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Cancer Research

Suivi du trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques à l’aide de lymphocytes T humains transduits par la luciférase

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Ici, nous décrivons une méthode de transduction des lymphocytes T humains avec de la luciférase pour faciliter le suivi in vivo du trafic de lymphocytes T induit par les anticorps bispécifiques vers les tumeurs dans des études visant à évaluer l’efficacité antitumorale et le mécanisme des anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T.

Abstract

Les anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T (T-BsAbs) sont à différents stades de développement préclinique et d’essais cliniques pour les tumeurs solides. Des facteurs tels que la valence, l’arrangement spatial, la distance interdomaine et les mutations Fc affectent l’efficacité antitumorale de ces thérapies, généralement en influençant le ralliement des lymphocytes T aux tumeurs, ce qui reste un défi majeur. Ici, nous décrivons une méthode pour transduire les cellules T humaines activées avec la luciférase, permettant le suivi in vivo des cellules T pendant les études de thérapie T-BsAb. La capacité des T-BsAbs à rediriger les cellules T vers les tumeurs peut être évaluée quantitativement à plusieurs moments du traitement, ce qui permet aux chercheurs de corréler l’efficacité antitumorale des T-BsAbs et d’autres interventions avec la persistance des cellules T dans les tumeurs. Cette méthode atténue la nécessité de sacrifier des animaux pendant le traitement pour évaluer histologiquement l’infiltration des lymphocytes T et peut être répétée à plusieurs moments pour déterminer la cinétique du trafic des lymphocytes T pendant et après le traitement.

Introduction

Les anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T (T-BsAbs) sont des anticorps modifiés utilisés pour fournir une spécificité artificielle aux lymphocytes T polyclonaux en engageant les lymphocytes T par un bras de liaison et un antigène tumoral par un autre bras de liaison. Cette technologie a été appliquée avec succès aux cancers hématologiques (blinatumomab1 ciblant CD19), et de nombreux T-BsAbs sont en développement préclinique et clinique pour une variété de tumeurs solides ainsi que2. Les T-BsAbs engagent les lymphocytes T polyclonaux d’une manière indépendante du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et, par conséquent, même les tumeurs qui régulent à la baisse les antigènes leucocytaires humains (HLA) sont sensibles à ce type de thérapie 3,4. Les T-BsAbs ont été développés dans des dizaines de formats différents, avec des différences dans la valence et la disposition spatiale des bras de liaison aux cellules T et aux tumeurs, les distances interdomaines et l’inclusion d’un domaine Fc, qui affecte la demi-vie et peut induire des fonctions effectrices si présent5. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont montré que ces facteurs affectent de manière significative l’efficacité antitumorale des T-BsAbs, avec des différences de puissance allant jusqu’à 1 000 fois6. Grâce à ce travail, nous avons identifié le format IgG-[L]-scFv comme la plateforme idéale pour les T-BsAbs (voir la section Résultats représentatifs pour plus de détails sur les formats T-BsAb), et nous avons appliqué cette plateforme à des cibles telles que GD2 (neuroblastome), HER2 (cancer du sein et ostéosarcome), GPA33 (cancer colorectal), STEAP1 (sarcome d’Ewing), CD19 (tumeurs malignes à cellules B) et CD33 (tumeurs malignes à cellules B)7. 8,9,10,11,12,13.

L’un des principaux défis pour réussir la mise en œuvre de la thérapie T-BsAb dans les tumeurs solides est de surmonter un microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME) pour conduire le trafic des lymphocytes T aux tumeurs14. Les facteurs affectant l’efficacité des T-BsAb décrits ci-dessus ont un impact significatif sur la capacité des T-BsAbs à induire efficacement le homing des lymphocytes T vers les tumeurs, mais cet effet est difficile à évaluer dans un système in vivo en temps réel. Ce manuscrit fournit une description détaillée de l’utilisation des lymphocytes T transduits par la luciférase dans les études précliniques des T-BsAbs pour évaluer le trafic des lymphocytes T vers divers tissus dans des modèles expérimentaux de souris immunodéprimées pendant le traitement. L’objectif global de cette méthode est de fournir un moyen d’évaluer l’infiltration des lymphocytes T dans les tumeurs et autres tissus, ainsi qu’un aperçu en temps réel de la cinétique et de la persistance de la localisation des lymphocytes T, sans avoir besoin de sacrifier des animaux pendant le traitement. Pour le nombre croissant de chercheurs qui se concentrent sur les immunothérapies cellulaires, la capacité de suivre les lymphocytes T in vivo dans des modèles animaux précliniques est cruciale. Notre objectif est de fournir une description complète et détaillée de la méthode que nous avons utilisée pour suivre les lymphocytes T transduits par la luciférase afin de permettre à d’autres chercheurs de reproduire facilement cette technique.

