Summary
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.
Abstract
인간 유도 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 전임상 심장 독성 시험을 위해 동물 및 동물 세포에 대한 의존도를 대체하고 감소시키는 데 사용됩니다. 2차원 단층 형식에서 hiPSC-CM은 최적의 세포외 기질(ECM)에서 배양할 때 성인 인간 심장 근육 세포의 구조와 기능을 요약합니다. 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM(성숙유도 세포외 기질-MECM)은 도금 후 7일 만에 hiPSC-CM의 구조, 기능 및 대사 상태를 성숙시킵니다.
성숙한 hiPSC-CM 단층은 또한 부정맥 및 심장 독성을 유발할 위험이 있는 알려진 임상적으로 관련된 약물에 예상대로 반응합니다. hiPSC-CM 단층의 성숙은 지금까지 규제 과학 및 안전성 스크리닝을 위해 이러한 귀중한 세포를 널리 채택하는 데 걸림돌이었습니다. 이 기사에서는 hiPSC-CM 전기생리학적 및 수축 기능의 도금, 성숙 및 고처리량, 기능적 표현형에 대한 검증된 방법을 제시합니다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 정제된 심근 세포뿐만 아니라 매우 효율적인 챔버 특이적 분화 프로토콜을 사용하여 사내에서 생성된 줄기 세포 유래 심근 세포에도 적용됩니다.
고처리량 전기생리학적 기능은 전압에 민감한 염료(VSD, 방출: 488nm), 칼슘 민감성 형광단(CSF) 또는 유전적으로 암호화된 칼슘 센서(GCaMP6)를 사용하여 측정됩니다. 고처리량 광학 매핑 장치는 각 기능 매개변수의 광학 기록에 사용되며 맞춤형 전용 소프트웨어는 전기생리학적 데이터 분석에 사용됩니다. MECM 프로토콜은 양성 수축 촉진제(이소프레날린) 및 인간 에테르-고-고-고-관련 유전자(hERG) 채널 특이적 차단제를 사용하여 약물 스크리닝에 적용됩니다. 이러한 리소스를 통해 다른 연구자는 고처리량, 전임상 심장 독성 스크리닝, 심장 약물 효능 테스트 및 심혈관 연구를 위해 성숙한 hiPSC-CM을 성공적으로 활용할 수 있습니다.
Introduction
인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)는 국제적 규모로 검증되었으며, 체외 심장독성 스크리닝에 사용할 수 있다1. 고순도 hiPSC-CM은 거의 무제한으로 생성, 냉동 보존 및 해동할 수 있습니다. 다시 도금 할 때, 그들은 또한 인간의 심장 2,3을 연상시키는 리듬으로 다시 살아 움직이고 수축하기 시작합니다. 놀랍게도, 개별 hiPSC-CM은 서로 결합되어 단일 조직으로 뛰는 기능적 세포융합을 형성합니다. 오늘날, hiPSC는 일상적으로 환자의 혈액 샘플에서 추출되므로, 시험관 내 hiPSC-CM 심장독성 스크리닝 분석법을 사용하여 모든 사람을 대표할 수 있다 4,5. 이를 통해 "Clinical Trials in a Dish"를 수행할 수 있는 기회가 주어지며, 다양한 집단을 대표하는 비율이 높아진다6.
기존 동물 및 동물 세포 심장 독성 스크리닝 접근법에 비해 한 가지 중요한 이점은 hiPSC-CM이 전체 인간 게놈을 활용하고 인간 심장과 유전적 유사성을 가진 시험관 내 시스템을 제공한다는 것입니다. 이는 약물유전체학 및 개인 맞춤 의학에 특히 매력적이며, 약물 및 기타 치료법 개발에 hiPSC-CM을 사용하면 보다 정확하고 정확하며 안전한 약물 처방을 제공할 것으로 예상됩니다. 실제로, 2차원(2D) hiPSC-CM 단층 분석은 부정맥을 유발할 위험이 있는 것으로 알려진 임상적으로 사용되는 약물 패널을 사용하여 약물 심장 독성을 예측하는 것으로 입증되었습니다 1,7,8,9. hiPSC-CM의 방대한 잠재력과 약물 개발을 간소화하고 더 저렴하게 만들겠다는 약속에도 불구하고 이러한 새로운 분석법을 사용하는 것을 꺼려했습니다10,11,12.
지금까지 hiPSC-CM 스크리닝 분석의 광범위한 채택 및 수용의 주요 한계 중 하나는 미성숙하고 태아와 유사한 외관과 기능입니다. hiPSC-CM 성숙의 중요한 문제는 과학 문헌 광고 메스꺼움13,14,15,16에서 검토되고 논의되었습니다. 마찬가지로, 2D 단층의 세포외 기질(ECM) 조작 및 3D 공학 심장 조직(EHT)의 개발을 포함하여 hiPSC-CM 성숙을 촉진하기 위해 많은 접근 방식이 사용되었습니다17,18. 현재 3D EHT를 사용하면 2D 단층 기반 접근 방식에 비해 우수한 성숙도를 제공할 것이라는 믿음이 널리 퍼져 있습니다. 그러나 2D 단층은 3D EHT에 비해 셀 활용 효율이 높고 도금 성공률이 높습니다. 3D EHT는 더 많은 수의 셀을 사용하며, 종종 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 다른 셀 유형을 포함해야 합니다. 따라서 이 기사에서는 전기적 및 기계적으로 결합된 세포의 2D 단층으로 배양된 hiPSC-CM을 성숙시키는 간단한 방법을 사용하는 데 중점을 둡니다.
