Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

فحص السمية القلبية عالي الإنتاجية باستخدام أحاديات الخلايا العضلية القلبية الناضجة المستحثة بالخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64364
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Summary

توفر الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) بديلا لاستخدام الحيوانات لفحص السمية القلبية قبل السريرية. من القيود المفروضة على التبني الواسع النطاق ل hiPSC-CMs في فحص السمية قبل السريرية هو النمط الظاهري غير الناضج الذي يشبه الجنين للخلايا. تظهر هنا بروتوكولات للنضج القوي والسريع ل hiPSC-CMs.

Abstract

تستخدم الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) لتحل محل وتقليل الاعتماد على الحيوانات والخلايا الحيوانية لاختبار السمية القلبية قبل السريرية. في تنسيقات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد ، تلخص hiPSC-CMs بنية ووظيفة خلايا عضلة القلب البشرية البالغة عند زراعتها على مصفوفة مثالية خارج الخلية (ECM). ينضج ECM المشتق من الخلايا الجذعية البشرية في الفترة المحيطة بالولادة (مصفوفة خارج الخلية تحفز النضج) هيكل hiPSC-CM ووظيفته وحالة التمثيل الغذائي في 7 أيام بعد الطلاء.

تستجيب أحاديات الطبقة الناضجة hiPSC-CM أيضا كما هو متوقع للأدوية ذات الصلة سريريا ، مع وجود خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب والسمية القلبية. كان نضوج الطبقات الأحادية hiPSC-CM عقبة أمام الاعتماد الواسع النطاق لهذه الخلايا القيمة للعلوم التنظيمية وفحص السلامة ، حتى الآن. تقدم هذه المقالة طرقا تم التحقق من صحتها للطلاء والنضج والتنميط الظاهري الوظيفي عالي الإنتاجية لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية والانقباض hiPSC-CM. تنطبق هذه الطرق على خلايا عضلة القلب النقية المتاحة تجاريا ، وكذلك خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي يتم إنشاؤها داخليا باستخدام بروتوكولات تمايز عالية الكفاءة خاصة بالغرفة.

يتم قياس وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية عالية الإنتاجية باستخدام إما الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs ؛ الانبعاثات: 488 نانومتر) ، أو الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم (CSFs) ، أو مستشعرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GCaMP6). يتم استخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية عالي الإنتاجية للتسجيلات البصرية لكل معلمة وظيفية ، ويتم استخدام برنامج مخصص مخصص لتحليل البيانات الكهربية. يتم تطبيق بروتوكولات MECM لفحص الأدوية باستخدام مؤثرات إينوتروب إيجابية (إيزوبرينالين) وحاصرات خاصة بقناة الجينات البشرية المرتبطة بالأثير (hERG). ستمكن هذه الموارد الباحثين الآخرين من الاستفادة بنجاح من hiPSC-CMs الناضجة لفحص السمية القلبية قبل السريرية عالي الإنتاجية واختبار فعالية أدوية القلب وأبحاث القلب والأوعية الدموية.

Introduction

تم التحقق من صحة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) على نطاق دولي ، وهي متاحة لفحص السمية القلبية في المختبر 1. يمكن إنشاء hiPSC-CMs عالية النقاء بأعداد غير محدودة تقريبا ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها. عند إعادة الطلاء ، يقومون أيضا بإعادة التنشيط ويبدأون في التعاقد مع إيقاع يذكرنا بقلب الإنسان 2,3. ومن اللافت للنظر أن hiPSC-CMs الفردية تتزاوج مع بعضها البعض وتشكل تخليقية وظيفية تنبض كنسيج واحد. في الوقت الحاضر ، يتم اشتقاق hiPSCs بشكل روتيني من عينات دم المريض ، لذلك يمكن تمثيل أي شخص باستخدام فحوصات فحص السمية القلبية hiPSC-CM في المختبر 4,5. هذا يخلق الفرصة لإجراء "التجارب السريرية في طبق" ، مع تمثيل كبير من مجموعات سكانية متنوعة6.

تتمثل إحدى المزايا الحاسمة على مناهج فحص السمية القلبية للخلايا الحيوانية والحيوانية الحالية في أن hiPSC-CMs تستخدم الجينوم البشري الكامل وتقدم نظاما في المختبر مع أوجه تشابه وراثية مع قلب الإنسان. هذا جذاب بشكل خاص لعلم الصيدلة الجيني والطب الشخصي - من المتوقع أن يوفر استخدام hiPSC-CMs للأدوية وتطوير العلاجات الأخرى وصفات أدوية أكثر دقة ودقة وأمانا. في الواقع ، أثبتت فحوصات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) hiPSC-CM أنها تنبئ بسمية القلب للأدوية ، باستخدام لوحة من الأدوية المستخدمة سريريا مع خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب1،7،8،9. على الرغم من الإمكانات الهائلة ل hiPSC-CMs والوعد بتبسيط وجعل تطوير الأدوية أرخص ، كان هناك إحجام عن استخدام هذه المقايسات الجديدة10،11،12.

حتى الآن ، فإن أحد القيود الرئيسية على التبني والقبول الواسع النطاق لفحوصات فحص hiPSC-CM هو مظهرها غير الناضج الشبيه بالجنين ، فضلا عن وظيفتها. تمت مراجعة ومناقشة القضية الحرجة لنضج hiPSC-CM في الأدبيات العلمية ad nauseum13،14،15،16. وبالمثل ، تم استخدام العديد من الأساليب لتعزيز نضوج hiPSC-CM ، بما في ذلك التلاعب بالمصفوفة خارج الخلية (ECM) في أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد وتطوير أنسجة القلب المهندسة ثلاثية الأبعاد (EHTs) 17،18. في الوقت الحالي ، هناك اعتقاد سائد على نطاق واسع بأن استخدام 3D EHTs سيوفر نضجا فائقا مقارنة بالنهج القائمة على 2D أحادية الطبقة. ومع ذلك ، توفر الطبقات الأحادية 2D كفاءة أعلى لاستخدام الخلايا وزيادة النجاح في الطلاء مقارنة ب 3D EHTs ؛ تستخدم 3D EHTs أعدادا أكبر من الخلايا ، وغالبا ما تتطلب إدراج أنواع أخرى من الخلايا يمكن أن تربك النتائج. لذلك ، في هذه المقالة ، ينصب التركيز على استخدام طريقة بسيطة لنضج hiPSC-CMs المستزرعة كطبقة أحادية 2D من الخلايا المقترنة كهربائيا وميكانيكيا.