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Protocol

Les procédures suivantes ont été évaluées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Memorial Sloan Kettering.

1. Transfection de cellules 293T avec luciférase et récolte de surnageant viral

  1. Culture de cellules 293T
    1. Préparer les milieux en ajoutant ce qui suit à un litre de DMEM chacun : 110 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine.
    2. Décongeler 5 cellules x 106 293T et les transférer dans une fiole T175 avec le milieu préparé comme décrit ci-dessus.
    3. Divisez les cellules 293T 1:10 tous les 3 jours pendant 6 jours. Ne laissez pas les cellules devenir confluentes à plus de 90%.
  2. Transfection de cellules 293T
    NOTE: Les quantités suivantes de réactifs sont calculées pour transfecter une fiole T175 de cellules 293T. Ajuster en conséquence si d’autres flacons doivent être transduits.
    1. Transférer 1,5 mL de média dans chacun des deux tubes de 50 ml à l’aide d’une pipette. Dans un tube, ajouter 10 μg de plasmide VSV-G, 20 μg de Gag/pol et 20 μg de plasmide luciférase TD rouge de coléoptère rouge (CBR-TDR) et mélanger. Dans l’autre tube, ajouter 100 μL de réactif de transfection in vitro d’ADN et mélanger. Incuber les deux tubes à température ambiante (RT) pendant 5 min.
      NOTE: Tous les plasmides décrits dans ce manuscrit ont été fournis par le Dr Vladimir Ponomarev.
    2. Transférer goutte à goutte le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN dans le tube contenant les plasmides d’ADN (sur environ 30 s) et mélanger doucement à l’aide d’une pipette. Incuber à TA pendant 20 min.
    3. Au cours de cette incubation de 20 minutes, détacher les cellules 293T en ajoutant 5 à 10 ml de trypsine à 0,05 %. Une fois les cellules détachées, ajouter 10 mL de média et centrifuger à 800 x g pendant 5 min. Remettez les cellules en suspension dans 1,5 mL de média.
    4. Ajouter le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN et les plasmides d’ADN aux cellules 293T et incuber à 37 °C pendant 30 min.
    5. Transvaser dans une fiole T175 et ajouter 18 ml de média. Incuber à 37 °C pendant une nuit.
    6. Le lendemain, aspirez soigneusement le média avec une pipette en verre sans détacher les cellules. Remplacer par 18 ml de média frais. Incuber à 37 °C pendant une nuit dans un incubateur.
  3. Récolte du surnageant viral
    1. Retirer le surnageant viral à l’aide d’une pipette placée sur de la glace. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules et les débris.
      REMARQUE : Si la pastille de la cellule est grande, les cellules ont probablement été perturbées du flacon lorsque le surnageant a été retiré. Ces cellules peuvent être plaquées à nouveau dans une nouvelle fiole avec un milieu frais.
    2. Filtrer le surnageant viral à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    3. Utilisez le surnageant viral immédiatement. Conservez-le sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à 24 h, ou congelez-le à -80 °C pour un stockage à long terme.

