Summary
Hier beschrijven we een methode voor het transduceren van menselijke T-cellen met luciferase om in vivo tracking van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel naar tumoren in studies te vergemakkelijken om de anti-tumor werkzaamheid en het mechanisme van T-cel-engaging bispecifieke antilichamen te evalueren.
Abstract
T-cel-engaging bispecifieke antilichamen (T-BsAbs) bevinden zich in verschillende stadia van preklinische ontwikkeling en klinische testen voor solide tumoren. Factoren zoals valentie, ruimtelijke ordening, interdomeinafstand en Fc-mutaties beïnvloeden de anti-tumor werkzaamheid van deze therapieën, meestal door de homing van T-cellen naar tumoren te beïnvloeden, wat een grote uitdaging blijft. Hier beschrijven we een methode om geactiveerde menselijke T-cellen te transduceren met luciferase, waardoor in vivo tracking van T-cellen tijdens T-BsAb-therapiestudies mogelijk is. Het vermogen van T-BsAbs om T-cellen om te leiden naar tumoren kan kwantitatief worden geëvalueerd op meerdere tijdstippen tijdens de behandeling, waardoor onderzoekers de anti-tumor werkzaamheid van T-BsAbs en andere interventies kunnen correleren met de persistentie van T-cellen in tumoren. Deze methode verlicht de noodzaak om dieren tijdens de behandeling op te offeren om T-celinfiltratie histologisch te beoordelen en kan op meerdere tijdstippen worden herhaald om de kinetiek van T-celhandel tijdens en na de behandeling te bepalen.
Introduction
T-cel-engaging bispecifieke antilichamen (T-BsAbs) zijn gemanipuleerde antilichamen die worden gebruikt om kunstmatige specificiteit te bieden aan polyklonale T-cellen door T-cellen aan te spreken via de ene bindingsarm en een tumorantigeen via een andere bindingsarm. Deze technologie is met succes toegepast op hematologische kankers (CD19-targeting blinatumomab1), en talrijke T-BsAbs zijn in preklinische en klinische ontwikkeling voor een verscheidenheid aan solide tumoren en2. T-BsAbs betrekken polyklonale T-cellen op een belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) -onafhankelijke manier, en daarom zijn zelfs tumoren die menselijke leukocytenantigenen (HLA's) downreguleren vatbaar voor dit type therapie 3,4. T-BsAbs zijn ontwikkeld in tientallen verschillende formaten, met verschillen in de valentie en ruimtelijke rangschikking van de T-cel en tumorbindende armen, interdomeinafstanden en de opname van een Fc-domein, dat de halfwaardetijd beïnvloedt en effectorfuncties kan induceren indien aanwezig5. Eerder werk in ons laboratorium heeft aangetoond dat deze factoren de anti-tumor werkzaamheid van T-BsAbs aanzienlijk beïnvloeden, met tot 1.000-voudige verschillen in potentie6. Door dit werk hebben we het IgG-[L]-scFv-formaat geïdentificeerd als het ideale platform voor T-BsAbs (zie de sectie Representatieve resultaten voor meer informatie over T-BsAb-formaten) en hebben we dit platform toegepast op doelen zoals GD2 (neuroblastoom), HER2 (borstkanker en osteosarcoom), GPA33 (colorectale kanker), STEAP1 (Ewing-sarcoom), CD19 (B-cel maligniteiten) en CD33 (B-cel maligniteiten)7, 8,9,10,11,12,13.
Een van de grootste uitdagingen voor het succesvol implementeren van T-BsAb-therapie in solide tumoren is het overwinnen van een immunosuppressieve tumormicro-omgeving (TME) om T-celhandel naar tumoren te drijven14. De hierboven beschreven factoren die de werkzaamheid van T-BsAb beïnvloeden, hebben een significante invloed op het vermogen van T-BsAbs om effectief T-cel homing aan tumoren te induceren, maar dit effect is moeilijk te evalueren in een in vivo systeem in realtime. Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van luciferase-getransduceerde T-cellen in preklinische studies van T-BsAbs om T-celhandel naar verschillende weefsels in experimentele immuungecompromitteerde muismodellen tijdens de behandeling te evalueren. Het algemene doel van deze methode is om een middel te bieden om T-celinfiltratie in tumoren en andere weefsels te evalueren, evenals real-time inzicht in T-cel homing kinetiek en persistentie, zonder de noodzaak om dieren op te offeren tijdens de behandeling. Voor het toenemende aantal onderzoekers dat zich richt op cellulaire immunotherapieën, is het vermogen om T-cellen in vivo te volgen in preklinische diermodellen cruciaal. We streven ernaar een grondige, gedetailleerde beschrijving te geven van de methode die we hebben gebruikt voor het volgen van luciferase-getransduceerde T-cellen om andere onderzoekers in staat te stellen deze techniek gemakkelijk te repliceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedures zijn geëvalueerd en goedgekeurd door memorial Sloan Kettering's Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Transfectie van 293T-cellen met luciferase en oogst van viraal supernatant
- Kweek van 293T cellen
- Bereid media door het volgende toe te voegen aan een liter DMEM elk: 110 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 11 ml penicilline-streptomycine.
