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Cancer Research

Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane con luciferasi per facilitare il monitoraggio in vivo del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici ai tumori in studi per valutare l'efficacia antitumorale e il meccanismo degli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T.

Abstract

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono in varie fasi di sviluppo preclinico e test clinici per i tumori solidi. Fattori come la valenza, la disposizione spaziale, la distanza interdominio e le mutazioni Fc influenzano l'efficacia antitumorale di queste terapie, comunemente influenzando l'homing delle cellule T nei tumori, che rimane una grande sfida. Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane attivate con luciferasi, consentendo il tracciamento in vivo delle cellule T durante gli studi di terapia T-BsAb. La capacità di T-BsAbs di reindirizzare le cellule T ai tumori può essere valutata quantitativamente in più punti temporali durante il trattamento, consentendo ai ricercatori di correlare l'efficacia antitumorale di T-BsAbs e altri interventi con la persistenza delle cellule T nei tumori. Questo metodo allevia la necessità di sacrificare gli animali durante il trattamento per valutare istologicamente l'infiltrazione delle cellule T e può essere ripetuto in più punti temporali per determinare la cinetica del traffico di cellule T durante e dopo il trattamento.

Introduction

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono anticorpi ingegnerizzati utilizzati per fornire specificità artificiale alle cellule T policlonali coinvolgendo le cellule T attraverso un braccio legante e un antigene tumorale attraverso un altro braccio legante. Questa tecnologia è stata applicata con successo ai tumori ematologici (CD19-targeting blinatumomab1), e numerosi T-BsAb sono in fase di sviluppo preclinico e clinico per una varietà di tumori solidi così come2. I T-BsAb coinvolgono le cellule T policlonali in modo indipendente dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), e quindi anche i tumori che sottoregolano gli antigeni dei leucociti umani (HLA) sono suscettibili a questo tipo di terapia 3,4. I T-BsAb sono stati sviluppati in dozzine di formati diversi, con differenze nella valenza e nella disposizione spaziale delle cellule T e dei bracci leganti il tumore, le distanze interdomini e l'inclusione di un dominio Fc, che influenza l'emivita e può indurre funzioni effettrici se presente5. Precedenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che questi fattori influenzano significativamente l'efficacia antitumorale di T-BsAbs, con differenze fino a 1.000 volte nella potenza6. Attraverso questo lavoro, abbiamo identificato il formato IgG-[L]-scFv come la piattaforma ideale per T-BsAbs (vedere la sezione Risultati rappresentativi per maggiori dettagli sui formati T-BsAb) e abbiamo applicato questa piattaforma a target tra cui GD2 (neuroblastoma), HER2 (cancro al seno e osteosarcoma), GPA33 (cancro del colon-retto), STEAP1 (sarcoma di Ewing), CD19 (tumori maligni delle cellule B) e CD33 (tumori maligni delle cellule B)7, 8,9,10,11,12,13.

Una delle principali sfide per implementare con successo la terapia T-BsAb nei tumori solidi è superare un microambiente tumorale immunosoppressivo (TME) per guidare il traffico di cellule T verso i tumori14. I fattori che influenzano l'efficacia di T-BsAb sopra descritti hanno un impatto significativo sulla capacità di T-BsAbs di indurre efficacemente l'homing delle cellule T ai tumori, ma questo effetto è difficile da valutare in un sistema in vivo in tempo reale. Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata dell'uso delle cellule T trasdotte dalla luciferasi negli studi preclinici di T-BsAbs per valutare il traffico di cellule T verso vari tessuti in modelli murini immunocompromessi sperimentali durante il trattamento. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un mezzo per valutare l'infiltrazione delle cellule T nei tumori e in altri tessuti, nonché una visione in tempo reale della cinetica e della persistenza delle cellule T, senza la necessità di sacrificare animali durante il trattamento. Per il crescente numero di ricercatori che si concentrano sulle immunoterapie cellulari, la capacità di tracciare le cellule T in vivo in modelli animali preclinici è fondamentale. Miriamo a fornire una descrizione completa e dettagliata del metodo che abbiamo impiegato per tracciare le cellule T trasdotte dalla luciferasi per consentire ad altri ricercatori di replicare facilmente questa tecnica.