2. Expansion et transduction des lymphocytes T humains activés avec la luciférase

  1. Activation des lymphocytes T humains in vitro
    1. Lavez les billes en ajoutant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube stérile de 15 mL, en ajoutant des billes (une bille pour deux lymphocytes T), en les plaçant dans un support magnétique pendant 2 minutes et en aspirant le PBS.
    2. Préparer le milieu comme décrit à l’étape 1.1.1, puis ajouter l’IL-2 jusqu’à une concentration finale de 30 UI/mL et ajouter les billes lavées. Fabriquer 2,5 mL de milieu pour deux millions de lymphocytes T à activer.
    3. Compter les lymphocytes T (fraîchement purifiés ou préalablement purifiés, congelés, décongelés et lavés) à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration bleue de trypan. Ajouter les lymphocytes T au milieu préparé à l’étape 2.1.2 et retourner délicatement le tube pour mélanger. Les cellules T se développeront au moins 20x selon la source et l’état de santé général des cellules. Déterminer le nombre de lymphocytes T à activer en calculant le nombre nécessaire pour traiter les souris et en divisant par 20. Ici, 20 x 106 cellules T par souris ont été utilisées sur la base d’expériences préliminaires.
    4. Plaque de 2,5 mL de milieu contenant deux millions de lymphocytes T, de billes et d’IL-2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Culture à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .
    5. Examinez les lymphocytes T au microscope 20x tous les jours pendant les 3 prochains jours pour déterminer quand transduire avec la luciférase. Les cellules sont prêtes lorsqu’elles s’agglutinent et épuisent le média, le faisant passer du rouge / rose à l’orange clair.
  2. Préparation des plaques de rétronectine
    REMARQUE: La rétronectine est utilisée pour recouvrir les plaques utilisées dans la transduction car elle améliore la transductiondu gène 15.
    1. Ajouter 2 mL de 20 μg/mL de rétronectine dans du PBS à un puits d’une plaque à 6 puits non traitée. Incuber pendant 2 h à TA ou 1 h à 37 °C. Un puits recouvert de rétronectine est nécessaire pour chaque tranche de deux millions de lymphocytes T à transduire.
    2. Aspirer la rétronectine sans rayer le fond de la plaque.
    3. Ajouter 3 mL de BSA à 2 % dans du PBS (filtré stérile) par puits dans la plaque à 6 puits. Incuber pendant 30 min à RT.
  3. Spinoculation
    1. Aspirer le BSA sans rayer le fond de la plaque.
    2. Lavez les puits une fois avec 3 mL de PBS par puits. Continuer ou remplacer par du PBS frais et laisser la plaque couverte à 4 °C pendant la nuit.
    3. Ajouter 2 mL de surnageant viral luciférase CBR-TDR (recueilli à l’étape 1.3) par puits.
    4. Centrifuger à 1 240 x g pendant 90 min à 32 °C.
  4. Transduction
    1. Comptez les lymphocytes T.
    2. Aspirez le surnageant viral sans gratter le fond de la plaque.
    3. Plaquer deux millions de lymphocytes T par puits dans 6 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 30 UI/mL d’IL-2 humaine.
    4. Examinez les lymphocytes T quotidiennement. Les lymphocytes T sont prêts à être dilatés lorsqu’ils sont presque confluents, généralement après 2 jours.
    5. Lorsque les cellules sont presque confluentes, les laver délicatement du fond de la plaque à l’aide d’une pipette et transférer chaque puits dans une fiole T75 séparée. Ajouter 9 mL de fluide pour un total de 15 mL de média par fiole.
    6. Le lendemain, ajoutez 15 ml de média supplémentaires. Les cellules doivent être prêtes à être injectées dans les souris le lendemain de cet ajout de milieu. Confirmer la réussite de la transduction en effectuant une cytométrie en flux (la construction de la luciférase contient un fluorophore de tomate TD visible dans le canal PE)16.

