Summary
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。
Abstract
ヒト誘導幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性試験のために動物および動物細胞への依存を置き換え、軽減するために使用されます。2次元単層フォーマットでは、hiPSC-CMは、最適な細胞外マトリックス(ECM)上で培養すると、成人のヒト心筋細胞の構造と機能を再現します。ヒト周産期幹細胞由来ECM(成熟誘導細胞外マトリックス-MECM)は、プレーティング後7日でhiPSC-CMの構造、機能、代謝状態を成熟させます。
成熟したhiPSC-CM単分子膜は、臨床的に関連する薬物療法にも期待どおりに反応し、不整脈や心毒性を引き起こすリスクが知られています。hiPSC-CM単分子膜の成熟は、これまで、これらの貴重な細胞を規制科学や安全性スクリーニングに広く採用する上での障害となっていました。本稿では、hiPSC-CMの電気生理学的および収縮機能のプレーティング、成熟、ハイスループットの機能的表現型分析のための検証済みの方法を紹介します。これらの方法は、市販の精製心筋細胞だけでなく、高効率のチャンバー特異的分化プロトコルを使用して社内で生成された幹細胞由来の心筋細胞にも適用されます。
ハイスループットの電気生理学的機能は、電位感受性色素(VSD、発光:488 nm)、カルシウム感受性蛍光色素(CSF)、または遺伝子にコードされたカルシウムセンサー(GCaMP6)のいずれかを使用して測定されます。各機能パラメータの光学記録にはハイスループットの光学マッピング装置を使用し、電気生理学的データ解析にはカスタム専用ソフトウェアを使用します。MECMプロトコルは、陽性変力剤(イソプレナリン)およびヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネル特異的遮断薬を使用した投薬スクリーニングに適用されます。これらのリソースにより、他の研究者は、ハイスループットの前臨床心毒性スクリーニング、心臓投薬効果試験、および心血管研究のために成熟したhiPSC-CMをうまく利用することができます。
Introduction
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は国際規模で検証されており、in vitro心毒性スクリーニングに利用できます1。高純度のhiPSC-CMは、事実上無制限の数で生成し、凍結保存し、解凍することができます。再メッキすると、彼らはまた蘇生し、人間の心臓を彷彿とさせるリズムで収縮し始めます2,3。驚くべきことに、個々のhiPSC-CMは互いに結合し、単一の組織として拍動する機能的合胞体を形成します。現在、hiPS細胞は日常的に患者の血液サンプルに由来するため、in vitro hiPSC-CM心毒性スクリーニングアッセイを使用して、あらゆる人を表すことができます4,5。これにより、「皿の中の臨床試験」を実施する機会が生まれ、多様な集団からの重要な代表がいます6。
既存の動物および動物細胞の心毒性スクリーニングアプローチに対する重要な利点の1つは、hiPSC-CMが完全なヒトゲノムを利用し、ヒト心臓と遺伝的に類似したin vitroシステムを提供することです。これは、薬理ゲノミクスや個別化医療にとって特に魅力的であり、薬物療法やその他の治療法の開発にhiPSC-CMを使用することで、より正確で正確かつ安全な投薬処方が可能になると予測されています。実際、2次元(2D)hiPSC-CM単層アッセイは、不整脈を引き起こすリスクが知られている臨床的に使用される薬物のパネルを使用して、薬物の心毒性を予測することが証明されています1、7、8、9。hiPSC-CMの大きな可能性と、医薬品開発を合理化し、より安価にすることを約束しているにもかかわらず、これらの新しいアッセイを使用することには消極的でした10、11、12。
これまで、hiPSC-CMスクリーニングアッセイの広範な採用と受け入れの大きな制限の1つは、未熟な胎児のような外観とその機能でした。hiPSC-CM成熟の重要な問題は、科学文献アドナウセウム13,14,15,16でレビューされ、議論されています。同様に、2D単層での細胞外マトリックス(ECM)操作や3D操作心臓組織(EHT)の開発など、hiPSC-CMの成熟を促進するために多くのアプローチが採用されてきました17,18。現時点では、3D EHTの使用は、2D単層ベースのアプローチと比較して優れた成熟度を提供すると広く信じられています。ただし、2D単分子膜は、3D EHTと比較して、セル利用の効率が高く、めっきの成功率が向上します。3D EHTはより多くの細胞を利用し、多くの場合、結果を混乱させる可能性のある他の細胞タイプを含める必要があります。そこで本稿では、電気的・機械的結合細胞の2次元単層として培養したhiPSC-CMを簡便な方法で成熟させることに焦点をあてます。
