa.
    2. Recuperar la suspensión celular en un tubo cónico de 1,5 ml y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio R-10. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la tinción para citometría de flujo.
      NOTA: Si los grupos son visibles, filtre la muestra a través de un filtro de células de 100 μm.

5. Tinción celular para citometría de flujo (Figura 2 y Figura 3)

NOTA: Centrifugar las suspensiones de células ganglionares a partir del paso 4.11.3 a 450 x g durante 5 min a 4 °C, y resuspender la cápsula celular en 500 μL de tampón FACS (Tabla 1).

  1. Tinción celular para la identificación de ILC2s (Figura 3 y Figura complementaria 2)
    NOTA: Este procedimiento de tinción es específico para la identificación de células ILC2 que expresan IL-9.
    1. Placa de 150 μL por muestra pulmonar (aproximadamente 1,8 x 10 6 células) del paso 4.10.14, y 50 μL por muestra de ganglio linfático del paso 4.11.3 (aproximadamente 0,7 x 10 6 y 2,2 x 106 células para muestras de ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, respectivamente) en una placa de cultivo de fondo cónico de 96 pocillos. Añadir 100 μL de tampón FACS y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Placa de 100 μL por muestra de intestino delgado (aproximadamente 2,7 x 10 6 y 0,6 x 106 células para muestras intraepiteliales y de lámina propia, respectivamente) de los pasos 4.8.3 y 4.9.7 en una placa de cultivo de fondo cónico de 96 pocillos. Añadir 150 μL de tampón FACS y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Desechar el sobrenadante y resuspender cada pellet celular en 50 μL del cóctel de anticuerpos biotinilados (Tabla 2) diluido en tampón FACS. Incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz.
      NOTA: Utilice tampón FACS con 20 μg/ml de DNasa para muestras intraepiteliales y de lámina propia.
    4. Añadir 150 μL de tampón FACS. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS. Centrifugar de nuevo y desechar el sobrenadante.
    6. Resuspender el pellet celular en 50 μL del cóctel anticuerpo/tinción (Tabla 2) e incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz.
    7. Añadir 150 μL de tampón FACS. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS. Centrifugar de nuevo y desechar el sobrenadante. Repetir el lavado (paso 5.1.7) y desechar el sobrenadante.
    9. Resuspender el pellet celular en 300 μL de tampón FACS, y analizar por citometría de flujo.
    10. Para las muestras de intestino delgado y pulmón, use la estrategia de compuerta: linfocitos, células individuales, células vivas, células hematopoyéticas, células de linaje CD90+, células ST2+ y células IL-9+ (Figura 3A, B y Figura complementaria 2A). Para las muestras de ganglios linfáticos, utilice la estrategia de compuerta: células vivas, células individuales, células de linaje CD90+, células ST2+ y células IL-9+ (Figura complementaria 2B, C).
  2. Tinción celular para la identificación de linfocitos productores de IL-9 (Figura 2 y Figura complementaria 3)
    1. Transfiera 800 μL por muestra pulmonar desde el paso 4.10.14 a un tubo de 1,5 ml (aproximadamente 14,6 x 106 células). Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
    2. Para muestras de ganglios linfáticos, placa 400 μL de la suspensión celular del paso 4.11.3 (aproximadamente 5,6 x 10 6 y 17,5 x 106 células para muestras de ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, respectivamente) en una placa inferior cónica de 96 pocillos en dos pasos.
      1. Transfiera primero 200 μL, centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
      2. Transfiera otros 200 μL al pozo correspondiente. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    3. Resuspender el pellet celular en 50-400 μL del cóctel anticuerpo/tinción (Tabla 3) e incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz.
      NOTA: Las muestras de pulmón deben resuspenderse en 400 μL, las muestras de ganglios linfáticos mediastínicos en 50 μL y las muestras de ganglios linfáticos mesentéricos en 100 μL del cóctel de tinción.
    4. Añadir 150 μL de tampón FACS a las muestras de ganglios linfáticos mediastínicos y 100 μL a las muestras de ganglios linfáticos mesentéricos. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    5. Lave las muestras de pulmón y ganglios linfáticos resuspendiendo los gránulos en 1 ml y 200 μl de tampón FACS, respectivamente. Centrifugar a 450x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y repita el lavado.
    6. Resuspender las muestras pulmonares en 600 μL de tampón FACS y analizarlas por citometría de flujo. Utilice la estrategia de compuerta: linfocitos, células individuales, células vivas, células hematopoyéticas, células CD4+TCRβ+ y células IL-9+ (Figura 2A).
    7. Resuspender las muestras de ganglios linfáticos en 300 μL de tampón FACS y analizar por citometría de flujo. Utilice la estrategia de compuerta: linfocitos, células individuales, células vivas, células CD4+ TCRβ+ y células IL-9+ (Figura 2B y Figura complementaria 3A).