ECM을 사용하여 2D 단층에서 고급 hiPSC-CM 성숙을 달성할 수 있습니다. hiPSC-CM의 2D 단층은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포(마우스 ECM)에서 분비되는 기저막 매트릭스로 코팅된 부드럽고 유연한 폴리디메틸실록산 커버슬립을 사용하여 성숙할 수 있습니다. 2016년 보고서에 따르면 이 부드러운 ECM 조건에서 배양된 hiPSC-CM은 기능적으로 성숙하여 성인 심장 값(~50cm/s)에 가까운 활동 전위 전도 속도를 나타냅니다18. 또한, 이러한 성숙한 hiPSC-CM은 과분극 휴지막 전위 및Kir2.1의 발현을 포함하여 성인 심장을 연상시키는 많은 다른 전기생리학적 특성을 나타냈습니다. 보다 최근에, 보고된 바에 따르면, 2차원 hiPSC-CM의 구조적 성숙을 촉진하는 인간 주산기 줄기세포 유래 ECM 코팅이 확인되었다19. 여기에서는 고처리량 전기생리학적 스크린에 사용하기 위해 구조적으로 성숙한 2D hiPSC-CM 단층에 사용하기 쉬운 방법을 제시합니다. 또한 전압에 민감한 염료(VSD)와 칼슘에 민감한 프로브 및 단백질을 사용하여 2D hiPSC-CM 단층 전기생리학적 기능의 자동 획득 및 분석을 위한 광학 매핑 기기의 검증을 제공합니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 hiPSC 사용은 미시간 대학 HPSCRO 위원회(Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee)에 의해 승인되었습니다. 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오. 미디어와 그 구성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
1. 성숙 유도 세포외 기질(MECM)에서 성숙을 위해 상업적으로 이용 가능한 냉동 보존된 hiPSC-CM의 해동 및 도금
- 모든 시약을 실온으로 데우고 심근 세포 도금 전 1시간 동안 Hank's balanced salt solution(HBSS) 또는 칼슘과 마그네슘을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)로 MECM 플레이트를 재수화합니다(96웰 플레이트의 웰당 완충액 200μL).
- 심근세포 플레이팅(96웰 플레이트의 웰당 완충액 200μL) 전에 1시간 동안 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 HBSS 또는 PBS로 MECM 플레이트를 2배 세척하고 웰을 수화 상태로 유지합니다.
- 37°C 수조를 준비합니다.
- 액체 질소 탱크에서 심근 세포 튜브를 제거하고 튜브를 드라이 아이스로 옮긴 다음 튜브 캡을 약간 열어 압력을 해제합니다.
알림: 튜브의 압력을 해제하는 것은 매우 중요합니다! 튜브 내부에 너무 많은 압력이 가해지면 폭발할 수 있습니다. - 튜브 캡을 다시 밀봉하고 수조에 넣어 4분 동안 해동합니다.
알림: 부분 해동으로 인한 세포 손상을 방지하기 위해 완전히 해동하십시오. - 세포가 해동된 후 튜브를 열기 전에 70% 에탄올을 분사합니다. 1mL 피펫을 사용하여 세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 8mL의 도금 배지를 천천히 떨어뜨리고 1mL를 첨가할 때마다 튜브를 교반하여 세포가 삼투압 변화에 적응할 수 있도록 합니다.
- 1 mL 유리 피펫을 사용하여 1 mL의 도금 매체로 cryovial을 세척합니다. 그런 다음 세척액을 15mL 원뿔형 튜브에 천천히 떨어뜨립니다.
- 튜브를 ~300 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 1mL의 도금 매체에 재현탁합니다. 분취량을 제거하고 혈구계로 생세포 계수를 수행합니다. 7.5 × 105 cells/mL를 얻기 위해 추가 도금 매체를 추가합니다.
참고: 96개의 웰을 준비하려면 약 10mL의 세포 현탁액이 필요합니다. - 멀티채널 피펫을 사용하여 MECM 코팅된 96웰 플레이트의 웰당 100μL의 세포 현탁액을 분주합니다.
알림: 도금하는 동안 세포 침전을 피하고 모든 웰에서 균일한 세포 밀도를 얻으십시오. - 배지를 유지 배지(200 μL/웰)로 변경하기 전에 세포를 37°C, 5%CO2에서 2일 동안 배양합니다. 해동 후 5일째에 유지 매체를 교체하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 7일 또는 그 이후에 EP 분석을 수행한다 8,9. 세포 배양을 연장하기로 선택할 때 격일로 배지를 교체하십시오.
2. hiPSC 심장 지향 분화 및 hiPSC-CM 정제
- 시중에서 판매되는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 1개, 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS(HBSS--) 및 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포(마우스 ECM)에 의해 분비된 가용화된 기저막 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트를 실온으로 따뜻하게 합니다.
- 위상차 현미경으로 분화된 콜로니를 표시하고 흡인/절제합니다. 각 웰을 HBSS 1mL로 세척합니다--. >10 개의 분화 지점이 들어있는 웰에서 두 번의 세척을 수행하십시오.
- HBSS를 흡인하고 각 웰에 EDTA 용액 1mL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 최대 5분 동안 인큐베이션합니다. 3 분 후에 플레이트를 확인하고 반투명 한 흰색의 눈에 보이는 콜로니를 찾으십시오.
- EDTA 용액을 흡인하고 단일 웰에 1mL를 추가합니다. 현탁액을 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 2mL의 hiPSC 배지로 세포를 제거하고 10mL 유리 피펫을 사용하여 웰에서 모든 줄기 세포를 분리하고 세포 현탁액을 수집 튜브로 옮깁니다. 후속 우물로 흡인과 제거를 반복하십시오.
알림: 유리 피펫 끝으로 집락을 들어올리기 어렵게 제거합니다. - 줄기 세포를 세고 부피를 8.0 × 105 세포/웰로 조정합니다. 줄기 세포가 90% 합류에 도달할 때까지 hiPSC 배지(2mL/웰)에서 세포를 배양합니다(이 시간은 지금부터 D0이라고 함).
- 4μM의 CHIR99021이 보충된 2mL의 기본 분화 배지를 준비합니다.
- D0 상에서, 줄기 세포의 6-웰 플레이트의 각 웰을 웰 당 1 mL의 HBSS로 세척한다. HBSS를 4μM의 CHIR99021이 보충된 기저 분화 배지로 교체합니다.
- D1에서는 아무 작업도 수행하지 않습니다.
- D2 상에서, 4 μM의 IWP4로 보충된 염기 분화 배지를 준비한다.
- 배지를 웰당 IWP4가 보충된 기저 분화 배지 2mL로 교체합니다.
- D3에서는 심실 특이적 분화를 위해 아무 것도 하지 않습니다. 심방 특이적 분화를 위해 배지를 흡인하고 웰당 4μM의 IWP4 및 1μM 레티노산(RA) 용액이 보충된 기본 배지 2mL를 추가합니다.
- D4에서 배지를 흡인하고 심실 분화를 위해 웰당 2mL의 기본 배지를 추가합니다. 심방 분화를 위해 배지를 흡인하고 웰당 1μM RA 용액이 보충된 기본 배지 2mL를 추가합니다.
- D5에서는 아무 작업도 수행하지 않습니다.
- D6에서 배지를 흡인하고 웰당 2mL의 기본 배지를 추가합니다(심방 및 심실 분화 모두).
- D7에서는 아무 작업도 수행하지 않습니다.
- D8에서 배지를 흡인하고 심근 세포 유지 배지 2mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 격일로 배지를 교체하거나 만성 약물 노출 계획을 따르십시오.
3. MACS(자기 활성화 세포 분류) 를 통한 hiPSC-CM 정제
- 세포 배양 배지를 흡인하고 각 웰을 1mL의 HBSS로 세척합니다--. 0.25% 트립신/EDTA 1mL를 첨가하고 37°C, 5%CO2 에서 10분 동안 배양하여 세포를 해리합니다. 트립신/EDTA를 비활성화하기 위해 2mL의 도금 배지로 각 웰의 세포를 재현탁하고 특이화합니다.
- 6개의 웰에서 70μm 스트레이너가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 다음 3mL의 도금 매체로 여과기를 세척합니다. 세포를 세십시오.
- 현탁액을 ~300 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 20mL의 얼음처럼 차가운 MACS 분리 완충액으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 ~300 × g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
- 펠릿을 5 ×6 세포 당 80 μL의 차가운 MACS 분리 완충액에 재현탁합니다. 5 ×10 6 세포 당 20 μL의 차가운 비 심근 세포 고갈 칵테일 (인간)을 추가하십시오. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 10분 동안 얼음에서 배양합니다.
- 5 ×10 6 세포 당 4 mL의 차가운 MACS 분리 완충액을 첨가하여 샘플을 세척한다. ~300 × g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
- 펠릿을 5 ×6 세포 당 80 μL의 차가운 MACS 분리 완충액에 재현탁합니다. 5 ×10 6 세포 당 20 μL의 차가운 항비오틴 마이크로 비드를 추가합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
- 샘플이 배양되는 동안 MACS 분리기에 포지티브 공핍 컬럼(30μm 사전 분리 필터 장착)을 놓고 라벨이 부착된 15mL 수집 튜브를 컬럼 아래에 놓습니다. 5 × 106 셀마다 하나의 열이 필요합니다.
- 3mL의 저온 MACS 분리 완충액으로 각 컬럼을 프라이밍합니다. 항체 처리된 세포 현탁액을 5 ×10 6 세포당 2 mL의 MACS 분리 완충액과 혼합하고, 컬럼에 첨가한다.
알림: 원심분리하지 마십시오! 이 단계에서의 원심분리는 심근세포 수율에 해로운 영향을 미친다. - 각 컬럼에 2mL의 MACS 분리 완충액을 추가하고 12mL의 유동 심근 세포 현탁액이 수집될 때까지 유동을 수집합니다.
알림: 컬럼이 완전히 건조되지 않도록 하십시오. - 심근 세포를 ~ 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버리고 심근 세포를 1mL의 도금 배지에 현탁시킵니다.
- 세포를 세어 농도를 결정하고, 원하는 파종 밀도로 부피를 조정하고, 세포를 플레이트합니다. 정제된 심근세포를 상기 1.9-1.11 단계(7.5 ×10 5 세포/웰)에서 설명한 바와 같이 MECM 96-웰 플레이트에 플레이트한다.
4. 전압에 민감한 염료(VSD)와 칼슘에 민감한 형광단(CSF)을 사용한 광학 매핑
- HBSS mL당 1μL의 VSD 염료와 HBSS mL당 10μL의 로딩 보조제를 추가하여 칼슘과 마그네슘이 포함된 HBSS에서 적절한 양의 VSD를 준비합니다.
참고: 일반적으로 96웰 플레이트에는 10mL의 VSD 용액이 필요합니다. - 또는 5μM의 CSF가 보충된 칼슘과 마그네슘으로 HBSS를 준비합니다. 심근 세포 유지 배지를 흡인하고 96웰 플레이트의 웰당 100μL의 VSD 또는 CSF로 교체합니다. 세포 배양 배양기에서 30분 동안 세포를 배양한다.
- 염료를 제거하고 분석 배지 또는 HBSS로 교체합니다. 37°C에서 평형을 이루어 고처리량 광학 매핑 장치를 사용하여 기본 데이터 광학 매핑을 수집합니다.
- 급성 노출 테스트를 위해 약물을 사용하여 세포를 처리하거나 관심 약물에 만성적으로 노출된 세포를 매핑합니다.
- 96웰 플레이트에서 심장 독성 테스트를 하려면 용량당 최소 6웰이 있는 화합물을 4회 용량으로 사용하십시오. 임상적으로 효과적인 치료 혈장 농도의 투여량을 포함하는, 효과적인 치료 혈장 농도 이하 내지 이상의 범위의 투여량을 사용한다.
- 약물을 디메틸 설폭사이드에 희석하고 -20°C에서 원액으로 저장한 다음 HBSS에서 원하는 농도로 희석합니다.
- 섹션 5에 설명된 대로 약물 적용 전에 기본 전기 생리학 측정을 수행합니다. 약물이 적용되면 만성 연구를 위해 최소 30분 후에 전기생리학 기록을 합니다. 광학 매핑 데이터 수집 및 분석 절차에 대해서는 다음 섹션을 참조하십시오.
5. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 사용한 광학 매핑
- MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 성숙한 hiPSC-CM을 만들기 위해 위에서 설명한 바와 같이 시판되거나 MACS 정제된 hiPSC-CM을 플레이트합니다. 합류 단층을 형성하기 위해 각 96웰 플레이트의 웰당 7.5 ×10 4 CM을 플레이트합니다. 도금 매체를 사용하십시오.
- 도금 매체에서 48시간 후 심근세포 유지 매체로 전환합니다.
- 해동 및 재도금 후 4일째에 GCaMP6m(AdGCaMP6m)을 발현하기 위한 재조합 아데노바이러스를 감염 다중성(MOI) = 5로 세포에 추가합니다. CM 분석 배지를 사용하여 바이러스를 추가합니다.
참고: 여기서, GCaMP6m을 사용한 실험은 상용 판매업체의 iCell2 심근세포에서 수행되었습니다. - 5일째에 adGCaMP6m 배지를 제거하고 새로운 RPMI+B27(심근세포 유지 배지)로 교체합니다.
- 7일째에 현미경 또는 광학 매핑 이미저를 사용하여 CM을 관찰하여 자발적인 수축과 해당 칼슘 과도 현상을 시각화합니다.
- 7일 또는 그 이후, 약물 스크리닝을 위해 기준선 데이터 수집을 위해 GCaMP6m을 발현하는 성숙한 hiPSC-CM 단층의 96웰 플레이트를 인큐베이터에서 광학 매핑 이미저로 직접 옮깁니다.
- 전기생리학 데이터 수집 후 CM의 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 반환하여 후속 시점에서 측정합니다.
- 기준선 기록에 따라 각 약물을 최소 4회 투여하고 투여량당 최소 6웰을 사용하여 약물을 적용합니다. 데이터 수집 전에 최소 30분 동안 세포에서 약물을 평형화합니다. 데이터를 수집하기 전과 수집하는 동안 우물 온도를 ~37°C로 따뜻하게 합니다.
- 전체 플레이트의 기준선 기록에 따라 모든 웰에 이소프로테레놀(500nM)을 추가하여 강력한 약물 반응 데이터를 가능하게 합니다. 섹션 6에 설명된 대로 단층 박동률, 수축 진폭(칼슘 과도 진폭) 및 칼슘 과도 기간( 그림 5 참조)에 대한 이소프로테레놀의 효과를 정량화합니다.
6. 광학 매핑 데이터 수집 및 분석
- 광학 매핑 장치 카메라, 트랜스일루미네이터 및 플레이트 히터가 켜져 있는지 확인하십시오.
- 수집 소프트웨어를 열고 파일 저장 위치를 결정합니다.
- 전면 서랍을 열고 플레이트 히터에 플레이트를 놓습니다.
- Dark Frame 버튼을 클릭하여 어두운 프레임을 획득합니다.
- 지속 시간(10-30초) 및 획득 프레임 속도(예: 100fps, 더 높은 시간 해상도의 경우 250fps)를 선택하고 획득 시작을 클릭합니다.
- 해석 소프트웨어를 열고 가져오기/필터 탭에서 단일 파일 찾아보기 또는 다중 배열 을 선택하여 플레이트를 재구성합니다.
- 매개변수 모드(APD 또는 CaTD)를 선택하고, 픽셀당 거리를 입력하고, 웰 마법사를 사용하여 이미지에서 웰의 위치를 확인합니다. 저장 처리를 클릭하여 다음 탭으로 이동합니다.
- ROI(관심 영역) 탭을 열고 ROI를 수동, 자동 또는 전혀 사용하지 않도록 선택하여 분석을 위해 전체 웰을 고려합니다. ROI를 선택한 후 처리/저장 버튼을 클릭하여 다음 단계로 이동합니다. 웰 숨기기 및 필터링된 항목만 표시 상자를 선택하여 ROI를 시각화합니다.
- 분석 탭을 열고 화면 오른쪽 상단에서 각 웰 또는 ROI를 선택하여 자동 비트 감지의 정확도를 확인합니다. Add Beat/Save Beats를 누르거나 개별 Beat를 선택하고 키보드에서 Delete 키를 눌러 추적에서 Beats를 추가하거나 제거합니다.
- 선택적으로 평균 히트 맵 기능을 사용하여 플레이트에 대해 선택한 매개변수의 히트맵을 생성합니다.
- 분석 탭에서 시공간 플롯 버튼을 클릭하여 각 웰 또는 ROI에 대한 데이터를 시각화합니다. 비트 감지가 정확한지 확인한 후 내보내기 탭으로 이동하여 파일 형식을 선택합니다. 내보내기를 누르고 내보낼 데이터의 폴더를 만듭니다. 계속해서 데이터 파일을 열고 선택한 통계 분석 루틴을 실행합니다.
참고: .xlxs 파일은 모든 매개 변수를 단일 파일로 내보내는 것이 좋습니다. 다른 형식(.csv 또는 .tsv)은 매개 변수당 하나의 파일을 생성합니다.
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Representative Results
위상차 및 면역형광 공초점 이미징을 특징으로 하는 hiPSC-CM 성숙
MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM의 ECM 매개 성숙에 대한 타임라인은 그림 1A에 나와 있습니다. 이러한 데이터는 냉동 보존된 세포 바이알로 실험실에 도착하는 상업적으로 이용 가능한 심근 세포를 사용하여 수집됩니다. 각 바이알에는 >5 × 106 개의 생존 가능한 심근 세포가 들어 있습니다. 세포는 ~ 98 % 순수하고 품질 관리를 위해 엄격한 테스트를 거쳤습니다 (분석 인증서는 각 바이알과 함께 제공됨). CM 수가 많기 때문에 동일한 셀 배치를 사용하여 CM을 다른 ECM 조합에 해동 및 도금할 수 있습니다. 그림 1에서 hiPSC-CM은 마우스 ECM 코팅 플레이트 또는 MECM 코팅 플레이트에 도금되어 있습니다. MECM에 도금된 hiPSC-CM은 성숙하고 마우스 ECM에 재도금된 동일한 배치의 hiPSC-CM과 구조적으로 구별됩니다. 즉, 성숙한 세포는 막대 모양이 되고 미성숙 세포는 원형을 유지합니다. 이것은 위상차 이미징과 심장 근섬유를 염색할 때 볼 수 있습니다(그림 1B; 트로포닌 I[TnI], 빨간색). hiPSC-CM의 구조적 성숙도에 대한 보다 광범위한 검증이 그림 2에 나와 있습니다. α-액티닌 항체로 염색된 CM의 넓은 시야(20x 목적)는 각 ECM 조건에서 배양된 세포의 전형적인 모양을 보여줍니다. α-actinin은 심장 근섬유에 규칙적인 간격으로 배열된 중요한 구조 단백질입니다. 도 1의 TnI 염색과 일관되게, α-액티닌 염색은 MECM 상에서 배양된 hiPSC-CMs의 성숙을 추가로 나타낸다. 막대 모양의 성숙한 표현형을 촉진하는 것 외에도 MECM은 더 큰 육종 조직(60x 이미지)을 유도합니다. 미토콘드리아 함량과 활성은 마우스 ECM과 MECM에서 배양된 세포 간에도 구별됩니다(그림 2B). 태아-미성숙 hiPSC-CM 미토콘드리아 함량은 세포질에서 거의 발견되지 않는 핵주위 공간으로 제한됩니다. 대조적으로, 성숙한 hiPSC-CMs 미토콘드리아 함량은 세포 전체에 분포되어 있습니다. 미토콘드리아 평가는 확립된 프로토콜19를 사용합니다.
hiPSC 심장 지향 분화 및 심장 챔버 사양
여기에는 정제된 챔버별 hiPSC-CM의 자체 생산 및 성숙을 위한 프로토콜이 제공됩니다(그림 3A). 이것은 이전에 발표된 보고서(20)를 기반으로 한다. 시판되는 자석 활성화 세포 분류(MACS) 키트를 사용한 hiPSC-CM 정제를 위한 자세한 절차가 제시되어 있습니다. 우리는 최근에 MACS 정제의 사용을 검증하고 대사 기반 hiPSC-CM 정제와 비교하여 MACS 사용의 이점을 보여주었습니다. 전형적으로, 95% 이상의 hiPSC-CM 순도는21로 예상된다. 초기 CM 함량이 <50%인 경우 MACS 정제는 ~85%에 도달할 수 있다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 이러한 경우 비 CM이 고갈된 후 CM 강화가 필요할 수 있습니다. 분화로 인한 초기 CM 함량이 >50%인 경우 MACS 키트를 사용하여 세포 집단에서 비 CM을 고갈하면 순도 >95%를 달성할 수 있습니다. 이 경우 CM의 추가 보강 또는 긍정적 인 선택이 필요하지 않습니다. 챔버 특이적 hiPSC-CM은 위에서 설명한 바와 같이 그림 1 및 그림 2에 표시된 대로 MECM 코팅된 96웰 플레이트를 사용하여 성숙할 수도 있습니다. 심방 특이적 세포(hiPSC-ACM)는 심실 특이적 세포(hiPSC-VCM)보다 훨씬 더 빠른 자발적 박동 속도와 더 짧은 활동 전위 지속 시간 80(APD80)을 가질 것으로 예상되어야 합니다. 이는 VSD 및 광학 매핑 시스템을 사용하여 기록된 활동 전위에 대한 일반적인 전기생리학적 데이터입니다(그림 3B-D).
High-throughput cardiac electrophysiological optical mapping (고처리량 심장 전기생리학적 광학 매핑)
높은 처리량 방식으로 수행할 수 있는 모든 분석에 대해 과학적 엄격함이 크게 증가합니다. 심장 독성 스크리닝 데이터는 그림 4, 그림 5, 그림 6 및 그림 7에 제시되어 있으며, 96웰 플레이트에서 성숙한 hiPSC-CM 단층을 사용한 고처리량 전기생리학적 스크리닝을 보여줍니다. APD80(그림 4A)과 같은 매개변수에 대한 전체 플레이트 히트맵은 플레이트 내에서 웰에서 웰까지 주어진 매개변수의 재현성을 보여줍니다. 또한 전체 플레이트 히트맵은 데이터 세트의 모든 이상값을 빠르게 검사할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 4A에 제시된 플레이트의 웰 E4에서, 이 웰은 훨씬 더 큰 APD80 값을 가지며, 웰은 노란색으로 나타나는 반면, 다른 웰은 남색으로 나타난다는 것이 분명하다. 성숙한 2D hiPSC-CM 단층(그림 4B)의 일반적인 활동 전위는 배양에서 분리 및 테스트된 성인 심근 세포의 활동 전위 형태를 연상시킵니다. 또한, 전형적인 활동 전위 자발적 리듬이 그림 4C에 표시됩니다. 그림 4C의 데이터는 행 A, 열 1-12의 시공간 플롯입니다. 그림 4A의 플레이트 맵을 가로지르는 흰색 선은 이를 나타냅니다. 각 웰에서 시간 경과에 따른 각각의 밝은 형광 플래시는 단일 자발적 활성화를 나타냅니다. 그림 5와 그림 6은 GCaMP6m 유전자 인코딩 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 세포 내 칼슘 과도 현상을 측정하는 유용성을 보여줍니다. 도 6은 또한 이소프로테레놀에 대한 예상된 반응을 보여준다-고전적 심장 양성 이노트로프이다. 이소프로테레놀에 대한 반응으로 β1-아드레날린 수용체의 활성화는 양성 연성(그림 6A), 양성 수축성(그림 6B) 및 양성 윤활성(그림 6C)을 유발합니다. 이소프로테레놀에 대한 이러한 반응은 hiPSC-CM β1-아드레날린 수용체 및 세포내 신호 전달 캐스케이드의 상당한 성숙을 나타냅니다.
그림 7에는 GCaMP6m 칼슘 형광을 사용하여 리듬을 모니터링하고 수축성에 대한 대리 마커 역할을 하는 인간 Ether-a-go-go-go 관련 유전자(hERG) 채널 차단제에 대한 hiPSC-CM 반응이 나와 있습니다. E-4031은 hERG 특이적 채널 차단제로, 자발적인 박동 속도를 늦추고 칼슘 과도 지속 시간(CaTD80) 및 삼각 측량(CaT 삼각 측량)을 증가시킵니다. 도 7A는 E-4031 hERG 채널 차단에 의해 야기된 초기 탈분극의 검출을 보여준다. 돔페리돈, 반데타닙 및 소탈롤을 포함한 다른 hERG 채널 차단제도 테스트되었으며 결과는 그림 7E-G에 나와 있습니다. 이들 화합물 및 용량은 최근의 hiPSC-CM 검증 연구 1,7,9에 기초하여 선택되었다.
그림 1: 상업적으로 이용 가능하거나 기타 공급원 냉동 보존된 hiPSC-CM의 빠른 성숙을 위한 타임라인 . (A) 도금 배지에 현탁된 해동된 심근 세포를 0일에 MECM에 적용합니다. 2일째에는 배지를 유지보수 매체로 교체하고 5일째에는 폐배지를 교체합니다. 세포는 추가로 2일 동안 배양되고, 7일째에는 hiPSC-CM의 성숙한 세포융합에 다운스트림 적용을 위한 기록 용액을 로드하거나 더 오랜 기간 동안 배양할 수 있습니다. (B) 마우스 ECM 또는 MECM에 도포된 심근세포의 세포융합의 대조 단계는 마우스 ECM에 도포된 심근세포가 MECM에 도포된 심근세포에 비해 더 큰 원형도를 갖는다는 것을 보여줍니다. 또한, TnI에 대한 면역염색은 마우스 ECM에 도금된 심근세포가 MECM에 도금된 dolichomorphic 및 잘 구조화된 hiPSC-CM과 대조적으로 방사형 대칭 형태 및 무질서한 육종을 유지한다는 것을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm (B, 상단); 50 μm (B, 하부). 약어: hiPSC-CMs = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; ECM = 세포외 기질; MECM = 성숙 유도 ECM; 96wp = 96-웰 플레이트; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; TnI = 트로포닌 I. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 ECM 또는 MECM에 도말한 hiPSC-CM의 육종 조직 비교. (A) α-액티닌에 대해 면역염색된 마우스 ECM 배양 hiPSC-CM은 방사형 형태를 나타내며, 매트릭스에 도금되고 막대 모양의 형태(20x)를 나타내는 동일한 배치의 hiPSC-CM과 대조적으로 심근 세포를 통해 분산된 육종의 밀도가 더 낮습니다. (60x) 컨포칼 현미경으로 hiPSC-CM을 관찰한 결과, 마우스 ECM에서 배양된 hiPSC-CM은 MECM에서 배양된 동일한 배치의 hiPSC-CM과 대조적으로 육종의 주변 분포가 더 조밀하고 방사상 근관의 밀도가 낮은 방사형 대칭 형태를 가지고 있음을 보여줍니다. 그들은 세포의 더 긴 축을 따라 조직 된 육종의 균질 한 분포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm(상단); 50 μm (하부). (B) 높은 막투과 전위로 미토콘드리아를 염색하는 미토콘드리아 염료로 마우스 ECM 또는 MECM에서 배양된 hiPSC-CM의 염색은 MECM에 비해 마우스 ECM에서 배양된 심근 세포에서 더 낮은 염색 강도를 보여줍니다. 또한, MECM에서 배양된 hiPSC-CM은 미토콘드리아의 핵주위 축적을 나타내는 마우스 ECM에서 배양된 hiPSC-CM과 달리 심근 세포에 균질하게 분포된 미토콘드리아를 가지고 있습니다. 스케일 바 = 200 μm. 약어: hiPSC-CMs = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; ECM = 세포외 기질; MECM = 성숙 유도 ECM; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 챔버 특이적 심근 세포의 생산. (A) 챔버 특이적 심근 세포의 생산을 위한 프로토콜은 0일에서 2일까지 GSK3의 억제에 의한 Wnt 신호의 thr 자극 및 2일과 4일 사이에 이 경로의 억제와 함께 동일한 Wnt 신호 전달 경로 조작을 공유합니다. 챔버 사양은 3일과 6일 사이에 레티노산 경로의 활성화와 Wnt 신호 조작으로 달성됩니다. (B) 챔버 사양의 결과로, 심방 심근 세포는 심실 심근 세포에 비해 더 빠른 자연 탈분극 속도를 나타냅니다. (C) 심실 hiPSC-CM은 심방 hiPSC-CM에 비해 박동률이 느립니다. 따라서 재분극의 80%에서의 활동 전위 지속 시간은 hiPSC-VCM에 비해 hiPSC-ACM에서 더 짧습니다. 약어: hiPSC-CMs = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; hiPSC-ACM = 심방 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; hiPSC-VCM = 심실 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 광학 매핑 장치로 획득하고 Pulse로 분석한 광학 매핑. (A) 광학 매핑 장치와 매핑된 영화 여과 후 96웰 플레이트에서 평가된 매개변수의 전체적인 관찰 및 96웰 플레이트의 관심 영역 결정을 위한 히트맵의 예. 이 예에서는 이상값 웰(E4)과 데이터를 생성하지 못한 웰(웰 H3, 4 및 5)을 나타내는 APD80% 히트맵입니다. (B) 또한, 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 선택된 웰에서 평균 활동 전위 형태를 쉽게 플로팅할 수 있습니다. (C) 추가 데이터 시각화 도구를 사용할 수 있습니다. 이 예에서 행 A(패널 A)의 웰을 가로지르는 수평선에서 생성된 시공간 플롯은 10초 동안 각 웰의 수평 단면(행 A를 가로지르는 흰색 선)에 걸친 활성화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용한 세포 내 칼슘 일시적인 변화의 매핑을 위한 타임라인. MECM-코팅된 96-웰 플레이트에 시판되는 심근세포를 플레이팅한 후 4일째에, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 세포를 밤새 CM 분석 배지에서 5 MOI의 바이러스로 형질도입시켜야 한다. 배지는 6일까지 CDI 유지 배지로 교체되고 7일에서 11일 사이에 페놀 레드가 없는 CDI 유지 배지로 변경하여 노틸러스로 세포 내 칼슘 일시적인 변화를 즉각적이고 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. (B) 해동 후 7일, 9일 및 10일에 광학 매핑으로 평가된 AdGCaMP6f로 변환된 hiPSC-CMstransduced는 칼슘에 민감한 염료를 다시 도포할 필요 없이 장기간에 걸쳐 동일한 플레이트의 일일 광학 매핑을 허용하는 안정적인 세포 내 칼슘 매개 형광 변화의 존재를 나타냅니다. 약어: GECI = 유전적으로 암호화된 칼슘 지표; CM = 심근 세포; MOI = 감염의 다중성; 96wp = 96-웰 플레이트; BSA = 소 혈청 알부민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: hiPSC-CM의 성숙한 기능적 syncytia에서 얻은 데이터를 Nautilus와 Pulse로 분석하고 Pulse로 분석한 데이터의 시각적 비교를 위한 히트맵의 빠르고 쉬운 활용 . (A) 이소프로테레놀로 처리된 hiPSC-CM은 히트맵 검사에서 관찰되고 쌍체 t-검정으로 확인된 바와 같이 박동률의 증가를 보여줍니다. (B) 유사하게, 이소프로테레놀 처리 전후의 세포 매핑은 히트맵의 시각적 비교 및 쌍체 t-검정에 의한 β-아드레날린 자극의 수축 효과를 보여줍니다. (C) 마지막으로, 데이터의 시각적 비교를 위한 히트맵의 활용은 쌍체 t-검정(p < 0.0001)으로 확인된 β-아드레날린 자극의 또 다른 표준 효과인 lusitropy를 보여줍니다. 원이 없으면 해당 특정 웰에 대한 데이터 수집/분석이 실패했음을 나타냅니다. 약어: hiPSC-CMs = 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포; ISO = 이소프로테레놀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: hERG 채널 차단제를 사용한 GECI 심장독성 스크리닝 분석의 검증. (A) HBSS의 기준선 웰 및 500nM E-4031이 있는 상태에서 대표적인 자발적 칼슘 플럭스 흔적. (B-D) 박동률, 칼슘 과도 지속 시간 80(CaTD80) 및 칼슘 과도 삼각 측량(CaT 삼각 측량)에 대한 기준선 및 +E-4031 효과의 정량화. *,**는 상당한 차이를 나타냅니다. 짝을 이루지 않은 t-검정; p < 0.01; 각 그룹에서 n = 8. (E) 또 다른 hERG 차단제인 돔페리돈의 GECI 검출. (F) 반데타닙에 의해 유도된 hERG 블록의 GECI 검출. (G) 고용량의 소탈롤에 의한 hERG 차단의 GECI 검출. 약어: GECI = 유전적으로 암호화된 칼슘 지표; hERG = 인간 Ether-a-go-go-go 관련 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
hiPSC-CM을 사용한 체외 심장 독성 스크리닝에는 여러 가지 접근 방식이 있습니다. hiPSC-CM의 사용에 관한 최근의 "모범 사례" 논문은 다양한 체외 분석법, 1차 판독값, 그리고 중요하게는 인간 심장 전기생리학적 기능을 정량화하기 위한 각 분석의 세분성을 제시했다20. 멤브레인 피어싱 전극을 사용하는 것 외에도 인간의 심장 전기생리학적 기능에 대한 가장 직접적인 측정은 VSD에 의해 제공됩니다. VSD 분석 판독을 통해 활동 전위 지속 시간, 활동 전위 전파 속도, 활동 전위 업스트로크, 활동 전위 삼각 측량, 박동률, 박동 규칙성 및 활동 전위 지속 시간 이질성을 포함한 중요한 전기생리학적 파라미터를 직접 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 마찬가지로, 칼슘에 민감한 프로브는 hiPSC-CM 단층 리듬, 속도 및 이벤트 기간에 대한 정보를 제공합니다. 형광 프로브를 사용하여 수행된 hiPSC-CM 칼슘 과도 측정은 각 수축의 수축성 및 수축 강도에 대한 정보도 제공합니다. 이 논문은 고처리량 VSD 및 칼슘 과도 측정 분석에서 성숙한 hiPSC-CM(96웰 플레이트)을 사용하는 방법을 제공합니다. 광학 매핑 방법 외에도 고처리량 EP 데이터 분석을 위한 소프트웨어가 제공됩니다.