高度なhiPSC-CM成熟は、ECMを使用して2D単層で達成できます。hiPSC-CMの2D単分子膜は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞(マウスECM)によって分泌される基底膜マトリックスでコーティングされた、柔らかく柔軟なポリジメチルシロキサンカバーガラスを使用して成熟させることができます。2016年には、このソフトECM条件で培養したhiPSC-CMが機能的に成熟し、成人の心臓値(~50 cm/s)に近い活動電位伝導速度を示すことが報告されました18。さらに、これらの成熟したhiPSC-CMは、過分極休止膜電位やKir2.1の発現など、成人の心臓を連想させる他の多くの電気生理学的特性を示しました。最近では、2D hiPSC-CMの構造的成熟を促進するヒト周産期幹細胞由来のECMコーティングが同定されたという報告があります19。ここでは、ハイスループット電気生理学的スクリーニングで使用するために、構造的に成熟した2D hiPSC-CM単分子膜に使いやすい方法を紹介します。さらに、電位感受性色素(VSD)とカルシウム感受性プローブおよびタンパク質を使用して、2D hiPSC-CM単層電気生理学的機能の自動取得と分析のための光学マッピング装置の検証を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルにおけるhiPScの使用は、ミシガン大学HPSCRO委員会(ヒト多能性幹細胞監視委員会)によって承認された。材料と機器のリストについては、 材料表 を参照してください。メディアとその組成については 、表 1 を参照してください。
1. 市販の凍結保存済みhiPSC-CMを成熟誘導細胞外マトリックス(MECM)上で解凍・めっき
- すべての試薬を室温に温め、心筋細胞プレーティングの前に、カルシウムとマグネシウムを含むハンクの平衡塩溶液(HBSS)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でMECMプレートを1時間再水和します(96ウェルプレートのウェルあたり200 μLのバッファー)。
- 心筋細胞プレーティングの前に、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSまたはPBSでMECMプレートを2回洗浄し(96ウェルプレートのウェルあたり200 μLのバッファー)、ウェルを水和状態に保ちます。
- 37°Cの水浴を用意します。
- 心筋細胞チューブを液体窒素タンクから取り外し、チューブをドライアイスに移し、チューブキャップを少し開いて圧力を解放します。
注:チューブ内の圧力を解放することは 非常に重要です !チューブ内に圧力がかかりすぎると、爆発する可能性があります。 - チューブキャップを再シールし、水浴に入れて4分間解凍します。
注意: 部分的な解凍による細胞の損傷を避けるために、完全に解凍してください。 - 細胞が解凍したら、開封前にチューブに70%エタノールをスプレーします。細胞を1 mLピペットで15 mLコニカルチューブに移します。8mLのメッキ培地をゆっくりと滴下し、1mLが添加されるたびにチューブを攪拌し、細胞が浸透圧の変化に順応できるようにした。
- 1 mLのガラスピペットを使用して、1 mLのメッキ媒体でクライオバイアルを洗浄します。次に、洗浄液を15 mLのコニカルチューブにゆっくりと滴下します。
- チューブを~300 × g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLのメッキ媒体に再懸濁します。アリコートを除去し、血球計算盤で生細胞計数を行います。追加のめっき培地を追加して、7.5 × 105 cells/mLを取得します。
注:96ウェルを調製するには、約10 mLの細胞懸濁液が必要です。 - マルチチャンネルピペットを使用して、MECMコーティングされた96ウェルプレートのウェルあたり100 μLの細胞懸濁液を分注します。
注:プレーティング中は、細胞の沈殿を避け、すべてのウェルで均一な細胞密度を得るようにしてください。 - 細胞を37°C、5%CO2 で2日間インキュベートしてから、培地を維持培地(200 μL/ウェル)に変更します。解凍後5日目にメンテナンス培地を交換してください。前述のように、7日目以降にEPアッセイを実行します8、9。細胞培養の延長を選択する場合は、一日おきに培地を交換してください。
2. hiPS細胞心臓指向性分化とhiPSC-CM精製
- 市販のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液1x、カルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSS(HBSS--)、およびエンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞(マウスECM)によって分泌される可溶化基底膜マトリックスでコーティングされた6ウェルプレートを室温に温めます。
- 分化したコロニーを位相差顕微鏡と吸引/アブレートでマークします。各ウェルを1 mLのHBSSで洗浄します--.>10の分化スポットを含むウェルで2回の洗浄を行います。
- HBSSを吸引し、各ウェルに1 mLのEDTA溶液を加えます。プレートを37°Cで最大5分間インキュベートします。 3分後にプレートを確認し、半透明の白い目に見えるコロニーを探します。
- EDTA溶液を吸引し、1 mLを1つのウェルに加えます。10 mLのガラスピペットを使用してすべての幹細胞をウェルから剥離し、細胞懸濁液を回収チューブに移し、懸濁液を上下に繰り返しピペッティングして、2 mLのhiPSC培地で細胞を取り除きます。その後のウェルで吸引と脱落を繰り返します。