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Protocol

Le seguenti procedure sono state valutate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Memorial Sloan Kettering.

1. Trasfezione di cellule 293T con luciferasi e prelievo di surnatante virale

  1. Coltura di cellule 293T
    1. Preparare i terreni aggiungendo quanto segue a un litro di DMEM ciascuno: 110 ml di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 11 ml di penicillina-streptomicina.
    2. Scongelare 5 x 106 293T e trasferirle in un matraccio T175 con i mezzi preparati come descritto sopra.
    3. Dividere le celle 293T 1:10 ogni 3 giorni per 6 giorni. Non permettere alle cellule di diventare più del 90% confluenti.
  2. Trasfezione di cellule 293T
    NOTA: Le seguenti quantità di reagenti sono calcolate per trasfettare un matraccio T175 di cellule 293T. Regolare di conseguenza se devono essere trasdotti più palloni.
    1. Trasferire 1,5 mL di fluido in ciascuna delle due provette da 50 mL utilizzando una pipetta. A una provetta, aggiungere 10 μg di plasmide VSV-G, 20 μg di Gag/pol e 20 μg di plasmide luciferasi, pomodoro rosso coleottero click beetle (CBR-TDR) e mescolare. All'altra provetta, aggiungere 100 μL di reagente di trasfezione in vitro del DNA e mescolare. Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti.
      NOTA: Tutti i plasmidi descritti in questo manoscritto sono stati forniti dal Dr. Vladimir Ponomarev.
    2. Trasferire il mezzo contenente il reagente di trasfezione in vitro del DNA goccia a goccia sulla provetta contenente i plasmidi del DNA (oltre circa 30 s) e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a RT per 20 min.
    3. Durante questa incubazione di 20 minuti, staccare le cellule 293T aggiungendo 5-10 ml di tripsina allo 0,05%. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 ml di fluido e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 1,5 ml di supporto.
    4. Aggiungere i terreni contenenti il reagente di trasfezione in vitro del DNA e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 °C per 30 minuti.
    5. Trasferire in un matraccio T175 e aggiungere 18 mL di supporto. Incubare a 37 °C durante la notte.
    6. Il giorno dopo, aspirare con cura il supporto con una pipetta di vetro senza staccare le celle. Sostituire con 18 mL di terreno fresco. Incubare a 37 °C durante la notte in un'incubatrice.
  3. Raccolta di supernatante virale
    1. Rimuovere il surnatante virale usando una pipetta messa sul ghiaccio. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti per pellettare le cellule e i detriti.
      NOTA: Se il pellet cellulare è grande, le cellule sono state probabilmente interrotte dal pallone quando il surnatante è stato rimosso. Queste celle possono essere nuovamente placcate in un nuovo pallone con terreni freschi.
    2. Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 μm.
    3. Utilizzare immediatamente il surnatante virale. Conservalo su ghiaccio o a 4 °C per un massimo di 24 ore o congelalo a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