3. Greffe de lymphocytes T transduits par la luciférase chez des souris immunodéprimées

  1. Préparer et compter les lymphocytes T pour injection.
    1. Retirez les lymphocytes T des flacons et comptez. Les cellules sont prêtes à s’injecter lorsqu’elles se sont dilatées de 20 à 30 fois, généralement au jour 7 après l’activation.
    2. Centrifuger les lymphocytes T à 800 x g pendant 5 min. Remettez en suspension dans 2 ml de média et retirez les billes à l’aide d’un support magnétique.
    3. Pour les expériences où les lymphocytes T seront injectés séparément des anticorps bispécifiques, compter les lymphocytes T et les remettre en suspension de sorte que la concentration finale soit de 20 millions de lymphocytes T par 100 μL de milieu. Passez à l’étape 3.2. Pour les expériences utilisant des lymphocytes T armés ex vivo (EAT), passez à l’étape 3.1.4.
    4. Pour les expériences utilisant des cellules T armées ex vivo , compter les cellules T et les séparer en tubes individuels de 1,5 mL pour chaque groupe, avec 20 millions de cellules par souris. Par exemple, s’il y a trois groupes de cinq souris chacun, préparez trois tubes de 1,5 mL avec 100 millions de lymphocytes T chacun.
    5. Centrifuger les tubes de 1,5 mL à 800 x g pendant 5 min. Retirez le média avec précaution sans déranger la pastille de lymphocytes T. Remettre en suspension dans un maximum de 50 μL de milieu contenant les anticorps bispécifiques. Incuber à TA pendant 30 min.
      REMARQUE : Aux fins des expériences menées dans le cadre de cette étude, des anticorps bispécifiques exclusifs engageant les lymphocytes T IgG-[L]-scFv et générés en laboratoire ont été utilisés. Pour l’armement des lymphocytes T, utiliser 5 μg d’anticorps pour 20 x 106 lymphocytes T. Des anticorps bispécifiques disponibles dans le commerce pourraient également être utilisés.
    6. Éliminer l’excès d’anticorps en ajoutant 1 450 μL de milieu à chaque tube. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min, aspirer soigneusement le milieu et remettre en suspension à une concentration de 20 millions de lymphocytes T armés par milieu de 100 μL.
  2. Injection et greffe chez la souris
    1. Anesthésier les souris dans une chambre fournissant 3,5 % (v/v) d’isoflurane inhalé dans 1 L/min d’oxygène. Les souris sont entièrement anesthésiées lorsque le réflexe de retrait de la pédale des membres postérieurs a disparu.
      REMARQUE: Fournir un support thermique tout au long de la procédure.
    2. À l’aide d’une aiguille de 26 G, injecter 20 millions de lymphocytes T dans 100 μL de média rétroorbitalement par souris.
    3. Administrer 1 000 UI d’IL-2 recombinante par voie sous-cutanée pour soutenir la survie des lymphocytes T in vivo.
    4. Administrer les anticorps bispécifiques rétroorbitalement (dans l’œil non utilisé pour l’injection de lymphocytes T) ou intrapéritonéal. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie et retournez dans leurs cages.
      REMARQUE: Encore une fois, ici, des anticorps exclusifs générés en laboratoire ont été utilisés, mais des anticorps disponibles dans le commerce pourraient être utilisés à la place. Dans les expériences ici, 0,3-10 μg d’anticorps par souris et par dose ont été administrés. Les anticorps ont été administrés deux fois par semaine pendant 3-4 semaines.

4. Imagerie in vivo de souris greffées avec des lymphocytes T transduits par la luciférase

NOTE: Cette étape doit être effectuée le jour de l’imagerie, qui n’est pas nécessairement le même jour que les cellules T et / ou les anticorps sont administrés aux souris. En règle générale, nous effectuons une imagerie 24 heures après l’administration des lymphocytes T transduits par la luciférase.

  1. Préparation de D-luciférine
    1. Dissoudre 1 g de D-luciférine dans 33,3 mL de PBS stérile (concentration finale : 30 mg/mL).
    2. Aliquote la D-luciférine dissoute dans 33 tubes microcentrifuges de 1,5 mL et maintenir les tubes à -20 °C.
    3. Le jour de l’imagerie, décongeler suffisamment d’aliquotes de 30 mg/mL de D-luciférine pour que le nombre d’animaux soit imagée. Un tube suffit pour 10 animaux.
      REMARQUE: Recongeler le reste de la D-luciférine après utilisation. La d-luciférine est stable pendant au moins cinq cycles de gel/dégel.
  2. Administration de D-luciférine à la souris
    REMARQUE: Avant d’administrer la D-luciférine aux souris, ouvrez le logiciel d’imagerie et initialisez le système. La caméra peut prendre plusieurs minutes à refroidir, et cela devrait être fait avant que les souris ne soient injectées avec D-luciférine pour s’assurer que l’imagerie peut avoir lieu 5 minutes après l’administration du substrat.
    1. Anesthésier jusqu’à cinq souris dans une chambre fournissant 3,5 % (v/v) d’isoflurane inhalé dans 1 L/min d’oxygène. Les souris sont entièrement anesthésiées lorsque le réflexe de retrait de la pédale des membres postérieurs a disparu.
    2. Une fois les souris complètement anesthésiées, administrer 100 μL de D-luciférine à 30 mg/mL par souris (3 mg par souris) par injection rétroorbitaire avec une aiguille de 26 G. Imaginez ce groupe de souris avant d’administrer la D-luciférine au groupe suivant. Placez le groupe de souris suivant dans la chambre d’isoflurane à anesthésier pendant que le groupe précédent est photographié.
  3. Imagerie des lymphocytes T transduits par la luciférase
    1. Déplacer les souris anesthésiées dans la chambre étanche à la lumière de l’imageur et continuer à administrer de l’isoflurane à 3 % à 0,5 L/min. Placez les souris sur le côté de manière à ce que le flanc portant la xénogreffe soit tourné vers la caméra. Prenez une autre série d’images avec les souris en décubitus dorsal pour évaluer la présence de lymphocytes T dans les poumons.
    2. À l’aide du Panneau de configuration des acquisitions, sélectionnez Luminescent, Photographie et Superposition. Définissez le temps d’exposition sur auto, le binning sur moyen et F/Stop sur 1. Acquérir des images. Après la première image, définissez le temps d’exposition pour qu’il corresponde à celui qui a été calculé automatiquement pour la première image afin que les images suivantes puissent être comparées directement. Il peut être utile de capturer des images avec plusieurs temps d’exposition pour déterminer le temps d’exposition optimal pour obtenir le signal le plus lumineux sans saturation de pixels.
    3. Retirez les souris de l’isoflurane, retournez dans leurs cages et observez-les jusqu’à ce qu’elles soient éveillées et ambulatoires.
    4. Répétez les étapes de l’étape 4.2.1 jusqu’à ce que tous les groupes aient été imagés.