注意: ガラスピペットの先端でコロニーを持ち上げるために強く取り除きます。 - 幹細胞をカウントし、容量を調整して8.0 × 105 細胞/ウェルをプレートします。幹細胞が90%コンフルエントに達するまで、hiPSC培地(2 mL /ウェル)で細胞を培養します(この時間はこれからD0と呼びます)。
- 4 μMのCHIR99021を添加した2 mLの基礎分化培地を調製します。
- D0上で、幹細胞の6ウェルプレートの各ウェルを1ウェル当たり1mLのHBSSで洗浄する。HBSSを4 μMのCHIR99021を添加した基礎分化培地と交換します。
- D1 では、何もしません。
- D2上に、4μMのIWP4を添加した基礎分化培地を調製する。
- 培地をウェルあたり2 mLのIWP4添加基礎分化培地と交換します。
- D3では、心室特異的分化のために何もしません。心房特異的分化のために、培地を吸引し、ウェルあたり4 μMのIWP4および1 μMのレチノイン酸(RA)溶液を補充した2 mLの基礎培地を追加します。
- D4で、培地を吸引し、心室分化のためにウェルあたり2 mLの基礎培地を追加します。心房分化の場合は、培地を吸引し、ウェルあたり1 μM RA溶液を補充した2 mLの基礎培地を追加します。
- D5 では、何もしません。
- D6で、培地を吸引し、ウェルあたり2 mLの基礎培地を追加します(心房分化と心室分化の両方)。
- D7 では、何もしません。
- D8に培地を吸引し、心筋細胞維持培地2mLを加える。細胞が分離するまで一日おきに培地を交換するか、慢性薬物曝露計画に従ってください。
3. MACS(磁気活性化細胞ソーティング )による hiPSC-CM精製
- 細胞培養培地を吸引し、各ウェルを1 mLのHBSSで洗浄します--.1 mLの0.25%トリプシン/EDTAを添加し、37°C、5%CO2 で10分間インキュベートすることにより、細胞を解離します。各ウェルの細胞を2 mLのプレーティング培地で再懸濁および単離し、トリプシン/EDTAを不活性化します。
- 6つのウェルから細胞を70 μmのストレーナーで50 mLのコニカルチューブに集めます。次に、3mLのメッキ媒体でストレーナーを洗浄します。セルを数えます。
- 懸濁液を~300 × g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、20 mLの氷冷MACS分離バッファーで細胞を洗浄します。その後、再び~300 × g で5分間遠心分離します。
- ペレットを5細胞あたり80 μLの低温MACS分離バッファーに再懸濁×10 6 細胞。5細胞×106 細胞あたり20 μLの冷たい非心筋細胞枯渇カクテル(ヒト)を追加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートします。
- 5 ×10 6 細胞あたり4 mLの冷MACS分離バッファーを加えてサンプルを洗浄します。サンプルを~300 × g で5分間遠心分離し、上清を吸引します。
- ペレットを5細胞×10細胞あたり80 μLの低温MACS分離バッファーに再懸濁します。5細胞×106細胞あたり20 μLの冷たい抗ビオチンマイクロビーズを追加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートします。
- サンプルのインキュベーション中に、ポジティブデプレッションカラム(30 μmの予備分離フィルターを取り付けた)をMACSセパレーターに置き、ラベルの付いた15 mL収集チューブをカラムの下に置きます。5 ×10 6 セルごとに 1 つの列が必要です。
- 各カラムを3 mLの冷MACS分離バッファーでプライミングします。抗体処理した細胞懸濁液を、 5 × 106 細胞あたり2 mLのMACS分離バッファーと混合し、カラムに加える。
注:遠心分離しないでください。この段階での遠心分離は、心筋細胞の収量に有害な影響を及ぼします。 - 各カラムに2 mLのMACS分離バッファーを加え、12 mLのフロースルー心筋細胞懸濁液が収集されるまでフロースルーを収集します。
注意: カラムを完全に乾燥させないでください。 - 心筋細胞を~300 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てて、心筋細胞を1 mLのプレーティング培地に懸濁します。
- 細胞を数えて濃度を決定し、容量を希望の播種密度に調整し、細胞をプレートします。上記のステップ1.9〜1.11(7.5×105 細胞/ウェル)で説明したように、精製した心筋細胞をMECM 96ウェルプレートにプレートします。
4. 電位感受性色素(VSD)およびカルシウム感受性蛍光色素(CSF)を用いた光学マッピング
- HBSS1 mLあたり1 μLのVSD色素とHBSS1 mLあたり10 μLのローディングアジュバントを添加して、カルシウムとマグネシウムを含むHBSS中の適量のVSDを調製します。
注:通常、96ウェルプレートには10 mLのVSD溶液が必要です。 - あるいは、5 μMのCSFを添加したカルシウムとマグネシウムでHBSSを調製します。心筋細胞維持培地を吸引し、96ウェルプレートのウェルあたり100 μLのVSDまたはCSFと交換します。細胞培養インキュベーター内で細胞を30分間インキュベートします。