- Ontdooi 5 x 106 293T cellen en breng ze over in een T175-kolf met de media voorbereid zoals hierboven beschreven.
- Splits de 293T cellen 1:10 om de 3 dagen gedurende 6 dagen. Laat de cellen niet meer dan 90% confluent worden.
- Transfectie van 293T cellen
OPMERKING: De volgende hoeveelheden reagentia worden berekend voor het transfecteren van één T175-kolf van 293T-cellen. Stel dienovereenkomstig in als er meer kolven moeten worden overgebracht.- Breng 1,5 ml media over naar elk van de twee buizen van 50 ml met behulp van een pipet. Voeg aan één buis 10 μg VSV-G-plasmide, 20 μg Gag/pol en 20 μg klikkever rode TD-tomaat (CBR-TDR) luciferaseplasmide toe en meng. Voeg aan de andere buis 100 μL DNA in vitro transfectiereagens toe en meng. Incubeer beide buizen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Alle plasmiden die in dit manuscript worden beschreven, werden geleverd door Dr. Vladimir Ponomarev. - Breng de media die het DNA in vitro transfectiereagens bevatten druppelsgewijs over naar de buis met de DNA-plasmiden (meer dan ongeveer 30 s) en meng voorzichtig met een pipet. Incubeer bij RT gedurende 20 min.
- Maak tijdens deze incubatie van 20 minuten de 293T-cellen los door 5-10 ml 0,05% trypsine toe te voegen. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u 10 ml media toe en centrifugeert u gedurende 5 minuten op 800 x g . Resuspendeer de cellen in 1,5 ml media.
- Voeg de media met het DNA in vitro transfectiereagens en de DNA-plasmiden toe aan de 293T-cellen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Breng over in een T175-kolf en voeg 18 ml media toe. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Zuig de media de volgende dag voorzichtig op met een glazen pipet zonder de cellen los te maken. Vervang door 18 ml verse media. Incubeer bij 37 °C gedurende een nacht in een couveuse.
- Breng 1,5 ml media over naar elk van de twee buizen van 50 ml met behulp van een pipet. Voeg aan één buis 10 μg VSV-G-plasmide, 20 μg Gag/pol en 20 μg klikkever rode TD-tomaat (CBR-TDR) luciferaseplasmide toe en meng. Voeg aan de andere buis 100 μL DNA in vitro transfectiereagens toe en meng. Incubeer beide buizen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Oogsten van viraal supernatant
- Verwijder het virale supernatant met behulp van een pipet op ijs. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten om de cellen en het puin te pelleteren.
OPMERKING: Als de celkorrel groot is, zijn de cellen waarschijnlijk verstoord door de kolf toen het supernatant werd verwijderd. Deze cellen kunnen opnieuw worden verguld in een nieuwe kolf met verse media. - Filter het virale supernatant met een filter van 0,22 μm.
- Gebruik het virale supernatant onmiddellijk. Bewaar het op ijs of bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur, of vries het in bij -80 ° C voor langdurige opslag.
- Verwijder het virale supernatant met behulp van een pipet op ijs. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten om de cellen en het puin te pelleteren.
2. Uitbreiding en transductie van geactiveerde menselijke T-cellen met luciferase
- Activering van menselijke T-cellen in vitro
- Was de kralen door 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe te voegen aan een steriele buis van 15 ml, kralen toe te voegen (één kraal per twee T-cellen), gedurende 2 minuten in een magneetrek te plaatsen en de PBS eruit te zuigen.
- Bereid media voor zoals beschreven in stap 1.1.1, voeg vervolgens IL-2 toe tot een eindconcentratie van 30 IE/ml en voeg de gewassen kralen toe. Maak 2,5 ml media voor elke twee miljoen T-cellen die moeten worden geactiveerd.