يمكن تحقيق نضج hiPSC-CM المتقدم في أحادي الطبقات 2D باستخدام ECM. يمكن نضج الطبقات الأحادية 2D من hiPSC-CMs باستخدام غطاء بوليديميثيل سيلوكسان ناعم ومرن ، مطلي بمصفوفة غشاء قاعدي تفرزها خلية ساركوما فأر Engelbreth-Holm-Swarm (الماوس ECM). في عام 2016 ، أظهرت التقارير أن hiPSC-CMs المستزرعة على حالة ECM الناعمة هذه نضجت وظيفيا ، حيث أظهرت سرعات توصيل جهد الفعل بالقرب من قيم قلب البالغين (~ 50 سم / ثانية) 18. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه hiPSC-CMs الناضجة العديد من الخصائص الكهربية الأخرى التي تذكرنا بقلب البالغين ، بما في ذلك إمكانات غشاء الراحة المفرط الاستقطاب والتعبير عن Kir2.1. في الآونة الأخيرة ، حددت التقارير طلاء ECM البشري المشتق من الخلايا الجذعية في الفترة المحيطة بالولادة والذي يعزز النضج الهيكلي ل 2D hiPSC-CMs19. هنا ، يتم تقديم طرق سهلة الاستخدام لأحادية الطبقات 2D hiPSC-CM الناضجة هيكليا لاستخدامها في الشاشات الكهربية عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، نقدم التحقق من صحة أداة رسم الخرائط الضوئية للاكتساب والتحليل الآلي لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الطبقة 2D hiPSC-CM ، باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) والمجسات والبروتينات الحساسة للكالسيوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام hiPSC في هذا البروتوكول من قبل لجنة HPSCRO بجامعة ميشيغان (لجنة الإشراف على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات). انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات. انظر الجدول 1 للاطلاع على الوسائط ومؤلفاتها.

1. إذابة الجليد والطلاء المتاحان تجاريا hiPSC-CMs المحفوظة بالتبريد للنضج على مصفوفة خارج الخلية تحفز النضج (MECM)

  1. قم بتسخين جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة وأعد ترطيب ألواح MECM بمحلول ملح هانك المتوازن (HBSS) أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ، لمدة 1 ساعة قبل طلاء خلايا عضلة القلب (200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر من صفيحة 96 بئرا).
  2. اغسل ألواح MECM 2x باستخدام HBSS أو PBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 1 ساعة قبل طلاء عضلة القلب (200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر من صفيحة 96 بئرا) وحافظ على رطوبة الآبار.
  3. تحضير حمام مائي 37 درجة مئوية.
  4. قم بإزالة أنابيب الخلايا العضلية القلبية من خزان النيتروجين السائل ، وانقل الأنابيب إلى الثلج الجاف ، وافتح أغطية الأنبوب قليلا لتحرير الضغط.
    ملاحظة: تحرير الضغط في الأنابيب مهم للغاية ! إذا تراكم الكثير من الضغط داخل الأنابيب ، فقد تنفجر.
  5. أعد إغلاق أغطية الأنابيب وضعها في حمام مائي لتذوب لمدة 4 دقائق.
    ملاحظة: اسمح لها بالذوبان تماما ، لتجنب تلف الخلايا بسبب الذوبان الجزئي.
  6. بعد ذوبان الخلايا ، قم برش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الفتح. انقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 1 مل. قم بالتنقيط ببطء 8 مل من وسط الطلاء ، مع تحريك الأنبوب في كل مرة يتم فيها إضافة 1 مل ، للسماح للخلايا بالتكيف مع التغيرات في الأسمولية.
    1. اغسل المبرد ب 1 مل من وسط الطلاء باستخدام ماصة زجاجية سعة 1 مل. ثم ، قم بتقطير الغسيل ببطء في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
  7. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح الطافع وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الطلاء. إزالة القسمة وإجراء عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم. أضف وسط طلاء إضافي للحصول على 7.5 × 105 خلايا / مل.
    ملاحظة: مطلوب حوالي 10 مل من تعليق الخلية لإعداد 96 بئرا.
  8. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 96 بئر مطلية ب MECM باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: تأكد من تجنب ترسيب الخلية والحصول على كثافة خلية موحدة في جميع الآبار أثناء الطلاء.
  9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة يومين قبل تغيير الوسط إلى وسط الصيانة (200 ميكرولتر / بئر). قم بتغيير وسيط الصيانة في اليوم 5 بعد الذوبان. قم بإجراء فحوصات EP في اليوم 7 أو ما بعده ، كما هو موضح سابقا 8,9. قم بتغيير الوسط كل يوم عند اختيار توسيع ثقافة الخلية.

2. التمايز الموجه للقلب hiPSC وتنقية hiPSC-CM

  1. محلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك الدافئ المتوفر تجاريا 1x (EDTA) ، HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS--) ، وألواح 6 آبار مطلية بمصفوفة غشاء قاعدي قابلة للذوبان تفرزها خلية ساركوما فأر Engelbreth-Holm-Swarm (الماوس ECM) إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتمييز المستعمرات المتمايزة عن طريق الفحص المجهري على النقيض من الطور ونضح / استئصال. اغسل كل بئر ب 1 مل من HBSS--. قم بإجراء غسلتين في الآبار التي تحتوي على >10 نقاط تمايز.
  3. استنشاق HBSS - وإضافة 1 مل من محلول EDTA إلى كل بئر. احتضن الأطباق لمدة تصل إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من اللوحات بعد 3 دقائق وابحث عن مستعمرات بيضاء شفافة مرئية.
  4. نضح محلول EDTA وإضافة 1 مل إلى بئر واحد. قم بإزاحة الخلايا التي تحتوي على 2 مل من وسط hiPSC عن طريق سحب المعلق لأعلى ولأسفل بشكل متكرر ، باستخدام ماصة زجاجية سعة 10 مل لفصل جميع الخلايا الجذعية عن البئر ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب تجميع. كرر الطموح والنزوح مع الآبار اللاحقة.
    ملاحظة: قم بإزاحة المستعمرات التي يصعب رفعها بطرف الماصة الزجاجية.
  5. عد الخلايا الجذعية واضبط الحجم على اللوحة 8.0 × 105 خلايا / بئر. استزرع الخلايا على وسط hiPSC (2 مل / بئر) حتى تصل الخلايا الجذعية إلى التقاء 90٪ (يشار إلى هذه المرة من الآن فصاعدا باسم D0).
  6. تحضير 2 مل من وسط التمايز القاعدي المكمل ب 4 ميكرومتر من CHIR99021.
  7. في D0 ، اغسل كل بئر من صفيحة 6 آبار من الخلايا الجذعية مع 1 مل من HBSS لكل بئر. استبدل HBSS بوسط تمايز قاعدي مكمل ب 4 ميكرومتر من CHIR99021.
  8. في D1 ، لا تفعل شيئا.
  9. في D2 ، قم بإعداد وسط التمايز القاعدي المكمل ب 4 ميكرومتر من IWP4.
  10. استبدل الوسط ب 2 مل من وسط التمايز القاعدي المكمل ب IWP4 لكل بئر.
  11. في D3 ، لا تفعل شيئا من أجل التمايز الخاص بالبطين. للحصول على تمايز خاص بالأذينين ، قم باستنشاق الوسط وإضافة 2 مل من الوسط القاعدي المكمل ب 4 ميكرومتر من IWP4 و 1 ميكرومتر من محلول حمض الريتينويك (RA) لكل بئر.
  12. في D4 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من الوسط القاعدي لكل بئر لتمايز البطين. للتمايز الأذيني ، قم باستنشاق الوسط وإضافة 2 مل من الوسط القاعدي المكمل بمحلول RA 1 ميكرومتر لكل بئر.
  13. في D5 ، لا تفعل شيئا.
  14. في D6 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من الوسط القاعدي لكل بئر (لكل من التمايز الأذيني والبطيني).
  15. في D7 ، لا تفعل شيئا.
  16. في D8 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من وسط صيانة عضلة القلب. قم بتغيير الوسط كل يومين حتى انفصال الخلايا ، أو اتبع خطة التعرض المزمن للأدوية.