- 色素を除去し、アッセイ培地またはHBSSと交換します。37°Cで平衡化して、高スループットの光学マッピングデバイスを使用してベースラインデータ光学マッピングを取得します。
- 急性暴露試験のために細胞を薬物で処理するか、目的の薬物に慢性的に曝露された細胞をマッピングします。
- 96ウェルプレートでの心毒性試験には、1用量あたり少なくとも6ウェルの化合物を4回投与します。臨床有効治療血漿濃度の用量を含む、有効治療血漿濃度の下から上の範囲の用量を使用する。
- 薬物をジメチルスルホキシドで希釈し、ストック溶液として-20°Cで保存してから、HBSSで希望の濃度に希釈します。
- セクション5で説明されているように、薬物適用の前にベースラインの電気生理学測定を行います。.薬が適用されたら、慢性研究のために少なくとも30分後に電気生理学の記録を行います。光学マッピング・データの取得および解析手順については、以下のセクションを参照してください。
5. 遺伝子カルシウムインジケーター(GECI)を用いた光学マッピング
- 市販のプレートまたはMACS精製hiPSC-CMsは、上述のように、MECMコーティングされた96ウェルプレートを用いて、成熟hiPSC-CMを作製した。コンフルエント単層を形成するには、各96ウェルプレートのウェルあたり7.5×104 CMのプレート。メッキ媒体を使用してください。
- プレーティング培地で48時間後、心筋細胞維持培地に切り替えます。
- 融解および再めっき後4日目に、GCaMP6m(AdGCaMP6m)を発現するための組換えアデノウイルスを感染多重度(MOI)= 5で細胞に加える。CMアッセイ培地を使用してウイルスを追加します。
注:ここでは、GCaMP6mを使用した実験を、市販ベンダーのiCell2 心筋細胞で実施しました。 - 5日目に、adGCaMP6m培地を取り外し、新しいRPMI+B27(心筋細胞維持培地)と交換します。
- 7日目に、顕微鏡または光学マッピングイメージャーを使用してCMを観察し、自発収縮と対応するカルシウム過渡現象を視覚化します。
- 7日目以降、投薬スクリーニングのために、GCaMP6mを発現する成熟hiPSC-CM単層の96ウェルプレートをインキュベーターから光学マッピングイメージャーに直接移し、ベースラインデータを取得します。
- 電気生理学データの取得に続いて、CMのプレートを組織培養インキュベーターに戻し、その後の時点で測定します。
- ベースライン記録に続いて、各薬の少なくとも4回の投与と、投与ごとに少なくとも6つのウェルを使用して、薬を適用します。.データ収集の前に、細胞上の薬を少なくとも30分間平衡化します。データ取得前および取得中にウェル温度を~37°Cに温めます。
- プレート全体のベースライン記録に続いて、すべてのウェルにイソプロテレノール(500 nM)を追加して、堅牢な薬物反応データを有効にします。セクション5で説明されているように、単層の拍動速度、収縮振幅(カルシウム過渡振幅)、およびカルシウム過渡持続時間に対するイソプロテレノールの効果を定量化します( 図6を参照)。
6. 光学マッピングデータの取得と解析
- 光学マッピングデバイスのカメラ、トランスイルミネーター、プレートヒーターがオンになっていることを確認します。
- 取得ソフトウェアを開き、ファイルの保存場所を決定します。
- 前面の引き出しを開き、プレートヒーターにプレートを配置します。
- ダークフレームボタンをクリックしてダーク フレーム を取得します。
- 「 継続 時間」(10〜30秒)と 「フレームレート 」(例:100 fps、時間解像度を高くする場合は250 fps)を選択し、「 取り込みを開始」をクリックします。
- 解析ソフトウェアを開き、[ インポート/フィルタ] タブで、[単一ファイル を参照 ]または [複数タイル] を選択してプレートを再構築します。
- パラメータモード(APDまたはCaTD)を選択し、ピクセルあたりの距離を入力し、ウェルウィザードを使用して画像内のウェルの位置を決定します。[プロセス保存] をクリックして、次のタブに移動します。
- ROI(関心領域)タブを開き、ROIを手動で描画するか、自動的に描画するか、ROIをまったく使用しないかを選択して、分析のために全体を考慮します。ROIを選択したら、[プロセス/保存]ボタンをクリックして次のステップに進みます。[ウェルを非表示にする] ボックスと [フィルターされたみを表示] チェックボックスをオンにして、ROI を視覚化します。
- [分析]タブを開き、画面の右上で各ウェルまたはROIを選択して、自動ビート検出の精度を確認します。トレースにビートを追加または削除するには、「ビートを追加/ビートを保存」を押すか、個々のビートを選択してキーボードのDeleteキーを押します。
- 必要に応じて、平均ヒートマップ機能を使用して、プレートの選択したパラメータの ヒートマップ を作成します。
- 分析タブの時空間プロットボタンをクリックして、各井戸のデータまたはROIを視覚化します。ビート検出が正確であることを確認したら、[エクスポート]タブに進み、[ファイル形式]を選択します。[エクスポート] を押して、データのエクスポート先のフォルダーを作成します。データ・ファイルのオープンに進み、選択した統計分析ルーチンを実行します。
注: .xlxs ファイルは、すべてのパラメーターが 1 つのファイルにエクスポートされるため、優先されます。その他の形式 (.csv または .tsv) では、パラメーターごとに 1 つのファイルが生成されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
位相差と免疫蛍光共焦点イメージングを特徴とするhiPSC-CM成熟
MECMコーティングされた96ウェルプレートを使用した市販のhiPSC-CMのECMを介した成熟のタイムラインを 図1Aに示します。これらのデータは、細胞の凍結保存されたバイアルとして実験室に到着する市販の心筋細胞を使用して収集されます。各バイアルには、>5×106 の生存心筋細胞が含まれています。細胞は~98%の純度で、品質管理のために厳密にテストされています(分析証明書は各バイアルに付属しています)。CMの数が多いため、同じセルバッチを使用して、CMを解凍して異なるECMの組み合わせにメッキすることができます。 図1では、hiPSC-CMはマウスECMコーティングプレートまたはMECMコーティングプレートのいずれかにメッキされています。MECMにメッキされたhiPSC-CMは成熟し、マウスECMにプレーティングされたhiPSC-CMの同じバッチとは構造的に異なります。すなわち、成熟細胞は棒状になり、未熟細胞は円形を保持する。これは、位相差イメージングおよび心筋フィラメントを染色すると見ることができる(図1B;トロポニンI[TnI]、赤色)。hiPSC-CMの構造成熟のより広範な検証を 図2に示します。α-アクチニン抗体で染色されたCMの広い視野(20倍対物レンズ)は、各ECM条件で培養された細胞の典型的な形状を示しています。α-アクチニンは、心筋フィラメントに規則的な間隔で配置された重要な構造タンパク質です。 図1のTnI染色と一致して、α-アクチニン染色は、MECM上で培養されたhiPSC-CMの成熟をさらに示しています。MECMは、棒状の成熟表現型を促進するだけでなく、より大きなサルコメア組織化も誘導します(60倍画像)。ミトコンドリア含量および活性は、マウスECM上で培養された細胞とMECMとの間でも異なっている(図2B)。胎児未熟なhiPSC-CMミトコンドリア含量は核周囲腔に限定され、細胞質ゾル中にはほとんどミトコンドリアが見られない。対照的に、成熟hiPSC-CMsミトコンドリア含量は細胞全体に分布している。ミトコンドリア評価は、確立されたプロトコル19を使用します。
hiPSC心臓指向分化と心腔仕様
ここでは、精製されたチャンバー特異的なhiPSC-CMの社内生産と熟成のためのプロトコルを提供します(図3A)。これは、以前に公開されたレポート20に基づいています。市販の磁石活性化セルソーティング(MACS)キットを使用したhiPSC-CM精製の詳細な手順を示します。最近、MACS精製の使用を検証し、代謝ベースのhiPSC-CM精製と比較してMACSを使用する利点を示しました。典型的には、95%を超えるhiPSC-CM純度が予想される21。初期CM含有量が<50%の場合、MACS精製は~85%にしか達しない可能性があることを指摘することが重要です。このような場合、非CMの枯渇後にCM濃縮が必要になることがあります。分化による初期CM含量が>50%の場合、MACSキットを使用した細胞集団からの非CMの枯渇は、純度>95%を達成できます。この場合、CMのさらなる濃縮または積極的な選択は必要ありません。チャンバー特異的なhiPSC-CMは、上記の図1および図2に示すように、MECMコーティングされた96ウェルプレートを使用して熟成させることもできます。心房特異的細胞(hiPSC-ACM)は、心室特異的細胞(hiPSC-VCM)よりも有意に速い自発拍動速度および短い活動電位持続時間80(APD80)を有することが予想されるべきである。これらは、VSDと光学マッピングシステムを使用して記録された活動電位の典型的な電気生理学的データです(図3B-D)。
ハイスループット心臓電気生理学的光学マッピング
科学的厳密さは、ハイスループットな方法で実施できれば、どのアッセイでも劇的に向上します。心毒性スクリーニングデータを図4、図5、図6、および図7に示し、96ウェルプレートで成熟hiPSC-CM単層を使用したハイスループット電気生理学的スクリーニングを示しています。APD80(図4A)などのパラメータのプレート全体のヒートマップは、プレート内の特定のパラメータの井戸から井戸への再現性を明らかにします。さらに、プレート全体のヒートマップにより、データセット内の外れ値をすばやく調べることができます。たとえば、図4Aに示すプレートのウェルE4では、このウェルのAPD80値がはるかに大きく、ウェルが黄色に見えるのに対し、他のウェルはインディゴブルーであることは明らかです。成熟2D hiPSC-CM単層の典型的な活動電位(図4B)は、培養で単離および試験された成体心筋細胞の活動電位形態を彷彿とさせます。また、典型的な活動電位自発リズムを図4Cに示す。図4Cのデータは、行Aの列1〜12の時空間プロットです。図4Aのプレートマップを横切る白い線はこれを示しています。各ウェルにおける経時的な各明るい蛍光フラッシュは、単一の自発的活性化を表す。図5と図6は、GCaMP6m遺伝子コードカルシウムインジケーター(GECI)を使用して細胞内カルシウム過渡を測定することの有用性を示しています。図6は、古典的な心臓陽性イノトロープであるイソプロテレノールに対する予想される応答も示しています。イソプロテレノールに応答して、β1-アドレナリン作動性受容体の活性化は、正の変時変化(図6A)、正の変力性(図6B)、および正のルシトロピー(図6C)を引き起こす。イソプロテレノールに対するこれらの応答は、hiPSC-CM β1-アドレナリン作動性受容体および細胞内シグナル伝達カスケードの有意な成熟を示す。
図7では、GCaMP6mカルシウム蛍光を使用してリズムを監視し、収縮性の代理マーカーとして機能するヒトエーテルアゴーゴー関連遺伝子(hERG)チャネルブロッカーに対するhiPSC-CM応答が示されています。E-4031はhERG特異的チャネル遮断薬であり、自発拍動速度を遅くし、カルシウム過渡持続時間(CaTD80)および三角測量(CaT三角測量)を増加させます。図7Aは、E-4031 hERGチャネル遮断によって引き起こされる早期の脱分極後の検出を示しています。ドンペリドン、バンデタニブ、ソタロールなどの他のhERGチャネル遮断薬もテストされ、結果を図7E-Gに示します。これらの化合物および用量は、最近のhiPSC-CM検証研究1、7、9に基づいて選択された。
図1:市販または他のソース凍結保存されたhiPSC-CMの高速成熟のタイムライン 。 (A)メッキ培地に懸濁した解凍心筋細胞を0日目にMECMに適用します。2日目に培地をメンテナンス培地に交換し、5日目に使用培地を交換します。細胞をさらに2日間培養し、7日目に、hiPSC-CMの成熟シンシチアにダウンストリームアプリケーション用の記録溶液をロードするか、長期間培養することができます。(B)マウスECMまたはMECMに播種された心筋細胞の合胞体のコントラスト相は、マウスECMに播種された心筋細胞がMECMに播種された心筋細胞と比較してより大きな円形性を有することを示す。さらに、TnIの免疫染色は、マウスECMに播種された心筋細胞が、MECMに播種されたドリコモルフィックでよく構造化されたhiPSC-CMとは対照的に、放射状の対称形態と無秩序なサルコメアを保持していることを示しています。スケールバー= 100 μm(B、上)。50 μm (B, 下段)略語:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;ECM =細胞外マトリックス;MECM = 成熟を誘発するECM;96wp = 96ウェルプレート;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TnI = トロポニンI. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスECMまたはMECMに播種したhiPSC-CMのサルコメア組織の比較。 (A)α-アクチニンに対して免疫染色されたマウスECM培養hiPSC-CMは、放射状形態を示し、心筋細胞を介して分散するサルコメアの密度が低く、マトリックスに播種された同じバッチのhiPSC-CMとは対照的に、棒状の形態を示します(20倍)。(60倍) 共焦点顕微鏡によるhiPSC-CMの観察では、マウスECMで培養したhiPSC-CMは、MECMで培養した同じバッチのhiPSC-CMとは対照的に、サルコメアの周囲分布が密で放射状サルコメアの密度が低いという放射対称形態を有することが示された。それらは、細胞の長軸に沿って組織化されたサルコメアの均質な分布を示す。スケールバー= 100 μm(上)。50 μm (下)。(B)マウスECMまたはMECMで培養したhiPSC-CMを、膜貫通電位の高いミトコンドリアを染色するミトコンドリア色素で染色すると、マウスECMで培養した心筋細胞はMECMと比較して染色強度が低いことがわかります。さらに、MECMで培養されたhiPSC-CMは、ミトコンドリアの核周囲蓄積を示すマウスECMで培養されたhiPSC-CMとは対照的に、心筋細胞にミトコンドリアが均一に分布しています。スケールバー= 200μm。略語:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;ECM =細胞外マトリックス;MECM = 成熟を誘発するECM;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:チャンバー特異的心筋細胞の産生 。 (A)チャンバー特異的心筋細胞産生のプロトコルは、0日目から2日目までのGSK3の阻害によるWntシグナル伝達のthr刺激、および2日目から4日目までのこの経路の阻害と、同一のWntシグナル伝達経路操作を共有しています。チャンバー仕様は、3日目から6日目までのレチノイン酸経路の活性化とWntシグナル伝達操作によって達成されます。(B)チャンバー仕様の結果として、心房心筋細胞は、心室心筋細胞と比較して、より速い自発的脱分極速度を示す。(C)心室性hiPSC-CMは、心房hiPSC-CMと比較して拍動速度が遅い。したがって、再分極の80%での活動電位持続時間は、hiPSC-VCMと比較してhiPSC-ACMの方が短くなります。略語:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;hiPSC-ACM = 心房ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;hiPSC-VCM = 心室ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:光学マッピング装置で取得し、Pulseで解析した光学マッピング。 (A)光学マッピング装置でマッピングされた、フィルムろ過後の96ウェルプレートで評価されたパラメータの全体的観察と96ウェルプレートの関心領域の決定のためのヒートマップの例。この例では、外れ値井戸(E4)とデータの生成に失敗した井戸(井戸H3、4、および5)を示すAPD80%ヒートマップ。(B)さらに、ユーザーフレンドリーなインターフェースにより、選択したウェルからの平均活動電位形態を簡単にプロットできます。(C)追加のデータ視覚化ツールが利用可能です。この例では、行Aのウェルを横切る水平線(パネルA)から生成された時空間プロットは、各ウェルの水平断面(行 Aを横切る白い線)にわたる10秒間の活性化を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:細胞内カルシウムの一時的な変化を遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターでマッピングするためのタイムライン。 市販の心筋細胞をMECMコーティングされた96ウェルプレートにプレーティングした後4日目に、 図1Aに示すように、細胞をCMアッセイ培地中の5 MOIのウイルスで一晩形質導入する必要があります。培地は6日目までCDI維持培地に交換され、7日目から11日目までフェノールレッドを含まないCDI維持培地に変更され、ノーチラスによる細胞内カルシウム過渡性変化の迅速または継続的なモニタリングが可能になります。(B)融解後7、9、および10日目に光学マッピングで評価されたAdGCaMP6fで形質導入されたhiPSC-CMは、安定した細胞内カルシウム媒介蛍光変化の存在を示し、カルシウム感受性色素の再塗布を必要とせずに、長期間にわたって同じプレートの毎日の光学マッピングを可能にします。略語:GECI =遺伝的にコードされたカルシウム指標;CM =心筋細胞;MOI =感染の多様性;96wp = 96ウェルプレート;BSA =ウシ血清アルブミン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:HiPSC-CMの成熟機能的合胞体から取得したデータをNautilus社と視覚的に比較し、Pulseで分析 するためのヒートマップの迅速かつ容易な利用。 (A)イソプロテレノールで処理されたhiPSC-CMは、ヒートマップの検査によって観察され、対応のある t検定で確認されたように、拍動率の増加を示します。(B)同様に、イソプロテレノール処理前後の細胞のマッピングは、ヒートマップの視覚的比較および対応のある t検定によるβアドレナリン作動性刺激の変力効果を示しています。(C)最後に、データの視覚的比較のためのヒートマップの利用は、対応のある t検定(p < 0.0001)で確認された、βアドレナリン作動性刺激の別の標準的な効果であるルシトロピーを示しています。円がない場合は、その特定の井戸のデータ取得/分析に失敗したことを示します。略語:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;ISO =イソプロテレノール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:hERGチャネル遮断薬を使用したGECI心毒性スクリーニングアッセイの検証。 (A)HBSSおよび500 nM E-4031の存在下でのベースラインウェルからの代表的な自発的カルシウムフラックストレース。(B-D)ビートレート、カルシウム過渡持続時間80(CaTD80)、およびカルシウム過渡三角測量(CaT三角測量)に対するベースラインおよび+E-4031の影響の定量化。*、**は有意差を示します。対応のないt検定;p < 0.01;各グループでn = 8。(E)別のhERGブロッカーであるドンペリドンのGECI検出。(F)バンデタニブによって誘導されるhERGブロックのGECI検出。(G)高用量のソタロールによるhERGブロックのGECI検出。略語:GECI =遺伝的にコードされたカルシウム指標;hERG = ヒトエーテル・ア・ゴー・ゴー関連遺伝子。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:メディアとその構成 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSC-CMを用いた in vitro 心毒性スクリーニングには、いくつかの異なるアプローチがあります。hiPSC-CMの使用に関する最近の「ベストプラクティス」論文では、さまざまな in vitro アッセイ、それらの主要な読み出し、そして重要なことに、ヒトの心臓電気生理学的機能を定量化するための各アッセイの粒度が提示されました20。メンブレンピアス電極の使用に加えて、ヒトの心臓電気生理学的機能の最も直接的な測定はVSDによって提供されます。 VSDアッセイの読み出しにより、活動電位持続時間、活動電位伝播速度、活動電位アップストローク、活動電位三角測量、拍動率、拍動規則性、活動電位持続時間の不均一性など、重要な電気生理学的パラメータを直接視覚化および定量化できます。同様に、カルシウム感受性プローブは、hiPSC-CM単層リズム、速度、およびイベント持続時間に関する情報を提供します。蛍光プローブを使用したhiPSC-CMカルシウム過渡測定では、各収縮の収縮性と収縮強度に関する情報も得られます。この論文では、ハイスループットVSDおよびカルシウム過渡測定アッセイにおける成熟hiPSC-CM(96ウェルプレート)の使用方法について説明します。光学マッピングの方法に加えて、ハイスループットEPデータ分析のためのソフトウェアが提示されます。
ここで概説する方法は、心毒性スクリーニングおよび規制科学の分野にとって重要な進歩です。ここでは、ハイスループットスクリーニングプレート(96ウェルプレート)における2D hiPSC-CM単分子膜の迅速な成熟と電気生理学的記録の方法を紹介しました。ここに示すMECM(7日)を用いた急速な成熟は、成熟が30〜100日にわたって起こることを必要とする以前のアプローチよりも大きな進歩である22、23。実験ごとに手動で塗布する必要がある他のECMと比較して、MECMプレートはECMでプレコーティングされており、すぐに使用できる状態でラボに到着します。MECMのこの側面により、他のECMコーティングを使用するよりも使いやすく、変動が少なく、効率的になります。重要なことに、このアプローチは、凍結保存された市販のhiPSC-CMと、チャンバー特異的な「自家製」hiPSC-CMの両方に使用できます。成熟したhiPSC-CMの明確な棒状の構造(図1 および 図2)のために、他のECMを利用するプロトコルと比較して、ここでのコンフルエント単層形成に必要な細胞数が多いことを指摘することが重要です。特に、マウスECM(細胞はパンケーキ表現型が持続的に広がる)を使用する場合、ウェルあたり50,000 hiPSC-CMをプレートしますが、MECMを使用する場合は、ウェルあたり75,000 hiPSC-CMをプレートします。細胞をパッチクランプや単一細胞を必要とするその他のイメージング技術などの単一細胞解析に使用する場合は、ウェルあたりのCM数を減らすこともできます。
市販のhiPSC-CMは、食品医薬品局(FDA)主導の国際的な取り組みによるこれらの細胞の広範な特性評価により、レギュラトリーサイエンスに利点をもたらします。しかし、市販の細胞は、結節性、心房性、心室性のhiPSC-CMの混合物であり、これらは非常に関連性の高い毒性情報を提供しますが、ヒトの心臓を模倣するチャンバー固有の特徴を欠いています。チャンバー特異的hiPSC-CMは、心房心筋細胞と心室心筋細胞の間のよく知られた電気生理学的違いを再現し、チャンバー特異的抗不整脈療法の開発のためのin vitroアッセイを提供します(図3B-D)。たとえば、心房細動に特化した薬剤は、堅牢で厳密なデータ収集のために、96ウェルプレートにメッキされたhiPSC-ACM単分子膜を使用してテストおよび開発できるようになりました。同様に、化合物が高リスクの心室性不整脈であるトルサードドポワント(TdP)を引き起こすかどうかを判断するためのスクリーニングでは、心房細胞と結節細胞が心室心臓単層を「汚染」しないことが最適です。したがって、これまでのFDA主導のhiPSC-CM検証の取り組みは、市販のCMの使用に焦点を当ててきましたが、将来の規制科学の推奨事項は、毒性スクリーニングをヒトの心臓の状態をさらに予測するためにチャンバー特異的細胞の使用に目を向ける可能性があります。ここで概説した方法は、以前の報告に基づいており、多能性幹細胞に由来するチャンバー特異的心筋細胞の生成のための堅牢なアプローチを提供する21。
これらのプロトコルと現場で通常使用されるプロトコルとの主な違いは、使用される精製アプローチです。自分の研究室でhiPSC-CMを生成する検査室の大多数は、代謝を介した心筋細胞の選択に依存しています22。ここでは、より健康な表現型23を持つCMを生成する臨床的に承認された細胞処理アプローチを使用して、MACSを使用してhiPSC-CMを精製することに依存しています。代謝チャレンジアプローチは有効であるが、心筋虚血を模擬する培地製剤を使用する24。hiPSC-CMのMACS精製を利用する場合、細胞集団からの磁気枯渇のために非CMを標的とする非CM枯渇カクテルを利用することが重要です。非CM空乏アプローチの使用は、CMが磁気カラムで経験するせん断応力を最小限に抑え、CM母集団の直接磁気標識よりも好まれます。チャンバー特異的細胞のMACS精製を使用すると、他のラボが研究および毒性試験用の健康なCMを生成できるようになります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TJHはStemBioSys, Inc.のコンサルタント兼科学アドバイザーであり、TBはStemBioSys, Inc.の従業員であり、AMRとJCはStemBioSys, Inc.の元コンサルタントであり、TJH、TB、AMR、およびJCはStemBioSys, Inc.の株主です。
Acknowledgments
この作業は、NIH助成金HL148068-04およびR44ES027703-02(TJH)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