- Tel de T-cellen (vers gezuiverd of eerder gezuiverd, bevroren, ontdooid en gewassen) met behulp van een hemocytometer en trypanblauwe vlek. Voeg T-cellen toe aan de media die in stap 2.1.2 zijn voorbereid en keer de buis voorzichtig om om te mengen. De T-cellen zullen minstens 20x uitzetten, afhankelijk van de bron en de algemene gezondheid van de cellen. Bepaal het aantal te activeren T-cellen door het aantal te berekenen dat nodig is om de muizen te behandelen en te delen door 20. Hier werden 20 x 106 T-cellen per muis gebruikt op basis van voorbereidende experimenten.
- Plaat 2,5 ml media met twee miljoen T-cellen, kralen en IL-2 in elke put van een 24-well weefselkweekplaat. Kweek bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2-incubator.
- Onderzoek de T-cellen elke dag onder een 20x microscoop gedurende de komende 3 dagen om te bepalen wanneer te transduceren met luciferase. De cellen zijn klaar wanneer ze samenklonteren en de media uitputten, waardoor deze van rood / roze naar lichtoranje verandert.
- Bereiding van retronectineplaten
OPMERKING: Retronectine wordt gebruikt om de platen te coaten die bij de transductie worden gebruikt, omdat het de gentransductieverbetert 15.- Voeg 2 ml 20 μg/ml retronectine in PBS toe aan een putje van een onbehandelde 6-well-plaat. Incubeer gedurende 2 uur bij RT of 1 uur bij 37 °C. Eén met retronectine gecoate put is nodig voor elke twee miljoen T-cellen die moeten worden getransduceerd.
- Zuig de retronectine aan zonder de bodem van de plaat te krassen.
- Voeg 3 ml 2% BSA in PBS (steriel gefilterd) per put toe in de 6-putplaat. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
- Spinoculatie
- Zuig de BSA aan zonder krassen op de bodem van de plaat.
- Was de putjes één keer met 3 ml PBS per put. Ga door of vervang door verse PBS en laat de plaat een nacht afgedekt bij 4 °C.
- Voeg 2 ml CBR-TDR luciferase viraal supernatant (verzameld in stap 1.3) per putje toe.
- Centrifugeer bij 1.240 x g gedurende 90 minuten bij 32 °C.
- Transductie
- Tel de T-cellen.
- Zuig het virale supernatant op zonder de bodem van de plaat te krassen.
- Plaat twee miljoen T-cellen per put in 6 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 30 IE/ml humaan IL-2.
- Onderzoek de T-cellen dagelijks. De T-cellen zijn klaar om te worden uitgebreid wanneer ze bijna samenvloeien, meestal na 2 dagen.
- Wanneer de cellen bijna samenvloeien, spoelt u ze voorzichtig van de bodem van de plaat met behulp van een pipet en brengt u elk putje over in een aparte T75-kolf. Voeg 9 ml media toe voor een totaal van 15 ml media per kolf.
- Voeg de volgende dag nog eens 15 ml media toe. De cellen moeten klaar zijn om de dag na deze toevoeging van media in muizen te injecteren. Bevestig succesvolle transductie door flowcytometrie uit te voeren (het luciferaseconstruct bevat een TD-tomatenfluorofoor die zichtbaar is in het PE-kanaal)16.
3. Engraftment van luciferase-getransduceerde T-cellen in immuungecompromitteerde muizen
- Bereid en tel de T-cellen voor injectie.
- Verwijder de T-cellen uit de kolven en tel. De cellen zijn klaar om te injecteren wanneer ze 20x-30x zijn uitgebreid, meestal op dag 7 na activering.
- Centrifugeer de T-cellen op 800 x g gedurende 5 minuten. Resuspendie in 2 ml media en verwijder de kralen met behulp van een magneetrek.
- Voor experimenten waarbij T-cellen afzonderlijk van bispecifieke antilichamen worden geïnjecteerd, telt u de T-cellen en resuspenseert u zodat de uiteindelijke concentratie 20 miljoen T-cellen per 100 μL media is. Ga verder met stap 3.2. Ga voor experimenten met ex vivo gewapende T-cellen (EAT's) verder met stap 3.1.4.
- Voor experimenten met ex vivo gewapende T-cellen, tel de T-cellen en scheid ze in individuele buizen van 1,5 ml voor elke groep, met 20 miljoen cellen per muis. Als er bijvoorbeeld drie groepen van elk vijf muizen zijn, bereid dan drie buizen van 1,5 ml voor met elk 100 miljoen T-cellen.