3. تنقية hiPSC-CM عبر MACS (فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا)

  1. نضح وسط زراعة الخلايا وغسل كل بئر مع 1 مل من HBSS--. فصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 0.25٪ تربسين / EDTA واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا وتفردها في كل بئر باستخدام 2 مل من وسط الطلاء لتعطيل التربسين / EDTA.
  2. اجمع الخلايا من الآبار الستة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع مصفاة 70 ميكرومتر. ثم اغسل المصفاة ب 3 مل من وسط الطلاء. عد الخلايا.
  3. أجهزة الطرد المركزي التعليق في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية واغسل الخلايا ب 20 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS المثلج البارد. ثم ، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 106 خلايا. أضف 20 ميكرولتر من كوكتيل استنفاد الخلايا العضلية غير القلبية الباردة (الإنسان) لكل 5 × 106 خلايا. اخلطي تعليق الخلية برفق واحتضنها على الثلج لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل العينة بإضافة 4 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 106 خلايا. أجهزة الطرد المركزي العينة في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق ونضح طاف طاف.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد لكل 5 × 106 خلايا. أضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات الباردة المضادة للبيوتين لكل 5 × 106 خلايا. امزج تعليق الخلية برفق واحتضنه لمدة 10 دقائق على الثلج.
  7. أثناء احتضان العينات ، ضع أعمدة الاستنفاد الإيجابية (المزودة بمرشحات ما قبل الفصل 30 ميكرومتر) على فاصل MACS ، وضع أنابيب التجميع 15 مل الموسومة أسفل الأعمدة. هناك حاجة إلى عمود واحد لكل 5 × 106 خلايا.
  8. قم بتجهيز كل عمود ب 3 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS البارد. امزج معلق الخلية المعالج بالأجسام المضادة مع 2 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS لكل 5 × 106 خلايا ، وأضفه إلى العمود.
    ملاحظة: لا أجهزة الطرد المركزي! الطرد المركزي في هذه الخطوة له آثار ضارة على إنتاج عضلة القلب.
  9. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفصل MACS إلى كل عمود ، واجمع التدفق حتى يتم جمع 12 مل من تعليق خلايا عضلة القلب المتدفقة.
    ملاحظة: لا تدع الأعمدة تجف تماما.
  10. أجهزة الطرد المركزي للخلايا العضلية القلبية في ~ 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، وتجاهل الطافية ، وتعليق خلايا عضلة القلب في 1 مل من وسط الطلاء.
  11. عد الخلايا لتحديد التركيز ، واضبط الحجم على كثافة البذر المطلوبة ، وقم بلوحة الخلايا. صفيحة الخلايا العضلية القلبية المنقاة على ألواح MECM 96-Well ، كما هو موضح أعلاه في الخطوات 1.9-1.11 (7.5 × 105 خلايا / بئر).

4. رسم الخرائط البصرية باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) والفلوروفورات الحساسة للكالسيوم (CSFs)

  1. تحضير الكمية المناسبة من VSD في HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من صبغة VSD لكل مل من HBSS و 10 ميكرولتر من مساعد التحميل لكل مل من HBSS.
    ملاحظة: عادة ، تتطلب لوحة 96 بئرا 10 مل من محلول VSD.
  2. بدلا من ذلك ، قم بإعداد HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم المكمل ب 5 ميكرومتر من السائل الدماغي النخاعي. نضح وسط صيانة خلايا عضلة القلب واستبدله ب 100 ميكرولتر من VSD أو CSF لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا.
  3. قم بإزالة الأصباغ واستبدلها بوسيط الفحص أو HBSS. التوازن عند 37 درجة مئوية للحصول على رسم الخرائط البصرية للبيانات الأساسية باستخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية عالي الإنتاجية.
  4. عالج الخلايا بالأدوية لاختبار التعرض الحاد ، أو قم بتعيين الخلايا التي تعرضت بشكل مزمن للعقاقير ذات الأهمية.
  5. لاختبار السمية القلبية في 96 لوحة بئر ، استخدم أربع جرعات من مركب يحتوي على ستة آبار على الأقل لكل جرعة. استخدم جرعات تتراوح من أقل إلى أعلى من تركيز البلازما العلاجية الفعال ، بما في ذلك جرعة من تركيز البلازما العلاجية الفعالة سريريا.
  6. تمييع الأدوية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، وتخزينها كمحاليل مخزون عند -20 درجة مئوية ، ثم تخفيفها في HBSS إلى التركيزات المطلوبة.
  7. قم بإجراء قياسات الفيزيولوجيا الكهربية الأساسية قبل تطبيق الدواء ، كما هو موضح في القسم 5. بمجرد تطبيق الأدوية ، قم بإجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية بعد 30 دقيقة على الأقل للدراسات المزمنة. راجع الأقسام التالية للحصول على بيانات الخرائط الضوئية وإجراءات تحليلها.