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Representative Results

Comme décrit à l’étape 4.3, les souris peuvent être orientées dans différentes positions pendant l’imagerie pour évaluer la présence de lymphocytes T dans différents tissus. Le positionnement en décubitus dorsal permet d’évaluer les lymphocytes T dans les poumons, ce qui est courant aux premiers moments après l’injection. Le positionnement latéral avec la xénogreffe sous-cutanée tournée vers le haut est utilisé pour évaluer au mieux le trafic des lymphocytes T vers la tumeur. Des souris femelles C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac ont été utilisées pour toutes les expériences décrites dans ce manuscrit. La figure 1 montre des images d’une expérience dans laquelle des souris portant des xénogreffes GD2-positives ont été traitées avec des lymphocytes T transduits par la luciférase armés ex vivo d’un GD2 BsAb ou de lymphocytes T transduits par la luciférase et GD2 BsAb injecté séparément17. La figure 1A montre que les lymphocytes T armés ont trafiqué vers la tumeur plus rapidement que les lymphocytes T non armés (Figure 1B), quittant les poumons 2 jours plus tôt. La figure 1C montre la quantification de ce phénomène. La figure 1E-G montre qu’il est possible de surveiller le trafic des lymphocytes T pendant au moins 28 jours après l’injection des lymphocytes T transduits par la luciférase, ce qui permet aux chercheurs de suivre la localisation et la persistance des lymphocytes T tout au long du traitement, contrairement à d’autres techniques telles que l’immunohistochimie (IHC) qui ne permettent qu’un instantané de l’infiltration des lymphocytes T.

Sans la capacité d’évaluer le trafic des lymphocytes T in vivo, les chercheurs testant les T-BsAbs sont incapables de déterminer si les lymphocytes T s’infiltrent et persistent dans les tumeurs pendant le traitement. Si un traitement échoue, sans sacrifier les animaux et effectuer une IHC, il peut être difficile ou impossible de savoir si l’échec était dû à un manque de trafic de lymphocytes T, à la persistance, à l’épuisement des lymphocytes T ou à une autre cause. La figure 2A-C montre une expérience dans laquelle des souris portant des xénogreffes dérivées de patientes atteintes d’un cancer du sein ont été traitées avec des lymphocytes T humains transduits par la luciférase et des BsAbs ciblant HER2 portant différentes mutations pour réduire au silence les fonctions Fc7. La figure 2C montre que le traitement avec le BsAb HER2 avec un Fc non silencieux n’a eu aucun effet sur la croissance tumorale par rapport à un BsAb témoin, alors que le traitement avec des BsAb HER2 contenant une mutation N297A seule ou en combinaison avec une mutation K322A a pu arrêter complètement la croissance tumorale. Les figures 2A et 1B montrent que dans les groupes présentant les mutations silençantes, le signal de luminescence des lymphocytes T a atteint un pic plus élevé le jour 3 après l’injection et a persisté à un niveau plus élevé que le BsAb témoin et le BsAb HER2 non silencieux. Des expériences de suivi ont montré que chez les souris traitées avec des cellules T et les BsAbs avec des Fc non silencieux, les cellules T dans les régions périvasculaires des poumons étaient entourées de neutrophiles murins et de macrophages, suggérant une séquestration Fc dépendante des cellules T liées à BsAb qui empêche la migration vers la tumeur. L’effet pro-tumorigène des macrophages polarisés M2 résidant dans la tumeur a été bien décrit. La figure 3A,B montre que chez les souris porteuses de xénogreffes dérivées de patients atteints de neuroblastome (PDX), la déplétion des macrophages positifs au Ly6c augmente significativement le passage des lymphocytes T vers les tumeurs, entraînant une diminution de la croissance tumorale et une survie prolongée (Figure 3C)18. Cet effet est encore plus prononcé dans les PDX d’ostéosarcome (Figure 3D).