6. Determinación del número absoluto de células en suspensiones unicelulares

  1. Diluir las muestras de los pasos de aislamiento 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 y 4.11.3 con PBS en una proporción de 1:20 (10 μL de muestra + 190 μL de PBS).
  2. Mezclar 10 μL de cada muestra diluida de la etapa 6.1 con 10 μL de azul de tripano. Cargue 10 μL en un hemocitómetro y cuente las células vivas, considerando cada dilución.
  3. Obtener el número absoluto de células multiplicando el porcentaje de la población de interés de células vivas determinado por citometría de flujo (células negativas para el colorante de viabilidad) por el número total de células vivas en la suspensión unicelular después del aislamiento, y dividiendo este número por 100 (Figura suplementaria 4, Figura complementaria 5 y Figura complementaria 6).
    Número absoluto = (Porcentaje de la población de interés de células vivas determinado por citometría de flujo x Número total de células vivas en la suspensión unicelular)/100

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Representative Results

Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 200 larvas de N. brasiliensis en estadio L3, o con PBS para controles simulados. El número de larvas utilizadas en este protocolo se ajustó para aislar células viables de los pulmones, el tejido linfoide y el intestino delgado, a diferencia de informes anteriores donde se utilizaron cargas más altas de gusanos para detectar células en tejidos linfoides y pulmones solo4. Los pulmones, los ganglios linfáticos mediastínicos, los ganglios linfáticos mesentéricos y el intestino delgado se recolectaron en los días 0, 4, 7 y 10 después de la infección para el aislamiento de linfocitos y la caracterización de las poblaciones productoras de IL-9. Se utilizaron un total de 27 ratones en dos o más experimentos independientes, incluidos nueve controles y de cuatro a seis ratones infectados con N. brasiliensis por punto de tiempo analizado. Se incluyeron controles infectados con simulacros en cada experimento para obtener números basales. Usando este protocolo, las células T CD4 + productoras de IL-9 (principalmente células Th9 en este modelo) se pueden aislar de los ganglios linfáticos pulmonares, mesentéricos y mediastínicos para su cuantificación y análisis adicionales.

Siguiendo el curso natural de la infección, primero evaluamos las frecuencias de linfocitos T CD4+ productores de IL-9 (Th9) presentes en los pulmones y los ganglios linfáticos mediastínicos (estrategia de activación mostrada en la Figura 2A y Figura 3A suplementaria). En ambos órganos, las frecuencias de Th9 aumentaron, comenzando en el día 4, y alcanzaron un pico en el día 7 después de la infección (Figura 2C), un incremento que también se observó en los números absolutos de Th9 (Figura suplementaria 4A, B). En los ganglios linfáticos mesentéricos (estrategia de activación mostrada en la Figura 2B), hubo un aumento significativo tanto en las frecuencias como en el número absoluto de células Th9 en los días 7 y 10 después de la infección (Figura 2C y Figura complementaria 4C), de acuerdo con los informes anteriores4. Se confirmó la presencia de células T e ILC2 en las muestras intraepiteliales y de lámina propia; sin embargo, no se observaron células Th9 en estos compartimentos intestinales durante toda la infección (Figura suplementaria 3B, C).

Luego evaluamos las células ILC2 que expresan IL-9 en tejidos linfoides y no linfoides de ratones infectados (estrategia de activación que se muestra en la Figura 3A, B y Figura complementaria 2). Observamos un aumento significativo en las frecuencias de ST2+ IL-9- y ST2+ IL-9+ que expresan ILC2s en los pulmones en el día 7 después de la infección (Figura 3C). Al mismo tiempo, el análisis de los números absolutos reveló un aumento estadísticamente significativo solo en la población ST2+ IL-9+ en el día 7 después de la infección (Figura complementaria 5A). En los ganglios linfáticos mediastínicos (estrategia de activación que se muestra en la Figura complementaria 2B), el número de células ILC2 que expresan IL-9 (ST2+ IL-9+) aumentó significativamente en el día 10 después de la infección, mientras que el número absoluto de células ST2+ mostró una tendencia a aumentar, comenzando en el día 7 y continuando hasta el día 10 después de la infección (Figura suplementaria 6A, C).