5. رسم الخرائط البصرية باستخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GECI)

  1. لوحة متاحة تجاريا أو hiPSC-CMs منقاة من MACS ، كما هو موضح أعلاه ، باستخدام ألواح 96 بئر مطلية ب MECM لصنع hiPSC-CMs ناضجة. لتشكيل طبقة أحادية متقاربة ، لوحة 7.5 × 104 سم لكل بئر من كل لوحة 96 بئر. استخدام وسط الطلاء.
  2. بعد 48 ساعة في وسط الطلاء ، قم بالتبديل إلى وسط صيانة عضلة القلب.
  3. في اليوم الرابع بعد الذوبان وإعادة الطلاء ، أضف الفيروس الغدي المؤتلف للتعبير عن GCaMP6m (AdGCaMP6m) إلى الخلايا عند تعدد العدوى (MOI) = 5. أضف الفيروس باستخدام وسيط مقايسة CM.
    ملاحظة: هنا ، تم إجراء تجارب باستخدام GCaMP6m في خلايا عضلة القلب iCell2 من بائع تجاري.
  4. في اليوم 5 ، قم بإزالة وسيط adGCaMP6m واستبدله ب RPMI + B27 جديد (وسط صيانة عضلة القلب).
  5. في اليوم 7 ، راقب CMs باستخدام المجهر أو تصوير الخرائط البصرية ، لتصور الانقباضات التلقائية وعابرات الكالسيوم المقابلة.
  6. في اليوم 7 أو بعد ذلك ، لفحص الدواء ، انقل مباشرة 96 لوحة بئر من الطبقات الأحادية الناضجة hiPSC-CM التي تعبر عن GCaMP6m إلى جهاز تصوير الخرائط البصري من الحاضنة للحصول على بيانات خط الأساس.
  7. بعد الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية ، أعد لوحات CMs إلى حاضنة زراعة الأنسجة ، لإجراء قياسات في نقطة زمنية لاحقة.
  8. باتباع التسجيلات الأساسية ، قم بتطبيق الأدوية ، باستخدام أربع جرعات على الأقل من كل دواء وستة آبار على الأقل لكل جرعة. قم بموازنة الأدوية على الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل جمع البيانات. قم بتسخين درجة حرارة البئر إلى ~ 37 °C قبل وأثناء الحصول على البيانات.
  9. بعد التسجيلات الأساسية للوحة كاملة ، أضف الأيزوبروتيرينول (500 نانومتر) إلى كل بئر لتمكين بيانات الاستجابة القوية للأدوية. تحديد آثار الأيزوبروتيرينول على معدل النبض أحادي الطبقة ، وسعة الانكماش (سعة الكالسيوم العابرة) ، ومدة الكالسيوم العابرة (انظر الشكل 6) ، كما هو موضح في القسم 5.

6. الحصول على بيانات الخرائط البصرية وتحليلها

  1. تأكد من تشغيل كاميرا جهاز رسم الخرائط الضوئية وجهاز الإرسال وسخان اللوحة.
  2. افتح برنامج الاستحواذ وحدد موقع حفظ الملف.
  3. افتح الدرج الأمامي وضع اللوحة على سخان اللوحة.
  4. احصل على إطار داكن بالنقر فوق الزر "إطار داكن ".
  5. حدد المدة (10-30 ثانية) ومعدل اكتساب الإطارات (على سبيل المثال، 100 إطار في الثانية؛ 250 إطارا في الثانية للحصول على دقة زمنية أعلى)، وانقر فوق بدء الاستحواذ.
  6. افتح برنامج التحليل، وفي علامة التبويب استيراد/تصفية ، حدد إما الاستعراض بحثا عن ملف واحد أو تجانب متعدد لإعادة إنشاء لوحة.
  7. حدد وضع المعلمات (APD أو CaTD)، أدخل المسافة لكل بكسل، واستخدم معالج البئر لتحديد مكان الآبار في الصورة. انقر فوق عملية حفظ للانتقال إلى علامة التبويب التالية.
  8. افتح علامة التبويب ROIs (مناطق الاهتمام) واختر رسم عائد الاستثمار يدويا أو تلقائيا أو عدم استخدام عائد الاستثمار على الإطلاق ، والذي سينظر بعد ذلك في البئر بالكامل للتحليل. بعد تحديد عائد الاستثمار ، انقر فوق معالجة / حفظ زر للانتقال إلى الخطوة التالية. حدد مربعات إخفاء الآبار وإظهار المربعات التي تمت تصفيتها فقط لتصور عائد الاستثمار.
  9. افتح علامة التبويب التحليل ، وفي أعلى الجانب الأيمن من الشاشة ، حدد كل بئر أو عائد استثمار لتأكيد دقة الكشف التلقائي عن النبضات. قم بإضافة أو إزالة Beats من الآثار بالضغط على Add Beat / Save Beats ، أو عن طريق تحديد Beat فردي والضغط على Delete على لوحة المفاتيح.
  10. اختياريا ، استخدم ميزة خرائط متوسط الحرارة لإنشاء خرائط حرارية للمعلمات المحددة للوحة.
  11. انقر فوق الزر Time-Space Plot في علامة التبويب Analysis لتصور البيانات لكل بئر أو عائد الاستثمار. بعد التأكد من دقة اكتشاف الإيقاع ، انتقل إلى علامة التبويب تصدير وحدد تنسيق الملف. اضغط على تصدير وأنشئ مجلدا للبيانات المراد تصديرها إليه. تابع لفتح ملفات البيانات وتشغيل روتين التحليل الإحصائي المختار.
    ملاحظة: يفضل ملفات .xlxs حيث يتم تصدير كافة المعلمات في ملف واحد; تقوم التنسيقات الأخرى (.csv أو .tsv) بإنشاء ملف واحد لكل معلمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتميز نضوج hiPSC-CM بتباين الطور والتصوير المناعي البؤري
يتم عرض الجدول الزمني للنضج بوساطة ECM ل hiPSC-CMs المتاحة تجاريا باستخدام ألواح 96 بئر مطلية ب MECM في الشكل 1A. يتم جمع هذه البيانات باستخدام خلايا عضلة القلب المتاحة تجاريا والتي تصل إلى المختبر كقوارير محفوظة بالتبريد للخلايا. تحتوي كل قارورة على >5 × 106 خلايا عضلية قلبية قابلة للحياة. الخلايا نقية ~ 98٪ ويتم اختبارها بدقة لمراقبة الجودة (يتم توفير شهادة التحليل مع كل قارورة). يتيح العدد الكبير من CMs إذابة وطلاء CMs على مجموعات ECM مختلفة باستخدام نفس مجموعة الخلايا. في الشكل 1 ، يتم طلاء hiPSC-CMs إما على ألواح مطلية بالماوس ECM أو MECM. تنضج hiPSC-CMs المطلية على MECM وتصبح متميزة هيكليا عن نفس مجموعة hiPSC-CMs المعاد طلاؤها على ECM للماوس. وهي الخلايا الناضجة تصبح على شكل قضيب ، بينما تحتفظ الخلايا غير الناضجة بشكل دائري. يمكن ملاحظة ذلك في تصوير تباين الطور وعند تلطيخ الخيوط العضلية القلبية (الشكل 1B ؛ تروبونين I [TnI] ، أحمر). يتم تقديم تحقق أكثر شمولا من النضج الهيكلي ل hiPSC-CMs في الشكل 2. يظهر مجال رؤية كبير (هدف 20x) من CMs الملطخة بجسم مضاد α-actinin الشكل النموذجي للخلايا المزروعة في كل حالة ECM. α-أكتينين هو بروتين هيكلي مهم يتم ترتيبه مع تباعد منتظم في الخيوط العضلية القلبية. تمشيا مع تلطيخ TnI في الشكل 1 ، يشير تلطيخ α-actinin أيضا إلى نضوج hiPSC-CMs المستزرعة على MECM. إلى جانب تعزيز النمط الظاهري الناضج على شكل قضيب ، فإن MECM يحفز أيضا تنظيما أكبر للساركومير (صور 60x). يميز محتوى الميتوكوندريا ونشاطها أيضا بين الخلايا المزروعة على ECM للفأر و MECM (الشكل 2B). يقتصر محتوى الميتوكوندريا hiPSC-CM غير الناضج للجنين على الفضاء المحيط بالنواة ، مع وجود القليل من الميتوكوندريا في العصارة الخلوية. في المقابل ، يتم توزيع محتوى الميتوكوندريا hiPSC-CMs الناضجة في جميع أنحاء الخلية. يستخدم تقييم الميتوكوندريا بروتوكولا راسخا19.