2. Espansione e trasduzione di cellule T umane attivate con luciferasi

  1. Attivazione di cellule T umane in vitro
    1. Lavare le perle aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in un tubo sterile da 15 ml, aggiungendo perline (una perla per due cellule T), mettendo in un rack magnetico per 2 minuti e aspirando il PBS.
    2. Preparare i terreni come descritto al punto 1.1.1, quindi aggiungere IL-2 ad una concentrazione finale di 30 UI/ml e aggiungere le perle lavate. Crea 2,5 ml di media per ogni due milioni di cellule T da attivare.
    3. Contare le cellule T (appena purificate o precedentemente purificate, congelate, scongelate e lavate) utilizzando un emocitometro e una macchia blu tripano. Aggiungere le cellule T al mezzo preparato al punto 2.1.2 e capovolgere delicatamente il tubo per miscelare. Le cellule T si espanderanno almeno 20 volte a seconda della fonte e della salute generale delle cellule. Determinare il numero di cellule T da attivare calcolando il numero necessario per trattare i topi e dividendo per 20. Qui, sono state utilizzate 20 x 106 cellule T per topo sulla base di esperimenti preliminari.
    4. Piastra 2,5 ml di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2 .
    5. Esaminare le cellule T al microscopio 20x ogni giorno per i prossimi 3 giorni per determinare quando trasdurre con luciferasi. Le cellule sono pronte quando si aggregano e impoveriscono il supporto, trasformandolo da rosso / rosa ad arancione chiaro.
  2. Preparazione di piastre retronectina
    NOTA: La retronectina viene utilizzata per rivestire le piastre utilizzate nella trasduzione in quanto migliora la trasduzione genica15.
    1. Aggiungere 2 mL di 20 μg/mL di retronectina in PBS in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti non trattata. Incubare per 2 ore a RT o 1 ora a 37 °C. È necessario un pozzetto rivestito di retronectina per ogni due milioni di cellule T da trasdurre.
    2. Aspirare la retronectina senza graffiare il fondo della piastra.
    3. Aggiungere 3 ml di BSA al 2% in PBS (filtrato sterile) per pozzetto nella piastra a 6 pozzetti. Incubare per 30 minuti a RT.
  3. Spinoculazione
    1. Aspirare il BSA senza graffiare il fondo della piastra.
    2. Lavare i pozzetti una volta con 3 ml di PBS per pozzetto. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a 4 °C per una notte.
    3. Aggiungere 2 ml di surnatante virale CBR-TDR luciferasi (raccolto nella fase 1.3) per pozzetto.
    4. Centrifugare a 1.240 x g per 90 minuti a 32 °C.
  4. Trasduzione
    1. Conta le cellule T.
    2. Aspirare il surnatante virale senza graffiare il fondo del piatto.
    3. Placcare due milioni di cellule T per pozzetto in 6 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 30 UI/mL di IL-2 umana.
    4. Esaminare le cellule T ogni giorno. Le cellule T sono pronte per essere espanse quando sono quasi confluenti, di solito dopo 2 giorni.
    5. Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra usando una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un matraccio T75 separato. Aggiungere 9 mL di supporto per un totale di 15 mL di supporto per pallone.
    6. Il giorno successivo, aggiungere altri 15 ml di supporto. Le cellule dovrebbero essere pronte per l'iniezione nei topi il giorno dopo questa aggiunta di media. Confermare la corretta trasduzione eseguendo la citometria a flusso (il costrutto di luciferasi contiene un fluoroforo di pomodoro TD visibile nel canale PE)16.

3. Attecchimento di cellule T trasdotte dalla luciferasi in topi immunocompromessi

  1. Preparare e contare le cellule T per l'iniezione.
    1. Rimuovere le cellule T dai palloni e contare. Le cellule sono pronte per l'iniezione quando si sono espanse 20x-30x, di solito entro il giorno 7 dopo l'attivazione.
    2. Centrifugare le cellule T a 800 x g per 5 minuti. Risospendere in 2 ml di supporto e rimuovere le perline utilizzando un rack magnetico.
    3. Per gli esperimenti in cui le cellule T saranno iniettate separatamente dagli anticorpi bispecifici, contare le cellule T e risospendere in modo che la concentrazione finale sia di 20 milioni di cellule T per 100 μL di mezzo. Andare al passaggio 3.2. Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo (EAT), andare al punto 3.1.4.
    4. Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo , contare le cellule T e separarle in singoli tubi da 1,5 ml per ciascun gruppo, con 20 milioni di cellule per topo. Ad esempio, se ci sono tre gruppi di cinque topi ciascuno, preparare tre tubi da 1,5 ml con 100 milioni di cellule T ciascuno.
    5. Centrifugare i tubi da 1,5 mL a 800 x g per 5 minuti. Rimuovere accuratamente il supporto senza disturbare il pellet di cellule T. Risospendere in non più di 50 μL di terreno contenente gli anticorpi bispecifici. Incubare a RT per 30 min.
      NOTA: Ai fini degli esperimenti condotti in questo studio, sono stati utilizzati anticorpi bispecifici proprietari IgG-[L]-scFv che coinvolgono le cellule T generati in laboratorio. Per l'armamento delle cellule T, utilizzare 5 μg di anticorpi per 20 x 106 cellule T. Potrebbero essere utilizzati anche anticorpi bispecifici disponibili in commercio.
    6. Lavare via gli anticorpi in eccesso aggiungendo 1.450 μL di fluido a ciascuna provetta. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti, aspirare accuratamente il fluido e risospendere ad una concentrazione di 20 milioni di cellule T armate per 100 μL di media.
  2. Iniezione e attecchimento nei topi
    1. Anestetizzare i topi in una camera che fornisce il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi sono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.
      NOTA: Fornire supporto termico durante tutta la procedura.
    2. Utilizzando un ago da 26 G, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 μL di terreno retroorbitalmente per topo.
    3. Somministrare 1.000 U ricombinante IL-2 per via sottocutanea per sostenere la sopravvivenza delle cellule T in vivo.
    4. Somministrare gli anticorpi bispecifici retroorbitalmente (nell'occhio non utilizzati per l'iniezione di cellule T) o intraperitonealmente. Consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia e tornare alle loro gabbie.
      NOTA: Ancora una volta, qui, sono stati utilizzati anticorpi proprietari generati in laboratorio, ma potrebbero essere utilizzati anticorpi disponibili in commercio. Negli esperimenti qui, sono stati somministrati 0,3-10 μg di anticorpi per topo per dose. Gli anticorpi sono stati somministrati due volte a settimana per 3-4 settimane.