También se encontraron células IL-9+ ILC2 en la lámina propia y los compartimentos intraepiteliales del intestino delgado (estrategia de activación mostrada en la Figura 3B y en la Figura complementaria 2A). La infección por N. brasiliensis resultó en un aumento estadísticamente significativo en las frecuencias de células ST2+ IL-9+ en el día 4, y poblaciones ST2-IL-9+ en los días 7 y 10 en la lámina propia. En el compartimento intraepitelial, también se observó un cambio significativo en las frecuencias de células ST2+ IL9+ y ST2- IL-9+ en el día 7 y el día 10 después de la infección, respectivamente (Figura 3C). Es importante destacar que, incluso con un número relativamente bajo de carga de larvas, la infección con el parásito causó daños extensos al intestino delgado; por lo tanto, el análisis de los números absolutos de ILC2s que expresan IL-9 es técnicamente inviable, lo que dificulta la cuantificación precisa de esta población debido a los bajos rendimientos de células vivas (Figura complementaria 5B, C). Por otro lado, el análisis de los ganglios linfáticos mesentéricos (estrategia de compuerta mostrada en la Figura Suplementaria 2C) reveló un aumento significativo en el número absoluto de células ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ y ST2- IL-9+ ILC2 en el día 10 post-infección (Figura Suplementaria 6D), como se informó anteriormente4. Mientras tanto, no se observó diferencia en las frecuencias de estas poblaciones a lo largo de la infección (Figura suplementaria 6B). Estos diversos subconjuntos de células que expresan ST2 e IL-9 son poblaciones intrigantes con funciones potencialmente diferenciales in vivo, y podrían corresponder a ILC2 naturales versus inflamatorias como se describió recientemente 18,19,20,21. Sin embargo, esto debe abordarse en estudios futuros.

En resumen, ajustamos este protocolo para la recuperación de células que expresan IL-9 del intestino infectado por N. brasiliensis, sin dejar de detectarlas en el pulmón y el tejido linfoide. La recuperación de células inmunes de intestinos infectados por parásitos ha demostrado ser técnicamente difícil. Aquí, un número ajustado de larvas utilizadas para la infección resultó en una mejor integridad del tejido intestinal, lo que permitió la recuperación de una población de IL-9+. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo desarrollado específicamente para el análisis de células que expresan IL-9 en el intestino durante la infección por N. brasiliensis. Sin embargo, otras células inmunes también pueden aislarse siguiendo estos pasos. Los datos presentados aquí muestran que la mayoría de las células residentes en tejido que expresan IL-9 en el intestino delgado son ILC2.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo descrito. Diagrama esquemático con los principales pasos utilizados para procesar diferentes órganos y los subconjuntos celulares que expresan IL-9 esperados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las células Th9 se encuentran en los pulmones, mediastínicos y ganglios linfáticos mesentéricos durante la infección por N. brasiliensis. Análisis de citometría de flujo representativo y estrategia de compuerta utilizada para la identificación de células Th9 de (A) pulmones y (B) ganglios linfáticos mesentéricos. Las suspensiones unicelulares de cada órgano se tiñeron con un colorante de viabilidad reparable, anti-CD45 marcado con fluorescencia para la identificación de células hematopoyéticas, y β y anti-CD4 para la identificación de linfocitos T CD4 +. La señal GFP+ indica el porcentaje de células Th9 presentes. La primera puerta muestra las propiedades de dispersión lateral (SSC)-A/dispersión hacia adelante (FSC)-A con la morfología clásica de las células linfoides. Se seleccionaron eventos de una sola célula, seguidos de células vivas y luego células CD45+. Dentro de esta población, nos centramos en las células TCR-β y CD4 doble positivas, a partir de las cuales las células GFP + se identificaron como células Th9. La tinción de los ganglios linfáticos no incluyó el anticuerpo anti-CD45, ya que se espera que toda la población sea positiva. (C) Frecuencias de células Th9 encontradas en pulmones, mediastinales y ganglios linfáticos mesentéricos en los momentos indicados después de la infección. Los datos representan la media ± SEM de uno o dos ratones analizados por grupo, a partir de tres experimentos independientes, por punto de tiempo; Prueba T no pareada; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las células ILC2 productoras de IL-9 se encuentran en órganos no linfoides. Análisis de citometría de flujo representativo y estrategia de compuerta utilizada para la identificación de células IL-9+ ILC2 de (A) pulmón y (B) lámina propia del intestino delgado. Las suspensiones unicelulares de cada órgano se marcaron con anticuerpos biotinilados para identificar células de linaje (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 y anti-Ter119), y Fc-Block. Las suspensiones celulares se tiñeron con colorante de viabilidad reparable, estreptavidina marcada con fluorocromo, anti-CD45 para la identificación de células hematopoyéticas y anti-CD90 para la identificación de células ILC2. La primera puerta muestra las propiedades de dispersión (SSC)-A/dispersión lateral (FSC)-A con la morfología clásica de las células linfoides. Se seleccionaron eventos de una sola célula, seguidos de células vivas y luego células CD45+. Dentro de esta población, nos centramos en las células lin-lin-CD90+; de este grupo, evaluamos la expresión de ST2 y GFP para identificar células IL-9+ ILC2. (C) Frecuencias de células ILC2 encontradas en los pulmones, la lámina propia y el compartimiento de células intraepiteliales en los puntos de tiempo indicados después de la infección. Los datos representan la media ± SEM de uno o dos ratones analizados por grupo, a partir de tres experimentos independientes, por punto de tiempo; prueba T no pareada; *p ≤ 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de soluciones químicas y sus composiciones. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Cóctel de anticuerpos para identificar células ILC2 productoras de IL-9. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Cóctel de anticuerpos para identificar linfocitos T productores de IL-9. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Representación esquemática de la localización del ganglio linfático mediastínico. Creado en BioRender.com Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Citometría de flujo representativa y estrategia de compuerta utilizada para identificar IL-9+ ILC2s dentro de las células intraepiteliales del intestino delgado y los ganglios linfáticos. (A) Las suspensiones unicelulares de células intraepiteliales del intestino delgado se incubaron primero con anticuerpos marcados con biotina para seleccionar células de linaje (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 y anti-Ter119), y Fc-Block. Esto fue seguido por la tinción con un colorante de viabilidad reparable, estreptavidina marcada con fluorocromo, anti-CD45 para la identificación de células hematopoyéticas y anti-CD90 para la identificación de células ILC2. La primera puerta muestra las propiedades de dispersión lateral (SSC)-A/dispersión hacia adelante (FSC)-A con la morfología clásica de las células linfoides. Se seleccionaron eventos de una sola célula, seguidos de células vivas y luego células CD45+. Dentro de esta población, nos centramos en las células lin-lin-CD90+; de este grupo, las células GFP+ se identificaron como células IL-9+ ILC2. (B,C) Citometría de flujo representativa y estrategia de activación para (B) ganglios linfáticos mediastínicos y (C) ganglios linfáticos mesentéricos para identificar células IL-9+ ILC2. La tinción de los ganglios linfáticos no incluyó el anticuerpo anti-CD45, ya que se esperaba que toda la población fuera positiva. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Análisis representativo de citometría de flujo y estrategia de compuerta utilizada para identificar células Th9 en ganglios linfáticos mediastínicos y el intestino delgado. Las suspensiones unicelulares de (A) ganglios linfáticos mediastínicos se tiñeron con un colorante de viabilidad reparable y anticuerpos anti-TCR-β y anti-CD4 marcados con fluorescencia. La primera puerta muestra las propiedades de dispersión lateral (SSC)-A/dispersión hacia adelante (FSC)-A con la morfología clásica de las células linfoides. Se seleccionaron eventos unicelulares, seguidos de células vivas y luego células TCR-β y CD4 doblemente positivas; de este grupo, las células GFP+ se identificaron como células Th9. Se utilizó una estrategia de citometría de flujo similar para (B) lámina propia y (C) células intraepiteliales del intestino delgado, excepto que las células CD45 + se seleccionaron después de las células vivas, seguidas de células TCR-β y CD4 doble positivas, de donde las células GFP + se identificaron como células Th9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: El número absoluto de células Th9 cambia significativamente a lo largo de la infección. El número absoluto de células IL-9+ de células TCR-β y CD4 doble positivas se determinó en los días 0, 4, 7 y 10 después de la infección en (A) pulmón, (B) ganglios linfáticos mediastínicos y (C) ganglios linfáticos mesentéricos. Los datos representan la media ± SEM de uno o dos ratones analizados por grupo, a partir de tres experimentos independientes, por punto de tiempo; prueba T no pareada *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Los números absolutos de células IL-9+ ILC2 difieren a lo largo de la infección. Se determinó el número absoluto de células IL-9+ ILC2 de la población lin-CD90+ en los días 0, 4, 7 y 10 después de la infección en (A) pulmón, (B) lámina propia y (C) células intraepiteliales del intestino delgado. Los datos representan la media ± SEM de uno o dos ratones analizados por grupo, a partir de tres experimentos independientes, por punto de tiempo; prueba T no pareada *p ≤ 0,05. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 6: Las frecuencias y el número absoluto de células IL-9+ ILC2 en los ganglios linfáticos aumentan significativamente durante la infección. (A) Frecuencia y (C) números absolutos de células IL-9+ ILC2 de ganglios linfáticos mediastínicos. (B) Frecuencia y (D) números absolutos de células IL-9+ ILC2 de ganglios linfáticos mesentéricos. Los valores se determinaron como células IL-9+ ILC2 dentro de la población lin-CD90+ en los días 0, 4, 7 y 10 después de la infección. Los datos representan la media ± SEM de uno o dos ratones analizados por grupo, a partir de tres experimentos independientes, por punto de tiempo; prueba T no pareada *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 7: Análisis por citometría de flujo de IL-9 que expresan células ILC2 del intestino infectado por N. brasiliensis. Gráficos representativos de células ILC2 aisladas del intestino de ratones reporteros de IL-9 en el día 7 después de la infección. La expresión de IL-9 se evaluó en células ILC2 recién aisladas de los compartimentos intraepitelial o de lámina propia de ratones informadores infectados (IL-9 REP) versus siguiendoel protocolo de tinción intracelular IL-9 descrito previamente 9 (IL-9 AB, utilizando un clon de anticuerpos IL-9 RM9A4, BioLegend). Para identificar ILC2 que expresan IL-9, las suspensiones unicelulares se incubaron primero con anticuerpos marcados con biotina para seleccionar células de linaje (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 y anti-Ter119) y Fc-Block, seguido de tinción con colorante de viabilidad flexible, estreptavidina marcada con fluorocromo, anti-CD45 y anti-CD90. Los gráficos muestran células ILC2 que expresan IL-9 cerradas en la población lin-CD45+CD90+ presentes en los compartimentos intraepitelial (A,B) y lámina propia (C,D), detectadas a través de la señal reportera de células recién aisladas (A,C) o tras la tinción intracelular de IL-9 (B,D). Los ratones de control fueron inyectados con PBS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Una comprensión completa de las interacciones parásito-huésped intestinal y las respuestas inmunes a la infección por helmintos requiere la identificación y el análisis de las diferentes poblaciones celulares y moléculas efectoras que son clave para la inducción de la remodelación tisular y la expulsión de gusanos. Las helmintiasis transmitidas por el suelo representan un gran problema en los países en desarrollo de todo el mundo. Sin embargo, hasta hace poco, no se disponía de un protocolo que permitiera el análisis de poblaciones celulares raras presentes en el intestino delgado, principal órgano afectado por esa infección5. Este protocolo cubre métodos descritos anteriormente que permiten el análisis citométrico de flujo de células linfoides que expresan IL-9 en los ganglios linfáticos pulmonares, mediastínicos y mesentéricos durante la infección por N. brasiliensis , con la ventaja adicional de la identificación de esta población por primera vez en el intestino delgado.

El éxito de este protocolo depende en gran medida de los tiempos de procesamiento de los tejidos. Es imperativo procesar un máximo de seis muestras de intestino delgado, por persona, a la vez. Si se van a procesar diferentes órganos, recomendamos que se haga en paralelo por otra persona. Mediante el uso de una carga de parásitos relativamente baja (200 larvas L3), este protocolo permite el aislamiento de células linfoides del intestino infectado por N. brasiliensis mientras se mantiene la capacidad de aislar estas células de otros órganos. El uso de cargas de parásitos más altas pone en peligro la calidad y cantidad de células aisladas del intestino delgado (datos no mostrados); sin embargo, podría resultar en un aumento significativo de células linfoides que expresan IL-9 en otros órganos4. Al procesar el intestino y los ganglios linfáticos mesentéricos, es fundamental eliminar el tejido graso adherido, ya que de lo contrario se produce un aumento de la muerte celular. Los datos apoyan la observación de que el curso natural de la infección afecta negativamente el número absoluto de células linfoides recuperadas del intestino delgado. En los estudios descritos aquí, las frecuencias de las células IL-9+ ILC2 permanecen constantes, mientras que los números absolutos muestran una alta variabilidad en cada experimento independiente. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de los números absolutos podrían ser inexactas y deberían evitarse. Además, dada la baja frecuencia de células T que expresan IL-9 en los tejidos, se recomienda la adquisición y tinción del mayor número posible de células.