여기에 요약된 방법은 심장 독성 스크리닝 및 규제 과학 분야에서 상당한 발전입니다. 여기에서 우리는 고처리량 스크리닝 플레이트(96웰 플레이트)에서 2D hiPSC-CM 단층의 빠른 성숙 및 전기생리학적 기록을 위한 방법을 제시했습니다. 여기에 제시된 MECM(7일)을 이용한 빠른 성숙은 30-100일에 걸쳐 성숙이 일어나야 하는 이전 접근법에 비해 주요한 진전이다22,23. 각 실험에 수동으로 적용해야 하는 다른 ECM과 비교하여 MECM 플레이트는 ECM으로 사전 코팅되어 실험실에 도착하여 바로 사용할 수 있습니다. MECM의 이러한 측면은 다른 ECM 코팅을 사용하는 것보다 사용하기 쉽고, 덜 가변적이며, 더 효율적입니다. 중요한 것은 이 접근 방식이 냉동 보존되고 상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM과 챔버 특이적일 수 있는 "수제" hiPSC-CM 모두에 사용할 수 있다는 것입니다. 성숙한 hiPSC-CM의 뚜렷한 막대 모양 구조(그림 1 및 그림 2)로 인해 다른 ECM을 사용하는 프로토콜에 비해 여기에서 합류 단층 형성에 더 많은 수의 셀이 필요하다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 특히, 마우스 ECM(세포는 지속적으로 확산되는 팬케이크 표현형을 가짐)을 사용할 때 웰당 50,000개의 hiPSC-CM을 플레이트하지만 MECM을 사용할 때는 웰당 75,000개의 hiPSC-CM을 플레이트합니다. 패치 클램프 또는 단일 세포가 필요한 기타 이미징 기술과 같은 단일 세포 분석에 세포를 사용하는 경우에도 웰당 CM 수를 줄일 수 있습니다.
상업적으로 이용 가능한 hiPSC-CM은 미국 식품의약국(FDA)이 주도하는 국제적 노력에 의해 이러한 세포의 광범위한 특성화로 인해 규제 과학에 이점을 제공합니다. 그러나 상업적으로 이용 가능한 세포는 결절, 심방 및 심실 hiPSC-CM의 혼합물로, 관련성이 높은 독성 정보를 제공하지만 인간의 심장을 모방하는 챔버 특이적 기능이 부족합니다. 챔버 특이적 hiPSC-CM은 심방 및 심실 심근 세포 간의 잘 알려진 전기생리학적 차이를 재현하고 챔버 특이적 항부정맥 요법 개발을 위한 시험관 내 분석을 제공합니다(그림 3B-D). 예를 들어, 강력하고 엄격한 데이터 수집을 위해 96웰 플레이트에 도금된 hiPSC-ACM 단층을 사용하여 심방세동 관련 약물을 테스트 및 개발할 수 있습니다. 마찬가지로, 화합물이 고위험 심실 부정맥인 Torsades de Pointes(TdP)를 유발하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝할 때 심방 및 결절 세포가 심실 심장 단층을 "오염"시키지 않는 것이 가장 좋습니다. 따라서 현재까지 FDA 주도의 hiPSC-CM 검증 노력은 상업적으로 이용 가능한 CM을 사용하는 데 중점을 두었지만 향후 규제 과학 권장 사항은 독성 스크리닝을 인간의 심장 상태를 더욱 예측할 수 있도록 챔버 특이적 세포의 사용으로 바뀔 가능성이 높습니다. 여기에 요약된 방법은 이전 보고서를 기반으로 하며, 만능 줄기 세포(pluripotent stem cells)로부터 유래된 챔버 특이적 심근 세포(chamber-specific cardiomyocytes)의 생성을 위한 강력한 접근법을 제공한다21.
이러한 프로토콜과 현장에서 일반적으로 사용되는 프로토콜의 주요 차이점은 사용되는 정제 접근 방식입니다. 자체 실험실에서 hiPSC-CM을 생성하는 대부분의 실험실은 심근 세포의 대사 매개 선택에 의존합니다22. 여기에서 우리는 더 건강한 표현형을 가진 CM을 생산하는 임상적으로 승인된 세포 처리 접근법을 사용하여 hiPSC-CM을 정제하기 위해 MACS를 사용합니다23. 대사 챌린지 접근법은 효과적이지만, 심근 허혈을 시뮬레이션하는 배지 제형을 사용한다24. hiPSC-CM의 MACS 정제를 활용할 때, 세포 집단의 자기 고갈을 위해 non-CM을 표적으로 하는 non-CM 고갈 칵테일을 활용하는 것이 중요합니다. 비 CM 공핍 접근법을 사용하면 CM이 자기 컬럼에서 경험하는 전단 응력을 최소화 할 수 있으며 CM 모집단의 직접 자기 라벨링보다 선호됩니다. 챔버 특이적 세포의 MACS 정제를 사용하면 다른 실험실에서 연구 및 독성 테스트를 위한 건강한 CM을 생성할 수 있습니다.
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Disclosures
TJH는 StemBioSys, Inc.의 컨설턴트이자 과학 고문입니다. TB는 StemBioSys, Inc.의 직원입니다. AMR과 JC는 StemBioSys, Inc.의 전 컨설턴트입니다. TJH, TB, AMR 및 JC는 StemBioSys, Inc.의 주주입니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 HL148068-04 및 R44ES027703-02(TJH)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
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