4. Imaging in vivo di topi innestati con cellule T trasdotte da luciferasi

NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno dell'imaging, che non è necessariamente lo stesso giorno in cui le cellule T e / o gli anticorpi vengono somministrati ai topi. Tipicamente, eseguiamo l'imaging 24 ore dopo la somministrazione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi.

  1. Preparazione di D-luciferina
    1. Sciogliere 1 g di D-luciferina in 33,3 mL di PBS sterile (concentrazione finale: 30 mg/ml).
    2. Aliquot la D-luciferina disciolta in provette da microcentrifuga da 33 x 1,5 mL e mantenere le provette a -20 °C.
    3. Il giorno dell'imaging, scongelare aliquote sufficienti di 30 mg / mL di D-luciferina per il numero di animali da fotografare. Un tubo è sufficiente per 10 animali.
      NOTA: Ricongelare la D-luciferina rimanente dopo l'uso. La D-luciferina è stabile per almeno cinque cicli di congelamento/scongelamento.
  2. Somministrazione di D-luciferina ai topi
    NOTA: Prima di somministrare D-luciferina ai topi, aprire il software di imaging e inizializzare il sistema. La fotocamera può richiedere diversi minuti per raffreddarsi, e questo dovrebbe essere fatto prima che i topi vengano iniettati con D-luciferina per garantire che l'imaging possa avvenire 5 minuti dopo la somministrazione del substrato.
    1. Anestetizzare fino a cinque topi in una camera che forniscono il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi sono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.
    2. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, somministrare 100 μL di 30 mg/mL di D-luciferina per topo (3 mg per topo) mediante iniezione retroorbitale con un ago da 26 G. Immagina questo gruppo di topi prima di somministrare D-luciferina al gruppo successivo. Posizionare il gruppo successivo di topi nella camera di isoflurano da anestetizzare mentre viene visualizzata l'immagine del gruppo precedente.
  3. Imaging delle cellule T trasdotte dalla luciferasi
    1. Spostare i topi anestetizzati nella camera a tenuta di luce dell'imager e continuare a somministrare isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Posizionare i topi sui fianchi in modo tale che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la fotocamera. Prendi un'altra serie di immagini con i topi in posizione supina per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.
    2. Utilizzando il Pannello di controllo acquisizione, selezionate Luminescente, Fotografia e Sovrapposizione. Impostare il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e F/Stop su 1. Acquisire immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Può essere utile acquisire immagini con più tempi di esposizione per determinare il tempo di esposizione ottimale per ottenere il segnale più luminoso senza saturazione di pixel.
    3. Rimuovere i topi dall'isoflurano, tornare alle loro gabbie e osservare fino a quando non sono svegli e deambulanti.
    4. Ripetere i passaggi dal passaggio 4.2.1 fino a quando non è stata creata la visualizzazione di tutti i gruppi.