Una limitación de este análisis de ILC2 es el uso de una combinación discreta de marcadores para definir esta población. Dependiendo del tejido de interés y de la fase de la infección, marcadores adicionales, como CD25, Klrg1 y ST2, entre otros, podrían ser utilizados para una caracterización fenotípica más detallada de las células ILC222. Reconocemos que el protocolo presentado aquí se basa en la cepa4 del ratón reportero INFER, y podría representar una ventaja para la identificación de células que expresan IL-9. Sin embargo, esperamos que los resultados encontrados aquí puedan obtenerse utilizando estrategias alternativas, incluyendo el uso de otras cepas reporteras de ratón y la tinción intracelular de IL-9 6,7,8,9. Es importante mencionar que el uso de ratones convencionales y la realización de tinción intracelular de IL-9 en células intraepiteliales y de lámina propia puede resultar en la pérdida de cualquier señal detectable y comprometer los datos obtenidos (Figura complementaria 7). Esto podría deberse a la manipulación a largo plazo requerida para manchar un subconjunto que ya es difícil de aislar y mantener ex vivo. Por lo tanto, recomendamos el uso de cepas de ratones reporteros para reducir los tiempos de procesamiento y garantizar un análisis confiable de la expresión de IL-9 in vivo. También reconocemos el hecho de que las células Th9 no son las únicas células T que expresan IL-923; Sin embargo, en este modelo parásito, no esperaríamos que otros subconjuntos lo expresaran. Sin embargo, para descartar la presencia de otros subconjuntos que expresan IL-9 en el contexto descrito, es factible una caracterización completa de las citoquinas tipo 2 junto con el uso de marcadores transcripcionales.

La cuantificación de las células linfoides que expresan IL-9 antes del día 5 después de la infección se ha informado previamente; sin embargo, resulta en frecuencias celulares muy bajas4. El protocolo en este estudio cubre una gran parte de la cinética de infección por N. brasiliensis hasta el inicio de la eliminación del parásito2. Sin embargo, notamos que algunas de las poblaciones celulares en este estudio no volvieron a los niveles basales dentro del marco de tiempo analizado, lo que sugiere que el estudio podría beneficiarse de puntos de tiempo extendidos para tener una perspectiva completa sobre el comportamiento de estas células en una etapa más avanzada de la infección in vivo. En cualquier caso, creemos que el trabajo presentado aquí podría servir como una guía de referencia para los investigadores interesados en estudiar las células linfoides que expresan IL-9 en modelos de infección parasitaria, permitiéndoles elegir la fase ideal de infección para la detección de los tipos de células específicas de los tejidos de interés. En conjunto, los métodos descritos aquí serán útiles para evaluar el fenotipo y la función de los linfocitos T y las células ILC2 que expresan IL-9 durante un modelo fisiológicamente relevante de infección parasitaria, ampliando nuestro conocimiento de estas células y potencialmente mejorando nuestra comprensión de ellas en otras condiciones patológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a José Luis Ramos-Balderas por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la siguiente subvención a PLL del CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P y EO-M recibieron una beca del CONACYT (736162 y 481437, respectivamente). MCM-M recibió una beca del CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

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References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

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Inmunología e infección Número 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 células linfoides parásito intestino delgado N. brasiliensis
Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por <em>Nippostrongylus brasiliensis</em>
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Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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