التمايز الموجه للقلب hiPSC ومواصفات غرفة القلب
يوجد هنا بروتوكول للإنتاج الداخلي ونضج hiPSC-CMs المنقى والخاص بالغرفة (الشكل 3 أ). ويستند هذا إلى تقرير نشر سابقا20. يتم تقديم إجراءات مفصلة لتنقية hiPSC-CM باستخدام مجموعة فرز الخلايا (MACS) المتاحة تجاريا والمنشطة بالمغناطيس. لقد تحققنا مؤخرا من استخدام تنقية MACS وأظهرنا فوائد استخدام MACS مقارنة بتنقية hiPSC-CM القائمة على التمثيل الغذائي. عادة ، من المتوقع نقاء hiPSC-CM أعلى من 95٪21. من المهم الإشارة إلى أنه إذا كان محتوى CM الأولي <50٪ ، فقد تصل تنقية MACS إلى ~ 85٪ فقط. في هذه الحالات ، قد يكون التخصيب CM ضروريا بعد استنفاد غير CMs. إذا كان محتوى CM الأولي من التمايز هو >50٪ ، فإن استنفاد غير CMs من مجموعة الخلايا باستخدام مجموعة MACS يمكن أن يحقق نقاء >95٪ ؛ في هذه الحالة ، ليس من الضروري إجراء مزيد من الإثراء أو الاختيار الإيجابي ل CMs. يمكن أيضا نضج hiPSC-CMs الخاصة بالغرفة باستخدام ألواح 96 بئر مطلية ب MECM ، كما هو موضح أعلاه وموضح في الشكل 1 والشكل 2. من المتوقع أن يكون للخلايا الأذينية الخاصة (hiPSC-ACM) معدل ضربات تلقائي أسرع بكثير ومدة جهد عمل أقصر 80 (APD80) من الخلايا الخاصة بالبطين (hiPSC-VCM). هذه بيانات فسيولوجية كهربية نموذجية لجهود الفعل المسجلة باستخدام VSDs ونظام رسم الخرائط الضوئية (الشكل 3B-D).

رسم الخرائط البصرية الفيزيولوجية الكهربية للقلب عالي الإنتاجية
يتم زيادة الدقة العلمية بشكل كبير لأي فحص إذا كان من الممكن تنفيذه بطريقة عالية الإنتاجية. يتم عرض بيانات فحص السمية القلبية في الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6 والشكل 7 ، والتي توضح الفحص الفيزيولوجي الكهربي عالي الإنتاجية باستخدام أحاديات hiPSC-CM الناضجة في صفيحة 96 بئرا. تكشف الخرائط الحرارية للوحة كاملة لمعلمات مثل APD80 (الشكل 4A) عن قابلية استنساخ معلمة معينة داخل لوحة من بئر إلى بئر. علاوة على ذلك ، توفر خرائط الحرارة للوحة الكاملة فحصا سريعا لأي قيم متطرفة في مجموعة البيانات. على سبيل المثال ، في البئر E4 من اللوحة المعروضة في الشكل 4A ، من الواضح أن هذا البئر له قيمة APD80 أكبر بكثير ، يشار إليها باللون الأصفر الذي يظهر البئر ، في حين أن الآبار الأخرى زرقاء نيلية. تذكرنا إمكانات الفعل النموذجية للطبقات الأحادية 2D hiPSC-CM الناضجة (الشكل 4B) بمورفولوجيا جهد الفعل لخلايا عضلة القلب البالغة المعزولة والمختبرة في الثقافة. علاوة على ذلك ، يتم عرض إيقاع تلقائي نموذجي لجهد الفعل في الشكل 4C. البيانات الواردة في الشكل 4C عبارة عن مخطط زمني للصف A ، الأعمدة من 1 إلى 12. يوضح الخط الأبيض عبر خريطة اللوحة في الشكل 4 أ هذا. يمثل كل وميض فلورسنت ساطع بمرور الوقت في كل بئر تنشيطا تلقائيا واحدا. يوضح الشكل 5 والشكل 6 فائدة استخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا GCaMP6m (GECI) لقياس عابرات الكالسيوم داخل الخلايا. يوضح الشكل 6 أيضا الاستجابة المتوقعة للأيزوبروتيرينول - الإينوتروب الإيجابي القلبي الكلاسيكي. استجابة للأيزوبروتيرينول ، يؤدي تنشيط مستقبلات β1 الأدرينالية إلى كرونوتروبي إيجابي (الشكل 6 أ) ، مؤثر في التقلص العضلي الإيجابي (الشكل 6 ب) ، و lusitropy إيجابي (الشكل 6C). تشير هذه الاستجابات للأيزوبروتيرينول إلى النضج الكبير لمستقبلات hiPSC-CM β1 الأدرينالية وشلالات الإشارات داخل الخلايا.

