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Cancer Research

Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Aqui, descrevemos um método para transdução de células T humanas com luciferase para facilitar o rastreamento in vivo do tráfego de células T induzido por anticorpos biespecíficos para tumores em estudos para avaliar a eficácia antitumoral e o mecanismo de anticorpos biespecíficos que envolvem células T.

Abstract

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) estão em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e testes clínicos para tumores sólidos. Fatores como valência, arranjo espacial, distância entre domínios e mutações Fc afetam a eficácia antitumoral dessas terapias, comumente influenciando o homing de células T para tumores, o que continua sendo um grande desafio. Aqui, descrevemos um método para transduzir células T humanas ativadas com luciferase, permitindo o rastreamento in vivo de células T durante estudos de terapia com T-BsAb. A capacidade dos T-BsAbs de redirecionar células T para tumores pode ser avaliada quantitativamente em vários momentos durante o tratamento, permitindo que os pesquisadores correlacionem a eficácia antitumoral de T-BsAbs e outras intervenções com a persistência de células T em tumores. Este método alivia a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento para avaliar histologicamente a infiltração de células T e pode ser repetido em vários pontos de tempo para determinar a cinética de tráfego de células T durante e após o tratamento.

Introduction

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) são anticorpos projetados usados para fornecer especificidade artificial às células T policlonais, engajando as células T através de um braço de ligação e um antígeno tumoral através de outro braço de ligação. Essa tecnologia tem sido aplicada com sucesso em cânceres hematológicos (blinatumomab1 direcionado para CD19), e numerosos T-BsAbs estão em desenvolvimento pré-clínico e clínico para uma variedade de tumores sólidos também2. Os T-BsAbs envolvem células T policlonais de maneira independente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e, portanto, mesmo tumores que regulam negativamente os antígenos leucocitários humanos (HLAs) são suscetíveis a esse tipo de terapia 3,4. Os T-BsAbs foram desenvolvidos em dezenas de formatos diferentes, com diferenças na valência e arranjo espacial dos braços de ligação de células T e tumores, distâncias interdomínios e a inclusão de um domínio Fc, que afeta a meia-vida e pode induzir funções efetoras sepresente5. Trabalhos anteriores em nosso laboratório mostraram que esses fatores afetam significativamente a eficácia antitumoral dos T-BsAbs, com diferenças de até 1.000 vezes napotência6. Através deste trabalho, identificamos o formato IgG-[L]-scFv como a plataforma ideal para T-BsAbs (veja a seção Resultados Representativos para mais detalhes sobre os formatos T-BsAb), e aplicamos essa plataforma a alvos incluindo GD2 (neuroblastoma), HER2 (câncer de mama e osteossarcoma), GPA33 (câncer colorretal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (malignidades de células B) e CD33 (malignidades de células B)7, 8,9,10,11,12,13.

Um dos principais desafios para implementar com sucesso a terapia com T-BsAb em tumores sólidos é superar um microambiente tumoral imunossupressor (TME) para direcionar o tráfego de células T para tumores14. Os fatores que afetam a eficácia do T-BsAb descritos acima têm um impacto significativo na capacidade dos T-BsAbs de induzir efetivamente o homing de células T para tumores, mas esse efeito é difícil de avaliar em um sistema in vivo em tempo real. Este manuscrito fornece uma descrição detalhada do uso de células T transduzidas por luciferase em estudos pré-clínicos de T-BsAbs para avaliar o tráfego de células T para vários tecidos em modelos experimentais de camundongos imunocomprometidos durante o tratamento. O objetivo geral deste método é fornecer um meio para avaliar a infiltração de células T em tumores e outros tecidos, bem como informações em tempo real sobre a cinética e persistência de células T, sem a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento. Para o número crescente de pesquisadores com foco em imunoterapias celulares, a capacidade de rastrear células T in vivo em modelos animais pré-clínicos é crucial. Nosso objetivo é fornecer uma descrição completa e detalhada do método que empregamos para rastrear células T transduzidas por luciferase para permitir que outros pesquisadores repliquem facilmente esta técnica.

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Protocol

Os procedimentos a seguir foram avaliados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Memorial Sloan Kettering.

1. Transfecção de células 293T com luciferase e colheita do sobrenadante viral

  1. Cultura de células 293T
    1. Preparar o meio adicionando a um litro de DMEM cada: 110 mL de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor, 11 mL de penicilina-estreptomicina.
    2. Descongelar células 5 x 106 293T e transferi-las para um balão T175 com o meio preparado como descrito acima.
    3. Divida as células 293T 1:10 a cada 3 dias por 6 dias. Não permita que as células se tornem mais de 90% confluentes.
  2. Transfecção de células 293T
    NOTA: As seguintes quantidades de reagentes são calculadas para transfecção de um frasco T175 de células 293T. Ajustar em conformidade se for necessário transduzir mais frascos.
    1. Transfira 1,5 mL de meio para cada um dos dois tubos de 50 mL usando uma pipeta. A um tubo, adicione 10 μg de plasmídeo VSV-G, 20 μg de Gag/pol e 20 μg de plasma de luciferase de tomate TD TD (CBR-TDR) e misture. Ao outro tubo, adicionar 100 μL de DNA in vitro transfecção reagente e misturar. Incubar ambos os tubos à temperatura ambiente (TR) por 5 min.
      NOTA: Todos os plasmídeos descritos neste manuscrito foram fornecidos pelo Dr. Vladimir Ponomarev.
    2. Transfira o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA gota a gota para o tubo contendo os plasmídeos de DNA (acima de aproximadamente 30 s) e misture suavemente com uma pipeta. Incubar em TR por 20 min.
    3. Durante esses 20 min de incubação, separar as células 293T adicionando 5-10 mL de tripsina a 0,05%. Uma vez que as células tenham se destacado, adicionar 10 mL de meio e centrifugar a 800 x g por 5 min. Ressuspender as células em 1,5 mL de meio.
    4. Adicionar o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA e os plasmídeos de DNA às células 293T e incubar a 37 °C por 30 min.
    5. Transferir para um balão T175 e adicionar 18 ml de meio. Incubar a 37 °C durante a noite.
    6. No dia seguinte, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro sem desprender as células. Substitua por 18 mL de meio fresco. Incubar a 37 °C durante a noite numa incubadora.
  3. Colheita do sobrenadante viral
    1. Retire o sobrenadante viral usando uma pipeta colocada no gelo. Centrifugar a 800 x g por 5 min para peletizar as células e detritos.
      NOTA: Se o pellet de células for grande, as células foram provavelmente interrompidas do frasco quando o sobrenadante foi removido. Estas células podem ser novamente plaqueadas em um novo frasco com meio fresco.
    2. Filtrar o sobrenadante viral usando um filtro de 0,22 μm.
    3. Use o sobrenadante viral imediatamente. Mantenha-o no gelo ou a 4 °C por até 24 h, ou congele-o a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

2. Expansão e transdução de células T humanas ativadas com luciferase

  1. Ativação de células T humanas in vitro
    1. Lavar as esferas adicionando 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM a um tubo estéril de 15 mL, adicionando esferas (uma conta para cada duas células T), colocando em um rack magnético por 2 min e aspirando o PBS.
    2. Preparar o meio conforme descrito na etapa 1.1.1, adicionar IL-2 a uma concentração final de 30 UI/mL e adicionar as esferas lavadas. Fazer 2,5 mL de meio para cada dois milhões de células T a serem ativadas.
    3. Conte as células T (recém-purificadas ou previamente purificadas, congeladas, descongeladas e lavadas) usando um hemocitômetro e coloração de azul de tripano. Adicionar células T ao meio preparado no passo 2.1.2 e inverter suavemente o tubo para misturar. As células T se expandirão pelo menos 20x, dependendo da fonte e da saúde geral das células. Determine o número de células T a serem ativadas calculando o número necessário para tratar os camundongos e dividindo por 20. Aqui, 20 x 106 células T por camundongo foram usadas com base em experimentos preliminares.
    4. Placa de 2,5 mL de meio contendo dois milhões de células T, contas e IL-2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Cultura a 37 °C em estufa umidificada a 5% CO2 .
    5. Examine as células T sob um microscópio de 20x todos os dias durante os próximos 3 dias para determinar quando transduzir com luciferase. As células estão prontas quando se amontoam e esgotam a mídia, transformando-a de vermelho/rosa para laranja claro.
  2. Preparação de placas de retronectina
    NOTA: A retronectina é usada para revestir as placas usadas na transdução, pois aumenta a transdução gênica15.
    1. Adicionar 2 mL de 20 μg/mL de retronectina em PBS a um poço de uma placa de 6 poços não tratada. Incubar durante 2 h a TR ou 1 h a 37 °C. Um poço revestido com retronectina é necessário para cada dois milhões de células T a serem transduzidas.
    2. Aspirar a retronectina sem riscar o fundo da placa.
    3. Adicionar 3 mL de BSA a 2% em PBS (filtrado estéril) por poço na placa de 6 poços. Incubar por 30 min no TR.
  3. Espinoculação
    1. Aspirar a BSA sem riscar o fundo da placa.
    2. Lave os poços uma vez com 3 mL de PBS por poço. Continue ou substitua por PBS fresco e deixe a placa coberta a 4 °C durante a noite.
    3. Adicionar 2 ml de sobrenadante viral CBR-TDR luciferase (recolhido no passo 1.3) por poço.
    4. Centrifugar a 1.240 x g por 90 min a 32 °C.
  4. Transdução
    1. Conte as células T.
    2. Aspirar o sobrenadante viral sem arranhar o fundo da placa.
    3. Placa de dois milhões de células T por poço em 6 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 30 UI/mL de IL-2 humana.
    4. Examine as células T diariamente. As células T estão prontas para serem expandidas quando estiverem quase confluentes, geralmente após 2 dias.
    5. Quando as células estiverem quase confluentes, lave-as suavemente do fundo da placa usando uma pipeta e transfira cada poço para um balão T75 separado. Adicionar 9 ml de meio para um total de 15 ml de meio por frasco.
    6. No dia seguinte, adicionar mais 15 mL de mídia. As células devem estar prontas para injetar em camundongos no dia seguinte a essa adição de meio. Confirme o sucesso da transdução realizando citometria de fluxo (a construção luciferase contém um fluoróforo de tomate TD visível no canal de PE)16.

3. Enxertia de células T transduzidas com luciferase em camundongos imunocomprometidos

  1. Preparar e contar as células T para injeção.
    1. Retire as células T dos frascos e conte. As células estão prontas para injetar quando tiverem expandido 20x-30x, geralmente no 7º dia pós-ativação.
    2. Centrifugar as células T a 800 x g por 5 min. Ressuspenda em 2 mL de mídia e remova as contas usando um rack magnético.
    3. Para experimentos em que as células T serão injetadas separadamente dos anticorpos biespecíficos, conte as células T e ressuspenda de modo que a concentração final seja de 20 milhões de células T por 100 μL de meio. Pule para a etapa 3.2. Para experiências que utilizem células T armadas ex vivo (EATs), avance para o passo 3.1.4.
    4. Para experimentos com células T armadas ex vivo , conte as células T e separe-as em tubos individuais de 1,5 mL para cada grupo, com 20 milhões de células por camundongo. Por exemplo, se houver três grupos de cinco camundongos cada, prepare três tubos de 1,5 mL com 100 milhões de células T cada.
    5. Centrifugar os tubos de 1,5 mL a 800 x g por 5 min. Remova o meio cuidadosamente sem perturbar o pellet de células T. Ressuspender em no máximo 50 μL de meios contendo os anticorpos biespecíficos. Incubar em TR por 30 min.
      NOTA: Para fins de experimentos conduzidos neste estudo, anticorpos patenteados IgG-[L]-scFv T cell-engaging biespecíficos gerados em laboratório foram usados. Para o armamento de células T, use 5 μg de anticorpo por 20 x 106 células T. Anticorpos biespecíficos comercialmente disponíveis também podem ser usados.
    6. Lave o excesso de anticorpos adicionando 1.450 μL de meio a cada tubo. Centrifugar a 800 x g por 5 min, aspirar cuidadosamente o meio e ressuspender a uma concentração de 20 milhões de células T armadas por meio de 100 μL.
  2. Injeção e enxertia em camundongos
    1. Anestesiar os camundongos em uma câmara que fornece 3,5% (v/v) de isoflurano inalado em 1 L/min de oxigênio. Os camundongos são totalmente anestesiados quando o reflexo de retirada do pedal do membro posterior desaparece.
      NOTA: Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento.
    2. Usando uma agulha de 26 G, injete 20 milhões de células T em 100 μL de meio retroorbitalmente por camundongo.
    3. Administrar 1.000 U de IL-2 recombinante por via subcutânea para apoiar a sobrevivência de células T in vivo.
    4. Administrar os anticorpos biespecíficos retroorbitalmente (no olho não utilizado para injeção de células T) ou intraperitonealmente. Permita que os ratos se recuperem da anestesia e retornem às suas gaiolas.
      NOTA: Novamente, aqui, anticorpos patenteados que foram gerados em laboratório foram usados, mas os anticorpos disponíveis comercialmente poderiam ser usados em vez disso. Nos experimentos, 0,3-10 μg de anticorpo por camundongo por dose foram administrados. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 3-4 semanas.

4. Imagem in vivo de camundongos enxertados com células T transduzidas por luciferase

NOTA: Esta etapa deve ser realizada no dia da aquisição de imagens, que não é necessariamente o mesmo dia em que as células T e/ou anticorpos são administrados aos camundongos. Tipicamente, realizamos exames de imagem 24 h após a administração das células T transduzidas pela luciferase.

  1. Preparação de D-luciferina
    1. Dissolver 1 g de D-luciferina em 33,3 mL de PBS estéril (concentração final: 30 mg/mL).
    2. Aliquot a D-luciferina dissolvida em tubos de microcentrífuga de 33 x 1,5 mL e mantenha os tubos a -20 °C.
    3. No dia da imagem, descongelar alíquotas suficientes de 30 mg/mL de D-luciferina para o número de animais a serem fotografados. Um tubo é suficiente para 10 animais.
      NOTA: Recongele a D-luciferina restante após o uso. A D-luciferina é estável por pelo menos cinco ciclos de congelamento/descongelamento.
  2. Administração de D-luciferina em camundongos
    NOTA: Antes de administrar D-luciferina aos ratos, abra o software de imagem e inicialize o sistema. A câmera pode levar vários minutos para esfriar, e isso deve ser feito antes que os camundongos sejam injetados com D-luciferina para garantir que a imagem possa ocorrer 5 minutos após a administração do substrato.
    1. Anestesiar até cinco camundongos em uma câmara que fornece isoflurano inalatório a 3,5% (v/v) em 1 L/min de oxigênio. Os camundongos são totalmente anestesiados quando o reflexo de retirada do pedal do membro posterior desaparece.
    2. Uma vez que os camundongos estejam totalmente anestesiados, administrar 100 μL de 30 mg/mL de D-luciferina por camundongo (3 mg por camundongo) por injeção retroorbital com uma agulha de 26 G. Imagine este grupo de camundongos antes de administrar D-luciferina ao próximo grupo. Coloque o próximo grupo de camundongos na câmara de isoflurano para ser anestesiado enquanto o grupo anterior está sendo fotografado.
  3. Imagem de células T transduzidas por luciferase
    1. Mover os camundongos anestesiados para a câmara estanque do imageador e continuar administrando isoflurano a 3% a 0,5 L/min. Coloque os ratos de lado de tal forma que o flanco que suporta o xenoenxerto esteja virado para cima em direção à câmera. Tire outro conjunto de imagens com os camundongos em posição supina para avaliar a presença de células T nos pulmões.
    2. Usando o Painel de Controle de Aquisição, selecione Luminescente, Fotografia e Sobreposição. Defina o tempo de exposição como automático, o binning como médio e F/Stop como 1. Adquirir imagens. Após a primeira imagem, defina o tempo de exposição para corresponder ao que foi calculado automaticamente para a primeira imagem para que as imagens subsequentes possam ser comparadas diretamente. Pode ser útil capturar imagens com vários tempos de exposição para determinar o tempo de exposição ideal para alcançar o sinal mais brilhante sem saturação de pixels.
    3. Retire os camundongos do isoflurano, retorne para suas gaiolas e observe até que estejam acordados e deambulando.
    4. Repita as etapas da etapa 4.2.1 até que todos os grupos tenham sido imageados.

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Representative Results

Como descrito na etapa 4.3, camundongos podem ser orientados em diferentes posições durante a aquisição de imagens para avaliar a presença de células T em diferentes tecidos. O posicionamento supino permite a avaliação das células T nos pulmões, o que é comum nos primeiros momentos após a injeção. O posicionamento lateral com o xenoenxerto subcutâneo virado para cima é usado para melhor avaliar o tráfego de células T para o tumor. Camundongos fêmeas C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac foram utilizados para todos os experimentos descritos neste manuscrito. A Figura 1 mostra imagens de um experimento em que camundongos portadores de xenoenxertos positivos para GD2 foram tratados com células T transduzidas por luciferase armadas ex vivo com um BsAb GD2 ou células T transduzidas por luciferase e BsAb GD2 injetado separadamente17. A Figura 1A mostra que as células T armadas trafegaram para o tumor mais rapidamente do que as células T desarmadas (Figura 1B), deixando os pulmões 2 dias mais cedo. A Figura 1C mostra a quantificação desse fenômeno. A Figura 1E-G mostra que é possível monitorar o tráfego de células T por pelo menos 28 dias após a injeção das células T transduzidas com luciferase, permitindo que os pesquisadores rastreiem o homing e a persistência das células T durante todo o curso do tratamento, ao contrário de outras técnicas, como a imunohistoquímica (IHQ), que permitem apenas um instantâneo da infiltração de células T.

Sem a capacidade de avaliar o tráfico de células T in vivo, os pesquisadores que testam T-BsAbs são incapazes de determinar se as células T estão ou não infiltrando e persistindo em tumores durante o tratamento. Se um tratamento falhar, sem sacrificar animais e realizar IHQ, pode ser difícil ou impossível saber se a falha foi devido à falta de tráfico de células T, persistência, exaustão de células T ou alguma outra causa. A Figura 2A-C mostra um experimento no qual camundongos portadores de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama foram tratados com células T humanas transduzidas com luciferase e BsAbs direcionados para HER2 com diferentes mutações para silenciar as funções Fc7. A Figura 2C mostra que o tratamento com o BsAb HER2 com um Fc não silenciado não teve efeito sobre o crescimento do tumor em comparação com um BsAb controle, enquanto o tratamento com BsAbs HER2 contendo uma mutação N297A isoladamente ou em combinação com uma mutação K322A foi capaz de interromper completamente o crescimento do tumor. A Figura 2A e a Figura 1B mostram que, nos grupos com as mutações silenciadoras, o sinal de luminescência das células T atingiu um pico mais alto no dia 3 pós-injeção e persistiu em um nível mais alto em comparação com o BsAb controle e o BsAb HER2 não silenciado. Experimentos de acompanhamento mostraram que, em camundongos tratados com células T e BsAbs com Fcs não silenciado, as células T em regiões perivasculares dos pulmões estavam cercadas por neutrófilos murinos e macrófagos, sugerindo um sequestro Fc-dependente das células T ligadas a BsAb, que impede a migração para o tumor. O efeito pró-tumorigênico de macrófagos M2 polarizados residentes em tumores tem sido bem descrito. A Figura 3A,B mostra que, em camundongos portadores de xenoenxertos derivados de pacientes com neuroblastoma (PDXs), a depleção de macrófagos Ly6c positivos aumenta significativamente o homing de células T para tumores, resultando em diminuição do crescimento tumoral e sobrevida prolongada (Figura 3C)18. Esse efeito é ainda mais pronunciado nos PDXs do osteossarcoma (Figura 3D).

In vivo O rastreamento de células T também permite que os pesquisadores monitorem como a cinética de tráfego de células T é afetada por outras variáveis na engenharia de anticorpos, incluindo a configuração estrutural. Como descrito na introdução deste artigo, trabalhos anteriores em nosso laboratório ressaltaram a importância da bivalência e da orientação cis dos braços de ligação de células T e tumorais para a eficácia in vivo de BsAbs. A Figura 4 mostra que, em um painel de BsAbs direcionado ao antígeno tumoral STEAP1 (Figura 4A), o formato IgG-[L]-scFv resultou em significativamente mais infiltração de células T no 6º dia após a primeira dose de células T, que persistiu durante todo o tratamento (Figura 4C)10. Esse fenômeno não foi previsto pelos ensaios de citotoxicidade in vitro (Figura 4B), enfatizando a importância da confirmação dos resultados in vitro em modelos in vivo.

Figure 1
Figura 1: As células T armadas exibem cinética de homing tumoral mais rápida do que as células T desarmadas direcionadas ao BsAb, ignorando rapidamente o sequestro pulmonar. Células T transduzidas por luciferase foram expandidas e armadas com BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Luc(+) GD2-EATs (10 μg de GD2-BsAb/2×10 7 células T) ou Luc(+) células T desarmadas (2 x 107 células) com ou sem GD2-BsAb (10 μg) foram administradas por via intravenosa em camundongos portadores de PDX com neuroblastoma GD2-positivo quando o volume tumoral médio atingiu 100 mm3. (A) Imagens de bioluminescência de GD2-EATs traficando tumores. (B) Imagens de bioluminescência de células T desarmadas dirigidas por GD2 BsAb em tumores ao longo de dias. (C) Quantificação da infiltração de células T em tumores ao longo do tempo, medida por bioluminescência (n = 5 camundongos/grupo) expressa em fluxo total ou radiância (fótons/s) por pixel integrado sobre o contorno tumoral (ROI). (D) Curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais tratados com GD2-EATs, GD2-BsAb mais células T desarmadas ou células T desarmadas. Para testar a persistência in vivo de EATs antígeno-específicos alvo, Luc(+) GD2-EATs (armados com 10 μg de GD2-BsAb/2×10 7 células T) ou Luc(+) HER2-EATs (10 μg de HER2-BsAb/2×107 células T) foram administrados por via intravenosa em camundongos portadores de osteossarcoma TEOS1C PDX. Duas doses adicionais de GD2-EATs ou HER2-EATs transduzidas sem luciferase foram administradas no dia 7 e no dia 14. (E) Quantificação da bioluminescência de Luc(+) EATs em tumores pós-tratamento. (F) Curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais tratados com GD2-EATs, HER2-EATs ou células T desarmadas, ou nenhum tratamento. (G) Imagens de bioluminescência de Luc(+) GD2-EATs (superior) ou Luc(+) HER2-EATs (inferior) em tumores ao longo do tempo. A bioluminescência dos EATs Luc(+) foi detectada ao longo de 28 dias após a injeção. Abreviaturas: EATs = células T armadas ex vivo; ROI = região de interesse. As barras de erro indicam o erro padrão da média. Esse valor foi modificado de Park et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Tráfico de células T para câncer de mama humano HER2-positivo PDX em camundongos DKO. (A) Imagens representativas de bioluminescência do tráfico de células T. (B) Quantificação do tráfego de células T para tumores ao longo do tempo por bioluminescência (n = 5 camundongos/grupo) expressa como fluxo total ou radiância (fótons/s) em cada pixel integrado ao longo de todo o contorno tumoral (ROI). (C) Crescimento PDX (M37) positivo para câncer de mama HER2 (n = 5 camundongos/grupo) após tratamento com Ctrl BsAb, HER2 BsAb e seus mutantes Fc. Os resultados apresentados são resultados representativos de pelo menos três experimentos independentes. As diferenças significativas foram calculadas com base na área sob a curva (AUC). As barras de erro indicam o erro padrão da média. Esse valor foi modificado de Wang et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Os efeitos da depleção de monócitos sobre o tráfego de células T direcionadas ao BsAb e a resposta antitumoral in vivo. (A) Células T transduzidas por luciferase (Luc(+) células T) ou células T GD2-BsAb transduzidas por luciferase (Luc(+) GD2-EATs) foram administradas com anticorpo anti-Ly6C aos camundongos portadores de um xenoenxerto derivado do paciente com neuroblastoma (PDX). (B) A bioluminescência nas lesões do tumor foi monitorada. As imagens de bioluminescência no dia 7 e quantificação da bioluminescência nas lesões do tumor. (C) A resposta antitumoral in vivo por GD2-EATs com anticorpo anti-Ly6C foi testada contra PDXs de neuroblastoma. (D) O efeito antitumoral in vivo de GD2-EATs com anticorpo anti-Ly6C foi testado contra PDXs de osteossarcoma, e a sobrevida a longo prazo foi analisada. As barras de erro indicam o erro padrão da média. O efeito antitumoral in vivo foi comparado pelas análises da AUC e da curva de sobrevida. Os linfócitos infiltrantes do tumor foram quantificados usando a AUC da bioluminescência. As diferenças entre as amostras indicadas na figura foram testadas quanto à significância estatística usando o teste t de Student bicaudal para dois conjuntos de dados e ANOVA one-way com teste post hoc de Tukey para três ou mais conjuntos de dados. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Esse valor foi modificado a partir de Park et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Atividades antitumorais do anticorpo biespecífico anti-STEAP1 T cell-engagement. (A) Representação esquemática dos seis formatos estruturais do STEAP1 BsAb. (B) Ensaio de citotoxicidade mediada por células T dependentes de anticorpos (ADTC) contra linhagens celulares de EFT (TC32 e TC71) usando diferentes formatos de STEAP1 BsAb. A relação entre células efetoras e alvo (ET) foi de 10:1. (C) Imagem por bioluminescência (BLI) de células T Luc(+) armadas com seis diferentes formatos de STEAP1 BsAb no (a) dia 6 e (b) dia 18 pós-tratamento e quantificação da intensidade da bioluminescência nas lesões do tumor. As células T transduzidas por luciferase (Luc(+) células T) foram armadas com vários formatos de STEAP1 BsAb (10 μg de STEAP1 BsAb/2 x 107 células T) e administradas com IL-2 suplementar (1.000 UI/dose) aos camundongos portadores de PDXs EFT (ES15a), e o BLIseguido. Abreviações: EFT = Ewing sarcoma família de tumores; PDXs = xenoenxertos tumorais derivados do paciente; STEAP = antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata. As barras de erro indicam o erro padrão da média. Os linfócitos infiltrantes do tumor foram quantificados calculando-se a área sob a curva de bioluminescência. As diferenças entre as amostras indicadas na figura foram testadas quanto à significância estatística usando ANOVA one-way com teste post hoc de Tukey. p < 0,0001. Esse valor foi modificado de Lin et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Enquanto o T-BsAb blinatumomab foi aprovado para neoplasias hematológicas CD19-positivas, a implementação bem-sucedida de T-BsAbs em tumores sólidos tem se mostrado muito mais difícil. O catumaxomabe, um T-BsAb dirigido contra a molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM), foi aprovado para o tratamento de ascite maligna em pacientes com câncer de ovário, mas a produção do fármaco foi posteriormente interrompida por razões comerciais19. Nenhum outro T-BsAbs foi aprovado para tumores sólidos, ressaltando os desafios associados a esse tipo de terapia. A toxicidade devido à síndrome de liberação de citocinas (SRC) é um problema comum, embora isso possa ser controlado com esteroides e inibidores de citocinas. Além da toxicidade, a falta de eficácia é comum em ensaios de T-BsAbs para tumores sólidos. A indução do tráfico de células T e da persistência no tumor tem se mostrado difícil, provavelmente devido a vários fatores imunossupressores naEMT14. No entanto, mesmo pré-clinicamente, muitas vezes não está claro por que um T-BsAb que tem um bom desempenho in vitro falha em tratar efetivamente tumores in vivo.

O método de rastreamento de células T in vivo em tempo real descrito neste artigo é útil aos pesquisadores por vários motivos. O monitoramento de células T fornece uma visão mecanicista sobre por que certos T-BsAbs têm sucesso ou falham, permitindo que os pesquisadores determinem quando o tráfico de células T começou e por quanto tempo as células T persistiram no tumor durante a terapia. O método pode ser repetido em vários pontos de tempo, permitindo que os pesquisadores plotem a cinética do homing de células T ao longo de várias semanas. (Resultados representativos na Figura 1 mostram que as células T persistem no tumor por pelo menos 28 dias.) A obtenção de imagens in vivo de células T transduzidas com luciferase também elimina a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento para avaliação histológica da infiltração de células T, reduzindo o custo global e o número de animais necessários por experimento. Como a imagem pode ser repetida quantas vezes forem necessárias, ela também permite uma avaliação muito mais fácil e completa da cinética de homing de células T em comparação com a análise histológica, que é essencialmente um instantâneo de um único ponto de tempo, a menos que vários animais sejam sacrificados em pontos de tempo diferentes.

A etapa mais crítica deste método é a transdução bem sucedida de células T com a construção luciferase. A transdução malsucedida pode levar à morte das células T ou à falta de sinal de luciferase in vivo. Se as células T não estiverem se expandindo como esperado após a transdução, pode ser possível reduzir o título viral com o qual são transduzidas, a fim de reduzir a toxicidade potencial do processo de transdução. Outra abordagem seria esperar mais um dia entre as etapas de expansão das células T para permitir que as células T se tornem mais confluentes antes de expandi-las para um vaso de cultura celular maior. Antes de injetar as células T nos camundongos, é uma boa ideia confirmar o sucesso da transdução usando citometria de fluxo (para verificar a expressão do repórter de tomate TD) ou um leitor de placa bioluminescente. Se as células T transduzidas ainda não forem visíveis com imagens bioluminescentes, pode ser possível que o número de células T seja muito baixo para detecção usando esta técnica. descrevem um método semelhante usando luciferase de vagalume aprimorada para detectar apenas 10 células T murinas, que pode ser implementado em situações que requerem esse nível de sensibilidade20.

Em resumo, o rastreamento in vivo de células T transduzidas por luciferase fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam T-BsAbs em modelos de câncer de camundongos imunocomprometidos. Além das aplicações discutidas acima, este método de rastreamento de células T tem sido aplicado a células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e pode ser ostensivamente aplicado a modelos singênicos de camundongos utilizando também células T transferidasadotivamente21. Esperamos que essa estratégia seja útil para pesquisadores que desenvolvem T-BsAbs translacionais e leve a um maior sucesso dessas terapias em pacientes com tumores sólidos.

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Disclosures

NKC relata ter recebido bolsas de pesquisa comercial da Y-mAbs Therapeutics. A NKC é a inventora e proprietária de patentes licenciadas pela MSK para Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand e Abpro-labs. A MSK e a NKC têm interesse financeiro na Y-mAbs. A NKC relata ter recebido opções de ações da Eureka Therapeutics. HFG e MEC não têm divulgações relevantes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Vladimir Ponomarev por compartilhar os construtos de luciferase usados nos experimentos descritos na seção de resultados representativos deste artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

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References

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  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

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Cancer Research anticorpos biespecíficos engagers de células T luciferase células T xenoenxertos
Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase
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Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

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