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Representative Results

Come descritto nella fase 4.3, i topi possono essere orientati in diverse posizioni durante l'imaging per valutare la presenza di cellule T in diversi tessuti. Il posizionamento supino consente la valutazione delle cellule T nei polmoni, che è comune nei primi punti temporali dopo l'iniezione. Il posizionamento laterale con lo xenotrapianto sottocutaneo rivolto verso l'alto viene utilizzato per valutare al meglio il traffico di cellule T verso il tumore. Topi femmina C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto. La figura 1 mostra le immagini di un esperimento in cui topi portatori di xenotrapianti GD2-positivi sono stati trattati con cellule T trasdotte da luciferasi armate ex vivo con un BsAb GD2 o cellule T trasdotte da luciferasi e GD2 BsAb iniettati separatamente17. La Figura 1A mostra che le cellule T armate trafficano verso il tumore più velocemente delle cellule T disarmate (Figura 1B), lasciando i polmoni 2 giorni prima. La figura 1C mostra la quantificazione di questo fenomeno. La figura 1E-G mostra che è possibile monitorare il traffico delle cellule T per almeno 28 giorni dopo l'iniezione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi, consentendo ai ricercatori di tracciare l'homing e la persistenza delle cellule T durante il corso del trattamento, a differenza di altre tecniche come l'immunoistochimica (IHC) che consentono solo un'istantanea dell'infiltrazione delle cellule T.

Senza la capacità di valutare il traffico di cellule T in vivo, i ricercatori che testano T-BsAbs non sono in grado di determinare se le cellule T si infiltrano e persistono nei tumori durante il trattamento. Se un trattamento fallisce, senza sacrificare gli animali ed eseguire IHC, può essere difficile o impossibile sapere se il fallimento è dovuto a una mancanza di traffico di cellule T, persistenza, esaurimento delle cellule T o qualche altra causa. La Figura 2A-C mostra un esperimento in cui topi portatori di xenotrapianti derivati da pazienti affetti da cancro al seno sono stati trattati con cellule T umane trasdotte da luciferasi e BsAb mirati a HER2 portatori di mutazioni diverse per silenziare le funzioni Fc7. La Figura 2C mostra che il trattamento con HER2 BsAb con una Fc non silenziata non ha avuto alcun effetto sulla crescita tumorale rispetto a un BsAb di controllo, mentre il trattamento con HER2 BsAbs contenente una mutazione N297A da solo o in combinazione con una mutazione K322A è stato in grado di arrestare completamente la crescita tumorale. La Figura 2A e la Figura 1B mostrano che nei gruppi con mutazioni silenzianti, il segnale di luminescenza delle cellule T ha raggiunto un picco più alto il giorno 3 post-iniezione e persisteva a un livello più alto rispetto al BsAb di controllo e al BsAb HER2 non silenziato. Gli esperimenti di follow-up hanno mostrato che nei topi trattati con cellule T e BsAb con Fc non silenziate, le cellule T nelle regioni perivascolari dei polmoni erano circondate da neutrofili murini e macrofagi, suggerendo un sequestro Fc-dipendente delle cellule T legate a BsAb che impedisce la migrazione al tumore. L'effetto pro-tumorigenico dei macrofagi M2-polarizzati residenti nel tumore è stato ben descritto. La Figura 3A,B mostra che nei topi portatori di xenotrapianti derivati da pazienti affetti da neuroblastoma (PDX), la deplezione di macrofagi Ly6c-positivi aumenta significativamente l'homing delle cellule T verso i tumori, con conseguente diminuzione della crescita tumorale e sopravvivenza prolungata (Figura 3C)18. Questo effetto è ancora più pronunciato nei PDX dell'osteosarcoma (Figura 3D).

In vivo Il monitoraggio delle cellule T consente inoltre ai ricercatori di monitorare il modo in cui la cinetica del traffico delle cellule T è influenzata da altre variabili nell'ingegneria degli anticorpi, inclusa la configurazione strutturale. Come descritto nell'introduzione di questo articolo, precedenti lavori nel nostro laboratorio hanno sottolineato l'importanza della bivalenza e dell'orientamento cis dei bracci leganti il tumore e le cellule T per l'efficacia in vivo di BsAbs. La Figura 4 mostra che tra un pannello di BsAb mirati all'antigene tumorale STEAP1 (Figura 4A), il formato IgG-[L]-scFv ha provocato un'infiltrazione di cellule T significativamente maggiore il giorno 6 dopo la prima dose di cellule T, che è persistita per tutta la durata del trattamento (Figura 4C)10. Questo fenomeno non è stato previsto dai saggi di citotossicità in vitro (Figura 4B), sottolineando l'importanza di confermare i risultati in vitro in modelli in vivo.

Figure 1
Figura 1: Le cellule T armate mostrano una cinetica di homing tumorale più veloce rispetto alle cellule T disarmate dirette da BsAb, bypassando rapidamente il sequestro polmonare. Le cellule T trasdotte dalla luciferasi sono state espanse e armate con BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Luc(+) GD2-EAT (10 μg di cellule T GD2-BsAb/2×10 7) o Luc(+) non armate (2 x 107 cellule) con o senza GD2-BsAb (10 μg) sono stati somministrati per via endovenosa in topi portatori di PDX con neuroblastoma GD2-positivo quando il volume medio del tumore ha raggiunto 100 mm3. (A) Immagini a bioluminescenza del traffico di GD2-EAT nei tumori. (B) Immagini di bioluminescenza del traffico di cellule T disarmate diretto da GD2 BsAb nei tumori per giorni. (C) Quantificazione dell'infiltrazione delle cellule T nei tumori nel tempo misurata dalla bioluminescenza (n = 5 topi / gruppo) espressa come flusso totale o radianza (fotoni / s) per pixel integrato sul contorno tumorale (ROI). (D) Curve di crescita tumorale di singoli topi trattati con GD2-EATs, GD2-BsAb più cellule T disarmate o cellule T non armate. Per testare la persistenza in vivo di EAT specifici dell'antigene bersaglio, Luc(+) GD2-EAT (armati con 10 μg di cellule GD2-BsAb/2×10 7 T) o Luc(+) HER2-EAT (10 μg di cellule HER2-BsAb/2×107 T) sono stati somministrati per via endovenosa in topi portatori di TEOS1C PDX con osteosarcoma. Due dosi aggiuntive di GD2-EAT o HER2-EAT trasdotte non-luciferasi sono state somministrate il giorno 7 e il giorno 14. (E) Quantificazione della bioluminescenza di Luc(+) EATs nei tumori post-trattamento. (F) Curve di crescita tumorale di singoli topi trattati con GD2-EATs, HER2-EATs, o cellule T disarmate, o nessun trattamento. (G) Immagini a bioluminescenza di Luc (+) GD2-EAT (superiore) o Luc(+) HER2-EAT (inferiore) nei tumori nel tempo. La bioluminescenza degli EAT Luc(+) è stata rilevata 28 giorni dopo l'iniezione. Abbreviazioni: EAT = cellule T armate ex vivo; ROI = regione di interesse. Le barre di errore indicano l'errore standard della media. Questa cifra è stata modificata da Park et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Traffico di cellule T nel carcinoma mammario umano PDX HER2-positivo in topi DKO. (A) Immagini rappresentative di bioluminescenza del traffico di cellule T. (B) Quantificazione del traffico di cellule T nei tumori nel tempo mediante bioluminescenza (n = 5 topi / gruppo) espressa come flusso totale o radianza (fotoni / s) in ciascun pixel integrato sull'intero contorno tumorale (ROI). (C) Crescita del carcinoma mammario HER2-positivo PDX (M37) (n = 5 topi/gruppo) dopo trattamento con Ctrl BsAb, HER2 BsAb e i suoi mutanti Fc. I risultati mostrati sono risultati rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. Le differenze significative sono state calcolate in base all'area sotto la curva (AUC). Le barre di errore indicano l'errore standard della media. Questa cifra è stata modificata da Wang et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Gli effetti della deplezione dei monociti sul traffico diretto delle cellule T di BsAb e sulla risposta antitumorale in vivo. (A) Le cellule T trasdotte dalla luciferasi (cellule T Luc(+) o le cellule T armate GD2-BsAb trasdotte dalla luciferasi (Luc(+) GD2-EATs) sono state somministrate con anticorpi anti-Ly6C ai topi portatori di uno xenotrapianto derivato dal paziente neuroblastoma (PDX). (B) È stata monitorata la bioluminescenza nelle lesioni del tumore. Le immagini di bioluminescenza del giorno 7 e quantificazione della bioluminescenza nelle lesioni del tumore. (C) La risposta antitumorale in vivo da parte di GD2-EAT con anticorpi anti-Ly6C è stata testata contro i PDX del neuroblastoma. (D) L'effetto antitumorale in vivo dei GD2-EAT con anticorpo anti-Ly6C è stato testato contro i PDX dell'osteosarcoma ed è stata analizzata la sopravvivenza a lungo termine. Le barre di errore indicano l'errore standard della media. L'effetto antitumorale in vivo è stato confrontato mediante analisi dell'AUC e della curva di sopravvivenza. I linfociti infiltranti il tumore sono stati quantificati utilizzando l'AUC della bioluminescenza. Le differenze tra i campioni indicati nella figura sono state testate per la significatività statistica utilizzando un t-test di Student a due code per due serie di dati e ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey per tre o più set di dati. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da Park et al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Attività antitumorale dell'anticorpo bispecifico anti-STEAP1 che coinvolge le cellule T. (A) Rappresentazione schematica dei sei formati strutturali di STEAP1 BsAb. (B) Saggio di citotossicità mediata da cellule T anticorpo-dipendenti (ADTC) contro linee cellulari EFT (TC32 e TC71) utilizzando diversi formati di STEAP1 BsAb. Il rapporto tra effettore e cellula bersaglio (ET) era di 10:1. (C) Bioluminescenza (BLI) di cellule T Luc(+) armate con sei diversi formati di STEAP1 BsAb in (a) giorno 6 e (b) giorno 18 post-trattamento e quantificazione dell'intensità della bioluminescenza nelle lesioni del tumore. Le cellule T trasdotte con luciferasi (cellule T Luc(+) sono state armate con vari formati di STEAP1 BsAb (10 μg di cellule STEAP1 BsAb/2 x 107 T) e somministrate con IL-2 supplementare (1.000 UI/dose) ai topi portatori di EFT PDX (ES15a) e il BLIfollowed. Abbreviazioni: EFT = famiglia di tumori del sarcoma di Ewing; PDX = xenotrapianti tumorali derivati dal paziente; STEAP = antigene epiteliale a sei transmembrane della prostata. Le barre di errore indicano l'errore standard della media. I linfociti infiltranti il tumore sono stati quantificati calcolando l'area sotto la curva della bioluminescenza. Le differenze tra i campioni indicati nella figura sono state testate per la significatività statistica utilizzando ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey. p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da Lin et al.10. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Mentre il T-BsAb blinatumomab è stato approvato per le neoplasie ematologiche CD19-positive, l'implementazione di successo di T-BsAbs nei tumori solidi si è dimostrata molto più difficile. Catumaxomab, un T-BsAb diretto contro la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EPCAM), è stato approvato per il trattamento dell'ascite maligna in pazienti con cancro ovarico, ma la produzione del farmaco è stata successivamente interrotta per motivi commerciali19. Nessun altro T-BsAbs è stato approvato per i tumori solidi, sottolineando le sfide associate a questo tipo di terapia. La tossicità dovuta alla sindrome da rilascio di citochine (CRS) è un problema comune, sebbene questo possa essere gestito con steroidi e inibitori delle citochine. Oltre alla tossicità, una mancanza di efficacia è comune negli studi di T-BsAbs per i tumori solidi. L'induzione del traffico delle cellule T e la persistenza nel tumore si sono dimostrati difficili, probabilmente a causa di vari fattori immunosoppressori nella TME14. Tuttavia, anche preclinicamente, spesso non è chiaro perché un T-BsAb che funziona bene in vitro non riesce a trattare efficacemente i tumori in vivo.

Il metodo per tracciare le cellule T in vivo in tempo reale descritto in questo articolo è utile ai ricercatori per diversi motivi. Il monitoraggio dell'homing delle cellule T fornisce informazioni meccanicistiche sul perché alcuni T-BsAb hanno successo o falliscono consentendo ai ricercatori di determinare quando il traffico delle cellule T è iniziato e per quanto tempo le cellule T hanno persistito nel tumore durante la terapia. Il metodo può essere ripetuto in più punti temporali, consentendo ai ricercatori di tracciare la cinetica dell'homing delle cellule T nel corso di diverse settimane. (I risultati rappresentativi nella Figura 1 mostrano che le cellule T persistono nel tumore per almeno 28 giorni.) L'imaging in vivo delle cellule T trasdotte dalla luciferasi elimina anche la necessità di sacrificare animali durante il trattamento per la valutazione istologica dell'infiltrazione delle cellule T, riducendo il costo complessivo e il numero di animali necessari per esperimento. Poiché l'imaging può essere ripetuto tutte le volte che è necessario, consente anche una valutazione molto più semplice e approfondita della cinetica di homing delle cellule T rispetto all'analisi istologica, che è essenzialmente un'istantanea di un singolo punto temporale a meno che più animali non vengano sacrificati in diversi punti temporali.

Il passo più critico di questo metodo è la trasduzione riuscita delle cellule T con il costrutto luciferasi. La trasduzione non riuscita può portare alla morte delle cellule T o alla mancanza di segnale della luciferasi in vivo. Se le cellule T non si espandono come previsto dopo la trasduzione, potrebbe essere possibile ridurre il titolo virale con cui vengono trasdotte al fine di ridurre la potenziale tossicità del processo di trasduzione. Un altro approccio sarebbe quello di attendere un altro giorno tra le fasi di espansione delle cellule T per consentire alle cellule T di diventare più confluenti prima di espanderle in un vaso di coltura cellulare più grande. Prima di iniettare le cellule T nei topi, è una buona idea confermare il successo della trasduzione usando la citometria a flusso (per verificare l'espressione del reporter di pomodoro TD) o un lettore di piastre bioluminescenti. Se le cellule T trasdotte non sono ancora visibili con l'imaging bioluminescente, potrebbe essere possibile che il numero di cellule T sia troppo basso per il rilevamento utilizzando questa tecnica. Rabinovich et al. descrivono un metodo simile che utilizza la luciferasi potenziata della lucciola per rilevare un minimo di 10 cellule T murine, che possono essere implementate in situazioni che richiedono questo livello di sensibilità20.

In sintesi, il monitoraggio in vivo delle cellule T trasdotte dalla luciferasi fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano T-BsAbs in modelli murini immunocompromessi di cancro. Oltre alle applicazioni discusse sopra, questo metodo di tracciamento delle cellule T è stato applicato alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e potrebbe apparentemente essere applicato a modelli murini singeneici che utilizzano anche cellule T trasferite adottivamente21. Speriamo che questa strategia sia utile ai ricercatori che sviluppano T-BsAbs traslazionali e porterà ad un maggiore successo di queste terapie nei pazienti con tumori solidi.

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Disclosures

NKC riferisce di aver ricevuto borse di ricerca commerciali da Y-mAbs Therapeutics. NKC è l'inventore e proprietario di brevetti rilasciati concessi in licenza da MSK a Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand e Abpro-labs. MSK e NKC hanno interessi finanziari in Y-mAbs. NKC riferisce di aver ricevuto stock option da Eureka Therapeutics. HFG e MEC non hanno divulgazioni pertinenti.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Vladimir Ponomarev per aver condiviso i costrutti di luciferasi utilizzati negli esperimenti descritti nella sezione dei risultati rappresentativi di questo articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

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References

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  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

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Ricerca sul cancro numero 195 anticorpi bispecifici engager delle cellule T luciferasi cellule T xenotrapianti
Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi
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Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

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