في الشكل 7 ، تظهر استجابة hiPSC-CM لحاصرات القنوات الجينية البشرية المرتبطة بالأثير (hERG) ، باستخدام مضان الكالسيوم GCaMP6m لمراقبة الإيقاع ولتكون بمثابة علامة بديلة للانقباض. E-4031 هو مانع قناة خاص ب hERG ، يبطئ معدل النبض التلقائي ويزيد من مدة الكالسيوم العابرة (CaTD80) والتثليث (تثليث CaT). يوضح الشكل 7 أ الكشف المبكر عن الاستقطاب بعد إزالة الاستقطاب الناجم عن حصار قناة E-4031 hERG. كما تم اختبار حاصرات قنوات hERG الأخرى ، بما في ذلك دومبيريدون وفاندتانيب وسوتالول ، وتظهر النتائج في الشكل 7E-G. تم اختيار هذه المركبات والجرعات بناء على دراسة التحقق من صحة hiPSC-CM الأخيرة1،7،9.

Figure 1
الشكل 1: الجدول الزمني للنضج السريع ل hiPSC-CMs المتاحة تجاريا أو المحفوظة بالتبريد من مصادر أخرى . (أ) يتم تطبيق خلايا عضلة القلب المذابة المعلقة في وسط الطلاء على MECM في اليوم 0. في اليوم 2 ، يتم استبدال الوسيط بوسيط الصيانة ، ويتم تغيير الوسيط المستهلك في اليوم 5. يتم استزراع الخلايا لمدة 2 أيام إضافية ، وفي اليوم 7 ، قد يتم تحميل syncytia الناضجة من hiPSC-CMs مع حل تسجيل للتطبيقات النهائية أو استزراعها لفترات أطول. (ب) تظهر مرحلة التباين في تخليق الخلايا العضلية القلبية المطلية على ECM للفأر أو MECM أن الخلايا العضلية القلبية المطلية على ECM للفأر لها دائرية أكبر مقارنة بالخلايا العضلية القلبية المطلية على MECM ؛ علاوة على ذلك ، يشير التلوين المناعي ل TnI إلى أن الخلايا العضلية القلبية المطلية على ECM للفأر تحتفظ بمورفولوجيا تناظر شعاعي وعضليات غير منظمة على عكس hiPSC-CMs ثنائية الشكل وجيدة التنظيم مطلية على MECM. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (B ، العلوي) ؛ 50 ميكرومتر (B ، أقل). الاختصارات: hiPSC-CMs = خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ؛ ECM = مصفوفة خارج الخلية ؛ MECM = ECM المحفز للنضج ؛ 96wp = لوحة 96 بئر ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ TnI = تروبونين I. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة بين تنظيم القطعة العضلية ل hiPSC-CMs المطلية على ECM للفأر أو MECM. (أ) تشير hiPSC-CMs المستزرعة بالفأر ECM الملطخة بالمناعة ضد α-actinin إلى مورفولوجيا شعاعية ، مع كثافة أقل من القطع العضلية المنتشرة عبر الخلية العضلية القلبية على عكس hiPSC-CMs من نفس الدفعة المطلية على المصفوفة وتقديم مورفولوجيا على شكل قضيب (20x). (60x) تظهر ملاحظة hiPSC-CMs باستخدام المجهر متحد البؤر أن hiPSC-CMs المستزرعة على ECM للفأر لها مورفولوجيا تناظر شعاعي ، مع توزيع محيطي أكثر كثافة للقطع العضلية وكثافة منخفضة من القطع العضلية الشعاعية على عكس hiPSC-CMs من نفس الدفعة التي تم استزراعها على MECM. وهي تقدم توزيعا متجانسا للقطع العضلية المنظمة على طول المحور الأطول للخلايا. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (العلوي) ؛ 50 ميكرومتر (أقل). (ب) يظهر تلطيخ hiPSC-CMs المستزرعة على ECM للفأر أو MECM بصبغة الميتوكوندريا التي تلطخ الميتوكوندريا ذات الإمكانات العالية عبر الغشاء كثافة أقل للتلطيخ في الخلايا العضلية القلبية المزروعة على ECM للفأر مقارنة ب MECM. علاوة على ذلك ، فإن hiPSC-CMs المزروعة على MECM لها ميتوكوندريا موزعة بشكل متجانس في خلايا عضلة القلب ، على عكس hiPSC-CMs المزروعة على ECM للفأر والتي تقدم تراكما حول النواة للميتوكوندريا. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: hiPSC-CMs = خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ؛ ECM = مصفوفة خارج الخلية ؛ MECM = ECM المحفز للنضج ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إنتاج الخلايا العضلية القلبية الخاصة بالغرفة. (أ) تشترك بروتوكولات إنتاج الخلايا العضلية القلبية الخاصة بالغرفة في معالجة مسار إشارات Wnt المتطابقة ، مع تحفيز إشارات Wnt عن طريق تثبيط GSK3 من اليوم 0 إلى 2 ، وتثبيط هذا المسار بين اليوم 2 و 4. يتم تحقيق مواصفات الغرفة من خلال تنشيط مسار حمض الريتينويك ومعالجة إشارات Wnt بين اليومين 3 و 6. (ب) نتيجة لتوصيف الغرفة، تقدم الخلايا العضلية القلبية الأذينية معدل أسرع من إزالة الاستقطاب التلقائي مقارنة بالخلايا العضلية القلبية البطينية. (ج) معدلات ضربات الهيبسيك-CMs البطينية أبطأ مقارنة ب hiPSC-CMs الأذينية؛ لذلك ، تكون مدة جهد الفعل عند 80٪ من إعادة الاستقطاب أقصر في hiPSC-ACMs مقارنة ب hiPSC-VCMs. الاختصارات: hiPSC-CMs = خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ؛ hiPSC-ACM = الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية الأذينية التي يسببها الإنسان ؛ hiPSC-VCM = خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية البطينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: رسم الخرائط الضوئية التي تم الحصول عليها باستخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية وتحليلها باستخدام Pulse. (أ) مثال على خريطة حرارية للمراقبة الشاملة للبارامترات التي تم تقييمها في لوحة 96 بئرا بعد ترشيح الفيلم وتحديد مناطق الاهتمام في لوحات 96 بئرا ، تم تعيينها بجهاز رسم الخرائط البصرية. في هذا المثال، خريطة حرارية APD80٪ تشير إلى بئر متطرف (E4) وآبار فشلت في إنتاج البيانات (الآبار H3 و4 و5). (ب) علاوة على ذلك ، تسمح الواجهة سهلة الاستخدام بالتخطيط السهل لمورفولوجيا جهد الفعل المتوسط من الآبار المختارة. (ج) توافر أدوات إضافية لتصور البيانات؛ في هذا المثال، يظهر مخطط الفضاء الزمني الذي تم إنشاؤه من الخط الأفقي الذي يعبر الآبار في الصف A (اللوحة A) التنشيط عبر مقطع أفقي لكل بئر (خط أبيض عبر الصف A) خلال فترة 10 ثوان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: الجدول الزمني لرسم خرائط التغيرات العابرة للكالسيوم داخل الخلايا باستخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا. في اليوم 4 بعد طلاء الخلايا العضلية القلبية المتاحة تجاريا في صفيحة 96 بئرا مغلفة ب MECM ، كما هو موضح في الشكل 1 أ ، يجب تحويل الخلايا ب 5 MOI من الفيروس في وسط مقايسة CM بين عشية وضحاها. يتم استبدال الوسط بوسط صيانة CDI حتى اليوم 6 ، ويتم تغييره إلى وسط صيانة CDI بدون الفينول الأحمر بين اليومين 7 و 11 للسماح بالمراقبة السريعة أو المستمرة للتغيرات العابرة للكالسيوم داخل الخلايا مع نوتيلوس. (ب) hiPSC-CMstransduced مع AdGCaMP6f تم تقييمه باستخدام رسم الخرائط الضوئية في الأيام 7 و 9 و 10 بعد الذوبان تشير إلى وجود تغيرات مضان مستقرة داخل الخلايا بوساطة الكالسيوم ، والتي تسمح برسم خرائط بصرية يومية لنفس اللوحة على مدى فترة طويلة من الأوقات دون الحاجة إلى إعادة تطبيق الأصباغ الحساسة للكالسيوم. الاختصارات: GECI = مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا. CM = عضلة القلب. MOI = تعدد العدوى ؛ 96wp = لوحة 96 بئر ؛ BSA = ألبومين مصل الأبقار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الاستخدام السريع والسهل للخرائط الحرارية للمقارنة البصرية للبيانات التي تم الحصول عليها من التخليق الوظيفي الناضج ل hiPSC-CMs مع نوتيلوس وتحليلها باستخدام Pulse. (أ) تظهر hiPSC-CMs المعالجة بالإيزوبروتيرينول زيادة في معدل النبض ، كما لوحظ من خلال فحص خرائط الحرارة وتم تأكيده باستخدام اختبار t المزدوج. (ب) وبالمثل ، يوضح رسم خرائط الخلايا قبل وبعد العلاج بالإيزوبروتيرينول تأثير التقلص العضلي لتحفيز β الأدرينالية من خلال المقارنة البصرية لخرائط الحرارة ومع اختبار t المزدوج. (ج) أخيرا ، يظهر استخدام الخرائط الحرارية للمقارنة البصرية للبيانات lusitropy ، وهو تأثير قانوني آخر لتحفيز β الأدرينالية ، تم تأكيده باستخدام اختبار t المزدوج (p < 0.0001). يشير عدم وجود دائرة إلى الفشل في الحصول على / تحليل البيانات لهذا البئر المحدد. الاختصارات: hiPSC-CMs = خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ؛ ISO = الأيزوبروتيرينول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التحقق من صحة فحص السمية القلبية GECI باستخدام حاصرات قناة hERG. (أ) آثار تدفق الكالسيوم التلقائي التمثيلي من آبار خط الأساس في HBSS وفي وجود 500 نانومتر E-4031. (ب-د) القياس الكمي لتأثيرات خط الأساس و + E-4031 على معدل النبض ، ومدة الكالسيوم العابرة 80 (CaTD80) ، وتثليث الكالسيوم العابر (تثليث CaT) على التوالي. *,** يدل على اختلاف كبير؛ اختبار t غير المزاوج ؛ ع < 0.01 ؛ ن = 8 في كل مجموعة. (ه) اكتشاف GECI لمانع hERG آخر ، دومبيريدون. (F) كشف GECI لكتلة hERG التي يسببها vandetanib. (ز) الكشف GECI عن كتلة hERG بجرعة عالية من السوتالول. الاختصارات: GECI = مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا. hERG = جين مرتبط بالأثير البشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وسائل الإعلام ومؤلفاتها الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك عدة طرق مختلفة لفحص سمية القلب في المختبر باستخدام hiPSC-CMs. قدمت ورقة "أفضل الممارسات" الأخيرة حول استخدام hiPSC-CMs المقايسات المختلفة في المختبر ، وقراءاتها الأولية ، والأهم من ذلك ، دقة كل فحص لتحديد وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب البشري20. بالإضافة إلى استخدام الأقطاب الكهربائية الخارقة للأغشية ، يتم توفير القياس الأكثر مباشرة لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب البشري بواسطة VSDs. تتيح قراءات مقايسة VSD التصور المباشر والقياس الكمي للمعلمات الكهربية الفسيولوجية الحرجة ، بما في ذلك مدة جهد الفعل ، وسرعة انتشار جهد الفعل ، وشوط جهد الفعل ، وتثليث جهد الفعل ، ومعدل النبض ، وانتظام النبض ، وعدم تجانس مدة جهد الفعل. وبالمثل ، توفر المجسات الحساسة للكالسيوم معلومات عن إيقاع الطبقة الأحادية hiPSC-CM ومعدله ومدد الأحداث. توفر قياسات الكالسيوم العابرة hiPSC-CM التي تم إجراؤها باستخدام مجسات الفلورسنت أيضا معلومات عن انقباض وقوة الانقباض لكل انكماش. يقدم هذا البحث طرقا لاستخدام hiPSC-CMs الناضجة (96 لوحة بئر) في فحوصات قياس VSD عالية الإنتاجية والكالسيوم العابرة. بالإضافة إلى طرق رسم الخرائط الضوئية ، يتم تقديم برنامج لتحليل بيانات EP عالية الإنتاجية.