In vivo Le suivi des lymphocytes T permet également aux chercheurs de surveiller comment la cinétique du trafic des lymphocytes T est affectée par d’autres variables de l’ingénierie des anticorps, y compris la configuration structurelle. Comme décrit dans l’introduction de cet article, des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont souligné l’importance de la bivalence et de l’orientation cis des bras de liaison aux cellules T et tumorales pour l’efficacité in vivo de BsAbs. La figure 4 montre que parmi un panel de BsAbs ciblant l’antigène tumoral STEAP1 (Figure 4A), le format IgG-[L]-scFv a entraîné significativement plus d’infiltration de lymphocytes T au jour 6 après la première dose de lymphocytes T, qui a persisté pendant toute la durée du traitement (Figure 4C)10. Ce phénomène n’a pas été prédit par des essais de cytotoxicité in vitro (figure 4B), ce qui souligne l’importance de confirmer les résultats in vitro dans des modèles in vivo.

Figure 1
Figure 1 : Les lymphocytes T armés présentent une cinétique de localisation tumorale plus rapide que les lymphocytes T non armés dirigés par BsAb, contournant rapidement la séquestration pulmonaire. Les lymphocytes T transduits par la luciférase ont été dilatés et armés de BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Des électro-EATs de Luc(+) GD2 (10 μg de cellules T GD2-BsAb/2×10 7 lymphocytes T) ou Luc(+) (2 x 107 cellules) avec ou sans GD2-BsAb (10 μg) ont été administrés par voie intraveineuse à des souris porteuses de PDX de neuroblastome GD2-positif lorsque le volume tumoral moyen atteignait 100 mm3. (A) Images de bioluminescence de GD2-EAT se transformant en tumeurs. (B) Images de bioluminescence de GD2 BsAb trafic de lymphocytes T non armés dans des tumeurs pendant des jours. (C) Quantification de l’infiltration des lymphocytes T dans les tumeurs au cours du temps mesurée par bioluminescence (n = 5 souris/groupe) exprimée en flux total ou radiance (photons/s) par pixel intégré sur le contour tumoral (ROI). (D) Courbes de croissance tumorale de souris individuelles traitées avec GD2-EATs, GD2-BsAb plus cellules T non armées, ou cellules T non armées. Pour tester la persistance in vivo d’EAT spécifiques de l’antigène cible, des ECAT Luc(+) GD2 (armés de 10 μg de cellules GD2-BsAb/2×10 7 T) ou Luc(+) HER2-EATs (10 μg de cellules HER2-BsAb/2×107 T) ont été administrés par voie intraveineuse à des souris TEOS1C PDX atteintes d’ostéosarcome. Deux doses supplémentaires de GD2-EATs ou HER2-EATs transduits sans luciférase ont été administrées le jour 7 et le jour 14. (E) Quantification de la bioluminescence des EAT Luc(+) dans les tumeurs post-traitement. (F) Courbes de croissance tumorale de souris individuelles traitées avec GD2-EATs, HER2-EATs, ou des cellules T non armées, ou aucun traitement. (G) Images de bioluminescence de Luc(+) GD2-EATs (supérieur) ou Luc(+) HER2-EAT (inférieur) dans les tumeurs au fil du temps. La bioluminescence des EAT Luc(+) a été détectée plus de 28 jours après l’injection. Abréviations : EAT = lymphocytes T armés ex vivo; ROI = région d’intérêt. Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. Cette figure a été modifiée à partir de Park et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Trafic des lymphocytes T en PDX du cancer du sein humain HER2-positif chez des souris DKO. (A) Images représentatives de bioluminescence du trafic de lymphocytes T. (B) Quantification du trafic des lymphocytes T dans les tumeurs au fil du temps par bioluminescence (n = 5 souris/groupe) exprimée en flux total ou radiance (photons/s) dans chaque pixel intégré sur l’ensemble du contour tumoral (ROI). (C) Croissance du cancer du sein PDX (M37) HER2-positif (n = 5 souris/groupe) après traitement par Ctrl BsAb, HER2 BsAb et ses mutants Fc. Les résultats présentés sont des résultats représentatifs d’au moins trois expériences indépendantes. Les différences significatives ont été calculées en fonction de l’aire sous la courbe (ASC). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. Cette figure a été modifiée à partir de Wang et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les effets de la déplétion monocytaire sur le trafic de lymphocytes T dirigé par BsAb et la réponse antitumorale in vivo. (A) Les lymphocytes T induits par la luciférase (cellules T Luc(+)) ou les lymphocytes T armés GD2-BsAb transduits par la luciférase (Luc(+) GD2-EATs) ont été administrés avec des anticorps anti-Ly6C aux souris portant une xénogreffe dérivée d’un patient neuroblastome (PDX). (B) La bioluminescence dans les lésions de la tumeur a été surveillée. Les images de bioluminescence au jour 7 et la quantification de la bioluminescence dans les lésions de la tumeur. (C) La réponse antitumorale in vivo des GAT GD2 avec des anticorps anti-Ly6C a été testée contre les PDX du neuroblastome. (D) L’effet antitumoral in vivo des AD GD2 avec anticorps anti-Ly6C a été testé contre les PDX de l’ostéosarcome, et la survie à long terme a été analysée. Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. L’effet antitumoral in vivo a été comparé par les analyses de l’ASC et de la courbe de survie. Les lymphocytes infiltrant les tumeurs ont été quantifiés à l’aide de l’ASC de bioluminescence. La signification statistique des différences entre les échantillons indiqués dans la figure a été vérifiée à l’aide d’un test t de Student bilatéral pour deux ensembles de données et d’une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey pour trois ensembles de données ou plus. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Cette figure a été modifiée à partir de Park et al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Activité antitumorale de l’anticorps bispécifique engageant les lymphocytes T anti-STEAP1. (A) Représentation schématique des six formats structurels de STEAP1 BsAb. (B) Test de cytotoxicité médiée par les lymphocytes T dépendants des anticorps (ADTC) contre des lignées cellulaires EFT (TC32 ad TC71) utilisant différents formats de STEAP1 BsAb. Le rapport effecteur/cellule cible (ET) était de 10:1. (C) Imagerie par bioluminescence (BLI) des lymphocytes T Luc(+) armés de six formats différents de STEAP1 BsAb le (a) jour 6 et (b) le jour 18 post-traitement et quantification de l’intensité de la bioluminescence dans les lésions de la tumeur. Les lymphocytes T transduits par la luciférase (cellules T Luc(+)) ont été armés de divers formats de STEAP1 BsAb (10 μg de STEAP1 BsAb/2 x 107 lymphocytes T) et administrés avec une IL-2 supplémentaire (1 000 UI/dose) aux souris portant des EFT PDX (ES15a), et le BLIfollow. Abréviations : EFT = famille de tumeurs du sarcome d’Ewing; PDX = xénogreffes tumorales dérivées de patients; STEAP = antigène épithélial transmembranaire six de la prostate. Les barres d’erreur indiquent l’erreur-type de la moyenne. Les lymphocytes infiltrant la tumeur ont été quantifiés en calculant l’aire sous la courbe de la bioluminescence. Les différences entre les échantillons indiquées dans la figure ont été testées pour la signification statistique à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey. p < 0,0001. Cette figure a été modifiée à partir de Lin et al.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Alors que le blinatumomab T-BsAb a été approuvé pour les hémopathies malignes CD19 positives, la mise en œuvre réussie des T-BsAbs dans les tumeurs solides s’est avérée beaucoup plus difficile. Le catumaxomab, un T-BsAb dirigé contre la molécule d’adhésion des cellules épithéliales (EPCAM), a été approuvé pour le traitement de l’ascite maligne chez les patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire, mais la production du médicament a ensuite été arrêtée pour des raisons commerciales19. Aucun autre T-BsAbs n’a été approuvé pour les tumeurs solides, soulignant les défis associés à ce type de thérapie. La toxicité due au syndrome de libération de cytokines (SRC) est un problème courant, bien que cela puisse être géré avec des stéroïdes et des inhibiteurs de cytokines. En plus de la toxicité, un manque d’efficacité est fréquent dans les essais de T-BsAbs pour les tumeurs solides. L’induction du trafic et de la persistance des lymphocytes T dans la tumeur s’est avérée difficile, probablement en raison de divers facteurs immunosuppresseurs dans le TME14. Cependant, même précliniquement, il est souvent difficile de savoir pourquoi un T-BsAb qui fonctionne bien in vitro ne parvient pas à traiter efficacement les tumeurs in vivo.

La méthode de suivi des lymphocytes T in vivo en temps réel décrite dans cet article est utile aux chercheurs pour plusieurs raisons. La surveillance du homing des lymphocytes T fournit un aperçu mécaniste des raisons pour lesquelles certains T-BsAbs réussissent ou échouent en permettant aux chercheurs de déterminer quand le trafic des lymphocytes T a commencé et pendant combien de temps les lymphocytes T ont persisté dans la tumeur pendant le traitement. La méthode peut être répétée à plusieurs moments, ce qui permet aux chercheurs de tracer la cinétique du homing des lymphocytes T sur plusieurs semaines. (Les résultats représentatifs de la figure 1 montrent que les lymphocytes T persistent dans la tumeur pendant au moins 28 jours.) L’imagerie in vivo des lymphocytes T transduits par la luciférase élimine également la nécessité de sacrifier des animaux pendant le traitement pour l’évaluation histologique de l’infiltration des lymphocytes T, réduisant ainsi le coût global et le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Parce que l’imagerie peut être répétée aussi souvent que nécessaire, elle permet également une évaluation beaucoup plus facile et plus approfondie de la cinétique de localisation des lymphocytes T par rapport à l’analyse histologique, qui est essentiellement un instantané d’un seul point temporel à moins que plusieurs animaux ne soient sacrifiés à différents moments temporels.

L’étape la plus critique de cette méthode est la transduction réussie des lymphocytes T avec la construction de la luciférase. Une transduction infructueuse peut entraîner la mort des lymphocytes T ou un manque de signal de luciférase in vivo. Si les lymphocytes T ne se développent pas comme prévu après la transduction, il peut être possible de réduire le titre viral avec lequel ils sont transduits afin de réduire la toxicité potentielle du processus de transduction. Une autre approche consisterait à attendre un autre jour entre les étapes d’expansion des cellules T pour permettre aux cellules T de devenir plus confluentes avant de les étendre dans un récipient de culture cellulaire plus grand. Avant d’injecter les lymphocytes T dans les souris, il est judicieux de confirmer le succès de la transduction à l’aide de la cytométrie en flux (pour vérifier l’expression du rapporteur de tomate TD) ou d’un lecteur de plaque bioluminescente. Si les lymphocytes T transduits ne sont toujours pas visibles avec l’imagerie bioluminescente, il est possible que le nombre de lymphocytes T soit trop faible pour être détecté par cette technique. Rabinovich et al. décrivent une méthode similaire utilisant la luciférase de luciole améliorée pour détecter aussi peu que 10 lymphocytes T murins, qui peut être mise en œuvre dans des situations nécessitant ce niveau de sensibilité20.

En résumé, le suivi in vivo des lymphocytes T transduits par la luciférase fournit un outil précieux pour les chercheurs qui étudient les T-BsAbs dans des modèles murins immunodéprimés de cancer. En plus des applications discutées ci-dessus, cette méthode de suivi des lymphocytes T a été appliquée aux lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) et pourrait ostensiblement être appliquée à des modèles de souris syngéniques utilisant également des lymphocytes T transférés par adoption21. Nous espérons que cette stratégie sera utile aux chercheurs développant des T-BsAbs translationnels et conduira à un succès accru de ces thérapies chez les patients atteints de tumeurs solides.

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Disclosures

NKC déclare avoir reçu des subventions de recherche commerciale de Y-mAbs Therapeutics. NKC est l’inventeur et le propriétaire des brevets délivrés sous licence par MSK à Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand et Abpro-labs. MSK et NKC ont des intérêts financiers dans Y-mAbs. NKC déclare avoir reçu des options d’achat d’actions d’Eureka Therapeutics. HFG et MEC n’ont pas de divulgations pertinentes.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier le Dr Vladimir Ponomarev d’avoir partagé les constructions de luciférase utilisées dans les expériences décrites dans la section des résultats représentatifs de cet article.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

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References

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  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

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Cancer Research numéro 195 anticorps bispécifiques engageurs de lymphocytes T luciférase lymphocytes T xénogreffes
Suivi du trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques à l’aide de lymphocytes T humains transduits par la luciférase
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Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

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