- Centrifugeer de buizen van 1,5 ml gedurende 5 minuten op 800 x g . Verwijder de media voorzichtig zonder de T-celkorrel te verstoren. Resuspendie in niet meer dan 50 μl media die de bispecifieke antilichamen bevatten. Incubeer bij RT gedurende 30 min.
OPMERKING: Voor de experimenten die in deze studie werden uitgevoerd, werden gepatenteerde IgG-[L]-scFv T-cel-engaging bispecifieke antilichamen gebruikt die in het laboratorium werden gegenereerd. Gebruik voor T-celarm 5 μg antilichaam per 20 x 106 T-cellen. In de handel verkrijgbare bispecifieke antilichamen kunnen ook worden gebruikt. - Spoel overtollige antilichamen weg door 1.450 μL media aan elke buis toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 800 x g , zuig de media voorzichtig op en resuspensie bij een concentratie van 20 miljoen bewapende T-cellen per 100 μL media.
- Injectie en transplantatie in muizen
- Verdoof de muizen in een kamer die 3,5% (v/v) geïnhaleerd isofluraan levert in 1 L/min zuurstof. De muizen worden volledig verdoofd wanneer de terugtrekkingsreflex van het achterpootpedaal is verdwenen.
OPMERKING: Zorg voor thermische ondersteuning tijdens de hele procedure. - Injecteer met een naald van 26 G 20 miljoen T-cellen in 100 μL media retroorbitaal per muis.
- Dien 1.000 U recombinant IL-2 subcutaan toe om de overleving van T-cellen in vivo te ondersteunen.
- Dien de bispecifieke antilichamen retroorbitaal (in het oog dat niet wordt gebruikt voor T-celinjectie) of intraperitoneaal toe. Laat de muizen herstellen van anesthesie en terugkeren naar hun kooien.
OPMERKING: Nogmaals, hier werden gepatenteerde antilichamen gebruikt die in het laboratorium werden gegenereerd, maar in plaats daarvan konden commercieel beschikbare antilichamen worden gebruikt. In de experimenten hier werd 0,3-10 μg antilichaam per muis per dosis toegediend. De antilichamen werden twee keer per week toegediend gedurende 3-4 weken.
- Verdoof de muizen in een kamer die 3,5% (v/v) geïnhaleerd isofluraan levert in 1 L/min zuurstof. De muizen worden volledig verdoofd wanneer de terugtrekkingsreflex van het achterpootpedaal is verdwenen.
4. In vivo beeldvorming van muizen geënt met luciferase-getransduceerde T-cellen
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd op de dag van beeldvorming, wat niet noodzakelijkerwijs dezelfde dag is dat de T-cellen en / of antilichamen aan de muizen worden toegediend. Doorgaans voeren we beeldvorming uit 24 uur na toediening van de luciferase-getransduceerde T-cellen.
- Bereiding van D-luciferine
- Los 1 g D-luciferine op in 33,3 ml steriele PBS (eindconcentratie: 30 mg/ml).
- Aliquoteer het opgeloste D-luciferine in 33 x 1,5 ml microcentrifugebuizen en houd de buisjes op -20 °C.
- Ontdooi op de dag van de beeldvorming voldoende aliquots van 30 mg/ml D-luciferine om het aantal dieren in beeld te brengen. Eén buis is genoeg voor 10 dieren.
OPMERKING: Vries de resterende D-luciferine na gebruik opnieuw in. D-luciferine is stabiel gedurende ten minste vijf vries-/dooicycli.
- Toediening van D-luciferine aan muizen
OPMERKING: Voordat u D-luciferine aan de muizen toedient, opent u de beeldvormingssoftware en initialiseert u het systeem. Het kan enkele minuten duren voordat de camera is afgekoeld, en dit moet worden gedaan voordat de muizen worden geïnjecteerd met D-luciferine om ervoor te zorgen dat beeldvorming 5 minuten na toediening van het substraat kan plaatsvinden.- Verdoof maximaal vijf muizen in een kamer die 3,5% (v/v) geïnhaleerd isofluraan levert in 1 l/min zuurstof. De muizen worden volledig verdoofd wanneer de terugtrekkingsreflex van het achterpootpedaal is verdwenen.
- Zodra de muizen volledig zijn verdoofd, dient u 100 μL 30 mg / ml D-luciferine per muis (3 mg per muis) toe via retroorbitale injectie met een naald van 26 G. Stel je deze groep muizen voor voordat je D-luciferine toedient aan de volgende groep. Plaats de volgende groep muizen in de isofluraankamer om te worden verdoofd terwijl de vorige groep wordt afgebeeld.
- Beeldvorming van luciferase-getransduceerde T-cellen
- Verplaats de verdoofde muizen naar de lichtdichte kamer van de imager en blijf 3% isofluraan toedienen bij 0,5 l/min. Plaats de muizen op hun zijkanten zodanig dat de flank met de xenograft naar boven is gericht naar de camera. Maak een andere reeks afbeeldingen met de muizen in rugligging om de aanwezigheid van T-cellen in de longen te evalueren.
- Selecteer in het configuratiescherm voor acquisitie de optie Luminescent, Photo en Overlay. Stel de belichtingstijd in op automatisch, de binning op gemiddeld en F/Stop op 1. Verkrijg afbeeldingen. Stel na de eerste afbeelding de belichtingstijd zo in dat deze overeenkomt met de tijd die automatisch is berekend voor de eerste afbeelding, zodat volgende afbeeldingen rechtstreeks kunnen worden vergeleken. Het kan handig zijn om beelden met meerdere belichtingstijden vast te leggen om de optimale belichtingstijd te bepalen voor het bereiken van het helderste signaal zonder pixelverzadiging.
- Verwijder de muizen uit isofluraan, keer terug naar hun kooien en observeer totdat ze wakker en ambulant zijn.
- Herhaal de stappen uit stap 4.2.1 totdat alle groepen zijn afgebeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals beschreven in stap 4.3, kunnen muizen tijdens de beeldvorming in verschillende posities worden georiënteerd om de aanwezigheid van T-cellen in verschillende weefsels te evalueren. Liggende positionering maakt de beoordeling van T-cellen in de longen mogelijk, wat gebruikelijk is op vroege tijdstippen na injectie. Laterale positionering met de subcutane xenograft naar boven gericht wordt gebruikt om de handel van T-cellen naar de tumor het beste te beoordelen. Vrouwelijke C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac muizen werden gebruikt voor alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven. Figuur 1 toont beelden van een experiment waarin muizen met GD2-positieve xenografts werden behandeld met luciferase-getransduceerde T-cellen die ex vivo gewapend waren met een GD2 BsAb of luciferase-getransduceerde T-cellen en GD2 BsAb afzonderlijk geïnjecteerd17. Figuur 1A laat zien dat gewapende T-cellen sneller naar de tumor werden gesmokkeld dan ongewapende T-cellen (figuur 1B), waardoor de longen 2 dagen eerder werden verlaten. Figuur 1C toont de kwantificering van dit fenomeen. Figuur 1E-G laat zien dat het mogelijk is om de handel in T-cellen gedurende ten minste 28 dagen na injectie van de luciferase-getransduceerde T-cellen te volgen, waardoor onderzoekers T-cel homing en persistentie gedurende de behandeling kunnen volgen, in tegenstelling tot andere technieken zoals immunohistochemie (IHC) die slechts een momentopname van T-celinfiltratie mogelijk maken.
Zonder de mogelijkheid om T-celhandel in vivo te beoordelen, zijn onderzoekers die T-BsAbs testen niet in staat om te bepalen of T-cellen tijdens de behandeling infiltreren en in tumoren blijven bestaan. Als een behandeling faalt, zonder dieren op te offeren en IHC uit te voeren, kan het moeilijk of onmogelijk zijn om te weten of het falen te wijten was aan een gebrek aan T-celhandel, persistentie, T-celuitputting of een andere oorzaak. Figuur 2A-C toont een experiment waarin muizen met van borstkankerpatiënten afgeleide xenografts werden behandeld met luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen en HER2-gerichte BsAbs met verschillende mutaties om Fc-functies tot zwijgen te brengen7. Figuur 2C laat zien dat behandeling met de HER2 BsAb met een niet-gedempt Fc geen effect had op de tumorgroei in vergelijking met een controle-BsAb, terwijl behandeling met HER2 BsAbs met een N297A-mutatie alleen of in combinatie met een K322A-mutatie de tumorgroei volledig kon stoppen. Figuur 2A en figuur 1B laten zien dat in groepen met de uitschakelingsmutaties het luminescentiesignaal van T-cellen een hogere piek bereikte op dag 3 na de injectie en op een hoger niveau bleef bestaan in vergelijking met controle-BsAb en niet-gestileerde HER2 BsAb. Vervolgexperimenten toonden aan dat bij muizen behandeld met T-cellen en BsAbs met niet-gedempt Fcs, de T-cellen in perivasculaire gebieden van de longen werden omringd door muriene neutrofielen en macrofagen, wat een Fc-afhankelijke sekwestratie van de BsAb-gebonden T-cellen suggereert die migratie naar de tumor voorkomt. Het pro-tumorigene effect van tumor-resident M2-gepolariseerde macrofagen is goed beschreven. Figuur 3A,B laat zien dat bij muizen met neuroblastoom patiënt-afgeleide xenografts (PDX's), depletie van Ly6c-positieve macrofagen de T-cel homing aan tumoren aanzienlijk verhoogt, wat resulteert in verminderde tumorgroei en verlengde overleving (Figuur 3C)18. Dit effect is nog meer uitgesproken bij osteosarcoom PDX's (figuur 3D).
In vivo T-cel tracking stelt onderzoekers ook in staat om te volgen hoe T-celhandelkinetiek wordt beïnvloed door andere variabelen in antilichaamtechnologie, waaronder structurele configuratie. Zoals beschreven in de inleiding van dit artikel, onderstreepte eerder werk in ons laboratorium het belang van bivalentie en cis-oriëntatie van de tumor- en T-celbindende armen voor de in vivo werkzaamheid van BsAbs. Figuur 4 laat zien dat onder een panel van BsAbs gericht op het tumorantigeen STEAP1 (figuur 4A), het IgG-[L]-scFv-formaat resulteerde in significant meer T-celinfiltratie op dag 6 na de eerste dosis T-cellen, die aanhield voor de duur van de behandeling (figuur 4C)10. Dit fenomeen werd niet voorspeld door in vitro cytotoxiciteitstests (figuur 4B), waarbij het belang van het bevestigen van in vitro resultaten in in vivo modellen werd benadrukt.
Figuur 1: Bewapende T-cellen vertonen snellere tumorhomingkinetiek dan BsAb-gerichte ongewapende T-cellen, waarbij longsekwestratie snel wordt omzeild. Luciferase-getransduceerde T-cellen werden uitgebreid en bewapend met BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Luc(+) GD2-EATs (10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-cellen) of Luc(+) ongewapende T-cellen (2 x 107 cellen) met of zonder GD2-BsAb (10 μg) werden intraveneus toegediend in GD2-positieve neuroblastoom PDX-dragende muizen wanneer het gemiddelde tumorvolume 100 mm3 bereikte. (A) Bioluminescentiebeelden van GD2-EATs die in tumoren worden verhandeld. (B) Bioluminescentiebeelden van GD2 BsAb-gerichte ongewapende T-celhandel in tumoren gedurende dagen. (C) Kwantificering van T-celinfiltratie in tumoren in de loop van de tijd gemeten door bioluminescentie (n = 5 muizen / groep) uitgedrukt als totale flux of uitstraling (fotonen / s) per pixel geïntegreerd over de tumorcontour (ROI). (D) Tumorgroeicurven van individuele muizen behandeld met GD2-EATs, GD2-BsAb plus ongewapende T-cellen of ongewapende T-cellen. Om de in vivo persistentie van doelantigeenspecifieke EATs te testen, werden Luc(+) GD2-EATs (gewapend met 10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-cellen) of Luc(+) HER2-EATs (10 μg HER2-BsAb/2×107 T-cellen) intraveneus toegediend in osteosarcoom TEOS1C PDX-dragende muizen. Twee extra doses niet-luciferase getransduceerde GD2-EATs of HER2-EATs werden toegediend op dag 7 en dag 14. (E) Kwantificering van bioluminescentie van Luc(+) EATs in tumoren na de behandeling. (F) Tumorgroeicurven van individuele muizen behandeld met GD2-EATs, HER2-EATs, of ongewapende T-cellen, of geen behandeling. (G) Bioluminescentiebeelden van Luc(+) GD2-EATs (boven) of Luc(+) HER2-EATs (onder) in tumoren in de loop van de tijd. Bioluminescentie van Luc(+) EATs werd gedetecteerd gedurende 28 dagen na injectie. Afkortingen: EATs = ex vivo gewapende T-cellen; ROI = regio van belang. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Dit cijfer is aangepast van Park et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: T-celhandel naar HER2-positieve menselijke borstkanker PDX bij DKO-muizen. (A) Representatieve bioluminescentiebeelden van T-celhandel. (B) Kwantificering van T-celhandel in tumoren in de loop van de tijd door bioluminescentie (n = 5 muizen / groep) uitgedrukt als totale flux of uitstraling (fotonen / s) in elke pixel geïntegreerd over de gehele tumorcontour (ROI). (C) HER2-positieve borstkanker PDX (M37) groei (n = 5 muizen/groep) na behandeling met Ctrl BsAb, HER2 BsAb en zijn Fc-mutanten. De getoonde resultaten zijn representatieve resultaten van ten minste drie onafhankelijke experimenten. De significante verschillen werden berekend op basis van het gebied onder de curve (AUC). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De effecten van monocytendepletie op BsAb gerichte T-celhandel en in vivo antitumorrespons. (A) Luciferase getransduceerde T-cellen (Luc(+) T-cellen) of luciferase getransduceerde GD2-BsAb gewapende T-cellen (Luc(+) GD2-EATs) werden toegediend met anti-Ly6C-antilichaam aan de muizen met een neuroblastoom patiënt-afgeleid xenograft (PDX). (B) Bioluminescentie in de laesies van de tumor werd gecontroleerd. De bioluminescentiebeelden op dag 7 en kwantificering van de bioluminescentie in de laesies van de tumor. (C) In vivo antitumorrespons door GD2-EATs met anti-Ly6C-antilichaam werd getest tegen neuroblastoom PDXs. (D) In vivo antitumoreffect van GD2-EATs met anti-Ly6C-antilichaam werd getest tegen osteosarcoom PDX's en de overleving op lange termijn werd geanalyseerd. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. In vivo antitumoreffect werd vergeleken door de AUC- en overlevingscurveanalyses. Tumor-infiltrerende lymfocyten werden gekwantificeerd met behulp van de AUC van bioluminescentie. Verschillen tussen steekproeven die in de figuur zijn aangegeven, werden getest op statistische significantie met behulp van een tweezijdige student's t-test voor twee sets gegevens en eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoctest voor drie of meer sets gegevens. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dit cijfer is aangepast van Park et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Antitumoractiviteiten van anti-STEAP1 T-cel-engaging bispecifiek antilichaam. (A) Schematische weergave van de zes structurele formaten van STEAP1 BsAb. (B) Antilichaamafhankelijke T-celgemedieerde cytotoxiciteit (ADTC) test tegen EFT-cellijnen (TC32 ad TC71) met behulp van verschillende formaten STEAP1 BsAb. De verhouding tussen effector en target (ET) cel was 10:1. (C) Bioluminescentie beeldvorming (BLI) van Luc(+) T-cellen gewapend met zes verschillende formaten STEAP1 BsAb op (a) dag 6 en (b) dag 18 na de behandeling en kwantificering van de bioluminescentie-intensiteit in de laesies van de tumor. Luciferase getransduceerde T-cellen (Luc(+) T-cellen) werden bewapend met verschillende formaten STEAP1 BsAb (10 μg STEAP1 BsAb/2 x 107 T-cellen) en toegediend met aanvullende IL-2 (1.000 IE/dosis) aan de muizen met EFT PDX's (ES15a) en de BLIfollowed. Afkortingen: EFT = Ewing-sarcoom familie van tumoren; PDX's = patiënt-afgeleide tumor xenografts; STEAP = zes-transmembraan epitheelantigeen van de prostaat. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Tumor-infiltrerende lymfocyten werden gekwantificeerd door het gebied onder de curve van de bioluminescentie te berekenen. Verschillen tussen de steekproeven in de figuur werden getest op statistische significantie met behulp van eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. p < 0,0001. Dit cijfer is aangepast van Lin et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de T-BsAb blinatumomab is goedgekeurd voor CD19-positieve hematologische maligniteiten, is de succesvolle implementatie van T-BsAbs in solide tumoren veel moeilijker gebleken. Catumaxomab, een T-BsAb gericht tegen epitheliale celadhesiemolecuul (EPCAM), werd goedgekeurd voor de behandeling van kwaadaardige ascites bij patiënten met eierstokkanker, maar de productie van het geneesmiddel werd vervolgens om commerciële redenen stopgezet19. Er zijn geen andere T-BsAbs goedgekeurd voor solide tumoren, wat de uitdagingen van dit type therapie onderstreept. Toxiciteit als gevolg van cytokine release syndrome (CRS) is een veel voorkomend probleem, hoewel dit kan worden beheerd met steroïden en cytokineremmers. Naast toxiciteit is een gebrek aan werkzaamheid gebruikelijk in onderzoeken met T-BsAbs voor solide tumoren. Het induceren van T-celhandel en persistentie in de tumor is moeilijk gebleken, waarschijnlijk als gevolg van verschillende immunosuppressieve factoren in de TME14. Zelfs preklinisch is het echter vaak onduidelijk waarom een T-BsAb die in vitro goed presteert, er niet in slaagt om tumoren in vivo effectief te behandelen.
De methode voor het volgen van T-cellen in vivo in realtime die in dit artikel wordt beschreven, is om verschillende redenen nuttig voor onderzoekers. Het monitoren van T-cel homing geeft mechanistisch inzicht in waarom bepaalde T-BsAbs slagen of falen door onderzoekers in staat te stellen te bepalen wanneer T-celhandel is begonnen en hoe lang de T-cellen tijdens de therapie in de tumor zijn gebleven. De methode kan op meerdere tijdstippen worden herhaald, waardoor onderzoekers de kinetiek van T-cel homing in de loop van enkele weken kunnen plotten. (Representatieve resultaten in figuur 1 laten zien dat T-cellen ten minste 28 dagen in de tumor blijven.) In vivo beeldvorming van luciferase-getransduceerde T-cellen elimineert ook de noodzaak om dieren op te offeren tijdens de behandeling voor histologische beoordeling van T-celinfiltratie, waardoor de totale kosten en het aantal dieren dat per experiment nodig is, worden verminderd. Omdat de beeldvorming zo vaak als nodig kan worden herhaald, maakt het ook een veel eenvoudigere en grondiger evaluatie van T-cel homingkinetiek mogelijk in vergelijking met histologische analyse, die in wezen een momentopname is van een enkel tijdstip, tenzij meerdere dieren op verschillende tijdstippen worden geofferd.
De meest kritische stap van deze methode is de succesvolle transductie van T-cellen met het luciferaseconstruct. Mislukte transductie kan leiden tot T-celdood of een gebrek aan luciferasesignaal in vivo. Als T-cellen na transductie niet uitzetten zoals verwacht, kan het mogelijk zijn om de virale titer waarmee ze worden getransduceerd te verminderen om potentiële toxiciteit van het transductieproces te verminderen. Een andere benadering zou zijn om nog een dag te wachten tussen T-celexpansiestappen om de T-cellen meer confluent te laten worden voordat ze worden uitgebreid naar een groter celkweekvat. Voordat u de T-cellen in de muizen injecteert, is het een goed idee om het transductiesucces te bevestigen met behulp van flowcytometrie (om te controleren op expressie van de TD-tomatenreporter) of een bioluminescente plaatlezer. Als de getransduceerde T-cellen nog steeds niet zichtbaar zijn met bioluminescente beeldvorming, kan het zijn dat het aantal T-cellen te laag is voor detectie met deze techniek. Rabinovich et al. beschrijven een vergelijkbare methode met behulp van verbeterde vuurvlieg luciferase om slechts 10 murine T-cellen te detecteren, die kunnen worden geïmplementeerd in situaties die dit niveau van gevoeligheid vereisen20.
Samenvattend biedt in vivo tracking van luciferase-getransduceerde T-cellen een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die T-BsAbs bestuderen in immuungecompromitteerde muismodellen van kanker. Naast de hierboven besproken toepassingen, is deze methode van T-celtracking toegepast op chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en zou ogenschijnlijk kunnen worden toegepast op syngenetische muismodellen die ook gebruik maken van adoptief overgedragen T-cellen21. We hopen dat deze strategie nuttig zal zijn voor onderzoekers die translationele T-BsAbs ontwikkelen en zal leiden tot een verhoogd succes van deze therapieën bij patiënten met solide tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NKC meldt commerciële onderzoekssubsidies te ontvangen van Y-mAbs Therapeutics. NKC is de uitvinder en eigenaar van uitgegeven patenten die door MSK in licentie zijn gegeven aan Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand en Abpro-labs. MSK en NKC hebben financieel belang in Y-mAbs. NKC meldt aandelenopties te ontvangen van Eureka Therapeutics. HFG en MEC hebben geen relevante openbaarmakingen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Vladimir Ponomarev bedanken voor het delen van de luciferase-constructies die worden gebruikt in de experimenten die worden beschreven in de sectie representatieve resultaten van dit artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
References
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
- Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
- Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
- Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
- Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
- Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
- Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
- Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
- Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
- Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
- Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
- Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
- Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
- Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
- Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
- Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).