تعد الطرق الموضحة هنا تقدما كبيرا في مجالات فحص السمية القلبية والعلوم التنظيمية. هنا ، قدمنا طرقا للنضج السريع والتسجيل الكهربي للطبقات الأحادية 2D hiPSC-CM في لوحات غربلة عالية الإنتاجية (96 لوحة بئر). يعد النضج السريع باستخدام MECM (7 أيام) الموضح هنا تقدما كبيرا مقارنة بالنهج السابقة التي تتطلب أن يحدث النضج خلال 30-100 يوم22,23. بالمقارنة مع ECMs الأخرى ، والتي تتطلب تطبيقا يدويا لكل تجربة ، يتم طلاء لوحات MECM مسبقا ب ECM وتصل إلى المختبر جاهزة للاستخدام. هذا الجانب من MECM يجعله أسهل في الاستخدام وأقل متغيرا وأكثر كفاءة من استخدام طلاءات ECM الأخرى. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج لكل من hiPSC-CMs المحفوظة بالتبريد والمتاحة تجاريا و hiPSC-CMs "محلية الصنع" ، والتي يمكن أن تكون خاصة بالغرفة. نظرا للهيكل المميز على شكل قضيب ل hiPSC-CMs الناضجة (الشكل 1 والشكل 2) ، من المهم الإشارة إلى أن هناك حاجة إلى عدد أكبر من الخلايا لتشكيل أحادي الطبقة المتقاربة هنا ، مقارنة بالبروتوكولات التي تستخدم ECMs الأخرى. والجدير بالذكر أنه عند استخدام الماوس ECM (تحتوي الخلايا على نمط ظاهري فطيرة منتشر باستمرار) ، فإننا نضع 50000 hiPSC-CMs لكل بئر ، ولكن عند استخدام MECM ، نقوم بلوحة 75000 hiPSC-CMs لكل بئر. يمكن أيضا تقليل عدد CMs لكل بئر إذا كانت الخلايا ستستخدم لتحليل الخلية الواحدة ، مثل مشبك التصحيح أو أي تقنية تصوير أخرى تتطلب خلايا مفردة.

توفر hiPSC-CMs المتاحة تجاريا مزايا للعلوم التنظيمية بسبب التوصيف المكثف لهذه الخلايا من خلال الجهود الدولية التي تقودها إدارة الغذاء والدواء (FDA). ومع ذلك ، فإن الخلايا المتاحة تجاريا هي مزيج من hiPSC-CMs العقدية والأذينية والبطينية ، والتي توفر معلومات سمية ذات صلة عالية ولكنها تفتقر إلى الميزات الخاصة بالغرفة التي تحاكي قلب الإنسان. تعيد hiPSC-CMs الخاصة بالغرفة إنشاء الاختلافات الفيزيولوجية الكهربية المعروفة بين خلايا عضلة القلب الأذينية والبطينية ، وتوفر مقايسة في المختبر لتطوير علاجات مضادة لاضطراب النظم خاصة بالغرفة (الشكل 3B-D). على سبيل المثال، يمكن الآن اختبار الأدوية الخاصة بالرجفان الأذيني وتطويرها باستخدام طبقات أحادية الطبقة من hiPSC-ACM مطلية في 96 بئرا لجمع البيانات بقوة وصرامة. وبالمثل ، عند الفحص لتحديد ما إذا كان المركب يسبب Torsades de Pointes (TdP) ، وهو عدم انتظام ضربات القلب البطيني عالي الخطورة ، فمن الأفضل عدم وجود خلايا أذينية وعقدية "تلوث" أحاديات القلب البطينية. لذلك ، على الرغم من أن جهود التحقق من صحة hiPSC-CM التي تقودها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية حتى الآن قد ركزت على استخدام CMs المتاحة تجاريا ، فمن المحتمل أن تتحول توصيات العلوم التنظيمية المستقبلية إلى استخدام الخلايا الخاصة بالغرفة لجعل فحص السمية أكثر تنبؤا بحالة القلب البشري. تستند الطرق الموضحة هنا إلى التقارير السابقة ، وتوفر نهجا قويا لتوليد خلايا عضلية قلبية خاصة بالغرفة مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات21.

الفرق الرئيسي بين هذه البروتوكولات وتلك المستخدمة عادة في هذا المجال هو نهج التنقية المستخدم. تعتمد غالبية المختبرات التي تولد hiPSC-CMs في مختبراتها الخاصة على الاختيار بوساطة التمثيل الغذائي لخلايا عضلة القلب22. هنا ، نعتمد على استخدام MACS لتنقية hiPSC-CMs ، باستخدام نهج معالجة الخلايا المعتمد سريريا والذي ينتج CMs مع الأنماط الظاهرية الصحية23. نهج التحدي الأيضي فعال ، لكنه يستخدم تركيبة وسائط تحاكي نقص تروية عضلة القلب24. عند استخدام تنقية MACS ل hiPSC-CMs ، من المهم استخدام كوكتيل النضوب غير CM ، والذي يستهدف غير CMs للنضوب المغناطيسي من سكان الخلايا. يقلل استخدام نهج الاستنفاد غير CM من إجهاد القص الذي تتعرض له CMs في العمود المغناطيسي ، ويفضل على وضع العلامات المغناطيسية المباشرة لسكان CM. إن استخدام تنقية MACS للخلايا الخاصة بالغرفة سيمكن المختبرات الأخرى من توليد CMs صحية للبحث واختبار السمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

TJH هو مستشار ومستشار علمي لشركة StemBioSys، Inc. TB هو موظف في StemBioSys، Inc. AMR و JC مستشاران سابقان لشركة StemBioSys، Inc. TJH و TB و AMR و JC مساهمون في StemBioSys، Inc.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL148068-04 و R44ES027703-02 (TJH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Gibco 25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) Millipore Sigma A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) Millipore Sigma H4034
AdGCaMP6m Vector biolabs 1909
Albumin human Sigma A9731-1G
alpha actinin antibody ThermoFisher MA1-22863
B27 Gibco 17504-044
Blebbistatin Sigma B0560
CalBryte 520AM AAT Bioquest 20650
CELLvo MatrixPlus 96wp StemBiosys N/A https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021 LC Laboratories c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite) ThermoFisher A1896701 For adenovirus transduction
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM:F12 Gibco 11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135-500ML
FluoVolt ThermoFisher F10488
HBSS Gibco 14025-092
iCell CM maintenance media FUJIFILM/Cellular Dynamics M1003
iCell2 CMs FUJIFILM 1434
Incucyte Zoom  Sartorius
iPS DF19-9-11T.H WiCell
Isoproterenol MilliporeSigma CAS-51-30-9
IWP4 Tocris 5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960-5g
L-glutamine Gibco A2916801
LS columns Miltenyii Biotec 130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) Miltenyii Biotec 130-091-221
Matrigel Corning 354234
MitoTracker Red ThermoFisher M7512
Nautilus HTS Optical Mapping  CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope Nikon
nonessential amino acids Gibco 11140-050
pre-separation filter Miltenyii Biotec 130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human Miltenyii Biotec 130-110-188
Pulse CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet) Miltenyii Biotec 130-091-051
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI 1640  Gibco 11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) Gibco 22400-089
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyii Biotec 130-107-086
TnI antibody (pan TnI) Millipore Sigma MAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) Gibco 15040-066
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
β-mercaptoethanol Gibco 21985023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ،
فحص السمية القلبية عالي الإنتاجية باستخدام أحاديات الخلايا العضلية القلبية الناضجة المستحثة بالخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monteiro da Rocha, A., Allan, A.,… More

Monteiro da Rocha, A., Allan, A., Block, T., Creech, J., Herron, T. J. High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers. J. Vis. Exp. (193), e64364, doi:10.3791/64364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter